PROGRAMA DE LA ASIGNATURA Curso académico 2009-2010

Identificación y características de la asignatura

Denominación Biología Celular y Molecular de Microorganismos Eucariotas

Código

Créditos (T+P) 4T + 3P

Titulación Licenciatura en Biología

Centro Facultad de Ciencias

Curso 4º Temporalidad Primer cuatrimestre

Carácter Obligatoria

Descriptores (BOE)

Nombre Despacho Correo-e Página web Profesor/es

Luis M. Hernández Isabel Olivero Manuel Ramírez

Edif. Juan R. Camacho, 2ª planta

lmhernan@unex.es iolivero@unex.es mramirez@unex.es

Área de conocimiento

Microbiología

Departamento Ciencias Biomédicas

Profesor coordinador (si hay más de uno)

Luis M. Hernández

Objetivos y/o competencias

Al terminar de cursar esta asignatura, el alumno deberá haber adquirido los

siguientes conocimientos en relación con los microorganismos eucariotas:

1.- Terminología utilizada en este campo de la Biología y relación con otras

ramas de las Ciencias Biológicas.

2.- Mecanismos de síntesis y secreción de macromoléculas, con especial énfasis

en las glicoproteínas.

3.- Funciones de los oligosacáridos de las glicoproteínas.

4.- Técnicas generales demanipulación y transferencia de genes utilizadas en

microorganismos eucariotas.

5.- Vectores de clonación y/o expresión.

6.- Obtención de microorganismos con nuevas capacidades por manipulación

genética.

Temas y contenidos (especificar prácticas, teoría y seminarios, en su caso)

TEMARIO *

PROGRAMA DE CLASES TEÓRICAS Presentación y justificación del programa (1 clase) Temas 1 a 4: 13 clases. Temas 5 a 8: 13 clases. Temas 9 a 15: 13 clases TEMA 1.- SECRECIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS. Introducción y generalidades. Comparación con la secreción de proteínas en eucariotas superiores. Métodos de estudio de secreción en Saccharomyces cerevisiae: mutantes sec. Esquema general de la ruta secretora en S. cerevisiae y principales genes implicados. Maduración de las proteínas de secreción en el retículo endoplásmico TEMA 2.- FACTORES Y MECANISMOS MEDIANTE LOS QUE LAS PROTEÍNAS SECRETORAS ALCANZAN SU DESTINO. Formación de vesículas y selección de sustancias a transportar. Características de las vesículas implicadas en el proceso secretor en S. cerevisiae: vesículas de clatrina y vesículas recubiertas de coatómeros (COPI y COPII). Factores

