ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การศกษาผลของสารสกดจากใบเฟองฟาและบานเยนตอการยบยงการเขาท าลาย ของเชอไวรสใบดางแตง

A study of antiviral activity of Bougainvillea spp. and Mirabilis jalapa L.

on Cucumber mosaic virus (CMV).

โดย

นางสาววาสนา รงสวาง

ควบคมและอนมตโดย

…………………………… วนท เดอน พ.ศ. 2551 (ดร. สจนต ภทรภวดล) อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ

การศกษาผลของสารสกดจากใบเฟองฟาและใบบานเยนตอการยบยงการเขาท าลาย ของเชอไวรสใบดางแตง

นางสาววาสนา รงสวาง

บทคดยอ

ศกษาผลของสารสกดจากใบเฟองฟาและบานเยนตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง (CMV) ในพชอาศย 2 ชนด คอถวเขยวและพรก โดยท าการศกษาผลของสารสกดทใชน าเปนตวท าละลายและทใชฟอสเฟตบฟเฟอรเปนตวท าละลาย จากการทดสอบการฉดพนสารสกดลงบนใบพชทดสอบเปนเวลา 24 ชวโมง กอนการปลกเชอดวยวธกล พบวา สารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน าสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอ CMV ในถวเขยวไดสงสด 90.13 เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบกบตนควบคมทไมมการฉดพน(control) ระดบความเขมขนทใหผลการยบยงไดดทสดคอทความเขมขน 1:10 นอกจากน สารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน าสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอ CMV ในถวเขยวไดสงสด 45.47 เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบกบตน control ระดบความเขมขนทใหผลการยบยงไดดทสดคอทความเขมขน 1:10 อยางไรกตาม สารสกดทงสองชนดไมสามารถลดปรมาณเชอ CMV ในพรกไดเมอเปรยบเทยบกบตนพรกทไมมการฉดพนสารสกด

ค าส าคญ : สารสกดใบเฟองฟา, สารสกดใบบานเยน,น า, ฟอสเฟตบฟเฟอร, CMV ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร

ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ดร. สจนต ภทรภวดล ปทพมพ : 2550 จ านวนหนา : 27

A study of antiviral activity of Bougainvillea spp. and Mirabilis jalapa L. on Cucumber mosaic virus (CMV).

Miss Wasana Rungsawang

Abstract

Fresh leaves of Bougainvillea spp. and Mirabilis jalapa L. were used for extraction of

antiviral compounds. The antiviral activity of the crude extracts on Cucumber mosaic virus (CMV) was studied. CMV was inoculated in a day after the treatment, by spraying the crude extracts over the entire surface of the leaf. Water was sprayed instead on the untreated control. The tests were carried out with Vigna unguiculata (L.) Walp. cv .KPS2 which is liable to develop local lesions if a virus is inoculated. The number of local lesions which had developed two-three days after the inoculation of CMV was counted, and the degree of inhibition was calculated. While Capsicum annum cv. CA 500 was employed for systemic symptom. The symptoms on the inoculated plants were observed and the effects of the treatment were determined by comparing the proportion of diseased plants between the treated and untreated. The results showed that Bougainvillea spp. and M. jalapa crude extracts could decrease the number of local lesions on V. unguiculata. Both crude extracts diluted from stock to concentration of 10-1 showed excellent effects against CMV. However, the active ingredient contained in both plant extracts were not able to inhibit the viral infection in the systemic hosts.

Key words : Bougainvillea spp. Extracts, Mirabilis jalapa L.extracts, water,

phosphate buffers, CMV Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty

of Agricultural Kamphaeng Saen, Kasetsart University. Advisor : Sujin Patarapuwadol Year : 2007 Page : 27

ค านยม

ขอขอบพระคณ ดร.สจนต ภทรภวดล อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทกรณาใหความร ค าแนะน า และค าปรกษาเกยวกบการศกษาและการท าการทดลอง ตลอดจนตกเตอนและแกไขขอผดพลาดหรอความบกพรองทเกดขนในการท าการทดลองและในรปเลมของปญหาพเศษจนถกตองสมบรณมากยงขน ขอขอบคณศนยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน และภาควชาโรคพชทเออเฟอในเรองของสถานทหองปฏบตการ เครองมอและอปกรณทางวทยาศาสตร สารเคม และโรงเรอนปลกพชทดลอง เพอการทดลองในครงน ขอขอบพระคณ คณพอคณแม ทใหการเลยงด สนบสนน และใหก าลงใจในดานการศกษาเปนอยางด และขอขอบคณพๆในหองปฏบตการทกคน โดยเฉพาะพมนทและพพจนทคอยใหค าแนะน าและใหการชวยเหลอเปนอยางด และทขาดไมได คอ ขอขอบคณทกก าลงใจจากพๆ เพอนๆ และนองๆทกคน ทสงผลใหการปฏบตงานในครงนส าเรจลลวงไปไดดวยด

วาสนา รงสวาง มนาคม 2551

สารบญ หนา

สารบญ -1- สารบญตาราง -2- สารบญภาพ -4- ค าน า 1 วตถประสงคและสถานทท าการทดลอง 2 การตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 6 ผลการทดลอง 12 วจารณผลการทดลอง 19 สรปผลการทดลอง 21 เอกสารอางอง 22 ภาคผนวก 23

สารบญตาราง ตารางท หนา

1 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว 15 เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน า ทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

2 เปรยบเทยบคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 405 15 นาโนเมตร ของพรกหลงการตรวจปรมาณเชอดวยเทคนค ELISA เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน า ทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

3 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว 16 เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลาย ฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

4 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว 17 เมอท าการฉดพนสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน า ทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

5 เปรยบเทยบคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 405 17 นาโนเมตร ของพรกหลงการตรวจปรมาณเชอดวยเทคนค ELISA เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน า ทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

สารบญตาราง (ตอ) ตารางท หนา

6 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว 18

เมอท าการฉดพนสารสกดใบบานเยนในตวท าละลาย ฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

สารบญภาพ ภาพผนวกท หนา

1 องคประกอบการเตรยมสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยน 26 ส าหรบฉดพนใหกบพชทดสอบ (ก) องคประกอบส าหรบ การปลกเชอโดยวธกล (ข)

2 ใบถวเขยวปกต (ก) และ ใบถวเขยวทไดรบการเขาท าลาย 27 จากเชอไวรส CMV จงแสดงอาการแผลจด(Local lesion) สน าตาลแดง

3 ลกษณะของพรกปกต (ก) และ ลกษณะของพรกทไดรบ 27 การเขาท าลายจากเชอไวรส CMV จงแสดงอาการ แพรกระจายทวทงตน (Systemic symptom) ไดแก อาการใบดางและใบบดเบยวเสยรป

ค าน า

เชอไวรสใบดางแตง(Cucumber mosaic virus) เปนสาเหตของโรคพชทส าคญ สามารถเขาท าลายพชไดหลายชนดและมพชอาศยเปนจ านวนมาก แนวทางในการควบคมและปองกนโรคพชทจะเกดจากเชอไวรสมดวยกนหลาย วธ มกจะใชหลายๆวธการรวมกนเพอการควบคม แตยงไมมวธการใดทสามารถควบคมและปองกนโรคพชทเกดจากเชอไวรสอยางไดอยางมประสทธภาพ ในปจจบนมรายงานการควบคมโรคพชทเกดจากเชอไวรสโดยการใชสารสกดจากพชหลายชนดทมคณสมบตในการยบยงเชอไวรส และมรายงานวาโปรตนบางชนดทพบทวไปในพชชนสงในวงศ Nyctaginaceae เชน เฟองฟาและบานเยน สามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสบางชนดได ดงนนงานวจยในครงนจงไดทดลองโดยอาศยแนวทางในการใชสารสกดจากพชมาท าการทดสอบกบเชอไวรสใบดางแตง(Cucumber mosaic virus) โดยใชสารสกดจากพช 2 ชนด ไดแก เฟองฟาและบานเยน เพอศกษาและเปรยบเทยบประสทธภาพของสารสกดจากใบเฟองฟาและใบบานเยน และเปรยบเทยบหาระดบความเขมขนของสารสกดทใหผลดทสดตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง

วตถประสงคในการทดลอง

1. ศกษาประสทธภาพของสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยนตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง

2. ศกษาระดบความเขมขนของสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยนทเหมาะสมตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง

3. ศกษาระดบความเขมขนและความเปนกรดดางของตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรทเหมาะสมในการท าสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยน

สถานทท าการทดลอง

1. เรอนปลกพชทดลอง ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

2. อาคารปฏบตการวจยเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร หองปฏบตการ A309

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาในการศกษาทดลอง

ระหวางเดอนมถนายน พ.ศ.2550 ถง เดอนธนวาคม พ.ศ.2550

ตรวจเอกสาร

เชอสาเหตโรค ไวรสใบดางแตง (Cucumber mosaic virus) หรอ CMV มรายงานวาพบครงแรกใน

แตงกวา (Cucumis sativus L.) ทประเทศสหรฐอเมรกา เมอป ค.ศ.1900 (Brunt et al.,1996) ปจจบนเปนไวรสทจดอยในตระกล Cucumovirus วงศ Bromoviridae (Roossinck,2002) มอนภาคเปนทรงกลมและมขนาดเสนผานศนยกลางประมาณ 30 นาโนเมตร (ธระ, 2532) ซงจากการรายงานของ ธระ (2532) กลาววาในประเทศไทยพบเชอไวรส CMV ตงแตป พ.ศ.2517 ซงเปนสาเหตโรคใบหงกของพรกทมการแพรระบาดและท าความเสยหายใหกบพรกทปลกในเขตตลงชนและเขตบางแค จ.กรงเทพมหานคร อ.ด าเนนสะดวกและ อ.โพธาราม จ.ราชบร ผลการศกษาอาการของพชทดสอบหลงไดรบเชอ CMV ใบพชจะแสดงอาการรอยแผลเฉพาะแหงและอาการแพรกระจายไปตามสวนตางๆของพช ซงอาการทเกดขนจะแตกตางกนตามชนดของพช โดยทเชอ CMV มพชอาศยกวางมาก จากการทดลองพช 46 ชนด ใน 13 วงศ พบวา CMV มพชอาศยถง 35 ชนด ใน 10 วงศ มเพยง 3 วงศเทานนทไมใชพชอาศย คอ พชในวงศ Cruciferae, Gramineae และ Convolvulaceae

เชอ CMV เปนไวรสทถายทอดดวยวธสมผสคอนขางมาก (ธระ, 2532) นอกจากจะสามารถถายทอดเชอไดโดยวธกลจากการสมผสแลว ยงถายทอดเชอผานเมลด (seed-transmission) มแมลงพาหะจ าพวกเพลยออนมากกวา 60 ชนด ความสมพนธของการถายทอดเชอไวรสกบแมลงพาหะเปนแบบ non-persistent ดงนน การควบคมโรคทเกดจากเชอไวรส CMV ท าไดหลายวธและตองอาศยหลายวธรวมกน (Gallitelli, 2000) ซงการควบคมโรคทสามารถด าเนนการไดโดยการดแลและก าจดพชทเปนโรคในแปลงปลกใหหมดไป การก าจดวชพชทเปนพชอาศยของไวรส (ธระ, 2532) และการควบคมทนยมปฏบตในปจจบน ไดแก การก าจดเพลยออนทเปนพาหะโดยการใชสารเคมหรอการใชวสดคลมดนและการดกจบดวยวธอน การใชพนธ พชตานทานตอเชอไวรสทไดจากการปรบปรงพนธพชโดยวธผสมพนธแบบธรรมดา หรอโดยการใชเทคนคทางพนธวศวกรรมสรางพชดดแปลงพนธกรรม ทมความตานทานตอเชอไวรสโดยใชชนสวนยนของไวรสเอง (Gallitelli, 2000) การควบคมเชอสาเหตโรคพชทเกดจากไวรสโดยวธการใชสารสกดจากพช จากการรายงานพบวามพชหลายชนดทมคณสมบตในการยบยงเชอไวรสพช คอ Pelargonium hortorum Chenopodium album Chenopodium amarnticolor Capsicum

frutescens Azaairachata indica Vitis vinifera และ Rose bankia (Allard, 1918) โดยกลมสารทออกฤทธในการยบยงเชอไวรส ไดแก Furocoumarins Alkaloids Terpenoids Lignins และโปรตนบางชนด โดยจากการศกษาของ Vivanco et al.(1999) พบวาโปรตนชนดหนงทมฤทธตานเชอไวรสคอ ribosome-inactivating proteins (RIPs) พบทวไปในพชตระกล Nyctaginaceae ซงเปนชนสง โดยมการศกษาพบวาใบและรากมสาร RIP type I ทมชอวา Mirabilis antiaviral protein (MAP) มน าหนกโมเลกล 24.2 kDa สาร MAP ทบรสทธแสดงผลยบยงการถายทอดเชอไวรส Tobacco mosaic virus (TMV) โดยวธกลในพชหลายชนด ไดแก ยาสบ มะเขอเทศ พรก และยบยงการถายทอดเชอไวรส cucumber green mottle mosaic virus ในแตง จากการศกษาปฏกรยาการตานไวรสและไวรอยดของสารสกดจากรากของ Mirabilis jalapa โดยการทดสอบกบเชอ potato virus X potato virus Y potato leaf roll virus และ potato spindle tuber viroid พบวา เมอฉดสารสกดจากรากพช M. jalapa กอนการปลกเชอเปนเวลา 24 ชวโมงสามารถยบยงการเขาท าลายไดเกอบ 100% โดยการทดลองกบพชทดสอบแลวตรวจนบแผลเฉพาะแหงทเกดขนและท าการไฮบรไดซเซชน พบวาการใชสาร MAP ทแยกใหบรสทธหรอการใชสารสกดหยาบใหผลในการยบยงเชอไดเชนเดยวกน (Vivanco et al.,1999)

และจากการศกษาของ ชมพณณ (2546) ใหผลการทดลองทสอดคลองกบผลการทดลองของ Vivanco et al.(1999) โดยพบวาสารสกดดวยน าของพชตระกล Nyctaginaceae ทใชในการทดสอบทง 2 ชนด ไดแก เฟองฟาและบานเยน แสดงปฏกรยาตานการเขาสพชของเชอไวรส Tobacco mosaic virus โดยสามารถลดจ านวนจดแผลไดมากกวา 50% พชทใชในการท าสารสกด

