3.- MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.- ANIMALES, MATERIALES Y EQUIPOS.

3.1.1.- ANIMALES.

Los experimentos se llevaron a cabo con ratas macho adultas. Se utilizaron

dos cepas de ratas: Sprague-Dawley procedentes del animalario de la Universidad

(SDU) y Wistar (W) procedentes de un proveedor externo (Harlan, España). Los

animales, en grupos de 3-4 por jaula, se mantuvieron con ciclos de luz-oscuridad de

12 horas, comida y agua ad libitum, y temperatura 20-22º C. Los experimentos in

vivo fueron llevados a cabo entre las 10:00 y las 14:30h.

Con antelación a los experimentos in vivo, los animales se acostumbraron al

ambiente donde tendrían lugar éstos, al menos durante las 24 horas previas.

Se siguieron las directrices éticas para la investigación de dolor experimental

en animales (Zimmermann, 1983).

3.1.2.- MATERIALES Y EQUIPOS.

En los correspondientes apartados de métodos se especifican algunos de los

materiales y equipos utilizados, el resto de los materiales se relacionan en la tabla V.

3.2.- MÉTODOS.

La metodología utilizada en este trabajo comprende estudios conductuales in

vivo para valorar distintas acciones opioides en rata, y estudios bioquímicos in vitro.

Los diferentes métodos utilizados se describen a continuación.

3.2.1.- ESTUDIOS DE CONDUCTA ANIMAL.

Con estos experimentos in vivo se ha pretendido analizar posibles diferencias,

a nivel conductual y en respuesta a opioides, entre las dos cepas de ratas en estudio.

56

MATERIAL Y MÉTODOS

3.2.1.1.- ESTUDIOS DE ANALGÉSIA.

Para determinar el grado de nocicepción basal y antinocicepción inducida por

analgésicos opioides se utilizaron los tests de retirada de la cola, placa caliente y test

de la formalina. Para determinar el grado de antinocicepción en el test de analgesia

inducida por estrés se utilizó el test de retirada de la cola.

3.2.1.1.1.- TEST DE RETIRADA DE LA COLA O TAIL FLICK.

El tail flick es un test nociceptivo de tipo térmico, en el que la respuesta

considerada como señal de nocicepción es la retirada rápida de la cola. En este

trabajo se utilizó el test de tail flick diseñado por D´Amour y Smith (1941) siguiendo

las modificaciones realizadas por Menéndez y cols. (1993).

Descripción del dispositivo.

Se ha utilizado un analgesímetro Socrel modelo DS-20 (Italia). Este

dispositivo dispone de una fuente lumínico-térmica de intensidad graduable, y de un

cronómetro, que conectado a una célula fotoeléctrica, registra con una exactitud de

0.1 segundos el tiempo de permanencia bajo el estímulo térmico.

Protocolo del método.

El animal fue cuidadosamente inmovilizado, envolviéndolo en un paño de

tacto suave, con objeto de que evitar en lo posible someterlo a una situación de

estrés.

Se determinó el tiempo de respuesta basal al estímulo nociceptivo térmico

(55-60º C) 3 veces (con intervalos superiores a un minuto), en cada rata

individualmente, y se estableció la latencia basal como el promedio de las tres

medidas. Los animales con latencia basal menor a 3 ó superior a 5, fueron excluidos

del estudio. Se calculó un valor de tiempo de permanencia máxima permitida (valor

de cut off), según la siguiente fórmula (Menéndez y cols., 1993):

cut off = latencia basal · 10 / 4.5

57

MATERIAL Y MÉTODOS

A continuación se inyectó el fármaco en estudio y se determinó, en el

momento de efecto máximo (previamente determinado) el tiempo que el animal

tardaba en retirar la cola (latencia). En ausencia de respuesta, y para evitar daño

tisular en el animal, se le retiraba la cola cuando transcurría un tiempo igual al cut

off.

Se realizaron curvas dosis-efecto antinociceptivo de morfina, metadona,

fentanilo y 3-d, con dosis acumulativas, siguiendo el método descrito por Adams y

cols (1990) y modificado por Paronis y cols. (1992). Este método consistió en que

tras la administración de la primera dosis del fármaco y la medición de su efecto en

el tiempo correspondiente al pico de efecto, previamente determinado (ver grupos de

estudio), se administraba una segunda dosis correspondiente a la diferencia hasta un

incremento logarítmico de 0.15 ó 0.30 de la dosis anterior, tal y como muestra la

siguiente fórmula:

d2 = 10 (0.15 ó 0.30 + log d1) – d1

Y así sucesivamente hasta un máximo de cinco dosis por animal y sesión. De

manera que si la primera dosis es de 1.2 mg/Kg la segunda administración es de 0.5

mg/Kg para así alcanzar una dosis acumulativa de 1.7 mg/Kg, y así sucesivamente.

Este método permite una considerable reducción en el número de animales

utilizados.

En el resto de los casos, se realizaron curvas dosis-efecto convencionales,

administrándose una sola dosis por animal y procediéndose a la medición de su

efecto en el tiempo correspondiente al pico de efecto previamente determinado.

58

MATERIAL Y MÉTODOS

Grupos de estudio.

Los distintos grupos experimentales con las diferentes dosis administradas, la

vía de administración y los tiempos de medición del efecto, se detallan a

continuación:

a) Grupos de agonistas opioides.

Se realizaron los siguientes grupos de tratamiento, con el fin de obtener

curvas dosis-efecto de los distintos agonistas opioides en ambas cepas de ratas.

• Morfina. Dosis: 0.30, 0.43, 0.60, 0.85, 1.20, 1.70, 2.50, 3.40, 4.80, 6.80 y

9.60 mg/Kg. Vía s.c. Tiempo de medición: 30 minutos tras la administración.

• Metadona. Dosis: 0.85, 1.20, 1.70, 2.50, 3.40 y 4.80 mg/Kg. Vía s.c. Tiempo

de medición: 30 minutos tras la administración.

• Fentanilo. Dosis: 2.5, 5.0, 10.0, 20.0, 30.0, 40.0 y 57.0 µg/Kg. Vía s.c.

Tiempo de medición: 20 minutos tras la administración.

• 3-d. Dosis: 0.15, 0.30, 0.60, 0.85, 1.20 y 1.70 mg/Kg. Vía i.p. Tiempo de

medición: 5 minutos tras la administración.

