CAPÍTOL VII

268

5. PART EXPERIMENTAL

5.1 Estudis de radiocompostos de tecneci

5.1.1 Preparació de vials

Es varen preparar prèviament una sèrie de vials que contenien els lligands i altres

reactius necessaris. Tots els vials es guardaren sota atmosfera de nitrogen.

En tots els vials es varen introduir 0.60 µmol de lligand, i en alguns es va afegir

també 0.13 µmol de SnCl2·2H 2O. Per tal de dipositar aquestes quantitats tan

petites de producte dins dels vials es va procedir de la següent manera: a) pesar

quantitats més elevades de producte (entre 25 i 75 mg); b) diluir en un dissolvent

(3 a 5 ml); c) mesurar amb una micro-xeringa la quantitat necessària (entre 20 i

50 µl) per obtenir els µmol desitjats; d) dipositar aquest volum a dins d’un vial i

evaporar el dissolvent al buit.

En la primera bateria d’experiments, amb els lligands 10, 11 i 12, els vials

preparats contenien:

- Vial 1: 0.29 mg (0.60 µmol) de lligand 10.

- Vial 2: 0.29 mg (0.60 µmol) de lligand 10 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

- Vial 3: 0.39 mg (0.60 µmol) de lligand 11.

- Vial 4: 0.39 mg (0.60 µmol) de lligand 11 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

- Vial 5: 0.60 mg (0.60 µmol) de lligand 12.

- Vial 6: 0.60 mg (0.60 µmol) de lligand 12 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

En la segona bateria d’experiments es varen usar els lligands 2, 3, 4 i 8 i els vials

preparats contenien:

- Vial 1: 0.36 mg (0.60 µmol) del lligand 2 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

- Vial 2: 0.57 mg (0.60 µmol) del lligand 3 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

- Vial 3: 0.27 mg (0.60 µmol) del lligand 4 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

- Vial 4: 0.19 mg (0.60 µmol) del lligand 8 i 0.03 mg (0.13 µmol) de SnCl2·2H 2O.

Finalment en l’últim experiment es va usar la difosfina 18 i es prepararen 3 vials

per separat cadascun amb un dels reactius:

- Vial 1: 28 mg de lligand 18 per dissoldre en 10 ml de EtOH i agafar 100 µl

(0.60 µmol).

- Vial 2: 30 mg SnCl2 per dissoldre en 5 ml de solució salina fisiològica 0.05M HCl

i agafar 5 µl (0.13 µmol).

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

269

- Vial 3: 100 mg de D-gluconat de sodi per dissoldre en 5 ml de solució salina

fisiològica i agafar 50 µl (4.58 µmol).

5.1.2 Formació dels radiocompostos de tecneci

Aquesta part ha estat realitzada per personal especialitzat del Departament de

Medicina Nuclear de l’Hospital Clínic de Barcelona.

En els experiments amb els lligands 10, 11 i 12 es va seguir el següent

procediment: s’injecta amb agitació a cada un dels vials preparats 3 ml d’una

solució salina fisiològica (0.9% NaCl, pH = 5.5) de l’ordre de 0.01 _mol/l de99mTcO 4

− (entre 30 i 50 mCi/3ml). Aquesta concentració depèn del moment en el

que s’ha eluït del generador i del temps transcorregut després de l’elució. Una

vegada injectat el 99mTcO 4− es procedeix a realitzar una cinètica de la reacció.

S’agafen mostres a l’inici de l’experiment i als minuts 15, 30, 60 i 120. S’analitzen

totes les mostres mitjançant tres tècniques: cromatografia en placa sílica-Gel,

cromatografia en placa C-18 i cromatografia Sep-Pak® C-18 (Waters Corporation,

USA).

- Cromatografia en placa sílica-gel: es varen utilitzar plaques amb suport de vidre

de 20 cm de llargada. L’eluent fou una mescla 75:25 de metanol:aigua. El revelat

de les plaques es va realitzar amb un radiocromatògraf de capa fina.

- Cromatografia en placa C-18: es varen utilitzar també plaques amb suport de

vidre de 20 cm de llargada. L’eluent fou una mescla 65:35 de diclorometà:

acetona. Pel revelat de les plaques es va fer servir també un radiocromatògraf de

capa fina.

