Transcripción en Eucariotas

M.C. Ana Isabel García Santiago

• Intrón: secuencias no codificadoras de ADN que son separadas por los exones.

• Exón: secuencias codificadoras de DNA en genes

• Operón: un grupo de genes cuya expresión ésta controlada por un único operador.

• Promotor: una región del DNA a la que puede unirse la RNA polimerasa para comenzar la transcripción.

Vocabulario

• Factores de transcripsión: son proteínas que coordinan y regulan la expresión de un gen o de un grupo de genes. Interaccionan con regiones específicas del ADN, la ARN pol, y con otros factores de transcripción o con moléculas que activan o inhiben su función.

• Potenciador (enhancer): región corta del ADN que puede unirse con proteínas (factores de transcripción) para aumentar los niveles de transcripción de genes en un grupo de genes. Un potenciador no tiene porque estar localizado cerca de los genes sobre los que actúa, ni siquiera en el mismo cromosoma

• Represor: Es una proteína de unión de ADN que regula la expresión de uno o más genes mediante la disminución de la tasa de transcripción. Los represores se unen a un segmento de ADN evitando que la ARN polimerasa cree el ARN mensajero.

• Elemento de respuesta: El sitio capaz de ser reconocido por un factor de transcripción dado de manera más o menos específica

• Elementos reguladores: Las secuencias a las cuales los factores de transcripción se unen

• Espliceosomas: o complejo de corte y empalme es un complejo formado por cinco ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP, del inglés small nuclear ribonucleoproteins) capaz de eliminar los intrones de los precursores del mRNA

pre−ARNm

Diferencias entre la transcripción procariota y eucariota

Diferencias entre la transcripción procariota y eucariota

ARNm policistrónico transcripción y traducción acopladas ARN Polimerasa única

ARNm monocistrónicotranscripción y procesamiento acoplados 3 ARN Polimerasas diferentes

procariota eucariota

La transcripción y la traducción noson procesos simultáneos

La transcripción y la traducción sonprocesos simultáneos.

Diferencias entre la transcripción procariota y eucariota

La ARN pol Procariota La ARN pol Eucariota

El sitio promotor es reconocido en eucariontes por una variedad de proteínas

Factores de transcripsión TBP, B, F, E y H

ARN polimerasaII síntesis del ARNm

RNA polimerasas

• Las 3 ARN pol son similares a las subunidades β de la ARN pol procariota.

• Están conformadas por 8 a 14 cadenas polipeptídicas.

• 5 subunidades son comunes. Estas enzimas son proteínas aparecen como agregados de 500 kDa. Las RNA polimerasas de mitocondrias y cloroplastos de menor tamaño y se asemejan a la bacteriana.

La unión de RNA polimerasas a los moldes de DNA es eucariotas depende de numerosas proteínas que modulan el reconocimiento de los promotores y el inicio de la transcripción.

RNA POLIMERASA I• Se localiza en el nucléolo, transcribe los principales genes de

RNA ribosómico (un solo transcrito, el RNAr 45s, precursor del RNAr 18s, 28s, y 5.8s).

• Contiene 13 subunidades• Necesita al menos 2 factores de transcripción para iniciar el

proceso. _UBF1 es un polipéptido que se une a una región rica en

G-C tanto en el núcleo del promotor como en UCE.

_SL1 está formada por 4 proteínas, una de estas es la TBP (binding protein), esta proteína se une a la secuencia TATA.

RNA POLIMERASA II• Se encuentra en el nucleoplasma y sintetiza el RNAhn (RNA

heterogéneo nuclear), el precursor del RNAm, también sintetiza algunos RNAsn.

• Transcribe genes estructurales (los que se traducen a proteínas)• ESTRUCTURA: Contiene entre 8 y 12 subunidades. Dos grandes

subunidades de 240 kD = RPB1 (β) y 140 Kd = RPB2 (β´)._ La subunidad β (múltiples repeticiones YSPTTSPS en el COOH de

reconociminto de señales de activación), muestra un alto grado de homología con la subunidad β´ de la RNA polimerasa bacteriana.

_La subunidad β´, es similar a la subunidad β bacteriana. _Otras dos subunidades llamadas RBP3 y RBP11 semejantes a las 2

subunidades α de la ARNpol bacteriana. ARN pol ll utiliza al menos 7 factores de transcripción: TFIIA, TFIIB,

TFIID (se une a la caja TATA), TFIIE, TFIIF, TFIIH y TFIIJ.Los promotores de la RNApol lI se localizan en el extremo 5’ del centro

de iniciación de la transcripción

La ARN polimerasa II es la única responsable de la transcripción de los genes que codifican proteínas (síntesis del ARNm).