determinantes del transporte, anclaje y fusión de las vesículas con la membrana diana: papel de los SNARES, tethering y proteínas sec17/sec18. TEMA 3.- TRANSPORTE DE SUSTANCIAS A TRAVÉS DE LA RUTA SECRETORA. Transporte de proteínas desde el RE a Golgi. Retorno de proteínas desde Golgi al RE: señales de retención. Transporte de proteínas intra golgi. Selección de proteínas en el trans-golgi y transporte de las mismas hacia el endosoma o a la membrana plasmática: señales de selección El endosoma de levaduras: intersección de las rutas golgi-vacuola y endocítica. Paso de sustancias del endosoma a la vacuola. TEMA 4.- LA VACUOLA DE LEVADURAS. Estructura, componentes y funciones. Turnover de proteínas. Hambre de nutrientes y autofagia. ATP-asa vacuolar. Hidrolasas vacuolares, ruta secretora y maduración de las mismas. Algunas hidrolasas llegan a la vacuola a través de una ruta llamada extrasecretora . TEMA 5. VIRUS DE LEVADURAS Y FACTORES MATADORES. Introducción. Tipos de factores matadores. Replicación de partículas ScV-LA, ScV-M1 y ScV-M2. Procesamiento y secreción del factor matador K1. Mecanismos de acción de los factores K1, K2 y K28. Otras toxinas matadoras. Importancia de los factores matadores en la industria. Aplicaciones en el tratamiento de enfermedades infecciosas producidas por hongos. TEMA 6 (Introducción). OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS CON NUEVAS CAPACIDADES MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA "in vitro". Introducción. Experimento típico de clonación de un fragmento de DNA. Endonucleasas de restricción. Vectores de clonación: plásmidos, fagos, cósmidos y fásmidos. Procedencia del DNA. Detección de los clones de interés: métodos genéticos, inmunoquímicos y de hibridación de ácidos nucleicos. Expresión de los genes clonados. Secreción de proteínas foráneas codificadas por los genes clonados. Estabilidad de las proteínas exógenas. Optimización de la expresión de los genes clonados. Ejemplos significativos. Elección del microorganismo hospedador. TEMA 7. CLONACIÓN EN Saccharomyces cerevisiae. Ventajas de la levadura como micoorganismo hospedador. Vectores de clonación: tipos y características. Vectores basados en retrotransposones Ty. Transformación de levaduras. Análisis de los clones de interés. Expresión de los genes clonados. Vectores de expresión. Secreción de los productos. Procesamiento de intrones. Modificaciones postraduccionales. Expresión de genes en otras levaduras: Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Yarrowia, y Schizosacharomyces. TEMA 8. MANIPULACIÓN DE GENES CLONADOS EN LEVADURAS. Posibilidades de la levadura. Técnicas de remplazamiento de genes: alteración integrativa del gen, alteración en un solo paso y sustitución. Reparación de

huecos en plásmidos. "Plasmid suffling". Modificación directa de genes con fragmentos de PCR. TEMA 9. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA GLICOSILACION EN S. cerevisiae 1.- Generalidades. 2.- S. cerevisiae como modelo para el estudio de la glicosilación en eucariotas 3.- Tipos de unión carbohidrato-proteína. 4.- Glicoproteínas de interés en S. cerevisiae. 5.-Principales funciones de los restos glucídicos en las glicoproteínas. 6.-Procedencia de los precursores en reacciones de glicosilación. TEMA 10. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LOS RESTOS GLUCÍDICOS DE LAS GLICOPROTEÍNAS. 1.- Composición de la porción glucídica. 2. - Identificación de los sitios de glicosilación. 3.-Liberación de los restos glucídicos. 4.- Análisis estructurales: determinación del tipo de enlace por metilación y cromatografía de gases, cromatografía de filtración en gel e intercambio iónico, cromatografía en papel y en capa fina, cromatografía de afinidad con lectinas, HPAEC-PAD, 1H RMN, digestión con glicosidasas, espectrometría de masas. TEMA 11. ESTRUCTURA Y BIOSÍNTESIS DE LOS RESTOS O-GLICOSÍDICOS. 1.- Determinación de la estructura. 2.- Biosíntesis: 2.1 Aislamiento del gen DPM1 y obtención del mutante dpm1. 2.2 Aislamiento de los genes PMT y los correspondientes mutantes pmt. 2.3 Aislamiento y caracterización del gen MNT1. 2.4 La familia de genes KRE2/MNT1. 2.5 Participación de Ktr1p, Ktr3p y Kre2p/Mnt1p en O-glicosilación. 2.6 Efecto de la mutación mnn1 en las cadenas O-glicosídicas TEMA 12. ESTRUCTURA DE LOS RESTOS N-GLICOSÍDICOS. 1.- Primeros estudios estructurales. 2.- Aislamiento y caracterización de los mutantes mnn. 3.-Localización de los grupos fosfato en la molécula. 4.- Localización del punto de unión de la cadena externa al núcleo. TEMA 13. BIOSÍNTESIS DE LOS RESTOS N-GLICOSÍDICOS. 1.- Etapas que ocurren en el ER. Visión general del proceso. 2. Los genes/mutantes ALG. 3. Etapas en la cara citoplásmica de la membrana del RE. 4. Internalización del oligosacárido: la translocasa o flipasa. 5. Etapas en la cara interna: crecimiento del oligosacárido. 6. Transferencia a la proteína: La OST. 7. Procesamiento en ER: Hidrólisis de 3Glc y 1 Man. 8. El “control de calidad” en el RE. TEMA 14. 1.- Etapas que ocurren en el aparato de Golgi. Visión general del proceso. 2. Iniciación de la cadena externa. 3. 1ª elongación: M-Pol I. 4. 2ª elongación: M-Pol II. 5. Iniciación de las ramificaciones: Mnn2p. 6. Elongación de las ramificaciones: Mnn5p. 7 Fosforilación: Mnn6p y Mnn4p. 8. Adición de manosas terminales: Mnn1p. 9. El proceso de fosforilación. TEMA 15. ESTRUCTURA Y BIOSÍNTESIS DE LOS RESTOS GPI.

