Introduccin

Uno de los mtodos mas comunes para estimar la biomasa de comunidades de microalgas es a travs de la medicin de la cantidad de clorofila (CHL) en una muestra.

La clorofila es una molcula aromtica que consiste en dos partes, un anillo central de profirina y una cadena larga orgnica (i.e. hidrocarburo). El anillo central de porfirina es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados entre si para formar un anillo mayor (e.g. porfirina). En el centro del anillo de profirina se encuentra una molcula de magnesio.

Clorofila a Clorofila b Clorofila c1 y c2Figura 1. Estructura molecular de la clorofila a, b, c1 y c2.

La clorofila es el principal pigmento presente en las clulas de las plantas, y esta encargada de comenzar el proceso de la fotosntesis (i.e. fijacin de carbon). Ademas de la importancia que tiene en la fotosntesis, la clorofila es probablemente la molcula mas usada para estimar la biomasa de algas en el medio acutico. Esto se debe, entre otras cosas, a que la clorofila representa una medida de la biomasa de algas la cual no es afectada por substancias no relacionadas con las algas; a que la clorofila es una medida relativamente precisa del peso y volumen de algas; y finalmente a que acta como el enlace emprico entre la concentracin de nutrientes en el agua y otros procesos biolgicos importantes como lo es la produccin primaria.

Ademas de esto, es relativamente sencillo el realizar mediciones de clorofila. Esto contribuye a su popularidad, pero tambin provoca que los valores que se obtienen sean mas ambiguos de lo que aparentan ser.

Protocolo - determinacin de biomasa.

Universidad Autnoma Metropolitana - Unidad XochimilcoDivisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud - Licenciatura en Biologa

F. Linares, Ph.D.microphytobenthos@gmail.com

Ahora bien, la clorofila en si no es una sola molcula, sino que comprende a un grupo de molculas relacionadas entre si, designadas como clorofila a, b, c y d. La clorofila a es la molcula que se encuentra en todas las clulas de los productores primarios, y por ello es la que se reporta cuando se hacen anlisis de concentracin de clorofila. La clorofila d se encuentra solamente en algas rojas, pero lo clorofila b y c son mas comunes en especies de agua dulce. La concentracin relativa dentro de la clula de estas molculas de clorofila varia dependiendo de la especie de alga, pero la clorofila a es dominante en todas las especies de algas eucariotas y en las algas procariotas (i.e. cianobacterias).

Figura 2. Espectro de absorbancia de la clorofila a y b. La clorofila a muestra dos picos de absorbancia mxima, uno a 665 y otro a 465 nm.

Otros tipos de pigmentos tambin estn presentes en las clulas de las algas. Especficamente los carotenos y las xantofilas. En cianobacterias, las ficobiliproteinas (solubles en agua) son los pigmentos accesorios predominantes, lo cual provoca que este grupo de organismos presenten un caracterstico color azul-verde. Ademas de los pigmentos presentes en las algas, algunas especies de bacterias tambin contienen pigmentos, con una serie de compuestos que se conocen como bacterioclorofilas.

Ahora, en adicin a los pigmentos que ocurren de forma natural en las celulas de las algas, una muestra de agua tambin va a contener productos de degradacin de estos pigmentos, esto es importante. Cuando la clorofila de las algas se degrada, esta forma una serie de productos de degradacin, los cuales dependen de que parte de la molcula es la que este siendo afectada. Conforme la clorofila se degrada, el paso inicial es ya sea la perdida del magnesio del anillo central, o la perdida de la cadena orgnica. Cuando se pierde el magnesio se forma la feofitina; cuando se pierde la cadena orgnica se forma la clorofilida. Tanto la feofitina como la clorofilida se pueden seguir degradando para producir una molcula que se conoce como feoporbidina. De esta forma, cuando una molcula de clorofila comienza a degradarse, se comienzan a producir un

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numero especifico de feofitinas, clorofilidas y feoporbidinas, dependiendo del tipo especifico de clorofila inicial.