1. เฟองฟา (Bougainvillea spp.) จดเปนพชทอยในวงศ Nyctaginaceae มชอสามญวา Paper Flower และมชออนๆทเรยกกนวา ตรษจน หรอ ดอกกระดาษ เปนไมยนตนประเภทพมกงเลอยอายยนหลายสบป ขนาดตงแตพมเลกถงพมใหญ มหนามขนตามล าตนอยเหนอใบ ใบเปนใบเดยวแตกออกสลบกบกงหรอเยองกน มขนขนปกคลมเลกนอย มสเขยวหรอใบดาง รปรางรแหลมยาว 3-6 เซนตเมตร กวาง 2.5 เซนตเมตร. ใบประดบลกษณะคลายรปหวใจหรอรปไขม 3-5 ใบ มหลายส เชน มวง แดง ชมพ สม ฟา เหลองและอนๆ ผพบเหนทวไปมกเขาใจวาใบประดบคอดอก ดอกมทงดอกสมบรณเพศและไมสมบรณเพศ ออกเปนชอตามซอกใบหรอปลายกง แตละชอม 3 ดอกเปนหลอดยาว 1-2 เซนตเมตร ตดอยทเสนกลางใบของใบประดบ สวนใหญมกเขาใจวา

ดอกคอเกสรดอก ดอกเปนชนดไมมกลบดอก มกลบเลยง 5 กลบ มเกสรตวผ 5-10 อน การปลกเลยงในประเทศไทยมกจะเกดการกลายพนธ โดยเนอเยอบรเวณตามการเปลยนแปลงในระดบเซลท าใหสวนตางๆ เปลยนไป เชน สของใบประดบเปลยนไป กลายพนธ เปนใบประดบซอน กลายพนธ เปนใบดาง กลายพนธ เปนดอกกระจก เปนตน (ฐานขอมลพรรณไมทใชในงานภมสถาปตยกรรม, 2550) 2. บานเยน (Mirabilis jalapa L.) จดเปนพชทอยในวงศ Nyctaginaceae มชอสามญวา Four-o'clock Marvel of Peru False Jalap และมชออนๆทเรยกกนวา จนยาม จ ายาม ตามยาม ตตาเชา (จน) (นพพล, 2550) เปนไมลมลกอายหลายป มเงา สง 1-1.5 เมตร ล าตนมสแดง มนวลเลกนอย ใบรปไข หรอรปสามเหลยม มขนประปราย กวาง 2-9 เซนตเมตร ยาว 5-15 เซนตเมตร ปลายใบแหลม โคนตดหรอรปหวใจ กานใบยาว 1-4 เซนตเมตร กลบประดบรประฆง ตดทฐาน ยาว 1-1.5 เซนตเมตร ดอกเกอบไรกาน ม 4-5 ดอกในแตละชอ บานตอนบายๆ จนถงตอนเชา วงกลบสชมพ มวง ขาว เหลอง หรอดาง ยาวประมาณ 3-6 เซนตเมตร ปากกลบมเสนผานศนยกลางยาวประมาณ 2.5-3 เซนตเมตร เกศรเพศผ 5 อน ยนออกยาวประมาณ 1 เซนตเมตร กานเกสรสแดง อบเรณทรงกลม รงไขรปร กานเกศรเพศเมยยาวเทาๆ เกสรเพศผ สแดง ปลายเกสรเปนตม เปนพตนๆ ผลรปกลมร สด า ขนาดประมาณ ยาว 0.5-0.9 เซนตเมตร เปลอกบาง ม 5 สน เมลดกลม ขนาดประมาณ 0.7 เซนตเมตร บานเยนมถนก าเนดในประเทศเปร มเขตการกระจายพนธเฉพาะในทวปอเมรกาใต นยมปลกเปนไมประดบทวไป โดยเฉพาะดอกสชมพ บางครงขนเปนวชพช ทกสวนมสรรพคณเปนพชสมนไพรส าหรบแผลพพอง ฝ หนอง และมฤทธเปนยาถาย ดอกมกลนหอมฉน อาจท าใหมนเมาไดใชไลยงและแมลงได (สารานกรมพช, 2550) สวนทน ามาใชคอ ราก ใบ และหว ซงสรรพคณของราก คอ ม alkaloid trigonelline ซงมฤทธเปนยาถาย สรรพคณของใบ คอ ต าทาแกคนและพอกฝ สรรพคณของหว คอ รบประทานจะท าใหหนงชาอยคงกะพนเฆยนตไมแตก กลบท าใหรสกคนและเปนยาขบเหงอ แกไข ระงบความรอน (สรรพคณสมนไพร, 2550)

อปกรณและวธการทดลอง

1.อปกรณและสารเคม

1.1 เมลดพชทใชทดสอบการเพมปรมาณเชอ CMV จ านวน 2 ชนด จากศนยวจยพชผกเขตรอน ไดแก พรกพนธ CA 500 และถวเขยวพนธก าแพงแสน 2 (KPS 2)

1.2 กระถางพลาสตกนาดเสนผานศนยกลาง 6 นว จ านวน 20 กระถาง และถาดหลมพลาสตกขนาดเสนผานศนยกลาง 9 นว (6x4 หลม) จ านวน 10 ถาดหลม

1.3 พชส าหรบท าสารสกด ไดแก เฟองฟาและบานเยน 1.4 อปกรณและสารเคมส าหรบเตรยมท าสารสกดพช ไดแก ใบพชส าหรบท าสารสกด

ประกอบดวยเฟองฟาและบานเยน โถปนปนใบพช ผากรองสารสกด กระบอกตวงบกเกอร และเครองชง สวนสารเคมทใชคอน า RO ทผานการฆาเชอแลว

1.5 อปกรณและสารเคมส าหรบฉดพนสารสกดพช ไดแก กระบอกฉดพลาสตก (foggy) ถงมอแวนตา และสารเคมทใช ประกอบดวย สารสกดจากใบเฟองฟา สารสกดจากใบบานเยน และน า RO ทผานการฆาเชอแลว

1.6 เชอไวรส CMV(Cucumber mosaic virus) สายพนธก าแพงแสน(KPS 10) 1.7 อปกรณและสารเคมส าหรบการปลกเชอ CMV โดยการใชวธการทาน าคนพชทมเชอ CMV

ลงบนใบพช ไดแก เครองชง กระตกน าแขง กรรไกร บกเกอร โกรงและทบดตวอยางพช ผงคารบอรนดม 600 เมช และ 0.2 M Phosphate buffer pH 7.0

1.8 อปกรณและสารเคมส าหรบตรวจสอบปรมาณเชอไวรส CMV โดยวธ indirect ELISA ไดแก ELISA plate micropipette tip และเครองชง สารเคมทใชประกอบดวย Phosphate buffer saline(PBS)pH7.4 Carbonate coating buffer pH9.6 Washing buffer(PBST) antiserum CMV(monoclonal antibody) goat-antimouse IgG–AP conjugate

Substrate buffer pH 9.8 และ p-nitrophenyl phosphate(PNPP)

2.วธการทดลอง

2.1 การเตรยมตนกลาพชทดสอบ พรกพนธ CA 500 เพาะในกระถางขนาด 6 นว กระถางละประมาณ 20 เมลด เมอตน

กลาอาย 2 สปดาหยายกลาลงในถาดหลมขนาด 24 หลม จ านวน 6 ถาด เมอกลาพรกมอายประมาณ 1 เดอนหรอมใบจรง 1-2 ใบ จงน ามาท าการทดลอง สวนถวเขยวพนธก าแพงแสน 2 (KPS 2) ปลกในถาดหลมขนาด 24 หลม หลมละ 1 เมลด จ านวน 10 ถาดหลม เมออายได 4 วนหรอมใบเลยงคลออกอยางสมบรณแตยงไมมใบจรงเกดขน จงน ามาท าการทดลอง

