ESPECTROSCOPÍA LUMINISCENTE:

Existen tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí llamados:fluorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos,las moléculas de analíto se excitan para dar una especie cuyo espectro deemisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo

Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentesmoleculares.

La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitación se consiguemediante la absorción de fotones. Como consecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenómenos con el término más general de fotoluminiscencia.

La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las transicioneselectrónicas responsables de la fluorescencia no conllevan un cambio en el espíndel electrón. Como consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por uncambio en el espín del electrón, que hace que la radiación se mantenga duranteun tiempo fácilmente detectable, después de haber acabado la irradiación – amenudo varios segundos después o más. En la mayoría de los casos, la emisiónfotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es demayor longitud de onda que la radiación utilizada para su excitación.

Uno de los aspectos más atractivos de la luminiscencia es su inherente sensibilidad, con límites de detección que suelen ser de uno a tres órdenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopia de absorción. Los límites de detección características son del orden de partes por billón.

Debido a su alta sensibilidad, los métodos luminiscencia cuantitativos suelen sufrir serios efectos de interferencia procedentes de la matriz de la muestra.Por esta razón las medidas luminiscentes se suelen combinar con lasextraordinarias técnicas de cromatografía y electroforesis.

En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de absorción en los analitos cuantitativos debido a que el número de especies que absorben radiación ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del espectro.

Teoría de la Fluorescencia y de la FosforescenciaLa fluorescencia tiene lugar en sistemas gaseosos, líquidos y sólidos, tantosencillos como complejos.

El tipo más sencillo de fluorescencia es el que presentan los vapores atómicosdiluidos. Por ejemplo:Los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados alestado 3p mediante la absorción de radiación de longitudes de onda de 5 896 a5 890 Å.

Después de 10-8 a 10-5 s, los electrones vuelven al estado fundamental emitiendoradiación de estas mismas longitudes de onda en todas las direcciones.

Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sincambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescenciade resonancia.

Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere unarevisión del spín del electrón y de los estados excitados singulete / triplete.

- Espín del electrón:El principio de exclusión de Pauli establece que en un átomo no puede haberdos electrones con los cuatro números cuánticos iguales. Esta restricciónrequiere que no haya más de dos electrones en un orbital, y además, los dos deben tener los estados de espín opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que los espines están apareados. Debido al apareamiento de espines, la mayoría de las moléculas no presentan un campo magnético neto y se dice, por tanto, que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos permanentes.Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desapareados, tienen un momento magnético y, consecuentemente, son atraídos cuando se encuentran en un campo magnético; por ello, se dice que los radicales libres son paramagnéticos

- Estados excitados singulete/tripleteUn estado electrónico molecular en el cual todos los espines de los electronesestán apareados se llama singulete y cuando la molécula se expone a uncampo magnético no se produce un desdoblamiento de niveles de energía.Por otro lado, el estado fundamental para un radical libre, es un estado doblete, porque el electrón impar puede tomar dos orientaciones en un campo magnético, lo que comunica ligeras diferencias de energía al sistema. Cuando uno de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía superior, se forma un estado singulete o triplete. En el estado singulete excitado, el espín del electrón promocionado continua apareado con el electrón del estado fundamental; sin embargo, en el estado triplete los espiones de los dos electrones se han desapareado y, por tanto, están paralelos. Estos estados pueden representarse como sigue, donde las flechas representan la dirección del espín.

