BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICASFacultad Lic. en Químico Farmacobiólogo

BIOQUIMICA II

PRACTICA 1:

“DETERMINACION DE LA ACTIVIDADENZIMATICA DE LA ENZIMA SUCCINATO

DESHIDROGENASA”

Conceptos Metodologia¿ES POSIBLE OBSERVAR LA ACTIVIDAD

DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA MEDIANTE 

UNA REACCION COLORIMETRICA?

• ENZIMAS

• FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LASREACCIONES ENZIMATICAS

• CICLO DE KREBS.

• ETAPA DE LA OXIDACION DEL SUCCINATO EN EL CICLO DE KREBS.

• HIGADO.

• MATERIAL • DESARRROLLO

EXPERIMENTAL

• OBSERVACIONES

• DISCUSION DE RESULTADOS 

• CONCLUSION

ENZIMAS • Las enzimas son catalizadores muy potente y eficaces, quimicamente son

proteínas.

• Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

• La característica más sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos

EPECIFICIDAD DE SUSTRATO:El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica.  ESPECIFICIDAD DE ACCION: Cada reacción está catalizada por un enzima en específico.

• La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

• El sustrato se une al enzima a través de numerosas interacciones débiles como son: puentes de hidrógeno, electrostáticos, hidrófobos, etc. En un lugar específico, el centro activo. Este centro es una pequeña porción del enzima, constituido por una serie de aminoácidos que interaccionan con el sustrato.

1. Algunas enzimas actúan con la ayuda de estructuras no proteicas. En función de su naturaleza se denominan:

1. Cofactor. Cuando se trata de iones o moléculas inorgánicas. • Coenzima. Cuando es una molécula orgánica. Aquí se puede

señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde más bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la vitamina es la coenzima.

• El conjunto de enzima + cofactor o coenzima se denomina holoenzima, mientras que la parte proteica propiamente dicha se conoce como apoenzima. 

• Las enzimas tienen una estructura tridimensional sin la que no pueden desarrollar su actividad. 

• Las enzimas son esenciales para la vida ya que, de otra forma, las reaccioneS en las  células se darían con poca rapidez. Una mala función en una enzima, provocada poR una sobre producción o subproducción, mutación etc. , puede provocar enfermedades como la fenilcetonuria.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACIONES ENZIMATICAS.

• Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta cierta temperatura óptima, ya que después de aproximadamente 450 C se comienza a producir la desnaturalización térmica. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una temperatura óptima de 370 C.

• pH: El pH no afecta la actividad enzimática directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la reacción como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la velocidad de la reacción.

CICLO DE KREBSEl ciclo de Krebs es una serie de reacciones químicas de gran

importancia, que forman parte de la respiración celular en todas las células aerobias, es decir que utilizan oxígeno. En organismos

aeróbicos el ciclo de Krebs es parte de la vía catabólica que realiza la oxidación de hidratos de carbono, ácidos grasos y aminoácidos hasta

producir CO2 y agua, liberando energía en forma utilizable (poder reductor y ATP). El metabolismo oxidativo de hidratos de carbono, grasas y proteínas frecuentemente se divide en tres etapas, de las cuales el ciclo de Krebs supone la segunda. En la primera etapa los carbonos de estas macromoléculas dan lugar a moléculas de acetil-

CoA de dos carbonos, e incluye las vías catabólicas de aminoácidos, la beta oxidación de ácidos grasos y la glucolisis. La tercera etapa es la fosforilación oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2)

generado se emplea para la síntesis de ATP según la teoría del acomplamiento quimiosmótico.

El ciclo de Krebs también proporciona precursores para muchas biomoléculas tales como ciertos aminoácidos. Por ello se considera una vía anfibólica, es decir, catabólica y anabólica al mismo tiempo.

 

ETAPA DE LA OXIDACION DEL SUCCINATO EN EL CICLO DE KREBS.