Cuando una muestra de agua es filtrada y la clorofila es extrada para analizarla, esta contiene un gran numero de estos productos de degradacion, en adicion a la clorofila a, el pigmento primario que nos interesa medir. Las absorbancias de estas otras moleculas no son necesariamente distintas de la aborbancia de la clorofila a, lo cual produce resultados con absorbancias muy altas que no son correctas, y consecuentemente estimaciones errneas de biomasa. A pesar de lo sencillo que es analizar clorofila, la validez de los resultados obtenidos dependen de si es que estas interferencias han sido adecuadamente removidas o no. Casi todos los mtodos analticos descritos para el anlisis de clorofila toman en cuenta este problema, aunque en ocasiones omiten otros.

Parte 1: descripcin de los metodos.

Tcnicas de campo para la coleccin y preservacin de muestras de clorofila.

Colecta y filtracin.

El primer paso es el colectar una muestra de agua, ya sea usando mangueras o botellas de coleccin de agua (e.g. botellas Van Dorn). Si no se tiene acceso a este tipo de botellas/mangueras, es posible colectar la muestra de agua directamente utilizando la botella (preferentemente de polietileno) en donde va a quedar la muestra, utilizando guantes de plstico.

Una vez colectada la muestra, esta puede ser guardada a 4C en la oscuridad, y puede permanecer as por un lapso no mayor de un da. Despus de un da la clorofila comienza a degradarse. Una alternativa es la de congelar las muestras, en oscuridad, donde pueden permanecer por un lapso de 12 semanas.

El siguiente paso es el de filtracin de la muestra de agua. Es necesario filtrar el agua para poder concentrar la biomasa (y por tanto a la clorofila) antes de analizarla. Para filtrar la muestra comnmente se usan embudos de filtracin (i.e. mecnica o manual). La parte inferior del embudo se enrosca en un filtro de coleccin, el cual a su vez se enrosca en un recipiente de coleccin. La idea del principio es poner un micro-filtro de fibra de vidrio (e.g. Whatman Glass Microfiber Binder Free, Grade GF/F: 0.7 m) entre el embudo y el recipiente de coleccin. Una vez puesto, se vaca la muestra de agua en el embudo y comienza a filtrarse (manual o mecnicamente), de forma tal que la biomasa se concentra en el filtro mientras que el agua ya filtrada se deposita en el recipiente de coleccin.

La cantidad de biomasa (e.g. microalgas) filtradas en la muestra es importante. Estudios han demostrado que parece existir mas variabilidad en el cociente acidico de la muestra en absorbancias mas bajas (e.g. < 0.4), lo cual puede contribuir a errores en la determinacin de clorofila. Esta variabilidad en el cociente acidico puede ser el resultado de mucha acidez la cual causa que la feofitina se contine degradando en la muestra, pero tambin puede ser resultado de un error analtico asociado a bajas concentraciones de clorofila.

Preservacin de la clorofila.

Una vez que la clorofila se encuentra en el filtro, esta se vuelve muy susceptible a ser degradada conforme las celulas de las microalgas comienzan a morir y a descomponerse. Tambin en este punto la clorofila es muy sensible a la temperatura y a la luz. Por lo tanto, es importante impedir que los pigmentos comiencen a degradarse.

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El mtodo mas simple de preservacin es el de congelar las muestras. Varios estudios han demostrado que muestras que han sido congeladas no presentan degradacin significativa incluso 6 meses despus de que fueron colectadas (Lenz & Fritsche, 1980). Aun as, otros autores han encontrado problemas con el congelamiento de muestras y recomiendan no congelar las muestras (Jones & Lee, 1982).

Otro mtodo de preservacin es el de sumergir los filtros inmediatamente en el solvente, sellarlo y ponerlo en un lugar obscuro. La clorofila no se degrada tan rpidamente siempre y cuando se encuentre en la obscuridad.

En este caso se recomienda, una vez que se ha filtrado la muestra, poner el filtro en un tubo de ensayo con rosca, aadir el solvente inmediatamente, tapar el tubo y ponerlo en el refrigerador en la oscuridad. Esto comienza propiamente la etapa de extraccin de la clorofila.

Anlisis de la clorofila.

La parte final del mtodo es el anlisis de la clorofila. Para esto se utiliza un espectrofotometro. En la celda del espectrofotometro se pone el solvente, el cual ya contiene a la clorofila disuelta. Posteriormente se hacen mediciones a distintos anchos de banda, midiendo siempre la absorbancia. Con estos datos, y con el uso de formulas, se puede calcular la clorofila en la muestra. A continuacin se describe el procedimiento del mtodo.