- Cromatografia Sep-Pak® C-18: en aquesta cromatografia s’utilitza un cartutx Sep-

Pak® d’1.2 cm de llargada ple de sílica alquilada (C-18). Primer es fan passar 10 ml

de metanol pel cartutx mitjançant una xeringa, després s’hi passen 10 ml de

solució salina fisiològica i a continuació s’asseca fent-hi passar aire. Tot seguit es

dipositen en el cartutx 100 _l de la solució del radiocompost que es vol estudiar i

s’hi fan passar 10 ml de solució salina (aquosa), la qual s’analitza mitjançant un

microcurímetre. Després s’hi passen 10 ml de metanol que també s’analitzen i

finalment es determina l’activitat que queda en el producte retingut en el cartutx

(residu).

En els experiments amb els lligands 2, 3, 4 i 8 es va seguir el mateix procediment,

amb la diferència que es varen agafar mostres a l’inici i als 60 minuts de

l’experiment. En aquest cas les tècniques cromatogràfiques emprades foren: placa

sílica-gel, cartutx Sep-Pak® C-18 i paper Whatman. En les dues primeres tècniques

es va seguir el procediment ja comentat.

CAPÍTOL VII

270

- Cromatografia en paper Whatman: es varen utilitzar tires de paper Whatman 1 de

20 cm de llargada. L’eluent fou acetat d’etil i pel revelat es va usar un

radiocromatògraf de capa fina.

L’experiment amb el lligand 18 es va realitzar d’una forma diferent, ja que es

varen preparar els diferents reactius en vials per separat. A continuació es varen

dissoldre tal i com s’ha especificat en l’apartat 5.1.1, es mesclaren les quantitats

de cada vial, i s’hi varen afegir 3 ml d’una solució salina fisiològica (0.9% NaCl, pH

= 5.5) aproximadament 0.01 _mol/l de 99mTcO 4- (20 mCi/3 ml). Tot seguit es varen

agafar mostres a l’inici de la reacció, als 30 i als 60 minuts i s’analitzaren

mitjançant les quatre tècniques cromatogràfiques ja comentades.

5.1.3 Marcatge de leucòcits

Per tal de realitzar el marcatge de leucòcits primer de tot es sintetitzen el

radiocompostos tal i com s’ha comentat en l’apartat anterior. Els leucòcits es

separen dels hematies mitjançant l’ús del reactiu HESPAN. Es prenen uns 10-15 ml

de solució salina fisiològica amb leucòcits i es realitza un procés de centrifugat

durant 5 minuts a unes 1400 rpm amb el que s’obtenen en el fons del recipient els

leucòcits. Tot seguit es porta a terme una resuspensió afegint 1 ml de solució

salina fisiològica. En aquest punt s’addiciona una dosi aproximada d’entre 10 i 20

mCi en 2ml de radiocompost preparat unes dues hores abans. Es deixa un període

d’incubació d’uns 20 minuts i a continuació es realitza un altre centrifugat (1400

rpm, 5 min). Es retira el líquid sobrenedant i es renten els leucòcits dues vegades

successives amb 1 ml de solució salina fisiològica sense resuspendre. S’analitza la

radiació emesa pels leucòcits i pel líquid sobrenedant. Es realitza un altre rentat

dels leucòcits al cap d’una hora amb 10 ml de solució salina fisiològica,

centrifugant a continuació per tornar a separar el líquid sobrenedant dels leucòcits

per tal de ser analitzats novament. En funció del resultat es realitzen un o dos

rentats més.

5.1.4 Estudis “in vivo” en rates de laboratori

Aquest estudi es va realitzar conjuntament amb el Dr. Carlos Piera i el Dr. Josep

Queralt de la facultat de Farmàcia de Barcelona. Es varen emprar els

radiocompostos formats amb el lligand 18 d’aquest treball i amb 3 lligands

sintetitzats en el nostre grup de recerca (19, 20 i 21). Es varen utilitzar quatre

rates que eren germanes i pesaven uns 350 g.

Primer de tot es va procedir a la síntesi dels quatre radiocompostos realitzant un

control de qualitat mitjançant cromatografia en placa de sílica-gel, en placa C-18 i

amb cartutxos Sep-Pak® C-18. Al cap d’uns 75 minuts de la síntesi, cada un dels

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

271

radiocompostos va ser injectat a la jugular d’una de les rates prèviament

anestesiada. La dosi empleada va ser aproximadament de 300 µCi/350 µl. Al cap

de 30 i 90 minuts de la injecció es varen realitzar gammagrafies de la part

posterior i anterior de cada una de les rates. Una vegada finalitzades les

gammagrafies es va procedir al sacrifici de les rates per tal d’extreure mostres dels

seus cors, fetges, ronyons i músculs. Aquestes mostres varen ser pesades i

analitzades amb un detector de radioactivitat.