• U50488H. Dosis: 4.8, 9.6, 19.0 y 38.0 mg/Kg. Vía s.c. Tiempo de medición:

30 minutos tras la administración.

• SNC80. Dosis: 6.8, 9.6 y 13.5 mg/Kg. Vía i.p. Tiempo de medición: 15

minutos tras la administración.

b) Grupos de antagonistas.

Se realizaron los siguientes grupos de tratamiento con el fin de estudiar la

implicación en la mayor potencia antinociceptiva de morfina y de U50488H en SDU

de los receptores δ y κ (ver resultados, apartados 4.1.1.1. y 4.2.1.2).

• Naltrindol. De acuerdo a la pauta descrita por Ossipov y cols. (1995b), se

administró naltrindol (10 mg/Kg vía s.c.) 20 minutos previos a la

administración de distintas dosis de morfina (1.2, 3.4 y 9.6 mg/Kg, s.c.) o de

59

MATERIAL Y MÉTODOS

U50488H (19 mg/Kg). Transcurridos 30 minutos de la administración de

morfina o U50488H se determinó la latencia.

• Nor-binaltorfimina. Siguiendo la pauta descrita por Takemori y cols. (1988),

se administró nor-binaltorfimina (9,04 mg/Kg, s.c.) 90 minutos previos a la

administración de distintas dosis de morfina (0.6, 1.2, 1.7 y 3.4 mg/Kg s.c.) o

de U50488H (19 mg/Kg). Transcurridos 30 minutos de la administración de

morfina o U50488H se determinó la latencia.

Análisis de los resultados.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

El efecto antinociceptivo se evaluó en cada animal estudiado de forma

cuantitativa, midiendo éste como Porcentaje de Máximo Efecto Posible (%MEP),

que viene dado por la siguiente fórmula:

%MEP = 100 · (latencia – latencia basal / cut off – latencia basal)

Se consideró que los animales tenían el 100% de MEP si no respondían al

estímulo doloroso en un tiempo igual o superior a su valor de cut off, y se consideró

que tenían un 0% de MEP si la respuesta al estímulo doloroso tenía lugar en un

tiempo menor o igual a la latencia basal.

En el análisis estadístico de los resultados se utilizó el programa informático

GraphPad Prism (E.E.U.U.). Se compararon las curvas dosis-efecto obtenidas en

ambas cepas de ratas o con distintos tratamientos con un test de ANOVA de dos vías,

seguido de un test de Bonferroni para comparar los valores de %MEP en cada una de

las dosis de fármaco.

El test de ANOVA de dos vías permite analizar la influencia de dos factores

(en nuestro estudio dosis de agonista y cepa o tratamiento) sobre una variable

(%MEP), analizando los efectos de estos factores individualmente así como la

posible interacción existente entre ambos (Carrasco, 1986). De esta manera, permite

determinar si el valor de %MEP obtenido es dependiente de la dosis de agonista

60

log Dosis

Efec

to

log Dosis

Efec

to

MATERIAL Y MÉTODOS

empleada, de la cepa o del tratamiento, así como si las diferencias entre cepas o

tratamientos dependen de la dosis (es decir si las curvas dosis-respuesta no son

paralelas) (Motulsky, 1999) (figura 6).

Interacción (no paralelas)

No interacción (paralelas)

Figura 6. Ejemplo de curvas dosis-efecto paralelas y no paralelas, que hipotéticamente implican no interacción e interacción respectivamente.

61

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ajustaron las curvas dosis-efecto antinociceptivo, utilizando para ello el

programa informático SigmaPlot 8.0 (SPSS Science Software, Alemania), a la

siguiente ecuación:

%Unión = 100 / (1 + (D / DE50) nH)

Donde:

D: dosis de agonista.

DE50: dosis de fármaco precisa para alcanzar el 50% de efecto.

nH: coeficiente de Hill.

Los valores obtenidos de EC50, con el ajuste de las curvas, se compararon con

el test de la t de Student, considerándose significativas las diferencias a partir de

p<0.05.

3.2.1.1.2.- TEST DE LA PLACA CALIENTE O HOT PLATE.

El HP se trata de un test en el que el estímulo nociceptivo aplicado es de

naturaleza térmica. Las respuestas consideradas como señal de nocicepción son de

tipo elemental como el lamido de las patas y/o respuestas integradas a un nivel

supraespinal como el salto (Le Bars y cols, 2001). En este trabajo se utilizó el

método descrito por Woolfe y cols. (1944) con algunas modificaciones.

Descripción del dispositivo.

Se utilizó el analgesímetro Socrel modelo DS-37 (Italia). Este aparato consta

de una superficie metálica que mediante un sistema de resistencias eléctricas puede

mantenerse a la temperatura deseada. Posee también un cilindro de material plástico

transparente que permite el confinamiento del animal a la superficie caliente y la

observación de éste en todo momento. Así mismo dispone de un cronómetro que

permite registrar con una exactitud de 0.1 segundos el tiempo de permanencia bajo el

estímulo nociceptivo.

62

MATERIAL Y MÉTODOS

Protocolo del método.

El animal era colocado en la placa caliente la cual se mantenía a una

temperatura de 55±0.5º C. Se consideró como latencia el tiempo que transcurría entre

que la rata era puesta en esta superficie y comenzaba a lamerse las patas, saltaba o

realizaba tres elevaciones.

Se determinaron dos latencias para cada animal, y se consideró como latencia

basal la media de éstas.

Las ratas con latencia basal menores a 6 ó superiores a 14 segundos fueron

excluidas.

Se calculó un valor de tiempo de permanencia máxima (cut off), para cada

animal, según la fórmula (Shimomura y cols., 1971):

cut off = latencia basal · 2

La morfina se inyectó siguiendo el método de dosis acumulativas, como se

describe en el apartado 3.2.1.1.1. Transcurrido el tiempo correspondiente al pico de

efecto antinociceptivo previamente determinado, 30 minutos tras la inyección, se

determinó la latencia. En ausencia de respuesta nociceptiva en el tiempo de cut off, se

retiraba al animal del estímulo doloroso.

Mediante este test se estudió el efecto de morfina s.c. a dosis de 3.4, 4.8, 6.8,

9.6, 13.5 19.0 y 27.0 mg/Kg en ambas cepas de ratas:

Análisis de los resultados.