Velocidades de absorción y de emisión

La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, el 10-15 a 10-14proceso requiere del orden de s. Por otro lado, la emisiónfluorescente, tiene lugar a una velocidad significativamente más lenta. Eltiempo de vida del estado excitado se relaciona inversamente con laabsortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso deexcitación. Por tanto, para absortividades molares comprendidas entre 103

y 105, los tiempos de vida del estado excitado son de 10-9 a 10-7s. Parasistemas débilmente absorbentes, donde la probabilidad del proceso detransición es más pequeña, los tiempos de vida pueden ser tan largos como

10-6 10-5de a s. Como se ha señalado, la velocidad promedio de unatransición triplete a singulete es menor que la correspondiente transiciónsingulete a singulete. Por ello, la emisión fosforescente requiere tiemposcomprendidos entre 10-4 y 10s o superiores

Una molécula excitada puede volver a suestado fundamental mediante unacombinación de varias etapas mecanísticas.Como muestran las flechas verticalesrectas de la Figura, dos de estas etapas,fluorescencia y fosforescencia, conllevan laemisión de un fotón de radiación. Las otrasetapas de desactivación, indicadas porflechas onduladas, son procesos noradiantes. El camino más propicio hacia elestado fundamental es aquel que minimizael tiempo de vida del estado excitado. Porello, si la desactivación por fluorescencia esmás rápida que los procesos no radiantes,se observa tal emisión.Por otro lado, si la desactivación noradiante tiene una constante de velocidadmás favorable, la fluorescencia desapareceo es menos intensa

La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeñode sistemas que incorporan características estructurales y ambientalesque hacen que la velocidad de los procesos de relajación desactivaciónno radiantes se ralenticen hasta el punto en el que la reacción deemisión puede competir cinéticamente con ellos. La informaciónreferente a los procesos de emisión es suficientemente completa parapermitir un cálculo cuantitativo de estas velocidades. Sin embargo, lacomprensión de los otros caminos de desactivación es, en el mejor delos casos, rudimentaria; para estos procesos, sólo se pueden realizarafirmaciones o especulaciones cualitativas sobre las velocidades y los mecanismos.

FosforescenciaLa desactivación del estado electrónico excitado también fosforescencia. Después del cruce entre sistemas a un excitado, la desactivación posterior puede tener lugar interna o externa o por fosforescencia.

puede incluir laestado tripletepor conversión

Una transición triplete singulete es mucho menos probable que unaconversión singulete/singulete; como se ha dicho, el tiempo de vida medio

10-4de un estado triplete excitado respecto a la emisión oscila entre y 10 so más. Por tanto, la emisión causada por una transición de este tipo puedepersistir durante algún tiempo después que la irradiación se hayainterrumpido.Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con lafosforescencia que este tipo de emisión se observa normalmente sólo abajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por moléculas queestán adsorbidas sobre superficies sólidas.

Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescenciaTanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que una sustancia sea o no luminiscente; estos factores también determinan la intensidad de emisión cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.

Rendimiento cuántico

El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia de fosforescencia es simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia respecto al número total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies químicas que no presentan una fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.

INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LAFLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIALos distintos componentes de los instrumentos para la medida de lafotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros oespectrofotómetros ultravioleta/visible. La siguiente gráfica muestra unaconfiguración característica de estos componentes en los fluorómetros y losespectrofluorímetros. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente.

rdel haz

Dispositivo de lectura

Amplificadordiferencial

Fotomultiplicador de la muestra

Fotomultiplicador dereferencia

Atenuado

Filtro o Monocromador de emisión

Fuente

Muestra

Filtro o Monocromador de excitación

Radiación dispersada

El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador deexcitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia peroexcluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida.

El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia sereduce en un factor de 100 o más. Las señales procedentes delfotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificadordiferencial cuya salida se visualiza en un medidor o en un registro. Algunosinstrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue conatenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan uncircuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido de tratamiento de los datos para obtener la relación entre la intensidad de la emisión fluorescente y la intensidad de la fuente de radiación.

