3.- Diagnostico Molecular
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN MEDICINA Agosto del 2007 La mayor parte de las mutaciones que causan enfermedades hereditarias son tan pequeñas que no pueden identificarse mediante análisis citogenéticos como cariotipos. I. Cuando existen deleciones de un segmento de un gen o de un gen completo, como en casos de Distrofia Muscular de Duchenne la deleción se puede identificar mediante: a) “Southern blot”. Utilizando una sonda (ADN complementario al gen de interés) marcada radiactivamente se observa la ausencia o una disminución en la longitud del segmento de ADN hibridizado. b) PCR. Utilizando oligonucleótidos iniciadores (sentido y antisentido) que flanquean cada uno de los exones de un gen se detecta ausencia de amplificación para los exones deletados. c) FISH. Utilizando una sonda de ADN fluorescente complementaria al gen de interés se observa ausencia de hibridación en el cromosoma afectado. Duplicaciones de genes y expansiones de nucleótidos. Cuando existen amplificaciones en el número de copias de un gen, como en el caso del oncogen myc asociado a Neuroblastoma en humanos, se puede detectar generalmente mediante: a) Southern blot. Se observa como un fragmento de mayor longitud o de mayor intensidad. También cuando existen rearreglos genéticos en que segmentos alejados de un gen son yuxtapuestos por recombinación, se pueden identificar por “Southern blot” como un fragmento de longitud anormal. Un tipo de expansión de nucleótidos analizados frecuentemente en clínica son los Microsatélites. Éstos son repeticiones en tándem de secuencias cortas de nucleótidos, generalmente de 2 a 20. Se encuentran dispersas a lo largo del genoma y algunas en la vecindad de algún gen. Aunque su función no se conoce son marcadores útiles de Polimorfismo y segregación cromosomal. Es decir, es posible asociar una mutación en un individuo directamente al cromosoma del padre o al de la madre. Estos Microsatélites pueden expanderse o deletarse y este suceso puede asociarse a alteraciones cromosomales que llevan al Cáncer; proceso que se conoce como Pérdida de Heterozigocidad (“LOH”). Para detección de mutaciones puntuales comunes conocidas, como por ejemplo en las enfermedades Anemia de Células Falciformes, algunos tipos de Talasemias, de Fibrosis Quística, Fenilcetonuria y Gaucher entre pocas otras, se pueden utilizar las siguientes aplicaciones de PCR: a) Hibridación con Oligonucleótido Específico de Alelo (ASO). En este método se aísla ADN genómico del paciente y se hace PCR con oligonucleótidos iniciadores cercanos al sitio de la mutación. El producto de PCR se hibridiza con un Oligonucleótido 100% complementario a la secuencia silvestre (normal) y con otro Oligonucleótido 100% complementario a la secuencia mutada. Este formato se utiliza con frecuencia en la tipificación molecular para antígenos de histocompatibilidad mayor (HLA-MHC).
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DIAGNSTICO MOLECULAR EN MEDICINA
Agosto del 2007
La mayor parte de las mutaciones que causan enfermedades hereditarias son tan pequeas que no pueden identificarse mediante anlisis citogenticos como cariotipos.
I. Cuando existen deleciones de un segmento de un gen o de un
gen completo, como en casos de Distrofia Muscular de Duchenne la delecin se puede identificar mediante:
a) Southern blot. Utilizando una sonda (ADN complementario al gen de inters)
marcada radiactivamente se observa la ausencia o una disminucin en la longitud del segmento de ADN hibridizado.
b) PCR. Utilizando oligonucletidos iniciadores (sentido y antisentido) que flanquean cada uno de los exones de un gen se detecta ausencia de amplificacin para los exones deletados.
c) FISH. Utilizando una sonda de ADN fluorescente complementaria al gen de inters se observa ausencia de hibridacin en el cromosoma afectado.
Duplicaciones de genes y expansiones de nucletidos. Cuando existen amplificaciones en el nmero de copias de un gen, como en el caso del oncogen myc asociado a Neuroblastoma en humanos, se puede detectar generalmente mediante: a) Southern blot. Se observa como un fragmento de mayor longitud o de mayor intensidad. Tambin cuando existen rearreglos genticos en que segmentos alejados de un gen son yuxtapuestos por recombinacin, se pueden identificar por Southern blot como un fragmento de longitud anormal.
Un tipo de expansin de nucletidos analizados frecuentemente en clnica son los Microsatlites. stos son repeticiones en tndem de secuencias cortas de nucletidos, generalmente de 2 a 20. Se encuentran dispersas a lo largo del genoma y algunas en la vecindad de algn gen. Aunque su funcin no se conoce son marcadores tiles de Polimorfismo y segregacin cromosomal. Es decir, es posible asociar una mutacin en un individuo directamente al cromosoma del padre o al de la madre. Estos Microsatlites pueden expanderse o deletarse y este suceso puede asociarse a alteraciones cromosomales que llevan al Cncer; proceso que se conoce como Prdida de Heterozigocidad (LOH).