2.2 การเตรยมสารสกดจากพช

2.2.1 สารสกดจากใบเฟองฟา โดยใชน าเปนตวท าละลาย น าใบเฟองฟามาลางดวยน าไหลผานเปนเวลา 10 นาท และแชในน าทผานการฆาเชอแลวเปนเวลา 5 นาท แลวน าขนจากน าทงไวครเพอใหสะเดดน า หลงจากนนใสใบเฟองฟาลงในโถปนพรอมกบน าทฆาเชอแลว ในอตราสวน 1:10 แลวปนดวยเครองปนจนใบพชละเอยด แลวน าน าทสกดออกมาไดกรองดวยผากรอง 2 ชนใสลงในบกเกอร โดยท าการกรองจ านวน 3 ครง จากนนแบงสารสกดทไดไปท าการเจอจางใหไดความเขมขนท 1:20 และ 1:50 โดยสารเคมทใชในการเจอจางสารสกดคอ น าทผานการฆาเชอแลวและน าไปใชในการทดลอง

2.2.2 สารสกดจากใบบานเยน โดยใชน าเปนตวท าละลาย น าใบบานเยนมาลางดวยน าไหลผานเปนเวลา 10 นาท และแชในน าทผานการฆาเชอแลวเปนเวลา 5 นาท แลวน าขนจากน าทงไวครเพอใหสะเดดน า หลงจากนน ใสใบบานเยนลงในโถปนพรอมกบน าทฆาเชอแลว ในอตราสวน 1:10 แลวปนดวยเครองปนจนใบพชละเอยด แลวน าน าทสกดออกมาไดกรองดวยผากรอง 2 ชนใสลงในบกเกอร โดยกรองเพยง 1 ครง จากนนแบงสารสกดทไดไปท าการเจอจางใหไดความเขมขนท 1:20 และ 1:50 โดยสารเคมทใชในการเจอจางสารสกดคอ น าทผานการฆาเชอแลวและน าไปใชในการทดลอง

2.2.3 สารสกดจากใบเฟองฟา โดยใชฟอสเฟตบฟเฟอรเปนตวท าละลาย น าใบเฟองฟามาลางดวยน าไหลผานเปนเวลา 10 นาท และแชในน าทผานการฆาเชอแลวเปนเวลา 5 นาท แลวน าขนจากน าทงไวครเพอใหสะเดดน า หลงจากนน ใสใบบานเยนลงในโถปนพรอมกบฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ ไดแก ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 6.8 ความเขมขน 0.2 M pH 6.8 ความเขมขน 1.0 M pH 6.8 ความเขมขน 0.04 M pH 7.0 ความเขมขน 0.2 M pH 7.0

และความเขมขน 1.0 M pH 7.0 โดยแยกปนใบเฟองฟากบฟอสเฟตบฟเฟอรในแตละระดบ และใชอตราสวนระหวางใบเฟองฟากบฟอสเฟตบฟเฟอรเทากบ 1:10 ปนดวยเครองปนจนใบเฟองฟาละเอยด แลวน าน าทสกดออกมาไดกรองดวยผากรอง 2 ชนใสลงในบกเกอร โดยท าการกรองจ านวน 3 ครง หลงจากนน บรรจใสภาชนะเตรยมพรอมส าหรบการฉดพนใหแกพชทดสอบ

2.2.4 สารสกดจากใบบานเยน โดยใชฟอสเฟตบฟเฟอรเปนตวท าละลาย น าใบบานเยนมาลางดวยน าไหลผานเปนเวลา 10 นาท และแชในน าทผานการฆาเชอแลวเปนเวลา 5 นาท แลวน าขนจากน าทงไวครเพอใหสะเดดน า หลงจากนน ใสใบบานเยนลงในโถปนพรอมกบฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ ไดแก ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 6.8 ความเขมขน 0.2 M pH 6.8 ความเขมขน 1.0 M pH 6.8 ความเขมขน 0.04 M pH 7.0 ความเขมขน 0.2 M pH 7.0 และความเขมขน 1.0 M pH 7.0 โดยแยกปนใบบานเยนกบฟอสเฟตบฟเฟอรในแตละระดบ และใชอตราสวนระหวางใบเฟองฟากบฟอสเฟตบฟเฟอร เทากบ 1:10 ปนดวยเครองปนจนใบบานเยนละเอยด แลวน าน าทสกดออกมาไดกรองดวยผากรอง 2 ชนใสลงในบกเกอร โดยท าการกรองจ านวน 1 ครง หลงจากนน บรรจใสภาชนะเตรยมพรอมส าหรบการฉดพนใหแกพชทดสอบ

2.3 การฉดพนสารสกดพช ฉดพนสารสกดจากใบเฟองฟาและใบบานเยนทใชน าเปนตวท าละลายบนพรกพนธ CA 500 และถวเขยว (KPS 2) โดยก าหนดให 1 ถาดหลม มพชทดสอบ 1 ชนดและมสารสกดพช 1 ชนด โดยประกอบดวย 5 กรรมวธ ดงตอไปน 1. ไมฉดพนสารสกด (Control) 2. ฉดพนน าแทนสารสกด 3. สารสกดทความเขมขน 1:10 4. สารสกดทความเขมขน 1:20 5. สารสกดทความเขมขน 1:50 หลงจากนนปลอยทงไวเปนเวลา 24 ชวโมง จงจะท าการปลกเชอ CMV ฉดพนสารสกดจากใบเฟองฟาและใบบานเยนทใชฟอสเฟตบฟเฟอรเปนตวท าละลายบนถวเขยว (KPS 2) โดยก าหนดใหใน 1 ถาดหลม ประกอบดวย 8 กรรมวธ ดงตอไปน 1. ไมฉดพนสารสกด (Control) 2. ฉดพนน าแทนสารสกด

3. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 6.8 4. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.2 M pH 6.8 5. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 1.0 M pH 6.8 6. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 7.0 7. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.2 M pH 7.0 8. สารสกดทระดบของฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 1.0 M pH 7.0 หลงจากนน ปลอยทงไวเปนเวลา 24 ชวโมง จงจะท าการปลกเชอ CMV ใหแกพชทดสอบ

2.4 การเตรยมเชอ CMV

ท าการปลกเชอสยาสบใบกลางเพอเพมปรมาณเชอ CMV เมอยาสบใบกลางแสดงอาการใบดางชดเจนน าไปตรวจสอบปรมาณเชอดวยเทคนค ELISA หลงจากนนจงน าไปใชในการท าน าคนใบพชส าหรบการปลกเชอ CMV

2.5 การปลกเชอ CMV ใหกบพชทดสอบ

พชทดสอบม 2 ชนด คอ พรกพนธ CA 500 และถวเขยวพนธก าแพงแสน 2 (KPS 2) เมอผานการฉดพนสารสกดบานเยนและเฟองฟาเปนเวลาครบ 24 ชวโมงแลว จงท าการปลกเชอ CMV โดยการทาน าคนใบพชทมเชอ CMV ลงบนใบพรกและถวเขยว ซงการเตรยมน าคนใบพช มดงน บดใบยาสบใบกลางกบฟอสเฟตบฟเฟอร pH 7.0 ในอตราสวน 1:10 ในโกรงทแชเยนแลวผสมผงคารบอรนดม หลงจากไดน าคนใบพชทมเชอ CMV แลวจงท าการโรยผงคารบอรนดมลงบนใบพรก และถวเขยว หลงจากนนทาน าคนใบพชลงบนใบพรกและถวเขยว ทกใบ ภายหลงการปลกเชอประมาณ 15-20 นาทจงลางใบพชดวยน าเปลา