CAPÍTOL VII

272

5.2 Síntesi de compostos de reni

5.2.1 Síntesi de [ReOCl2(OEt)(PPh3)2] 168,169

Tot el procés es realitza a l’aire.

S’afegeixen 10 g de trifenilfosfina (38 mmol) sobre 50 ml d’etanol en un baló de

250 ml. Per una altra banda es dissolen 2 g de NH4ReO4 (7.46 mmol) sobre 5.25 ml

d’àcid clorhídric 35% (60 mmol) i tot seguit s’addicionen sobre la primera mescla.

La solució pren un color verdós. Es connecta el baló a un refrigerant i es porta la

mescla a refluir durant 15 minuts. Aquesta operació comporta un augment de la

intensitat del color verd de la solució. Es deixa refredar a temperatura ambient, es

filtra, es renta el precipitat dues vegades amb 20 ml d’etanol i dues vegades amb

20 ml d’èter i s’asseca el producte verd [ReOCl2(OEt)(PPh3)2]. Se n’obtenen 6.13 g

amb un rendiment del 98%.

20

30

40

50

60

70

80

90

5001000150020002500300035004000cm-1

%T

Figura 245: espectre IR del compost [ReOCl2(OEt)(PPh3)2] en pastilla de KBr

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

273

7.6

18

2

7.6

03

6

7.5

97

7

7.5

86

0

7.2

50

0

7.0

92

2

2.4

05

5

2.3

76

3

2.3

50

0

2.3

20

7

1.4

00

3

1.1

02

3

1.0

76

0

1.0

46

8

(ppm) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5

Figura 246: espectre de 1H-RMN (CDCl3) del compost [ReOCl2(OEt)(PPh3)2]

-4.8

85

7

-10

.02

07

-18

.38

63

(ppm) -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura 247: espectre de 31P{1H}-RMN (CDCl3) del compost [ReOCl2(OEt)(PPh3)2]

CAPÍTOL VII

274

5.2.2 Síntesi de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O 168,169

Aquest procés també es realitza a l’aire.

Es posen 6 g de [ReOCl2(OEt)(PPh3)2] (7.12 mmol) en un baló de 250 ml i s’hi

afegeixen 100 ml d’etanol i després 30 ml de piridina (372.8 mmol) gota a gota

amb agitació. Es connecta el baló a un refrigerant i es porta la mescla de reacció a

reflux durant 2 hores i el color verd de la solució inicial passa a grana. Es redueix

el volum a una tercera part i comença a precipitar un producte groc-ataronjat.

S’acaba de precipitar afegint una mica d’èter. Es filtra, es renta amb èter i s’asseca

a l’aire. S’obtenen 3.4 g de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O (rendiment 80%).

10

20

30

40

50

60

70

80

5001000150020002500300035004000cm-1

%T

Figura 248: espectre IR del compost [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O en pastilla de KBr

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

275

9.0

725

9.0

666

9.0

520

9.0

462

9.0

403

7.9

008

7.8

745

7.8

686

7.8

453

7.8

394

7.8

336

7.6

203

7.6

144

7.5

998

7.5

940

7.5

706

7.5

648

4.9

000

3.3

134

(ppm) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

Figura 249: espectre de 1H-RMN (CD3OD) del compost [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O

15

2.0

44

4

14

2.7

29

6

12

7.3

71

4

(ppm) 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165

Figura 250: espectre de 13C{1H}-RMN (CD3OD) del compost [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O

CAPÍTOL VII

276

5.2.3 Reacció del [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb el lligand 11

Aquesta reacció es va realitzar en diferents relacions estequiométriques com es

detalla a continuació.

Reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb 4 mol de lligand en tub

de RMN:

Es varen dissoldre 0.075 g (0.12 mmol) de lligand en 0.5 ml de metanol deuterat

dins d’un tub de RMN (es va enregistrar un espectre 31P{1H}-RMN). Tot seguit s’hi

varen afegir 0.016 g (0.03 mmol) de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O i es va agitar. Es va

introduir el tub de RMN dins de l’aparell (AM-400) i es varen enregistrar 3

espectres 31P{1H}-RMN a temperatura ambient (un cada 15 min). A continuació es

va augmentar la temperatura fins a 40ºC i s’enregistraren 25 espectres (un cada

36 min. aproximadament). Al final de l’experiment no s’observà cap canvi de

coloració en la solució resultant de la reacció.

-45 -35 -25 -15 -5 5 15 25 35 45 55 (ppm)

80 min

190 min

300 min

410 min

Figura 251: espectres de 31P{1H}-RMN (CD3OD) durant la reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2Oamb 4 mol de lligand 11

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

277

Reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb 2 mol de lligand en tub

de RMN:

Es va repetir la reacció anterior en tub de RMN però amb una relació

estequiomètrica 1:2 (metall:lligand).

Aquesta vegada es va emprar la mateixa quantitat de precursor, 0.016 g (0.03

mmol), i 0.037 g (0.06 mmol) de lligand fosfina. Es va enregistrar un primer

espectre de 31P{1H}-RMN del lligand. A continuació es va realitzar la mescla de

reacció i es varen enregistrar dos espectres més, un cada 30 min, a temperatura

ambient. A partir d’aquest moment s’augmentà la temperatura a 40ºC i

s’enregistraren 16 espectres més, un cada hora. Al final de l’experiment tampoc

s’observà cap canvi de coloració en la solució resultant de la reacció.

1 hora

3 hores

5 hores

7 hores

9 hores

11 hores

13 hores

15 hores

-55 -45 -35 -25 -15 -5 5 15 25 35 45 55 (ppm)

Figura 252: espectres de 31P{1H}-RMN (CD3OD) durant la reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2Oamb 2 mol de lligand 11

CAPÍTOL VII

278

5.2.4 Reacció del [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb el lligand 16

Es realitza tot el procés en atmosfera inert i amb el dissolvent desgasat.

Es dissolen per una banda 0.246 g (0.41 mmol) de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O en 10 ml

de metanol. Per altra banda es prepara una dissolució amb 0.314 g (0.82 mmol) de

lligand 16 en 10 ml de metanol que es barreja amb l’anterior, obtenint una solució

resultant de color vermell ataronjat. Es deixa el sistema en agitació en un bany a

40ºC durant 18 h, obtenint una solució fosca de color marró-negre amb una mica

de precipitat blanc. Es realitza l’espectre de 31P{1H}-RMN de la solució anterior

afegint un capil·lar de deuteroacetona.

-10

.97

44

-15

.65

14

-19

.05

06

-30

.38

14

(ppm) -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35

Figura 253: espectre de 31P{1H}-RMN (CD3OH + capil·lar de deuteroacetona) de la reacció d’un mol de[ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb 2 mol de lligand 16

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

279

5.2.5 Reacció del [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb el lligand difosfina 18

Aquesta reacció es realitza sota atmosfera de nitrogen i el dissolvent emprat és

prèviament desgasat.

Reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb dos mol de lligand en

etanol:

Es dissolen 0.100 g (0.16 mmol) de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O en 20 ml d’etanol i

afegim 0.170 g (0.36 mmol) de lligand 18, el qual es va dissolen lentament

(solució color taronja). Deixem la mescla de reacció en agitació a temperatura

ambient durant 24 h. Durant aquest temps no s’aprecia canvi de color en la

dissolució. S’evapora el dissolvent obtenint un precipitat de color taronja. Es va

realitzar l’espectre 31P{1H}-RMN (Figura 254).

Es va tornar a dissoldre en etanol el precipitat obtingut de l’evaporació anterior i es

va portar el sistema a reflux. Al cap de poca estona de refluir (20 min) s’observa

que la solució s’enfosqueix ràpidament. Es va aturar el reflux i es va evaporar el

dissolvent obtenint un precipitat de color verd marró. Es va dissoldre aquest

producte en CD3OD obtenint una solució una mica tèrbola, es va filtrar i es va

realitzar l’espectre 31P{1H}-RMN (Figura 255).

