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3. Aplicaciones

3.1. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA A PLAGAS Y ENFERMEDADES

Las plantas, como otros seres vivos, se encuentran sometidas a condiciones am-bientales cambiantes, en muchas ocasiones a condiciones desfavorables, ante las cuales deben adaptarse para sobrevivir. Son muchos los organismos potencialmen-te perjudiciales para la planta, desde agentes infecciosos (virus, viroides, bacterias, hongos), hasta organismos consumidores de vegetales (insectos, nematodos). En la figura 1, se ilustran las grandes diferencias que se observan al comparar el tamaño de posibles organismos patógenos para las plantas con el tamaño de una célula vegetal. Cualquiera de estos organismos es capaz de interferir de una u otra manera en los procesos normales del desarrollo, crecimiento o reproducción de una planta.

En la naturaleza, sin embargo, la situación más frecuente es aquella en la que una planta no es el huésped natural de un organismo potencialmente patógeno, con lo cual no se produce ningún efecto perjudicial en la planta. Por el contrario, cuando una planta es huésped natural, se establece una interacción entre ambas partes, planta y patógeno, que puede concluir bien en el desarrollo de una enfer-medad (interacción planta-patógeno de tipo compatible), bien en una resistencia frente al patógeno agresor (interacción planta-patógeno de tipo incompatible).

Las enfermedades causadas por patógenos y plagas son la causa más im-portante de pérdidas en las cosechas, pudiendo representar hasta el 30-40% de las pérdidas en todo el mundo, y si a esto se añaden las pérdidas que se produ-cen en periodos postcosecha, el porcentaje asciende al 60-70%. No hay que ol-vidar que existe una limitación en la superficie cultivable de la tierra, por no de-cir una reducción progresiva de la misma a causa de la erosión del suelo, acumulación de productos tóxicos, etc. Por otra parte, la población mundial si-gue en continuo crecimiento. Ello hace que sea imprescindible la utilización de nuevas variedades de especies vegetales, sobre todo en aquellas especies desti-nadas a la alimentación, variedades que resulten más productivas, mejor adap-tadas al entorno, o más resistentes al ataque de patógenos y plagas.

* Blanca San Segundo. Departamento de Genética Molecular. Instituto de Biología Molecular de Barcelona. Centro de Investigación y Desarrollo (CID). Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Barcelona.

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Evidentemente, el control de enfermedades en plantas puede y debe abor-darse contemplando diferentes estrategias, el éxito o fracaso de cada una de ellas dependerá del problema concreto frente al que nos enfrentemos. Históricamente, la solución al problema de las enfermedades y las plagas se ha abordado con di-ferentes estrategias. En muchos casos la utilización de las técnicas tradicionales de entrecruzamiento de especies para la obtención de variedades resistentes ha resultado útil para la mejora genética de especies concretas. Hasta finales el si-glo XIX, los agricultores dependían exclusivamente de prácticas de cultivo or-ganizadas, esto es, de la alternancia de cultivos. El tratamiento con agentes quí-micos se inicia en la década de 1870 con la utilización de insecticidas (compuestos

Figura 1. Diagrama ilustrativo de los posibles patógenos de plantas y su relación con el tamaño de una célula vegetal. Tomado de Plant Pathology (1988).

APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 81

derivados del cobre y arsénico). Un hito importante fue la aparición del DTT (diclorodifeniltricloroetano), momento a partir del cual las compañías químicas rápidamente expandieron sus áreas de investigación hacia el desarrollo de pes-ticidas sintéticos. Estos agentes fueron extensamente utilizados en el periodo de 1940 a 1960. Fue entonces cuando surgió la crisis de los pesticidas, como consecuencia directa del uso indiscriminado de estos agentes, los cuales estaban siendo responsables de la aparición de resistencias en los organismos que se pretendían combatir, de la destrucción de poblaciones naturales beneficiosas, y de la deterioración progresiva del medio ambiente, además del impacto negativo que se observaba en la alimentación humana. Una nueva solución surgió, esta vez por parte de la comunidad de entomólogos, con el uso de programas integrados para el control de plagas (IPM, «Integrated Pest Management»). De esta manera, las plagas que afectan a los cultivos pueden ser combatidas mediante el empleo de enemigos naturales, es decir, mediante el empleo de organismos que son depredadores naturales del organismo perjudicial (lucha biológica o control biológico de plagas).