2.6 การตรวจหาปรมาณโปรตนหอหมอนภาคของไวรส CMV ดวยเทคนค indirect ELISA

(indirect Enzyme – linked immunosorbent assay) สมเกบตวอยางใบพรกจากตนพรกทไดรบการปลกเชอ CMV ในแตละทรทเมนตจ านวน 2

ตน ตนละ 1-2 ใบ โดยเกบใบยอดและใบท 3 และ 5 ซงอยถดจากใบยอดรวมกนเปน 1 ตวอยางจาก 1 ตน โดยท าการเกบพรกเชนนท 60 ชวโมงหลงการปลกเชอ CMV น าตวอยางพรกมาตรวจวดปรมาณโปรตนของไวรสดวยเทคนค indirect ELISA โดยชงใบพรกในอตราสวน 1:10 กบ Coating buffer (0.2% sodiumdieca) ใสน าคนทเจอจางแลวปรมาตร 50 ไมโครลตรลงในหลม

ELISA microtitre plate หลมละ 1 ตวอยาง โดยมตวอยางพชทแสดงอาการของโรคใบดางแตง (Positive control) และตนพชปกต (Negative control) เปนตวอยางควบคม บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง หลงจากนน เทน าคนพชออกแลวลาง plate ดวย PBST จ านวน 3 ครงๆละ 5 นาท หลมละ 200 ไมโครลตร เตม antiserum ตออนภาคเชอ CMV (anti-CMV) ทเจอจางดวยอตรา 15 มลลกรมตอมลลลตร ใน 2% skim milk หลมละ 50 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เท antiserum ออกลาง plate ดวยPBST จ านวน 3 ครงๆละ 5 นาท หลมละ 200 ไมโครลตร เตม goat anti-mouse IgG – alkaline phosphatase conjugate (monoclonal antibodies) ทเจอจางดวยอตรา 1:5000 ใน PBST หลมละ 50 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เท goat anti-mouse IgG ออกลาง plate ดวยPBST จ านวน 3 ครงๆละ 5 นาท หลมละ 200 ไมโครลตร เตรยม substrate solution (p-nitrophenyl(PNPP) อตรา 0.01 กรมตอ 10 มลลลตรใน substrate buffer) ใสหลมละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภมหองในทมดเปนเวลา 30 และ 60 นาท ณ เวลาดงกลาวน ามาวดคาการดดกลนคลนแสง (Optical density ; OD.) ทความยาวคลน 405 นาโนเมตร ดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร คา OD. ทวดไดจะเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณของเชอ CMV 3.การบนทกผลการทดลอง

3.1 บนทกผลการทดลองของพชทดสอบแตละชนดดงน 3.1.1 บนทกผลการทดลองของถวเขยว โดยการนบจ านวนแผลจดทเกดขนบนใบของถวเขยวทกตน ซงจะท าการบนทกคาทเวลา 24 , 48 , 72 ชวโมง และ 7 วน ภายหลงการปลกเชอ CMV แลวน าขอมลมาวเคราะหคาสถตโดยใชโปรแกรม R-stat เพอเปรยบเทยบผลการทดลองทไดในแตละทรทเมนตและค านวณหาเปอรเซนตการยบยงจ านวนแผลจด

สตรการค านวณ เปอรเซนตการเขาท าลาย =

ประสทธภาพการยบยงการเขาท าลาย = 100 – เปอรเซนตการเขาท าลาย

จ านวนแผลจดบนใบถวเขยวทพนสารสกด X 100

จ านวนแผลจดบนใบถวเขยวทไมพนสารสกด

3.1.2 บนทกผลการทดลองของพรก โดยเกบตวอยางใบพรกท 60 ชงโมงภายหลงการปลกเชอ CMV มาตรวจสอบปรมาณเชอ CMV ดวยเทคนค indirect ELISA ซงแปลผลจากคาการดดกลนคลนแสง (Optical density ; OD) เปนปรมาณเชอโดยก าหนดให สองเทาของคาการดดกลนคลนแสงของหลม Negative control (ตนพชปกต) เปนตวอยางพรกทเกดโรค และสงเกตอาการของโรคดางเขยวโดยบนทกอาการท 3 สปดาหและ 6 สปดาหภายหลงการปลกเชอ CMV

ผลการทดลอง

1. ผลของสารสกดใบเฟองฟาตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง

1.1 โดยใชตวท าละลายน าในการสกดสาร 1.1.1 ทดสอบในถวเขยว

จากการทดลองโดยการฉดพนสารสกดจากใบเฟองฟาทระดบความเขมขนของสารสกดเทากบ 1:10 1:20 และ 1:50 ใหแกตนถวเขยวกอนท าการปลกเชอเปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากนนท าการบนทกผลการทดลองโดยการตรวจนบจ านวนแผลจด ทเวลา 24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง และ 7 วนหลงการปลกเชอ CMV พบวา ทเวลา 24 ชวโมงหลงการปลกเชอจะยงไมปรากฏแผลจดบนใบถวเขยว โดยจะพบแผลจดท 48 ชวโมง 72 ชวโมง และ 7 วนหลงการปลกเชอ ซงจ านวนแผลจดเฉลยบนใบถวเขยวทระดบความเขมขนของสารสกด 1:10 1:20 และ 1:50 ในแตละชวงเวลา ใหผลไปในแนวทางเดยวกน คอ ทระดบความเขมขน 1:10 มจ านวนแผลจดเฉลยนอยทสด โดยสามารถยบยงจ านวนแผลจดไดถง 90.13 เปอรเซนตเมอเปรยบเทยบกบกรรมวธทไมมการฉดพนสารสกด รองลงมาคอ ทระดบความเขมขน 1:20 และ 1:50 ในขณะทกรรมวธทไมฉดพนสารสกดพบจ านวนแผลจดเฉลยเทากบ 2.250 แผลจด (ตารางท 1) จากการน าขอมลของจ านวนแผลจดเฉลยไปวเคราะหขอมลทางสถต เพอเปรยบเทยบความแตกตางระหวางจ านวนแผลจดทเกดขนในแตละกรรมวธ พบวา กรรมวธทฉดพนดวยสารสกดจากใบเฟองฟาทระดบความเขมขน 1:10 แตกตางกนทางสถตอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเปรยบเทยบกบกรรมวธอนๆ (ตารางท 1) โดยมจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยวนอยทสด แสดงวาสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง (CMV) ไดดทสด

1.1.2 ทดสอบในพรก จากการทดลองโดยการใชสารสกดจากใบเฟองฟาทระดบความเขมขนของสารสกด

เทากบ 1:10 1:20 และ 1:50 ใหแกตนพรกกอนท าการปลกเชอ CMV เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากนน ท าการสมเกบตวอยางใบพรกในแตละกรรมวธ ภายหลงการปลกเชอเปนเวลา 60 ชวโมง มาท าการตรวจวดปรมาณเชอ CMV ดวยเทคนค indirect ELISA โดยวดคาการดดกลนคลนแสง (OD.) ท 405 นาโนเมตร แลวน าคาการดดกลนแสงทไดไปวเคราะหขอมลโดยการเปรยบเทยบความแตกตางของคาการดดกลนแสงในแตละกรรมวธ พบวา คาการดดกลนแสงของตวอยางทสมมาตรวจสอบในแตละกรรมวธไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 2)