El efecto antinociceptivo se evaluó en cada animal estudiado de forma

cuantitativa, midiendo éste como %MEP de la misma manera que se ha especificado

en el TF, realizándose también el mismo análisis estadístico (apartado 3.2.1.1.1.).

63

MATERIAL Y MÉTODOS

3.2.1.1.3.- TEST DE LA FORMALINA.

Se utilizó el test de la formalina diseñado por Dubuisson y Dennis (1977),

siguiendo las modificaciones realizadas por Abbott y cols. (1995).

Se trata de un test de tipo químico en el que, a diferencia de los anteriores, se

utiliza un estímulo doloroso de larga duración (dolor tónico). Consiste en la

observación y cuantificación de la respuesta comportamental nociceptiva en un

animal al que previamente se le ha inyectado, intradérmicamente en una pata, una

solución de formol. La magnitud del dolor puede cuantificarse mediante la suma del

tiempo de lamido de la pata inyectada y de elevación de ésta (Abbott y cols., 1995).

La respuesta nociceptiva en el test de la formalina puede dividirse en dos

fases: inicial (durante los primeros 10-15 minutos tras la inyección) y tardía (desde

los 10-15 minutos hasta aproximadamente 60 minutos tras la inyección). Se piensa

que la fase inicial es resultado de la estimulación directa de los nociceptores,

mientras que la segunda o tardía corresponde a una fase de sensibilización en la que

intervienen fenómenos inflamatorios (Hunskaar y Hole, 1987).

Protocolo del método.

Con el fin de permitir la habituación al ambiente del test, el animal era

situado individualmente en una caja de material plástico transparente (30 x 30 x 80

cm), 20 minutos antes de iniciar el mismo. Transcurrido este tiempo se sacaba el

animal de la caja y se le inyectaba intradérmicamente, en la superficie dorsal de la

pata derecha delantera, 50 µL de una solución de formalina (1.5% ó 2.5%),

utilizando para ello una microjeringa Hamilton 1710LT (Suiza) con una aguja de

26G. La rata era luego colocada de nuevo en la caja para su observación.

Se determinó la respuesta nociceptiva basal, es decir a la inyección de

formalina al 1.5 y 2.5%, y la respuesta a formalina tras diferentes tratamientos con

agonistas y antagonistas opioides.

64

MATERIAL Y MÉTODOS

Grupos de estudio.

Los distintos grupos experimentales de tratamiento, con las dos

concentraciones utilizadas de formalina se describen a continuación:

a) Grupos en los que se inyectó formalina a una concentración de 1.5%.

• Grupo basal 1.5%. Recibieron únicamente la inyección de formalina al 1.5%.

• Grupos 1.5% con morfina. Se administró morfina (s.c.) a diferentes dosis

(1.2, 2.5 y 4.8 mg/Kg), 20 minutos antes de la inyección de formalina, en

distintos grupos de animales de ambas cepas.

b) Grupos en los que se utilizó formalina a una concentración de 2.5%.

• Grupo basal 2.5%. Recibieron únicamente la inyección de formalina al 2.5%.

• Grupo naltrindol. Se inyectó naltrindol (s.c.), a dosis de 1 mg/Kg, 20 minutos

antes de la formalina.

Análisis de los resultados.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

La nocicepción producida por la formalina se evaluó en cada animal de forma

cuantitativa, midiendo el tiempo que permanecía el animal lamiéndose la pata en la

que se inyectó la formalina o elevando ésta, en periodos de 5 minutos, a lo largo de

una hora.

Las comparaciones entre cepas y tratamientos se realizaron con el test de la t

de Student, analizando la suma de los valores de tiempo que el animal permanecía

lamiéndose o elevando la pata inyectada durante la primera fase de respuesta (0-15

minutos tras la inyección de formalina) y durante la fase de respuesta tardía (15-60

minutos tras la inyección de formalina).

Con la finalidad de obtener datos de la secuencia temporal, cuando

aparecieron diferencias basales entre las cepas SDU y W, se compararon las curvas

65

MATERIAL Y MÉTODOS

temporales obtenidas para ambas cepas de ratas. Para ello se utilizó el test de

ANOVA de dos vías, seguido de un test de Bonferroni para comparar los valores de

tiempo de lamido y elevación de la pata inyectada en cada uno de los periodos de 5

minutos.

3.2.1.1.4.- TEST DE ANALGESIA INDUCIDA POR ESTRÉS.

Se ha descrito que el estrés inhibe la respuesta al dolor tanto en animales de

laboratorio como en el hombre (Akil y cols. 1976; Willer y Albe-Fessard 1980).

La analgesia inducida por estrés puede ser de naturaleza opioide o no serlo,

dependiendo del estímulo que la provoque. Los estímulos que se han empleado para

inducir estrés experimentalmente son numerosos. En concreto se ha observado que al

utilizar baños de corta duración y a una temperatura próxima a 20º C, se obtiene una

analgesia inducida por estrés que es esencialmente de naturaleza opioide (Terman et

al, 1986; Jackson y Kitchen, 1989).

Protocolo del método.

Se utilizó el método descrito por Muhammad y cols (1993), con pequeñas

modificaciones. En primer lugar se determinó las latencias en TF de los animales sin

estresar, valores de latencia que se consideraron basales. Posteriormente el animal

era sometido al estímulo estresante que consistía en hacer permanecer al animal en

un baño (45 cm de diámetro x 40 cm de profundidad) de agua a 21º C, durante 3

minutos. Tras este periodo se secaba al animal y se volvían a determinar las latencias

de respuesta al TF a 1, 5 y 10 minutos tras el baño. El animal permaneció envuelto en

un paño de tacto suave entre las determinaciones de estas latencias.

Grupos de estudio

Los distintos grupos experimentales, en animales de ambas cepas, con los

diferentes fármacos administrados y sus correspondientes vías de administración se

detallan a continuación:

66

MATERIAL Y MÉTODOS

• Grupo no estresado. Se procedió igual que en el grupo estresado, pero en

lugar del baño, al animal tan solo se le mojaba la cola.

• Grupo estresado. Se procedió tal y como se describe anteriormente.

• Grupo tratado con naloxona. Además del estímulo estresante los animales

recibieron, 15 minutos antes del baño, naloxona s.c. (10 mg/Kg).

• Grupos tratados con naltrindol. Además del estímulo estresante se administró,

15 minutos antes del baño, distintas dosis de naltrindol i.p. (1 y 2.5 mg/Kg) a

los animales de estos grupos.