En la actualidad, son muchos los programas que se han desarrollado para el control de plagas y enfermedades. Por citar un ejemplo, mencionar el importante papel que los ácaros fitoseidos desempeñan en el control biológico de las pobla-ciones de ácaros fitófagos en cultivos de vid y frutales. En el caso del control de en-fermedades producidas por hongos, probablemente el ejemplo que mejor ilustra esta estrategia es el empleo de cepas del hongo Trichoderma para combatir hon-gos fitopatógenos. No obstante, el diseño de programas para el control integrado de plagas es lento en cuanto a su desarrollo y además resulta de difícil implanta-ción en la comunidad de agricultores. Para un agricultor resulta más complejo in-troducir un programa diseñado para el control biológico de una plaga concreta que, por ejemplo, seguir un calendario predeterminado de tratamientos químicos.

Fue a mediados de la década de los 90 cuando los avances de la biología mo-lecular se vieron reflejados en la agricultura. En la actualidad, la Biotecnología Vegetal, integrada de una manera adecuada con los sistemas de mejora genéti-ca tradicionales, representa una herramienta de gran utilidad para la obtención de variedades resistentes al ataque por patógenos o plagas. Una de las mayores ventajas de la Biotecnología Vegetal es que permite diseñar múltiples estrate-gias para la mejora genética de plantas, estrategias que además pueden ser apli-cadas a muy diferentes especies cultivables. Sin embargo, para llegar a este pun-to, esto es a la posibilidad de obtener plantas transgénicas resistentes a enfermedades, ha sido necesario recorrer un largo camino en el estudio de los procesos naturales por los cuales una planta se protege frente a organismos per-judiciales. En otras palabras, el esclarecimiento de los mecanismos moleculares asociados a la respuesta natural de defensa de las plantas y de los compuestos y proteínas que participan en este proceso, ha sido la clave del éxito de la moder-na biotecnología aplicada a la mejora genética de las plantas.

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3.1.1. Mecanismos de defensa en plantas

Las plantas presentan diferentes tipos de defensas. Entre ellas se encuentran las defensas «pasivas», que consisten en acumular en sus tejidos compuestos que pueden resultar tóxicos para microorganismos o fitófagos. Así, en muchos órga-nos (frutos, hojas, tubérculos) se acumulan compuestos fenólicos y taninos en ele-vadas concentraciones, compuestos que poseen propiedades antifúngicas frente a fitopatógenos {Botrytis, Phytophthora, Fusarium). Las saponinas son un ejem-plo de metabolitos con propiedades antifúngicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. No está claro, sin embargo, que una planta sea resistente a un pa-tógeno concreto por el mero hecho de acumular este tipo de compuestos.

En la mayoría de los casos, sin embargo, se produce una respuesta de defensa «activa» por parte de la planta, respuesta que está asociada a importantes cambios en la expresión génica.Todo ello conduce a la puesta en marcha de una serie de pro-cesos bioquímicos, que constituyen lo que se ha definido como resistencia inducida.

En algunas interacciones planta-microorganismo se observa una resistencia que viene determinada genéticamente, basada en el modelo gen-a-gen descrito por Flor ya en 1971. Estas resistencias presentan una alta especificidad en lo que hace referencia a los genotipos de ambas partes (cultivar en la planta huésped y raza del patógeno), ya que dependen de la interacción entre el producto de un gen de resistencia en la planta (gen R) con el producto de un gen de avirulencia complementario (gen avr) en el patógeno. En 1984 se clonó el primer gen de avi-rulencia de un patógeno (Pseudomonas syringae pv glycinea race 6), lo cual re-presentó la primera evidencia molecular que corroboraba el modelo gen-a-gen. Hubo que esperar casi diez años, hasta que se identifico el primer gen de resis-tencia, el gen Pío de tomate, que codifica para una quinasa serina/treonina. Des-de entonces, se han identificado numerosos genes de resistencia, tanto en mono-cotiledóneas como en dicotiledóneas, cuyos productos génicos correspondientes presentan una serie de características estructurales en común: repeticiones ricas en leucina, cremalleras de leucina, dominios de unión a nucleótidos, dominios transmembrana, dominios quinasa. La existencia de estos dominios estructurales, que se sabe participan en interacciones proteína-proteína, apunta a una función de los productos de los genes de resistencia como intermediarios en la serie de reacciones en cascada, muy probablemente dentro de la ruta de señalización para la activación de genes que participan en la respuesta general de defensa de la planta. Resulta particularmente interesante el hecho de que, además de la conservación que se observa entre los diferentes genes de resistencia vegetales descritos hasta la fecha, existe un subgrupo de genes de resistencia vegetales que presentan una gran similitud con dos proteínas animales, la proteína Toll de Dro-sophila y el receptor de interleukina-1, proteínas que están implicadas en el proceso de immunidad innata de insectos y mamíferos, respectivamente. Ello apunta a que plantas y animales pueden haber desarrollado mecanismos similares para