52

.50

30

45

.51

16

44

.23

39

43

.99

28

43

.80

00

36

.44

70

36

.13

36

35

.67

55

33

.60

22

28

.63

60

20

.60

80

-15

.50

59

-16

.06

04

-16

.25

33

-16

.97

65

-17

.16

94

-17

.43

46

-18

.10

96

-25

.46

26

-25

.65

54

-28

.13

86

-31

.20

03

-31

.44

14

-31

.65

84

-31

.77

89

-32

.02

00

-32

.21

28

-32

.45

39

-32

.62

27

-35

.29

87

(ppm) -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Figura 254: espectre de 31P{1H}-RMN (CD3OD) de la reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb2 mol de lligand difosfina 18 en etanol a temperatura ambient

CAPÍTOL VII

280

44

.40

27

44

.11

34

43

.82

41

36

.76

04

36

.37

47

35

.89

25

20

.75

26

-9.1

41

4

-9.3

34

3 -1

1.2

38

8

-11

.43

17

-16

.18

10

-17

.36

23

-18

.44

71

-20

.25

52

-21

.07

49

-21

.48

47

-22

.18

39

-23

.05

18

-25

.65

54

(ppm) -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Figura 255: espectre de 31P{1H}-RMN (CD3OD) de la reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb2 mol de lligand difosfina 18 en etanol a reflux

Reacció d’un mol de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb un mol de lligand en

CH2Cl2:

Es dissolen 0.060 g (0.1 mmol) de [ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O en 20 ml de diclorometà.

Per altra banda es dissolen 0.046 g (0.1 mmol) del lligand en 10 ml de diclorometà,

quedant la solució una mica tèrbola. S’addiciona la solució de lligand poc a poc

sobre la del precursor metàl·lic amb agitació, observant-se una coloració taronjada

en la dissolució resultant. Tot seguit es connecta un refrigerant al sistema i

s’escalfa la mescla de reacció a 30º C. Al cap de 4 dies de reacció s’observa que el

color de la dissolució ha anat canviant des del taronja inicial fins a un grana. Es va

concentrar a la meitat del volum i es va realitzar l’espectre 31P{1H}-RMN.

RADIOCOMPOSTOS I COMPLEXOS DE RENI

281

39.2

909

38.6

400

30.9

254

-5.4

055

-6.2

733

-7.4

305

-8.4

431

-8.6

118

-10.8

298

-10.9

985

(ppm) -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40

Figura 256: espectre de 31P{1H}-RMN (CH2Cl2 amb capil·lar de C2D6O) de la reacció d’un mol de[ReO2(C5H5N)4]Cl·2H2O amb 1 mol de lligand difosfina 18

5.2.6 Reacció del [ReO2I(PPh3)2] amb el lligand difosfina 18

Es va realitzar la reacció sota atmosfera de nitrogen i els dissolvents emprats es

varen desgasar prèviament.

Es dissolen 0.200 g (0.23 mmol) de [ReO2I(PPh3)2] en 5 ml de diclorometà. Per

altra banda es dissolen 0.214 g (0.46 mmol) del lligand 18 en 5 ml d’aigua i

s’addicionen gota a gota sobre la dissolució del precursor. La solució sembla que

s’enterboleix una mica. Es deixa el sistema en agitació durant 30 minuts i a

continuació se separen les dues fases, s’evaporen i es realitzen els espectres de31P{1H}-RMN (l’espectre de la fase orgànica, que no es mostra, conté un únic

senyal majoritari aproximadament a –5 ppm). Es va intentar obtenir cristalls del

complex sòlid obtingut (fase aquosa) sense èxit.

CAPÍTOL VII

282

44

.59

55

44

.30

62

36

.47

11

32

.66

20

21

.11

43

-5.3

08

2

-17

.45

87

-28

.59

66

-31

.17

62

-31

.41

73

-31

.63

43

-31

.89

94

-32

.09

23

-32

.16

46

-32

.38

16

-32

.52

63

(ppm) -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Figura 257: espectre de 31P{1H}-RMN (CD3OD) de la reacció d’un mol de [ReO2I(PPh3)2] amb 2 molde lligand 18

-31.1

762

-31.4

173

-31.6

343

-31.8

994

-32.0

923

-32.1

646

-32.3

816

-32.5

263

(ppm) -36.5 -36.0 -35.5 -35.0 -34.5 -34.0 -33.5 -33.0 -32.5 -32.0 -31.5 -31.0 -30.5 -30.0 -29.5 -29.0 -28.5 -28.0 -27.5 -27.0

Figura 258: ampliació de la zona –27 a –36 ppm de l’espectre anterior (Figura 257)