Esta etapa es catalizada por la enzima "Succinato deshidrogenasa", una oxidoreductasa que utiliza FAD como coenzima. El FAD es de mayor poder oxidante que el NAD+, y es utilizado en esta clase de proceso oxidativo, donde es necesario producir una insaturación en una cadena hidrocarbonada. Es posible producir la insaturación entre los carbonos a y b, debido a que los grupos carboxilo contiguos a éstos, debilitan los enlaces C-H.• Tipo de reacción: Oxidación: Deshidrogenación• Enzima: Succinato deshidrogenasa. Esta enzima utiliza FAD como

coenzima. • Sustrato: Succinato • Producto: Fumarato • ðG° = 0.0 kcal/mol

Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna.

El H2O cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.

La enzima succinato deshidrogenasa es una flavoproteína que participa en el ciclo de Krebs y al ser una proteína integral de membrana mitocondrial interna se considera que forma parte de la cadena respiratoria como complejo II. 

La succinato deshidrogenasa cataliza estereoespecíficamente la deshidrogenación en trans del ácido succínico hasta ácido fumárico y contiene a FAD como grupo prostético pero el verdadero aceptor de electrones en la reacción es la ubiquinona QH2. Esta enzima se inhibe por malonato y maleato, que son análogos estructurales del succinato.

HIGADO

Para realizar sus funciones, el hígado cuenta con una gran cantidad de enzimas con funciones oxidativas y reductivas,

entre las cuales se encuentran el sistema del citocromo de la proteína 450 (P-450), flavin-monooxigenasas, peroxidasas, hidroxilasas, esterasas, y amidasas. Otras enzimas también presentes son las glucuroniltranferasas, las sulfotranferasas, metilasas, acetoltransferasas, tioltransferasas. Todas estas

enzimas tienen gran importancia en las biotransformaciones de los tóxicos.

¿ES POSIBLE OBSERVAR LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA

MEDIANTE UNA REACCION 

COLORIMETRICA?

MATERIAL2 tubos de ensaye

Se utilizaron para colocar las muestras.

2 pipetas de 5 ml.

Útiles para medir los volúmenes exactos de los reactivos a utilizar

Baño maría a 50 ºC

Proporcionó la fuente de calor para que se llevasen a cabo las reacciones de las muestras colocadas en

los tubos de ensaye.

Pinzas para tubo de ensaye

Instrumentos utilizados para sostener los tubos de ensaye dentro del baño María

1 mortero con pistilo

Se recurrió a éste para moler la muestra de hígado de rata hasta formar una masa.

1 perilla Facilito el pipeteo de los volúmenes de reactivos utilizados.

1 balanza 

Útil para pesar la muestra (hígado de rata)

1 termómetro Para mantener la temperatura del baño María da 50ºC.

DESARROLLO EXPERIMENTAL1.Pesar 1 g de hígado de una rata recientemente sacrificada.

• En el mortero molerlo con 3 o 4 ml de de ácido succínico hasta obtener una masa.

• Transferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir según la siguiente tabla:

REACTIVOS TUBO 1 TUBO 2

FENOL AL 90% 1.O ML -------

AZUL DE METILENO  2.0 gotas 2.0 gotas

MEZCLAR  MEZCLAR

ACEITE MINERAL O.5 ML 0.5ML

• Incube ambos tubos 10 minutos en baño María a 50 ºC.

• Observar los cambios.

OBSERVACIONES

DISCUSION DE RESULTADOS

La oxidación es una reacción química un metal o un no metal cede electrones. La reacción de química opuesta a la oxidación se le conoce como reducción es decir cuando una especie química acepta electrones estas 2 reacciones siempre se dan juntas es decir cuando una sustancia se oxida la otra se reduce. Una cede electrones y la otra los acepta.

Según los resultados obtenidos de las observaciones realizadas tenemos que:

Tubo 1: No camio de colorTubo 2: Se presento cambio de color (azul-verde a incoloro).