Análisis de los resultados.

El efecto analgésico se evaluó en cada animal estudiado de forma

cuantitativa, midiéndolo como %MEP, calculado según se describe en el apartado

3.2.1.1.1., pero en este caso se consideró como latencia el valor obtenido en los

animales sometidos al estímulo estresante. Así mismo, se consideró un %MEP de 0

cuando los animales sometidos a estrés tenían una latencia inferior a su propia basal.

Por otro lado, con el fin de estudiar la analgesia integrada durante el periodo

de estudio, se evaluó en cada animal, el área bajo la curva temporal de %MEP

(AUC).

El análisis estadístico de los resultados se realizó comparando las curvas

temporales de %MEP con un test de ANOVA de dos vías, seguido de un test de

Bonferroni para la comparación de los valores de %MEP en cada medición tras el

estímulo estresante. Además se comparó con el test de la t de Student los valores de

AUC obtenidos.

67

MATERIAL Y MÉTODOS

3.2.2.2.- DESARROLLO DE TOLERANCIA A MORFINA.

La tolerancia puede ser definida como la pérdida de efecto de una

determinada dosis de un fármaco tras su administración repetida. La tolerancia a

morfina puede inducirse con diferentes pautas de tratamiento, como implantación de

pellets, administraciones repetidas del fármaco, etc.

Protocolo del método.

El protocolo utilizado se resume en la tabla II. Para el estudio del desarrollo

de tolerancia a morfina se administraron dosis de este opioide cada 12 horas, durante

9 días consecutivos, analizándose el descenso del efecto antinociceptivo mediante el

test de TF en días alternos, y obteniéndose curvas dosis-efecto con dosis

acumulativas los días 1 y 9 para valorar el grado de desarrollo de tolerancia.

Tabla II. Esquema del diseño experimental realizado para la evolución del efecto antinociceptivo de morfina durante el tratamiento continuado con la DE100 de cada cepa y test.

Día 1 2 3 4 5 6 7 8 91ª administración DE100 X X X X X X X X X

30 min tras 1ª administración test test test test test2ª administración DE100 X X X X X X X X

68

MATERIAL Y MÉTODOS

Utilizando este protocolo, se han administrado distintas pautas de tratamiento

según la cepa con el fin de valorar el desarrollo de tolerancia a morfina con dosis

equianalgésicas.

Grupos de estudio.

Para valorar el descenso del efecto antinociceptivo de morfina en ambas

cepas de ratas, se utilizó la DE100 de morfina para cada una de las cepas, administrada

cada 12 horas durante 9 días, es decir, a los animales de la cepa SDU se administró

9.6 mg/Kg vía s.c., y a las de la cepa W 3.4 mg/Kg.

El noveno día de tratamiento se repitieron las curva dosis-efecto con dosis

acumulativas en ambos tests, utilizando para ello las dosis: 0.6, 0.85, 1.2, 1.7, 2.5,

3.4, 4.8, 6.8, 9.6 y 13.5 mg/Kg en los animales de la cepa SDU, y 1.7, 2.5, 3.4, 4.8,

6.8, 9.6, 13.5, 19.0, 27.0 y 38.0 mg/Kg en los de la cepa W.

Análisis de los resultados.

El efecto analgésico se evaluó en cada animal estudiado de forma

cuantitativa, midiendo éste como %MEP, calculado de igual manera a la descrita

previamente en el test de TF (apartado 3.2.1.1.1.).

El Índice de Tolerancia se calculó como el cociente entre la DE50 del 9o día y

la DE50 del 1er día.

El análisis estadístico de los resultados, se realizó comparando las curvas y

los valores estimados de DE50, como se describe en el apartado 3.2.1.1.1.

3.2.2.3.-SÍNDROME DE ABSTINENCIA PRECIPITADO POR NALOXONA.

El síndrome de abstinencia a opioides se manifiesta por una serie de signos y

síntomas que se caracterizan por ser opuestos a los efectos agudos de estos fármacos

(Koob y cols., 1992). En animales dependientes, la abstinencia puede ser precipitada

dramáticamente mediante la administración sistémica de antagonistas opioides. En

69

MATERIAL Y MÉTODOS

ratas, estas respuestas han sido caracterizadas por la aparición de una serie de signos

conductuales y fisiológicos (Way y cols 1969).

70

MATERIAL Y MÉTODOS

Protocolo del método.

Con el fin de estudiar el síndrome de abstinencia a morfina, se indujo la

dependencia a este fármaco mediante la administración repetida de dosis crecientes

de morfina i.p. durante seis días, como se describe en la tabla III. Debido a la

diferente potencia de morfina en SDU y W, en las primeras se utilizaron dos pautas

de tratamiento, con el fin de determinar si la mayor sensibilidad al efecto

antinociceptivo se acompaña de diferencias en el desarrollo de dependencia física.

El sexto día, transcurridas dos horas de la administración de morfina, se

desencadenó el síndrome de abstinencia mediante la administración de naloxona s.c.

(2 mg/Kg). A continuación, los animales se colocaron individualmente en una caja

de plástico transparente (30 x 30 x 80 cm), evaluándose signos somáticos (salto,

castañeteo de dientes y masticación) y fisiológicos (ptosis, diarrea, salivación,

pérdida de peso y variación de temperatura rectal) del síndrome de abstinencia

durante 30 minutos tras la administración de naloxona. Posteriormente se estableció

una puntuación global obtenida a partir de una ponderación de los distintos signos,

como se describe en el apartado de análisis de los datos (página 71 ), según el

método descrito por Maldonado y cols (1995).

Grupos de estudio.

• Grupo W dosis crecientes. Desde 9.6 hasta 48mg/Kg (tabla III).

• Grupo SDU dosis crecientes. Desde 9.6 hasta 48mg/Kg (tabla III).

• Grupo SDU dosis crecientes equianalgésicas. Desde 3.4 hasta 17mg/Kg (tabla

III).

71

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla III. Pautas de tratamiento utilizadas para inducir la dependencia física a morfina.

PautaDosis crecientes

(mg/Kg/12h)Dosis crecientes equianalgésicas

(mg/Kg/12h)Día SDU y W SDU1º 9.6 3.42º 9.6 3.43º 19.2 6.84º 38.4 13.65º 48.0 17.06º 48.0 / Nlx 17.0 / Nlx

Los controles de cada cepa fueron tratados diariamente con suero fisiológico

y se evaluaron de igual manera los signos del síndrome de abstinencia tras la

administración de naloxona.