1.- Estructura. 2.- Biosíntesis de los restos GPI y su unión a la proteína. 3.- Aislamiento y caracterización de los mutantes gpi1, gpi2 y gpi3. 3.- Aislamiento y fenotipos de mutantes afectados en síntesis de restos GPI. 4.- Manosiltransferasas implicadas en la síntesis de restos GPI. 5.- Función de los restos GPI.

PROGRAMA DE CLASES PRÁCTICAS 1.- Virus de levaduras y fenotipo “asesino” (killer). - Estudio del fenotipo killer. - Observación de los halos de inhibición de diferentes cepas “asesinas” sobre césped de distintas cepas sensibles. - Aislamiento de los RNA 2c (minipreparaciones). - Caracterización de los RNA por electroforesis en gel de agarosa. - Análisis y discusión de los resultados. 2.- Caracterización fenotípica de mutantes de glicosilación de Saccharomyces cerevisiae. Se utilizarán varias cepas con deleciones en genes relacionados con el proceso de glicosilación. - Observación del tamaño de la invertasa glicosilada reprimible por glucosa. - Rotura de las células. - Extracción de la invertasa. - Preparación de las muestras. - Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas. - Afinidad por el colorante azul alcian. - Siembra y crecimiento de las diferentes cepas. - Tinción con el colorante y cuantificación del color. - Observación morfológica directa. - Determinación del tipo sexual por observación directa de formación de zigotos. - Análisis y discusión de los resultados.

DEBATE/SEMINARIO METODOLOGÍA Y ACTIVIDADES

Clases teóricas (GG) y clases prácticas en laboratorio (SL). Estudio individual y en grupos (A y G). Evaluación de teoría y prácticas (E). Utilización regular del aula virtual (A). RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIO

- Asistencia a las clases teóricas (GG). - Estudio continuado (A y G). - Utilización de las tutorías siempre que sea necesario (Tu). - Visitar regularmente el aula virtual.

Criterios de evaluación

- El examen constará de preguntas cortas y de desarrollo.

- Además de los conceptos, se valorará el orden y la claridad en la

exposición. Deberá contestarse estrictamente a lo que se pregunta. Cualquier

información adicional podrá ser valorada negativamente.

- Cada Profesor evaluará la materia impartida por él y la calificará de 0 a

10 puntos.

- La contribución de la nota de cada Profesor a la nota final del examen

será directamente proporcional a los créditos impartidos.

- Para aprobar la asignatura se requiere haber realizado las prácticas y entregado el informe sobre la labor realizada. En caso de no asistencia justificada, habrá que superar un examen específico sobre las prácticas. - Si en examen teórico se ha obtenido una calificación de 5 o superior, la nota final podrá incrementarse hasta un máximo de 0,5 puntos por la nota del informe de prácticas.

Bibliografía

-. KAISER; GIMENO y SHAYWITZ.(1997). "Proteins Secretion, Membrane Biogenesis, and Endocytosis" en “The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces” Volumen 3. PRINGLE, BROACH y JONES Editores. Cold Spring Harbor Laboratory Press. -. Jones, Webb y Hiller (1997). “ Biogenesis and Function of the Yeast Vacuola” en “The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces”. Volumen 3. PRINGLE, BROACH y JONES Editores. Cold Spring Harbor Laboratory Press. -. LODISH, H. BALTIMORE, BERK, ZIPURSKY, MATSUDAI R., DARNELL, J. (2002). "Biología molecular y celular". 4ª Edición. -Current protocols in molecular biology. F.M. Ausubel, R. Brent, et al. Ed. Wiley Interscience. -Gene structure in eukaryotic microbes. J.R. Kinghorn (1987). Ed. IRL Press.

-Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. C. Guthrie and G.R. Fink (1991). Methods in Enzymology, Vol.194. Ed. Academic press. -Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Part. B. C. Guthrie and G.R. Fink (2002). Methods in Enzymology, Vol.350. Ed. Academic press. -Microbiología 1990. J. Casadesús y F. Ruiz-Berraquero. Ed. Manuales Universitarios. -Molecular cloning: a laboratory manual. Sambrok, Fritsch and Maniatis. 2nd edition (1989). Ed. CSH. -PCR protocols: a guide to methods and applications. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (1990). Ed. Academic press. -PCR technology. Henry A Erlich (1989). Stockton Press. -Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. RW Old and SB Primrose (1992 y 1994). Blackwell Scientific Publications. -Revisiones sobre biología celular Vol.4 (1985). E. Barberá-Guillem. Ed. Servicio editorial universidad del país vasco. -The molecular biology of the yeast Saccharomyces: life cycle and inheritance. Strahern, Jones and Broach (1981). Ed. CSH. -Molecular genetics of yeast. A practical approach. J. R. Johnston (1994). IRL Press. -Yeast genetics. J.F.T. Spencer, D.M. Spencer and I.J. Bruce (1989). Springer-Verlag. -Yeast protocols. Methods in cell and molecular biology, Vol. 53. I.H. Evans 1996. Humana. -Gel electrophoresis of nucleic acids. A practical aproach. D. Rickwood and B.D. Hames (1990). IRL Press. -Recombinant gene expresion protocols. Methods in cell and molecular biology, Vol. 62. R.S.Tuan (1997). IRL Press. Munro S. (2001). What can yeast tell us about N-linked glycosylation in the Golgi apparatus? FEBS Lett. 498:223-227. Ernst JF, Prill SK.(2001) O-glycosylation. Med Mycol.391:67-174. Knauer R, Lehle L. (1999). The oligosaccharyltransferase complex from yeast. Biochim Biophys Acta. 1426, 259-73. Dean N. (1999). Asparagine-linked glycosylation in the yeast Golgi. Biochim Biophys Acta. 1426, 309-22. Lussier M, Sdicu AM, Bussey H. (1999) The KTR and MNN1 mannosyltransferase families of Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta. 1426, 323-34. Willer T, Valero MC, Tanner W, Cruces J, Strahl (2003) S.O-mannosyl glycans: from yeast to novel associations with human disease. Curr Opin Struct Biol. 13, 621-30

Grabinska k, palamarczyk g.(2002) Dolichol biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae: an insight into the regulatory role of farnesyl

diphosphate synthase. FEMS Yeast Res 2, 259-265. Páginas web: www.yeastgenome.org/ http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/index.jsp

En ellas se puede encontrar información detallada sobre el genoma de Saccharomyces cerevisiae así como bibliografía reciente y numerosos enlaces a otras páginas web con información relacionada.

- ARTÍCULOS O REVISIONES PUBLICADOS RECIENTEMENTE SOBRE CUALQUIERA DE LOS TEMAS.

Tutorías (Luis M. Hernández)

Horario Lugar

Lunes

11-13

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Martes

11-13

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Miércoles

10-12

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Jueves

Viernes

Tutorías (Isabel Olivero)

Horario Lugar

Lunes

13-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Martes

13-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Miércoles

12-14

Despacho Edif Juan R. Camacho,

2ª planta.

Jueves

12-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Viernes

Tutorías (Manuel Ramírez)

Horario Lugar

Lunes

12-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Martes

12-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Miércoles

12-14

Despacho Edif Juan R. Camacho, 2ª planta.

Jueves

Viernes