CONCLUSIONSe puede concluir que el objetivo de la práctica se cumplió satisfactoriamente, ya que fue posible apreciar la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reacción calorimétrica en una muestra de hígado de rata. Esta resolución solo pudo ser posible con ayuda del colorante azul de metileno, el cuál tiene la característica de dar el vire de color verde en forma oxidada e incoloro en su forma reducida. Esta apreciación da como señal la actividad de la enzima SDH al formar parte de la cadena de transporte electrónico.

Cuestionario 1.       ¿Cuáles Son los colores del azul de metileno en sus estados oxidados y reducidos?OXIDADO – verde azuladoREDUCIDO – incoloro

Enzima-FADH2 + azul de metileno oxidado   Enzima-FAD + azul de metileno reducido(azul)                                                                         (incoloro) 2.       ¿Cuál es la función del fenol en la reacción?El fenol ayuda a la oxidación del azul de metileno ya que el fenol interviene en la reacción que se llevo a cabo en el  tubo 2 entre el azul de metileno y el FADH2 .En el tubo 2 se obtuvo el colorante reducido porque acepto los electrones que transporta el FADH2 mientras que en el tubo 1 el aceptor de electrones fue el fenol lo que provocó que el colorante permaneciera en su estado oxidado. 3.       ¿En qué vía metabólica esta involucrada la enzima succinato deshidrogenasa?La succínato deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, malato, oxalacético y oxálico, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de succinato.El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se re-oxida la coenzima FAD. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se re-oxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.Siendo la fosforilación oxidativa el centro de nuestro estudio dado que posee procesos calificados como cadena respiratoria, donde el ATP se genera por consecuencia del flujo de electrones a través de transportadores y componentes como el NAD y FAD DESHIDROGENASA, UBIQUINONA y CITOCROMO, estos compuestos se organizan en la membrana interna de la mitocondria de forma específica para asegurar el funcionamiento y las propiedades redox de los componentes, siendo la mitocondria la fuente de poder más importante de las células animales . Entonces para formar ATP dentro de la cadena respiratoria de las mitocondrias, se producen una serie de transferencias de electrones por reducción y oxidación de los componentes de la cadena, tratados de resumir en pequeños complejos mas entendibles, comenzando por la donación de electrones desde el NADH a la UBIQUINONA, catalizado por la Ubiquinona reductasa ( complejo I ). También se transfieren electrones desde el Succinato a la Ubiquinona (complejo II) nombrándose a este complejo Succinato-reductasa ó Succinato Deshidrogenasa, que ayuda a catalizar la oxidación del Succinato. Es importante mencionar que la transferencia de 2 electrones desde el Succinato a la Ubiquinona comprende un grupo proteico FAD y centro Fe-S. Estos pasos del nombrado complejo II también libera ATP pero en poca cantidad. Los electrones se pasan del complejo II al III formado por los citocromos. Como forma global se tiene que la transferencia de electrones desde el Succinato a O2 por la cadena y sus transportadores da como resultado ATP, que son 2 moléculas y no 3, que se obtienen del NADH al O2. Por esta razón se utiliza el A.M que cuando se oxida por el O2 da un tono azul, pero este puede ser reducido de nuevo por el Succinato, ya que el A.M es mediador entre electrones, protones, O2 y sustrato que se oxida (Succinato). El A.M reducido es incoloro, mostrando la dinámica de reducción. Por otra parte con la Succínico deshidrogenasa se emplea un aceptor artificial de hidrógenos que es la P.F.D. (Parafenilendiamina) con la cual se ve la cadena respiratoria en su etapa final pues esta se oxida en presencia del alfa - naftol quedando de un color azul llamado azul de indofenol. Así la P.F.D. es dadora de electrones para la siguiente etapa y el A.M aceptor. En resumen es una cadena transportadora de electrones que oxida al sustrato y transfiere electrones por la cadena ligada a la traslocación de protones, formando en la membrana mitocondrial interna un almacén de energía.