Análisis de los resultados.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

La magnitud del síndrome de abstinencia se expresó de dos maneras:

1) Puntuación Global (PG), correspondiendo ésta al resultado de dividir entre

10 la suma de los valores obtenidos al multiplicar la puntuación de cada signo por su

correspondiente factor (Maldonado y cols., 1995):

• Nº de saltos. Factor = 7.

• Nº de veces que se sacude como un perro secándose. Factor = 5.

• Nº de veces que castañetea. Factor = 7.

72

MATERIAL Y MÉTODOS

• Nº de masticaciones. Factor = 5.

• Nº de periodos de 5 minutos en lo que aparece ptosis. Factor = 3.

• Nº de periodos de 5 minutos en los que padecen diarrea. Factor = 3.

• Nº de periodos de 5 minutos en los que aparece salivación. Factor = 7.

• % de pérdida de peso. Factor = 4.

• Variación de temperatura en grados. Factor = 4.

2) Magnitud de cada uno de los signos por separado.

El efecto del tratamiento sobre los distintos signos del síndrome de

abstinencia se analizó con el test de ANOVA de una vía, seguido del test Newman-

Keuls para las comparaciones entre grupos. Las comparaciones entre cepas se

realizaron utilizando el test de ANOVA de una vía.

3.2.2.4.- PREFERENCIA DE PLAZA CONDICIONADA POR MORFINA.

Este ensayo se utiliza ampliamente para determinar los efectos de recompensa

de fármacos y/o de recompensantes naturales. En este paradigma, las propiedades

motivacionales de un fármaco sirven como estímulo no condicionado, inicialmente

relacionado con un estímulo ambiental neutro que va adquiriendo, a lo largo del

condicionamiento, propiedades motivacionales de manera que puede actuar como

estimulo condicionado, originando atracción cuando el animal es posteriormente

expuesto a dicho estímulo (Tzschentke y cols, 1998).

Protocolo del método.

Se siguió el método descrito por Valverde y cols. (1996) para rata,

utilizándose una caja de material plástico dividida en dos compartimentos cuadrados

(45 x 45 x 30 cm), ambos accesibles desde un tercer compartimento rectangular (18 x

36 x 30 cm). Uno de los compartimentos tiene color negro y el suelo está constituido

por una rejilla, y el otro está pintado a rayas blancas y negras, con el suelo cubierto

de serrín. El área neutral que da acceso a los compartimentos tiene el suelo y las

paredes de color gris. La caja se situó en una habitación silenciosa, y con una

iluminación y temperatura constantes.

73

MATERIAL Y MÉTODOS

El criterio para considerar que una rata se encuentra en un determinado

compartimento, viene dado por que tenga dentro de éste la cabeza y las dos patas

delanteras.

El test constó de tres fases tal como se representa en la tabla IV:

1) Fase de precondicionamiento: Cada animal se colocó en el compartimento

neutral y se midió durante 22 minutos el tiempo que permaneció en cada uno de los

compartimentos. Si el animal permanecía más del 75% o menos del 25% del tiempo

de la sesión en uno de los compartimentos, se descartaba. Realizada esta fase, los

distintos animales se ordenaron por tiempo de permanencia en uno de los

compartimentos, y se les asignó el compartimento al que se les condicionaría con el

fármaco de forma correlativa y balanceada. Así, por ejemplo, si el animal que

permaneció más tiempo se le adjudicó al compartimento de paredes negras, al

siguiente se le adjudicó al de paredes rayadas y así consecutivamente.

2) Fase de condicionamiento: durante seis días consecutivos se alternó

inyección de vehículo y de morfina s.c. Tras la inyección de morfina, se colocó,

durante 25 minutos, al animal en el compartimento en el que se pretende condicionar,

impidiendo el paso al otro compartimento con una puerta. Al día siguiente se le

administró suero salino y se colocó al animal, durante el mismo tiempo en el otro

compartimento. Así, las ratas recibieron inyección de morfina los días 1, 3 y 5 y de

vehículo los días 2, 4 y 6.

3) Fase de test: se realizó exactamente igual que la fase de

precondicionamiento.

74

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla IV. Esquema del protocolo del test de preferencia de plaza condicionada con morfina.

Días0 1 2 3 4 5 6 7

▲ Δ ▲ Δ ▲ Δ

Precond. Condicionamiento TestFases

El ensayo consiste en tres fases denominadas fase de precondicionamiento (Precond.), fase de condicionamiento y fase de test. El día 0 se realizó la fase de precondicionamiento, durante la cual el animal podía moverse libremente entre ambos compartimentos. Durante los días 1 a 6 se realizó la fase de condicionamiento, en la que al animal se le inyectaba morfina (▲) los días 1, 3 y 5 y era confinado a uno de los compartimentos, y se le inyectaba salino (Δ) los días 2, 4 y 6 y se le confinaba al compartimento contrario. El día 7 se llevó a cabo la fase de test en la que el animal podía moverse libremente entre ambos compartimentos.

75

MATERIAL Y MÉTODOS

En este ensayo, una determinada dosis de un fármaco que tenga efectos

reforzantes positivos incrementará el tiempo que el animal permanece en el

compartimento asociado al fármaco durante la fase del test, con respecto al tiempo

que permaneció en él en la fase de precondicionamiento.

Grupos de estudio.

Los distintos grupos experimentales, de ratas de ambas cepas, correspondían

a ratas condicionadas con diferentes dosis morfina (1.25, 5.0 y 10.0 mg/Kg).

Análisis de los resultados.

Para cada animal se calculó el valor de puntuación, expresándose para cada

grupo la média ± error estándar. Tanto en la fase de precondicionamiento como en la

del test, el tiempo de permanencia en el área neutral era repartido proporcionalmente

entre los dos compartimentos según la fórmula:

Px = Tx · Ts / Ts – Tn

Donde:

Px: puntuación en el compartimento x.

Tx: tiempo que pasa el animal en el compartimento x.

Ts: tiempo total de la sesión.

Tn: tiempo que pasa la rata en el compartimento neutral.