Factores de transcripcion de RNA polimerasa II

FactorNumero de subunidades

Peso molecular (kDa) Función

TFIID TBPsTAFs

1 12

38 15-250

Reconocimiento del centro del promotor TATA; reclutamiento de TFIIBReconocimiento del centro del promotor (elementos no TATA) ; funciones reguladoras positivas y negativas

TFIIA 3 12, 19, 35 Estabilización de la unión TBP; estabilización de interacciones TAF-DNA; funciones antirrepresoras

TFIIB 1 35 Reclutamiento de RNA pol II-TFTIIF, selección del lugar de comienzo de la RNA pol II

TFIIF 2 30, 74 Direccionamiento de la pol II al promotor, desestabilización de las interacciones inespecíficas RNA pol II-DNA

RNA pol II 12 10-220 Funciones catalíticas en la síntesis de RNA; reclutamiento de TFIIE

TFIIE 2 34, 57 Reclutamiento de TFIIH, modulación de las actividades helicasa, ATPasa y quinasa de TFIIH, potenciación directa de la fusión del promotor

TFIIH 9 35, 89 Fusion del promotor utilizando la actividad helicasa; depuración del promotor por la actividad CTD quinasa

RNA polimerasa IIISe encuentra en el nucleoplasma del núcleo.Transcribe los principales genes de RNA de transferencia, RNA ribosomal 5s y

RNA pequeños nucleares (RNAsn).Contiene 14 subunidades.Utiliza los factores transcripcionales: _ TFIIA: proteína con motivos de dedos de cinc. _ TFIIB: complejo formado por 3 proteínas, una TBP y dos proteínas más. _ TFIIC: complejo proteínico de mas de 500 kDa.

Otras Diferencias

• En los eucariotas cada gen tiene su propio promotor• El mecanismo de la transcripción eucariota también requiere

muchos más factores de transcripción• La ARN polimerasa II eucariota no se une directamente al

promotor, sino que primero se une a una docena o más de factores de transcripción, en un orden específico, para reconocer al promotor y despúes unirse a éste

• El núcleo de muchos promotores de eucariotas es la denominada caja TATA, ubicada a 30 bps hacia arriba del sitio de inicio de la transcripción, con un motivo consenso TATA(A/T)A(A/T). Sin embargo, no todos los promotores de eucariotas contienen la caja TATA

*Ocurre en el núcleo y no esta acoplada a la traducción

*Requiere de la remodelación de la cromatina

*En la regulación intervienen secuencias potenciadoras (intensificadoras ó enhancers) y silenciadoras aparte de las promotoras.

* Todas las ARNpol eucariotas necesitan Factores de transcripción basales (TF) para reconocer los promotores e iniciar la transcripción. Los factores de transcripción se unen a secuencias del ADN y modulan la fijación de la ARNpol al promotor.

* El uso de promotores alternativos permite regular la expresión génica.

*

Transcripción eucariota

DNA: estructura

• Región reguladora: inicio de transcripción • Región codificante

– Exón– Intrón

• Señales de terminación.

Está determinada por factores de transcripción basales y por factores de

transcripción especializados (activadores o silenciadores/represores).En los genes eucariotas hay 3 tipos de secuencias génicas reguladoras: • El promotor• Las secuencias potenciadoras (intensificadoras ó enhancers). • Las secuencias silenciadoras (silencers)

Regulación de la transcripción en eucariotas

PromotorLos genes de eucariotas y procariotas, precisan de promotores para iniciar la transcripción.• Secuencias de reconocimiento específico para Factores de Transcripción que ayudan a la ARN pol a colocarse en el sitio de iniciación del gen. •Estructura modular_Región promotora: Secuencias adicionales para una alta actividad promotora

-80

-120

Es la región más próxima al inicio de la transcripción.

Secuencias potenciadoras (intensificadoras ó enhancers)

Entre estas se intercalan secuencias silenciadoras. Son bidireccionales y no tienen una localización precisa respecto al sitio de iniciación entre -200 ó -1000 (secuencia arriba ó secuencia abajo o en medio de un gen).

Pueden ejercer su efecto sobre promotores situados a miles de pares de bases de distancia.

A ellas se unen los factores activadores de la transcripción. Existen 2 tipos de Factores de transcripción basales:

a) Remodelan la cromatina: Modifican las histonas por acetilación (histone acetyle transferases = HAT’s), metilación, fosforilación, entre otras.

b) Los que interacción con RNA pol II

Transactivadores: son proteínas de unión a Secuencias Potenciadoras. Aumentan la frecuencia de iniciación de la ARNPol II vía CO-ACTIVADORES, tienen dos dominios:

1. Dominios de unión al DNA de secuencias potenciadoras (enhancers)2. Dominios de unión a factores Transcripcionales Co-activadores.

• Coactivatores: son necesarios para el ensamblaje del Aparato básico de la Transcripción. Permiten la comunicación entre RNA pol II y Transactivadores. Integran señales de los activadores y represores de la transcripción e interaccionan con los factores de transcripción basales.

Secuencias silenciadoras (silencers):Las están intercaladas entre las activadoras y a ellas se unen los represores (impiden la función de los factores activadores, disminuyendo la velocidad de transcripción).

Regulación de la transcripción en Eucariotas

Las proteínas enumeradas con el peso molecular son las subunidades de la ARN pol ll.