Espectrometría de luminiscencia molecular

Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros

- FuentesEn la mayoría de las aplicaciones se necesitan fuentes más intensa que las lámparas de wolframio o hidrógeno utilizadas en las medidas de absorción.De hecho, la magnitud de la señal de salida y, por tanto, la sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente Po

- LámparasLa lámpara más común para los fluorómetros de filtro es la lámpara de

arco defundida. previa a

mercurio a baja presión equipada con una ventana de síliceEsta fuente emite líneas útiles para producir la excitación la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Las

líneas individuales se pueden aislar con filtros dede

interferencia oabsorción adecuados. Ya que, en la mayoría los compuestosfluorescentes, la fluorescencia se puede inducir con distintas longitudesde onda, aladecuada.

menos una de las líneas del mercurio suele resultar

- LáseresDesde los comienzos de los años setenta, se utilizan también diversostipos de láseres como fuentes de excitación para medidas defotoluminiscencia.Un particular interés tienen los láseres sintonizables de utilizan, como sistema de bombeo, un láser de nitrógeno láser de Nd:YAG.

colorante quepulsante o un

La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas(ya descritas) como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las fuentes de láser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1) cuando las muestras son muy pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2) en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza colimada de los haces de láseres vital: o (3) cuando se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para minimizar los efecto de las interferencias fluorescentes.

- Filtros y monocromadoresTanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la radiación fluorescente resultante, mayoría de los espectrofluorímetros están equipados con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.

- DetectoresLa señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los detectores más utilizados en instrumentosde fluorescencia sensibles. Suelen trabajar en la modalidad dede fotones para mejorar la relación señal/ruido. También se

recuentoutiliza, a relaciónveces, la refrigeración de los detectores para mejorar la

señal/ruido. También selos detectores de diodos

han propuesto, para los espectrofluorímetros,en serie y de transferencia de carga. Este tipo

de detectores permite el registro rápido de los espectros de excitación yde emisión y particularmente son útiles en cromatografía y enelectroforesis

APLICACIONES Y MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES

Es inherente a los métodos fluorescentes y fosforescentes el ser aplicables aintervalos de concentración más bajos que las medidas espectrofotométricasde absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles de lasque puedan disponer los científicos. El aumento de sensibilidad surge delhecho de que el parámetro relacionado con la concentración en fluorimetría y en fosforimetría F se puede medir independientemente de la potencia de la fuente Po. Por el contrario, una medida de absorbancia requiere la evaluaciónde Po y de P, ya que la absorbancia, quedepende de la relación entre estas dos

es proporcional a la concentración,cantidades. La sensibilidad de un

la en

método fluorimétrico puede mejorarse aumentando Po o medianteamplificación adicional de la señal de fluorescencia. Por el contrario,espectrofotometría, un aumento en Po da lugar a un cambio proporcional en Py, por ello, no afecta a la A. Por tanto, los métodos fluorimétricos tienen,generalmente, sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitudsuperiores a los correspondientes de absorción. Por otro lado, la precisión y la exactitud de los métodos fotoluminiscentes son habitualmente más pobres que las de los procedimientos espectrofotométricos en un factor entre, quizás, dos y cinco. Generalmente, los métodos fosforescentes son menos precisos que sus correspondientes métodos fluorescentes.

Determinación fluorimétrica de especies inorgánicasLos métodos inorgánicos fluorimétricos son de dos tipos. Los métodos directosque conllevan la formación de un quelato fluorescente y la medida de suemisión. Un segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia queresulta de la acción amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada. La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.Reactivos fluorimétricosLos reactivos fluorimétricos de más éxito en el análisis de cationes son los quepresentan estructuras aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que permitan la formación de quelatos con el ion metálico. A continuación se muestranDeterminación fluorimétrica de especies orgánicasEl número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas ybioquímicas es impresionante.Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los métodos para ladeterminación de máscompuestos orgánicos,naturales, esteroides y

de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad deenzimas y coenzimas, agentes medicinales, productosvitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones más

importantes de la fluorimetría se encuentran en el campo del análisis deproductos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.La sensibilidad y la selectividad del método hacen que sea una herramienta particularmente valiosa en estos campos.

BIBLIOGRAFÍA

• Principio de Análisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMANQuinta Edición. Mc Graw Hill.

• Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSONPrentice Hall. Madrid 2001.