La comparación entre las curvas dosis efecto de ambas cepas de ratas se

realizó mediante un test de ANOVA de dos vías. Así mismo en cada cepa este valor

se comparó con el obtenido en la fase de precondicionamiento con un test de

Dunnett.

76

MATERIAL Y MÉTODOS

3.2.3.- ESTUDIOS BIOQUÍMICOS.

Se han realizado una serie de estudios in vitro con el fin de dilucidar posibles

diferencias, a nivel receptorial y/o transduccional, entre las dos cepas de ratas en

estudio.

3.2.3.1.- PREPARACIÓN DE MEMBRANAS DE TEJIDO CEREBRAL.

Determinación de la actividad adenilato ciclasa.

La obtención de fracción microsomal se realizó, como se representa en la

figura 7, siguiendo el método descrito por Izenwasser y cols. (1993). En primer

lugar, tras la extracción del cerebro de cada animal se disecó el núcleo caudado-

putamen, homogeneizándose en 25 mL de tampón 1 (Tris-HCl 20mM pH 7.4,

conteniendo EGTA 2mM, MgCl2 1mM y sacarosa 250mM), utilizando para ello un

Polytron PT2100 (Kinematica AG, Suiza) a 22000 rpm, centrifugando

posteriormente el homogeneizado a 27.000xg durante 15 minutos a 4ºC. El

precipitado fue resuspendido en 25 mL del tampón anterior y se centrifugó de nuevo

como se ha descrito. Se desechó el sobrenadante y el precipitado final se

homogeneizó en 30 volúmenes de tampón 2 (Tris-HCl 2mM pH 7.4 y EGTA 2mM),

mediante homogeneizador de teflón-vidrio, tras lo cual se alicuotó y se guardó a

-70ºC hasta su uso. La concentración de proteínas se determinó, como en los

siguientes casos, utilizando el método descrito por Bradford (1976).

77

MATERIAL Y MÉTODOS

Disección del tejido (Caudado-Putamen).

Homogeneización con Polytron en 25 mL de tampón 1.

Centrifugación 27000Xg, 15 minutos, 4ºC.

Resuspensión precipitado en 25 mL de tampón 1.

Desechar sobrenadante.

Centrifugación 27000Xg, 15 minutos, 4ºC.

Resuspensión precipitado en 30 volúmenes de tampón 2.

Desechar sobrenadante.

Determinación concentración de proteínas. Determinación de la actividad adenilato ciclasa.

Figura 7. Esquema del método de obtención de membranas para la determinación de la actividad adenilato ciclasa, según Izenwasser y cols. (1993).

78

MATERIAL Y MÉTODOS

79

MATERIAL Y MÉTODOS

Unión de radioligandos y análisis de la activación de los receptores.

Se siguió el método descrito por Fang y cols. (1994) con ligeras

modificaciones (figura 8). Inicialmente, tras el sacrificio de los animales por

decapitación, se extrajo el cerebro (desechando el cerebelo) o la médula espinal y se

troceó y homogeneizó en 10 volúmenes de tampón A (Tris-HCl 50mM pH 7.4,

MgCl2 5mM) mediante un Polytron ajustado a 22000 rpm durante 15 segundos,

repitiéndose el proceso 3 veces, dejándolo reposar en hielo 2 minutos entre cada

homogeneización. El homogeneizado se centrifugó a 48000xg durante 15 minutos a

4ºC. El precipitado obtenido se resuspendió en 20 volúmenes de tampón B (Tris-HCl

50mM pH 7.4, EDTA 1mM, NaCl 100mM, GDP 100µM, conteniendo como

inhibidores de proteasas leupeptina 10µM y PMSF 100µM), incubándose a 25ºC

durante 30 minutos para disociar los péptidos endógenos opioides y saturar la

subunidad α de las proteínas G con GDP. Una vez terminada esta incubación se

centrifugó como antes y se lavó el precipitado tres veces en 20 volúmenes de tampón

A cada vez, para eliminar el Na+ y el GDP. El precipitado final se resuspendió en el

mismo tampón, se sonicó utilizando un sonicador Sonifier 450 (Branson, E.E.U.U.),

se alicuotó y tras congelarse con nitrógeno líquido se almacenó a -70ºC hasta su

utilización.

80

MATERIAL Y MÉTODOS

Disección del tejido (Cerebro menos cerebelo o médula espinal).

Homogeneización en 10 vol de tampón A.

Centrifugación 48000Xg, 15 minutos, 4ºC.

Resuspensión del precipitado en 20 vol de tampón B.

Desechar el sobrenadante.

Incubación 25ºC 30 minutos.

Centrifugación 48000Xg,15 minutos, 4ºC

3 vecesDesechar sobrenadante. Precipitado

Resuspensión del precipitado en 20 vol de tampón A

Resuspensión en tampón A

Sonicación y congelación a -70ºC

Determinación concentración proteínas. Utilización.

Figura 8. Esquema del método de obtención de membranas para en los experimentos de unión de radioligando y de activación de receptores, según Fang y cols. (1994).

81

MATERIAL Y MÉTODOS

3.2.3.2.- DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ADENILATO

CICLASA.

Para obtener una medida bioquímica del síndrome de abstinencia se

determinó la actividad adenilato ciclasa en homogeneizado de caudado-putamen, en

animales dependientes de ambas cepas.

Protocolo del método.

En primer lugar, se ajustó el homogeneizado de tejido (20µg de proteína en

10µL de tampón 2) a un volumen final de 60µL con tampón C frío, obteniéndose una

concentración final de Tris-HCl 80mM pH 7.4, MgSO4 1mM, EGTA 0.8mM, NaCl

30mM, ATP 0.25mM, GTP 0.01mM y Teofilina 10mM como inhibidor de la

fosfodiesterasa, mantenido la muestra en hielo. Las muestras se incubaron por

duplicado durante 5 minutos a 30ºC, deteniéndose la actividad adenilato ciclasa

mediante incubación de las muestras en un baño de agua hirviendo durante 2

minutos. A continuación, se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 minutos en una

microfuga (Beckman, E.E.U.U.) y se recogió el sobrenadante. La actividad adenilato

ciclasa se determinó en este sobrenadante mediante la cuantificación de los niveles

de AMPc formado. Para ello se utilizó el kit Cyclic AMP[3H] assay system

(Amersham, Reino Unido), basado en el ensayo de unión a proteína de [3H]AMPc

(Brown y cols, 1971; Puttfarcken y cols, 1986). Este kit utiliza la competición entre

el AMPc no marcado y una cantidad fija de [3H]AMPc para fijarse a una proteína de

unión que presenta una elevada afinidad y especificidad hacia el AMPc (figura 9).