Parte 2: procedimientos analticos para muestras de agua.

1. Colectar una muestra de agua y colocarla en una botella de polietileno. La botella debe estar limpia y de preferencia estril. Se recomienda colectar entre 2501000 mL.

2. Filtrar 250 mL de agua usando filtros de fibra de vidrio (Whatman GF/F), y un sistema de bombeo.3. Una vez filtrada la muestra, se remueve el filtro con mucho cuidado, utilizando pinzas se dobla y se

coloca en un tubo de ensayo con tapa/rosca.4. Se aaden 5 mL de 90% acetona.5. Se cierra el tubo con el filtro y la acetona, y en caso de ser necesario se cubre con papel aluminio.6. Con mucho cuidado se agita el tubo en el lapso de 1 minuto.7. Se coloca el tubo en el refrigerador y se deja extraer la clorofila por un lapso de 24 horas.8. Despus del lapso de 24 horas, con una pipeta se extrae la acetona del tubo, y se coloca en un tubo

limpio.9. La acetona en el tubo limpio se centrifuga por 10 minutos a 3000 RPM.10. Se extrae del tubo entre 13 mL los cuales se ponen en la celda del espectrofotometro.11. IMPORTANTE: Es necesario anotar la longitud de la celda del espectrofotometro. Normalmente varia

entre 1-2 cm.

Las mediciones que se hacen en el espectrofotometro son las siguientes:

1. Medir la absorbancia de la muestra a 664 nm.2. Medir la absorbancia de la muestra a 647 nm.3. Medir la absorbancia de la muestra a 630 nm.

Con los datos de absorbancia que se obtienen en el espectrofotometro es posible calcular la cantidad de clorofila a, b y c en la muestra, usando las ecuaciones propuestas por Jeffrey & Humphrey (1975):

CHLa = (11.85 x A664) (1.54 x A647) (0.08 x A630)CHLb = (-5.47 x A664) + (21.03 x A647) (2.66 x A630)CHLc = (-1.67 x A664) (7.60 x A647) + (24.52 x A630)

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Los valores obtenidos en estas ecuaciones se substituyen en las siguientes ecuaciones para obtener la concentracin final de clorofila a, b y c:

Clorofila a (mg mL-1) = [CHLa x v]/[l x V]Clorofila b (mg mL-1) = [CHLb x v]/[l x V]Clorofila c (mg mL-1) = [CHLc x v]/[l x V]

Donde CHLn es el resultado de las ecuaciones de Jeffrey & Humphrey (1975) para cada tipo de clorofila (i.e. a, b, c), v es el volumen de acetona usado para extraer los pigmentos (mL), l es la longitud de la celda del espectrofotometro (cm) y V es el volumen de agua filtrada (L).

Parte 3: procedimientos analticos para muestras de sedimento.

1. Para la colecta de muestras de sedimento se recomienda el uso de una jeringa de plstico (5 mL). Con una navaja se corta la punta (donde se encuentra la aguja), de forma tal que queda completamente abierta (i.e. como un cilindro).

2. Con esta jeringa se colectan tres muestras de sedimento. Cada muestra tendr una profundidad aproximada de 1 cm. Es importante anotar el dimetro de la jeringa para as poder calcular el volumen de la muestra.

3. Las muestras se colocan en tubos de plstico con rosca. Se recomienda que sean tubos para centrifuga, ya que las muestras eventualmente tendrn que ser centrifugadas.

4. Se aaden a cada tubo 5 mL de 90% acetona.5. Se cierra el tubo con el sedimento y la acetona, y en caso de ser necesario se cubre con papel

aluminio.6. Se agita el tubo en el lapso de 1 minuto.7. Se coloca el tubo en el refrigerador y se deja extraer la clorofila por un lapso de 24 horas.8. Despus del lapso de 24 horas, cada tubo se centrifuga por 10 minutos a 3000 RPM.9. Se extrae del tubo entre 13 mL (con una pipeta) los cuales se ponen en la celda del

espectrofotometro.10. IMPORTANTE: Es necesario anotar la longitud de la celda del espectrofotometro. Normalmente varia

entre 1-2 cm.

La clorofila se calcula utilizando el mismo procedimiento que viene en la parte 2 (ver arriba).

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