En eucariotas los nucleosomas reprimen la transcripción de todos los genes. Solo los genes activados son transcritos

Activación de la Transcripción

Los factores activadores de la transcripción, que cumplen las funciones: 1) Desempaquetar la cromatina

al disgregar los nucleosomas, y consiguen desenrollar la doble vuelta del ADN, para que la región promotora quede accesible.

2) Facilitan, a través de los coactivadores, el acoplamiento de los factores basales con la ARN polimerasa II.

3) Incrementar la velocidad de transcripción

Activación de la transcripción en eucariotas• Paso 1: DNA-binding transactivators (DBTs)

se unen a las secuencias intensificadoras.

• Paso 2: DBTs unen a los coactivatores con actividad HAT(Histona Acetil Transferasa) permitiendo la remodelación de la cromatina.

• Paso 3: DBTs también interactúan con el TFIID permitiendo que la TBP se una a la TATA box.

• Paso 4: Unión de la RNA pol II y formación del complejo básico de transcripción.

• Paso 5: Iniciación de la transcripción

Complejo de transcripción en EucariotasContiene 4 componentes:1) Proteínas de unión TATA, es un complejo de

proteínas que actúan como los factores de transcripción basales que se unen al promotor central.

2) Factores de transcripción basales llamados A,B,F,E y H.

3) Activadores y represores que regulan los factores basales.4) Proteínas coactivadoras que comunican a los factores basales y a los activadores.

Inicio de la transcripción en eucariotas

•La unión se realiza a través de la TBP (TATA Binding Protein) una subunidad del complejo TFIID. Provocando cambios conformacionales en la estructura del ADN.

Aparato Básico de transcripción: TFllD, TFllA, TFllB, TFllF, RNApol y TFllE.Complejo cerrado de transcripción: aparato básico de transcripción + TFllH

Formación del complejo de transcripción

Inicio de la transcripción en eucariotas• El complejo de preiniciación solamente proporciona unos niveles de

transcripción basales. Para alcanzar niveles de transcripción elevados se requieren otros factores de transcripción que se denominan activadores y que estimulan la actividad del promotor

T A C G A A C C G T T G C A C A T C

A U G C U U G G C A A C G U G

Transcripción:

2. Alargamiento: la síntesis de la cadena continúa en dirección 5'3'. Después de 30 nucleótidos se le añade al ARN una cabeza (caperuza o líder) de metil GTP en el extremo ‑5‘.

m-GTP

ARNpolimerasa

Extremo 5´del ARNm un resto de metil guanosina trifosfato ( protege de nucleasas y es reconocida como punto de inicio de la traducción).la enzima ARN polimerasa recorre la hebra molde en sentido 3´5´, mientras que la cadena del ARNm transcrito primario o preARN , continua creciendo en dirección 5´3´, a razón de 30 nucleótidos por segundo

• Alinear el ARNm sobre el ribosoma durante la traducción en el citosol.

• Evitar que el extremo 5’ del ARNm sea digerido por nucleasas.

• Ayudar a transportar el ARNm hacia fuera del núcleo.

La capucha es agregada enzimáticamente y consiste de un residuo de 7-metilguanosina unido en el extremo inicial (5´) por un enlace trifosfato (5´-5´).

TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN

• La ARNpol II sigue transcribiendo mas allá de la señal de terminación pasando a través de varias regiones AATAAA.

• Endonucleasa reconoce la secuencia TTATTT, que determina el final de la transcripción y la separación de la cadena de preARNm recién sinte-tizada de la hebra molde de ADN.

• El pre-RNAm que transporta esta señal en forma de AAUAAA se rompe por una endonucleasa que reconoce la señal y corta entre 11 y 30 residuos hacia el extremo 3’.

• Se añade una cola poli-A de 100-200pb mediante una polimerasa especial que no esta dirigida por un molde, el ARNm al añadirsele la cola poliA, es llamado = ARNm precursor. La cola poli-A, se mantiene también en el ARNm que se exporta al citoplasma, por lo que su función es: transportar al ARNm al citoplasma, permite estabilidad en la molécula de ARNm y a la vez ayuda con la traducción.

A U G C U C G U G

Transcripción Finalización:

m-GTP

poliA-polimerasa

U A G A A A A A

ARNm precursor

Sec. SeñalAAUAAA TTATTT

Endonucleasas cortan la molécula de pre−ARNm y una polimerasa poli−A añada unos 200 nucléotidos de A.

Terminación de la transcripción en eucariotas

ARNmprecursor

AAAAAAAUG UAG

cola

Maduración : El ARNm precursor contiene tanto exones como intrones. Se trata, por lo tanto, de un ARNm no apto para que la información que contiene sea traducida y se sintetice la correspondiente molécula proteica. En el proceso de maduración un sistema enzimático reconoce, corta y retira los intrones y las ARN ligasas unen los exones, formándose el ‑ ARNm maduro.

ARNmmaduro

Cabeza