[3H]AMPc [3H]AMPc-Proteína unión +

Proteína unión + +

AMPc AMPc-Proteína unión

Figura 9. Esquema de la competición del AMPc generado con una cantidad fija de [3H]AMPc, por la proteína de unión.

82

MATERIAL Y MÉTODOS

El método consistió en añadir [3H]AMPc (concentración final 4nM) y

proteína de unión (100µL) a cada sobrenadante. Tras la incubación a 4ºC durante 2

horas, se añadió carbón activo y se centrifugaron para separar el [3H]AMPc libre del

unido a la proteína de unión. El sobrenadante se llevó a viales de centelleo a los que

se añadió 5 mL de líquido de centelleo Ready SolvTM HP (Beckman, E.E.U.U.), y la

radioactividad se midió en un contador de centelleo líquido Wallac 1410

(Pharmacia, E.E.U.U.). Paralelamente se realizó la recta patrón correspondiente,

utilizando concentraciones crecientes de AMPc (0, 1, 2, 4, 8, 16 pmol/tubo).

También se midió la radioactividad total de [3H]AMPc, y de un blanco que no

contenía [3H]AMPc.

Análisis de los resultados.

Se obtuvo la recta patrón representando el cociente entre las cpm

correspondientes al tubo que no contiene AMPc y las cpm correspondientes a cada

tubo (C0/Cx) frente a los pmoles de AMPc adicionados a cada uno de ellos.

De esta manera, a partir de los valores de cpm de las distintas muestras, se

obtuvo, a través de la curva patrón, la concentración de AMPc presente en cada una

de ellas. Este valor sirvió para determinar la actividad adenilato ciclasa expresada en

pmoles de AMPc/mg de proteína/minuto, que se expresó como media ± error

estándar.

En cada cepa las comparaciones entre grupos de la actividad adenilato ciclasa

se se realizaron con el test Newman-Keuls. Las comparaciones entre cepas se

realizaron utilizando el test de la t de Student.

3.2.3.3.-CARACTERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES OPIOIDES:

ESTUDIOS DE UNIÓN DE RADIOLIGANDO.

Los radioligandos utilizados para la caracterización de los receptores opioides

fueron [3H]naltrindol (Actividad específica 60.0Ci/mmol, Tocris, Reino Unido),

83

MATERIAL Y MÉTODOS

[3H]U69593 (Actividad específica 57.0Ci/mmol, Amersham, Reino Unido) y

[3H]DAMGO (Actividad específica 60.0Ci/mmol, Amersham, Reino Unido).

Protocolo del método.

A.- Estudios de fijación de [3H]DAMGO.

Para realizar los estudios de unión de [3H]DAMGO se incubaron las muestras

por duplicado con tampón A en un baño con agitación, a 25ºC durante 1 hora,

conteniendo en un volumen final de 1 mL: membranas de cerebro (200µg de

proteína), concentraciones crecientes de [3H]DAMGO (que, en las concentraciones

superiores a 1nM se diluyó a razón 1/10 con DAMGO frío) en los experimentos de

saturación, o [3H]DAMGO 1nM y concentraciones crecientes de ligando frío en los

experimentos de desplazamiento. En ambos casos la unión inespecífica se determinó

incubando las muestras con naloxona 10µM.

Tras la incubación, se filtraron las muestras con filtros de microfibra de vidrio

GF/B (Whatman, Reino Unido) bajo vacío, sumergidos previamente durante más de

una hora en tampón A con polietilenimina al 0.5%, utilizando un Cell Harvester M-

24R (Brandel, E.E.U.U.). Tras la filtración, los filtros se lavaron tres veces con 3 mL

de tampón A frío, se depositaron en viales de centelleo, y se añadió 5 mL de líquido

de centelleo. Se incubaron toda la noche y se determinó la radioactividad con un

contador de centelleo líquido. Los resultados se expresaron en cpm.

B.- Estudios de fijación de [3H]U69593.

Para los estudios de fijación de [3H]U69593 se incubaron las muestras por

duplicado en tampón A en un baño con agitación a 25ºC, durante 1 hora, conteniendo

en un volumen final de 1 mL: membranas de cerebro (750 a 900µg de proteína),

concentraciones crecientes de [3H]U69593 (que se diluyó a razón 1/10 con U69593

frío en las superiores a 1nM) en los experimentos de saturación, o [3H]U69593 1nM

y concentraciones crecientes de ligando frío en los experimentos de desplazamiento.

De igual manera que en el caso anterior, para la determinación de la unión

inespecífica las muestras contenían una concentración 10µM de naloxona.

84

MATERIAL Y MÉTODOS

Tras la incubación se filtró y determinó la radioactividad retenida en los

filtros, exactamente igual que en el caso de los estudios con [3H]DAMGO, con la

diferencia de que en este caso los filtros fueron tratados con polietilenimina al 0.1%.

C.- Estudios de fijación de [3H]NALTRINDOL.

Los experimentos de unión de [3H]naltrindol se realizaron siguiendo el

método descrito por Fang y cols. (1994) con ligeras modificaciones. Se incubaron las

muestras por duplicado en tampón A durante 5 horas con agitación a 25ºC. Éstas

contenían en un volumen final de 1 mL: membranas de cerebro (160 a 200µg de

proteína), concentraciones crecientes de [3H]naltrindol en los experimentos de

saturación, o [3H]naltrindol 1nM y concentraciones crecientes de ligando frío en los

experimentos de desplazamiento. Para la determinación de la unión inespecífica las

muestras contenían además una concentración 80nM de naltrindol frío.

Tras la incubación se filtró, y determinó la radioactividad retenida en los

filtros, exactamente igual que en el caso de los estudios con [3H]DAMGO.

Análisis de los resultados.

A.- Experimentos de saturación.

Los resultados se ajustaron, a un modelo de saturación de un solo sitio (1) y a

uno de dos sitios (2), utilizando para ello el programa informático SigmaPlot 8.0,

para posteriormente comparar ambos ajustes con un test F.

(1) Modelo de saturación de un sitio.

B = {[L*] · Bmax / (Kd + [L*])} + NS · [L*]

Siendo:

B: unión total.