1.2 โดยใชตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ ในการสกดสาร จากการทดลองใชฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบความเขมขนและระดบ pH แตกตางกนเปนตวท าละลายในการสกดสารจากใบเฟองฟาแลวน าไปฉดพนใหกบตนถวเขยว พบวา จ านวนแผลจดเฉลยทเกดขนบนใบถวเขยวในแตละกรรมวธใหผลทไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 3) ซงอาจเปนผลมาจากประสทธภาพในการปลกเชอ CMV ในครงนคอยขางต า โดยสงเกตไดจากการทมแผลจดเกดขนนอยมากหรอไมเกดขนเลยทงในกรรมวธทฉดพนดวยน า และเกดแผลจดเพยง 1-2 จดในกรรมวธควบคม 2. ผลของสารสกดใบบานเยนตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง

2.1 โดยใชตวท าละลายน าในการสกดสาร 2.1.1 ทดสอบในถวเขยว จากการทดลองโดยใชสารสกดจากใบบานเยนทระดบความเขมขนของสารสกดเทากบ

1:10 1:20 และ 1:50 ฉดพนใหแกตนถวเขยวกอนท าการปลกเชอเปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากนน ท าการบนทกผลการทดลองโดยการตรวจนบจ านวนแผลจดทเวลา 24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง และ 7 วน หลงการปลกเชอ CMV พบวา ท 24 ชวโมง หลงการปลกเชอจะยงไมพบแผลจดบนใบถวเขยว จะพบแผลจดท 48 ชวโมง 72 ชวโมง และ 7 วน หลงการปลกเชอ ซงพบจ านวนแผลจดเฉลยบนใบถวเขยวทระดบความเขมขนของสารสกดเทากบ 1 :10 1:20 และ 1:50 ในแตละชวงเวลาหลงการปลกเชอใหผลไปในแนวทางเดยวกน คอ ทระดบความเขมขน 1:10 มจ านวนแผลจดเฉลยนอยทสด โดยสามารถยบยงจ านวนแผลจดไดถง 45.47 เปอรเซนต รองลงมา คอ ทระดบความเขมขน 1:20 และ 1:50 ในขณะทกรรมวธทไมฉดพนสารสกดพบแผลจดเฉลยเทากบ 0.917 จด (ตารางท 4) จากการน าขอมลของจ านวนแผลจดเฉลยไปวเคราะหขอมลทางสถตเพอเปรยบเทยบความแตกตางระหวางจ านวนแผลจดทเกดขนในแตละกรรมวธ พบวา กรรมวธทฉดพนดวยสารสกดจากใบบานเยนทระดบความเขมขน 1:10 และ 1:20 แตกตางอยางไมมนยส าคญทางสถต (P>0.05) เมอเปรยบเทยบกบกรรมวธทไมไดฉดพนสารสกดในขณะทกรรมวธทฉดพนดวยสารสกดทระดบความเขมขน 1:50 ใหผลทแตกตางกนทางสถตอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเปรยบเทยบกบกรรมวธทไมฉดพนสารสกด (ตารางท 4) โดยใหคาเฉลยของจ านวนแผลจดมากกวา

2.1.2 ทดสอบในพรก จากการทดลองโดยการใชสารสกดจากใบบานเยนทระดบความเขมขนของสารสกดเทากบ 1:10, 1:20 และ 1:50 ใหแกตนพรกกอนท าการปลกเชอ CMV เปนเวลา 24 ชวโมง หลงจากนน ท าการสมเกบตวอยางใบพรกในแตละกรรมวธ ภายหลงการปลกเชอเปนเวลา 60 ชวโมง มาท าการตรวจวดปรมาณเชอ CMV ดวยเทคนค indirect ELISA โดยวดคาการดดกลนคลนแสง (OD.) ท 405 นาโนเมตร แลวน าคาการดดกลนแสงทไดไปวเคราะหขอมลโดยการเปรยบเทยบความแตกตางของคาการดดกลนแสงในแตละกรรมวธ พบวา คาการดดกลนแสงของตวอยางทสมมาตรวจสอบในแตละกรรมวธไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 5)

2.2 โดยใชตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ ในการสกดสาร จากการทดลองใชฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบ pH และ ความเขมขน แตกตางกนเปนตวท า

ละลายในการสกดสารจากใบบานเยนแลวน าไปฉดพนใหกบตนถวเขยว พบวา จ านวนแผลจดเฉลยทเกดขนบนใบถวเขยวในแตละกรรมวธใหผลทไมแตกตางกนทางสถต (ตารางท 6) ซงอาจเปนผลมาจากประสทธภาพในการปลกเชอ CMV ในครงนคอยขางต า โดยสงเกตไดจากการทมแผลจดเกดขนนอยมากหรอไมเกดขนเลยทงในกรรมวธทฉดพนดวยน า และเกดแผลจดเพยง 1-2 จดในกรรมวธควบคม

ตารางท 1 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน าทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus และแสดงเปอรเซนตการยบยงจ านวนแผลจดท 48 ชวโมง

กรรมวธในการทดลอง

จ านวนแผลจดเฉลยภายหลงการปลกเชอ เปอรเซนตการยบยงแผลจดท 48 ชวโมง 24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง 7 วน

ไมพนสารสกด 0.00 2.250 a 2.167 a 2.222 ab 0

ฉดพนน า 0.00 2.667 a 2.500 a 2.500 a -18.53

ทระดบ 1:10 0.00 0.222 b 0.417 b 0.750 b 90.13

ทระดบ 1:20 0.00 1.917 a 2.417 a 2.417 ab 14.80

ทระดบ 1:50 0.00 2.750 a 2.917 a 3.583 a -22.22

F-test - * * *

หมายเหต : * หมายถง คาเฉลยมความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมน 95% : คาเฉลยทตามหลงดวยอกษรทเหมอนกน ไมมความแตกตางกน เมอวเคราะหคาเฉลยทละคโดยวธของพชเชอร (lsd) ทระดบความเชอมน 95%

ตารางท 2 เปรยบเทยบคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร ของพรกหลงการ

ตรวจสอบปรมาณเชอดวยเทคนค ELISA เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน าทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

กรรมวธในการทดลอง คา OD. จากการท า indirect ELISA

ไมฉดพนสารสกด(Control) 0.674 ns ฉดพนน า 0.494 ns

ฉดพนสารสกดทระดบ 1:10 0.588 ns ฉดพนสารสกดทระดบ 1:20 0.596 ns ฉดพนสารสกดทระดบ 1:50 0.359 ns

หมายเหต : ns หมายถง แตกตางกนอยางไมมนยส าคญทางสถต

ตารางท 3 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว เมอท าการฉดพนสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

กรรมวธในการทดลอง จ านวนแผลจดเฉลยภายหลงการปลกเชอ

24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง 7 วน ไมฉดพนสารสกด(Control) 0.000 0.083 ns 0.167 ns 0.000 ns

ฉดพนน า 0.000 0.000 ns 0.083 ns 0.000 ns 0.04 M pH 6.8 0.000 0.167 ns 0.167 ns 0.194ns 0.2 M pH 6.8 0.000 0.000 ns 0.083 ns 0.000 ns 1.0 M pH 6.8 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.083 ns 0.04 M pH 7.0 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns 0.2 M pH 7.0 0.000 0.167 ns 0.167 ns 0.000 ns 1.0 M pH 7.0 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns หมายเหต : ns หมายถง แตกตางกนอยางไมมนยส าคญทางสถต