Para deteccin de mutaciones puntuales comunes conocidas, como por ejemplo en las enfermedades Anemia de Clulas Falciformes, algunos tipos de Talasemias, de Fibrosis Qustica, Fenilcetonuria y Gaucher entre pocas otras, se pueden utilizar las siguientes aplicaciones de PCR:
a) Hibridacin con Oligonucletido Especfico de Alelo (ASO). En este mtodo
se asla ADN genmico del paciente y se hace PCR con oligonucletidos iniciadores cercanos al sitio de la mutacin. El producto de PCR se hibridiza con un Oligonucletido 100% complementario a la secuencia silvestre (normal) y con otro Oligonucletido 100% complementario a la secuencia mutada. Este formato se utiliza con frecuencia en la tipificacin molecular para antgenos de histocompatibilidad mayor (HLA-MHC).
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b) PCR Especfica de Alelo. Se utiliza un Oligonucletido iniciador, generalmente el Sentido con su ltimo nuclotido del extremo 3 complementario a la secuencia silvestre y otro Oligonucletido con el extremo 3 complementario a la secuencia mutada; con ambos oligos Sentido se acompaan del mismo oligo Antisentido. Solo habr producto de PCR cuando el oligo Sentido sea complementario a la secuencia blanco.
c) PCR y Anlisis de Enzima de Restriccin (PCR-RFLP). Algunas veces la mutacin crea o altera un sitio reconocido por una enzima de restriccin especfica. Es el ejemplo de la anemia de clulas falciformes y en algunos Polimorfismos o variaciones genticas. En estos casos se aisla ADN genmico y se amplifica mediante PCR la regin que contiene el sitio de la mutacin y despus se incuba con la enzima de restriccin especfica. Es muy til en clnica para tamizar varias muestras cuando se trata de mutaciones muy frecuentes.
ESCANEO MOLECULAR DE MUTACIONES. Cuando se sospecha que un gene puede estar mutado en cierta enfermedad, pero no se conoce el sitio exacto de la mutacin, el primer abordaje es recurrir a alguno de los siguientes mtodos para definir la regin o rea (p. Ej. Exones) en donde pueda estar la mutacin; una vez identificado el exn alterado, se procede a secuenciar el ADN para conocer la mutacin:
Polimorfismo de Cadena Sencilla de ADN (SSCP) y Anlisis de Heterodplices (HET).. Se aisla ADN genmico y se amplifican regiones codificantes (exones) del gen utilizando Oligos iniciadores separados por regiones de 150 a 200 pares de bases. Con fragmentos de este tamao es posible detectar cambios en la movilidad electrofortica de cadenas de ADN sencillas disociadas o de heteroduplex mutantes. Prueba de la Protena Truncada (PTT). Mutaciones que causan la lectura prematura de un codn de terminacin en el ARN mensajero producen protenas truncadas. Principalmente son mutaciones i) sin sentido, ii) por cambios de fase (de lectura del Cdigo Gentico) y iii) errores de empalme (procesamiento del ARNhn a ARNm). ste es el mtodo de eleccin para genes en donde prevalece la presencia de mutaciones truncantes, por ejemplo BRCA1 para cncer mamario, APC para cncer de colon, Distrofina para distrofia muscular. Es ms fcil a nivel de ADN que a nivel de ARNm, por el fenmeno de Decaimiento de ARNm sin sentido. (ver Regulacin de la traduccin). Microarreglos de ADN. Esta es una nueva tecnologa emergente en la cual secuencias de oligonucletidos son arregladas a alta densidad en renglones y columnas dentro del espacio de una laminilla de microscopa. La longitud puede ser desde menos de 10 nucletidos hasta ms de 100 y un espacio de unos pocos centmetros puede contener miles de secuencias diferentes que permiten analizar cientos de diferentes variaciones en la secuencia nucleotdica de un gene. Esta tecnologa se usa tambin para obtener perfiles de expresin gentica. Los genes que se expresan en un tejido estn representados en su poblacin de ARNm y este se puede extraer de tejidos tumorales para comparar los genes que aumentan o disminuyen en su expresin en comparacin al tejido normal. Western blot e inmunohistoqumica. Estos mtodos permiten identificar directamente la expresin de la protena. En el western (inmunotransferencia) la protena se identifica por su peso molecular
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mediante electroforesis y anticuerpos especficos. En la IHQ se utiliza el anticuerpo para detectar a la protena en cortes histolgicos que permiten su evaluacin en cuanto a su estado de expresin y de localizacin tisular.
Bibliografa.
- Devlin, TM. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas. 4.Ed Revert, 2004. - Baynes JW y Dominiczak. Bioqumica Mdica. 2.Ed, 2006. - Lodish H. Biologa Celular y Molecular. 5 Ed, 2005
![3.Diagnostico Delesiones Decaries.luz [Reparado]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/55cf970a550346d0338f6ef7/3diagnostico-delesiones-decariesluz-reparado.jpg)