[L*]: concentración de radioligando.

Bmax: cantidad total de receptores.

Kd: constante de disociación.

85

MATERIAL Y MÉTODOS

NS: unión inespecífica.

(2) Modelo de saturación de dos sitios.

B = {Bmax1 · [L*] / (Kd1 + [L*])} + {Bmax2 · [L*] / (Kd2 + [L*])} + NS · [L*]

Donde:

Bmax1 y Bmax2: cantidad total de cada uno de los dos sitios reconocidos con

distinta afinidad.

Kd1 y Kd2: constantes de disociación de cada uno de los dos sitios.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

B.- Experimentos de desplazamiento.

En este caso, utilizando el programa informático SigmaPlot 8.0, los valores

experimentales se ajustaron a un modelo de Hill (1), y en aquellos casos en que el

coeficiente de Hill obtenido fue inferior a la unidad se comparó el ajuste a un modelo

de un solo sitio de unión (2) y a uno de dos sitios de unión (3) mediante un test F.

(1) Modelo de Hill.

B = Bmin + (Bmax-Bmin) / (1 + ([L] / IC50) nH)

Donde:

B: porcentaje de unión específica.

Bmin y Bmax: mínimo y máximo de unión respectivamente.

[L]: concentración de ligando frío.

IC50: concentración de ligando precisa desplazar el 50% de la unión máxima.

nH: coeficiente de Hill.

(2) Modelo de un sitio de unión.

B = Bmin + (Bmax-Bmin) / (1+([L]/IC50))

86

MATERIAL Y MÉTODOS

(3) Modelo de dos sitios de unión.

B = Bmin + (Bmax-Bmin) · ((F1/(1+([L]/IC501))+(1-F1)/(1+([L]/IC502)))

Donde:

F1: fracción de sitios reconocida por el ligando frío con alta afinidad.

IC501: concentración de ligando frío precisa para desplazar al radioligando del

50% de los sitios de alta afinidad.

IC502 es la concentración de ligando frío precisa para desplazar al

radioligando del 50% de los sitios de baja afinidad.

El valor de Ki, para los distintos ligandos fríos, se calculó a partir del valor de

IC50 mediante la fórmula descrita por Cheng y Prusoff (1973):

Ki = IC50 / 1 + [L] / Kd

Siendo:

Ki: constante de inhibición.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

3.2.3.4.- ANÁLISIS DE LA ACTIVACIÓN DE LOS RECEPTORES

OPIOIDES: ESTUDIO DE LA ESTIMULACIÓN DE LA UNIÓN DE GTP-γ-

[35S].

Puesto que los receptores opioides son receptores acoplados a proteína G,

para estudiar posibles diferencias entre cepas en la funcionalidad de éstos se estudió

la unión de GTP-γ-[35S] (Actividad específica 1000Ci/mmol, Amersham, Reino

Unido) a membranas de cerebro o médula espinal inducida por distintos agonistas

opioides, así como por combinaciones de éstos.

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MATERIAL Y MÉTODOS

Protocolo del método.

Para estudiar la estimulación de la unión de GTP-γ-[35S] por distintos

fármacos opioides, se siguió el método descrito por Sim y cols. (1995) con ligeras

modificaciones, empleándose las membranas de cerebro de ambas cepas de ratas

obtenidas según se ha descrito en el apartado 3.2.3.1.3. Las muestras, por duplicado o

triplicado, se incubaron a 30ºC durante 1 hora con agitación, en el tampón de ensayo

(Tris-Base 50mM pH 7.4, MgCl2 5mM, NaCl 100mM, EGTA 0.2mM), conteniendo:

GTP-γ-[35S] 0.05nM, GDP 30µM, membranas de cerebro (10µg de proteína), y

concentraciones crecientes del agonista en cuestión o concentraciones fijas de

combinaciones de agonistas (volumen final = 1mL). La unión basal se determinó

incubando las muestras en ausencia de agonista, y la unión inespecífica adicionando

GTP-γ-S frío 100µM.

Tras la incubación se procedió a la filtración y determinación de la

radioactividad como se ha descrito anteriormente, con la diferencia de que en este

caso los filtros GF/B se sumergieron previamente sólo con tampón A.

Análisis de los resultados.

Los resultados se expresaron como porcentaje de unión de GTP-γ-[35S]. Los

porcentajes de unión de GTP-γ-[35S] se ajustaron al modelo de Hill (1), y en aquellos

casos en que el coeficiente de Hill obtenido fue inferior a la unidad se comparó el

ajuste a un modelo de un solo sitio de unión (2) y a uno de dos sitios de unión (3)

mediante un test F, tal y como se ha descrito en el apartado 3.2.3.3.B., excepto que

en este caso los parámetros obtenidos eran EC50.

Los resultados se muestran como media ± error estándar.

Las comparaciones de los parámetros farmacodinámicos (EC50, Emax y

coeficiente de Hill) se realizaron mediante el test de la t de Student. También se

utilizó este test, para las comparaciones entre cepas de los valores de estimulación de

la unión de GTP-γ-[35S], en los estudios del efecto conjunto de agonistas selectivos.

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MATERIAL Y MÉTODOS

Fármacos y reactivos. ProveedorMorfina Clorhidrato Alkaliber

Metadona Dr. Esteve

Fentanilo Citrato RocheSNC-80

II-DeltorfinaTocris

Naloxona ClorhidratoNaltrindol Clorhidrato

U50488HU69593

nor-Binaltorfiminap-Cl-DPDPEGpp(NH)pLeupeptinaTeofilina

PMSFGDPGTPATP

Polietilenimina

Sigma-Aldrich

3d oxalato de N-[1-(4-fluorofenil)pirazol-3-il]-N-

[1-(2-feniletil)-4-piperidil)propanamida

Gentileza de la Dra. Mª Isabel Martín, Facultad de Ciencias de la Salud, Área de

Farmacología, Universidad Rey Juan Carlos.

Productos químicos generales

Sigma-AldrichPanreackJT Baker

Materiales ProveedorViales de centelleo Mini Poly-Q Vial (Beckman, E.E.U.U.)

Instrumentos. ProveedorEspectrofotómetro Biomate 3 (ThermoSpectronic, E.E.U.U.)

Tabla V. Materiales cuya procedencia no ha sido especificada en el capítulo Material y Métodos.

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