ตารางท 4 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว เมอท าการฉดพนสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน าทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus และแสดงเปอรเซนตการยบยงจ านวนแผลจดท 48 ชวโมง

กรรมวธในการทดลอง

จ านวนแผลจดเฉลยภายหลงการปลกเชอ เปอรเซนตการยบยงแผลจดท 48 ชวโมง 24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง 7 วน

ไมพนสารสกด 0.00 0.917 b 1.000 ns 1.000 b 0

ฉดพนน า 0.00 1.083 ab 1.083 ns 1.500 ab -18.10

ทระดบ 1:10 0.00 0.500 b 0.750 ns 0.833 b 45.47

ทระดบ 1:20 0.00 1.167 ab 1.417 ns 1.417 ab -27.26

ทระดบ 1:50 0.00 1.917 a 2.000 ns 2.333 a -9.05

F-test - * * *

หมายเหต : * หมายถง คาเฉลยมความแตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมน 95% : คาเฉลยทตามหลงดวยอกษรทเหมอนกน ไมมความแตกตางกน เมอวเคราะหคาเฉลยทละคโดยวธของพชเชอร (lsd) ทระดบความเชอมน 95% : ns หมายถง แตกตางกนอยางไมมนยส าคญทางสถต

ตารางท 5 เปรยบเทยบคาการดดกลนคลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร ของพรกหลงการ

ตรวจสอบปรมาณเชอดวยเทคนค ELISA เมอท าการฉดพนสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน าทระดบความเขมขนตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

กรรมวธในการทดลอง คา OD. จากการท า indirect ELISA

ไมฉดพนสารสกด(Control) 0.633 ns ฉดพนน า 0.639 ns

ฉดพนสารสกดทระดบ 1:10 0.541 ns ฉดพนสารสกดทระดบ 1:20 1.028 ns ฉดพนสารสกดทระดบ 1:50 0.441 ns

หมายเหต : ns หมายถง แตกตางกนอยางไมมนยส าคญทางสถต

ตารางท 6 เปรยบเทยบจ านวนแผลจดเฉลยทปรากฏบนใบถวเขยว เมอท าการฉดพนสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรทระดบตางๆ กอนการปลกเชอ Cucumber mosaic virus

กรรมวธในการทดลอง จ านวนแผลจดเฉลยภายหลงการปลกเชอ

24 ชวโมง 48 ชวโมง 72 ชวโมง 7 วน ไมฉดพนสารสกด(Control) 0.000 0.083 ns 0.167 ns 0.167 ns

ฉดพนน า 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns 0.04 M pH 6.8 0.000 0.083 ns 0.083 ns 0.083 ns 0.2 M pH 6.8 0.000 0.000 ns 0.083 ns 0.083 ns 1.0 M pH 6.8 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns 0.04 M pH 7.0 0.000 0.167 ns 0.167 ns 0.167 ns 0.2 M pH 7.0 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns 1.0 M pH 7.0 0.000 0.000 ns 0.000 ns 0.000 ns หมายเหต : ns หมายถง แตกตางกนอยางไมมนยส าคญทางสถต

วจารณผลการทดลอง

จากการทดลองในครงน พบวา สารสกดจากใบพชในวงศ Nyctaginaceae ไดแก เฟองฟาและบานเยนในตวท าละลายน า มประสทธภาพยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตง(Cucumber mosaic virus) หรอเชอไวรส CMV ได โดยสามารถลดจ านวนแผลจดในถวเขยวได แตไมสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรส CMV ในพรก ทแสดงอาการแบบแพรกระจายได ซงสอดคลองกบการศกษาของ ชมพณณ (2546) ทกลาวไววา สารสกดดวยน าของพชวงศ Nyctaginaceae ททดสอบ 2 ชนด ไดแก เฟองฟาและบานเยน แสดงปฏกรยาตานการเขาสพชของเชอไวรส Tobacco mosaic virus(TMV) โดยสามารถลดจ านวนแผลจดในคโนโปเดยมไดมากกวา 50 เปอรเซนต แสดงใหเหนศกยภาพในการน าไปใชควบคมเชอไวรสสาเหตโรคพชได โดยเฉพาะสารสกดเฟองฟา ซงสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสไดดกวาสารสกดจากบานเยน แตในการทดลองกบยาสบทแสดงอาการแบบแพรกระจาย ไดแก อาการดาง พบวา ยาสบยงคงแสดงอาการดางถง 90 เปอรเซนต ดงนน สารสกดใบเฟองฟาและสารสกดใบบานเยนจงยงไมสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสได ซงในสวนนอาจเปนขอจ ากดทนาสนใจและน าไปศกษาทดลองในขนตอไป เพอใหทราบถงกลไกการยบยงเชอไวรส หากตองการจะน าสารสกดเหลานไปประยกตใชใหเกดประโยชนอยางแทจรง น าจดเปนตวท าละลายทด หางายและราคาถก แตโปรตนบางชนดกไมสามารถละลายไดในน าหรออาจจะละลายไดยาก ดงนน การเปลยนตวท าละลายจากน าเปนฟอสเฟตบฟเฟอร ซงเปนสารทนยมใชเปนตวท าละลายในการสกดพชในหองปฏบตการ เนองจากมสภาพทเหมาะสมตอการละลายของโปรตนมากกวาอาจจะสงผลใหสารสกดใบเฟองฟาและสารสกดใบบานเยนมประสทธภาพในการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสไดดยงขน หากโปรตนทมประสทธภาพในการยบยงไวรสสามารถละลายในตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรไดดกวาในตวท าละลายน าและบฟเฟอรอาจชวยรกษาสภาพของโปรตนทสกดออกมาได แตผลทไดจากในการทดลองครงนไมสามารถบอกไดวาสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยนในตวท าละลายฟอสเฟตบฟเฟอรมประสทธภาพในการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสไดดกวาสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยนในตวท าละลายน าหรอไม เนองจากประสทธภาพการปลกเชอในการทดลองนคอนขางต า โดยสงเกตจากจ านวนตนทเกดจดแผลและจ านวนจดแผลทเกดขนเพยงเลกนอยในกรรมวธควบคม อยางไรกตาม จากการทดสอบในถวเขยว เหนไดอยางชดเจนวาทเวลา 24 ชวโมงหลงการปลกเชอ จะยงไมปรากฏแผลจดบนใบถวเขยว โดยแผลจดจะเรมปรากฏทเวลา 48 ชวโมงหลงการปลกเชอ

สวนทเวลา 72 ชวโมงและ 7 วนหลงการปลกเชอ สวนใหญแลวพบวามจ านวนแผลจดปรากฏเพมขน แตมบางสวนทพบจ านวนแผลจดลดลง อาจเนองมาจากประสทธภาพในการปลกเชอในแตละกรรมวธทยงไมสม าเสมอ และสงเกตพบวาจดแผลบางจดจะเรมสซดจางลงจนสงเกตจดแผลไดไมชดเจนหลงการปลกเชอทเวลา 72 ชวโมง ดงนน จงสงผลใหเกดความผดพลาดในการบนทกและวเคราะหผลการทดลอง ดงนน การลดลงของจ านวนแผลจดจงไมนาจะเกดขนจากผลของสารสกดพช ในการทดลองครงตอไปจงควรเพมจ านวนพชทดสอบและจ านวนซ าในการทดลองใหมากขน เพอลดความผดพลาดในกรณทกลาวไวขางตน และชวงเวลาทเหมาะสมทจะสงเกตอาการและบนทกผลการทดลองเมอท าการทดสอบในถวเขยว คอทเวลา 48 และ 72 ชวโมงหลงการปลกเชอ ซงสอดคลองกบขอมลทกลาววา เชอไวรสใบดางแตงจะสงผลใหถวเขยวแสดงอาการแผลจดกลมสน าตาลแดง และมเสนผานศนยกลางประมาณ 1-1.5 มลลเมตร หลงการปลกเชอประมาณ 3 วน (ธระ, 2532)

สรปผลการทดลอง

สารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน าสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตงในถวเขยวได โดยทระดบความเขมขน 1:10 สามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไดดทสด ซงสามารถลดจ านวนจดแผลได 90.13 เปอรเซนต แตสารสกดใบเฟองฟาในตวท าละลายน าไมสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตงในพรกได เชนเดยวกนกบสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน าสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตงในถวเขยวได โดยทระดบความเขมขน 1:10 สามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไดดทสด ซงสามารถลดจ านวนจดแผลได 45.47 เปอรเซนต และสารสกดใบบานเยนในตวท าละลายน าไมสามารถยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางแตงในพรกได

เอกสารอางอง

ชมพณณ นาคศร. 2546. ผลของสารสกดพชบางชนดตอการยบยงการเขาท าลายของเชอไวรสใบดางยาสบ. ปญหาพเศษปรญญาตร. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, นครปฐม.

ฐานขอมลพรรณไมทใชในงานภมสถาปตยกรรม. ทมา : 158.108.89.200/agbbc/Plant%20for%20Landscape%20WebSite/Webpage/Vines/เฟองฟา.html, 14 พฤศจกายน 2550

ธระ สตะบตร. 2532. โรคไวรสและโรคคลายไวรสของพชส าคญในประเทศไทย. ภาควชาโรคพช คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพมหานคร. 310 น.

นพพล เกตประสาท. งานเรอนปลกพชทดลอง ฝายปฏบตการวจยและเรอนปลกพชทดลอง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จ.นครปฐม. ทมา : http://clgc.rdi.ku.ac.th/resource/fragrant/four_o_clock/mirabilis.html, 14 พฤศจกายน 2550

สรรพคณสมนไพร. ทมา : http://www.plantgenetic-rspg.org/herbs/herbs_05_5.htm, 14 พฤศจกายน 2550 สารานกรมพช. ทมา : www.dnp.go.th/Botany/Web_Dict/detail.aspx?words=

บานเยน&typeword=group, 14 พฤศจกายน 2550 Brunt, A.A., K. Crabtree, M.J. Dallwitz, A.J. Gibbs and L. Watson. 1996. Viruses of

Plants. UK at the University Press, Cambridge. Clark, M.F. and A.N. Adam. 1977. Charateristics of the microplasts method of Enzyme-

Linked Immunosorbent Assay of the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 : 475 – 483.

Gillitelli, D. 2000. The ecology of cucumber mosaic virus and sustainable agriculture. Virus Research 71 : 9 – 21.

Roossinek, M.J. 2002. Evolution history of cucumber mosaic virus deduced by phylogenetic analyses. J. Virology 76 : 3382 – 3387.

Vivanco, J.M., Querci, M. and Salazar, L.F. 1999. Antiviral and antiviroid activity of MAP containing extracts from Mirabilis jalapa roots. Plant Dis. 83 : 1116 – 1121.

ภาคผนวก

การเตรยมสารเคม 1. การเตรยมบฟเฟอรทใชปลกเชอไวรส CMV ลงพชทดสอบ ใช 0. 2 M phosphate buffer pH 7.0 เตรยมสารละลาย 0.2 M monobasic sodium phosphate (NaH2PO4.2H2O) 31.2 กรม ในน ากลน 1,000 มลลลตร จากนนละลาย 0.2 M dibasic sodium phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O) 53.63 กรม หรอ 71.7 กรม ตามล าดบ ในน ากลน 1,000 มลลลตร น าสารละลาย 0.2 M monobasic sodium phosphate ปรมาตร 39.0 มลลลตร ผสมกบ 0.2 M dibasic sodium phosphate ปรมาตร 61.0 มลลลตร 2. การเตรยมบฟเฟอรชนดตางๆ ทใชในการตรวจสอบดวยเทคนค indirect ELISA (Clark and Adam, 1977) 2.1 Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 NaCl 8.0 กรม Na2HPO4 . 12H2O 2.9 กรม KH2PO4 0.2 กรม KCl 0.2 กรม ปรบ pH จนได 7.4 แลวจงปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 มลลลตร 2.2 Carbonate coating buffer pH 9.6 NaHCO3 2.93 กรม Na2CO3 1.59 กรม ละลายในน ากลน 800 มลลลตร ปรบ pH จนได 9.6 แลวจงปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 มลลลตร

2.3 Washing buffer (PBST) PBS 100 มลลลตร Tween-20 0.5 มลลลตร นยมเตรยมทความเขมขน 10X PBST และ autoclave กอนน าไปเกบไวท

4 องศาเซลเซยส 2.4 Substrate buffer pH 9.8

Diethanolamine 97 มลลลตร

Sodium azide 0.2 กรม MgCl2 . 6H2O 0.1 กรม น ากลน 800 มลลลตร ปรบ pH จนได 9.8 แลวจงปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 มลลลตร

เกบแชเยนท 4 องศาเซลเซยสในทมด 3. การเตรยมฟอสเฟตบฟเฟอรท pH และระดบความเขมขนตางๆส าหรบใชเปนตวท าละลายเพอเตรยมสารสกดส าหรบการทดสอบ เตรยมโดยการเจอจาง stock สารของ 1.0 M monobasic sodium phosphate (NaH2PO4.2H2O) และ dibasic sodium phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O) ใหเปน 0.2 M และ 0.04 M หลงจากนนกน า stock สารของ 1.0 M monobasic sodium phosphate (NaH2PO4.2H2O) และ dibasic sodium phosphate (Na2HPO4.7H2O หรอ Na2HPO4.12H2O) ทระดบความเขมขนเดยวกนมาตวงแลวเทผสมกนเพอใหไดระดบ pH ทตองการ จะน าไปทดสอบ ซงจะไดฟอสเฟตบฟเฟอรทพรอมจะน าไปเปนตวท าละลายทง 6 ระดบดงน

- ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 6.8 - ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.2 M pH 6.8 - ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 1.0 M pH 6.8 - ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.04 M pH 7.0 - ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 0.2 M pH 7.0 - ฟอสเฟตบฟเฟอรความเขมขน 1.0 M pH 7.0

ภาพท 1 องคประกอบการเตรยมสารสกดใบเฟองฟาและใบบานเยน ส าหรบฉดพนใหกบ

พชทดสอบ (ก) องคประกอบส าหรบการปลกเชอโดยวธกล (ข)

(ก)

(ก)

(ข)

ภาพท 2 ใบถวเขยวปกต (ก) และ ใบถวเขยวทไดรบการเขาท าลายจากเชอไวรส CMV จง

แสดงอาการแผลจด(Local lesion) สน าตาลแดง ภาพท 3 ลกษณะของพรกปกต (ก) และ ลกษณะของพรกทไดรบการเขาท าลายจากเชอ

ไวรส CMV จงแสดงอาการแพรกระจายทวทงตน (Systemic symptom) ไดแก อาการใบดางและใบบดเบยวเสยรป

(ก) (ข)

(ก) (ข)