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defenderse de patógenos. Desde un punto de vista práctico, la elevada especifi-cidad que presentan las resistencias basadas en el modelo gen-a-gen, hace que en muchos casos no se disponga de variedades comerciales resistentes a cepas de patógenos establecidos localmente. Sin embargo, la disponibilidad de genes de resistencia tiene una clara aplicación para la mejora de las propiedades de resis-tencia en plantas transgénicas. Por citar un ejemplo, la introducción del gen de resistencia N de tabaco (el gen N que confiere resistencia al virus TMV en taba-co) en plantas de tomate ha permitido obtener líneas de tomate resistentes a TMV. Otro éxito de la biología molecular ha sido la aplicación de las técnicas de marcadores moleculares ligados a genes de resistencia para la identificación y se-lección temprana de genotipos en programas de mejora vegetal.

La situación más frecuente en la naturaleza es aquella en la cual la planta manifiesta resistencia frente a un patógeno o a un fitófago (insectos o nemato-dos) en función de la activación de mecanismos generales de defensa, o resistencia inducida. Este es un proceso complejo y a su vez altamente coordinado que está asociado a importantes alteraciones de la expresión génica en la planta huésped. En definitiva, se basa en la inducción de la expresión de genes de defensa, proceso que se desencadena como consecuencia directa del ataque por patógenos o predadores. En estas situaciones, no se trata de resistencias condicionadas genéticamente, y por tanto no presentan especificidad en cuanto a los genotipos del huésped y del patógeno. Es importante por tanto diferenciar un gen de resistencia de un gen de defensa vegetal.

3.1.2. Resistencia inducida frente a patógenos y fitófagos

Durante varias décadas, entomólogos y fitopatólogos han investigado de manera independiente las respuestas de las plantas bien frente a fitófagos bien frente a patógenos. A medida que se van conociendo los mecanismos molecula-res por los cuales las plantas se protegen frente a estos organismos, resulta ca-da vez más claro que se trata de procesos relacionados entre si.

La resistencia inducida en plantas presenta una serie de características ge-nerales. Un primer aspecto a considerar, es que en el proceso de resistencia in-ducida participan múltiples mecanismos y vías metabólicas, todo ello integrado de una manera sumamente coordinada. Un segundo aspecto, es la falta de es-pecificidad que se observa tanto en cuanto a los agentes inductores como a los organismos que resultan afectados por la respuesta de la planta. Como se verá a lo largo de este capítulo, esta idiosincrasia en la respuesta defensiva de las plan-tas es lo que en cierto modo permite modificar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos y plagas mediante transformación genética. Se de-sarrollan a continuación con más detalle cada uno de estos aspectos.

1. La resistencia inducida en plantas viene determinada por diferentes vías y mecanismos. Frecuentemente, la resistencia frente a determinados pa-


tógenos se manifiesta mediante la respuesta hipersensible. En este caso, las células que se encuentran en la proximidad del foco de infección su-fren una muerte controlada, hecho que contribuye a limitar la progresión de la infección del tejido. Hay un aparente paralelismo entre el fenóme-no de muerte celular programada que se produce en la respuesta hiper-sensible con el proceso de apoptosis en el sistema animal. Sin embargo, en muchos sistemas planta-patógeno la resistencia se produce en ausencia de esta respuesta hipersensible. Por otra parte, la resistencia puede ser loca-lizada, esto es, limitada al punto de infección o de ataque por un fitófago; en otros casos, se observa una resistencia sistémica, en zonas de la planta alejadas del punto de infección. Frecuentemente, se observa un efecto de Ímmunización en la planta según el cual una planta que ha estado expuesta y, ha superado una infección, se encuentra protegida frente a infecciones posteriores y no únicamente frente al patógeno inicial sino también fren-te a otros patógenos. Asimismo, esta protección se manifiesta no sólo en el tejido inicialmente infectado, sino también en puntos distantes de la planta. Este fenómeno es conocido como resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Acquired Resistance»). Por último, mencionar que al-gunas respuestas defensivas se desencadenan rápidamente, en cuestión de minutos u horas; otras por el contrario, se producen al cabo de varios dí-as después de la inducción. Esta diversidad de fenómenos y respuestas po-ne de manifiesto que la resistencia frente a patógenos y fitófagos se basa en la expresión de múltiples mecanismos que se integran en un proceso general coordinado de resistencia inducida. Las respuestas de defensa inducidas presentan una sorprendente falta de especificidad, no solo en lo que se refiere a las señales a las que la planta responde, sino también a los efectos que su respuesta produce. Son mu-chos los organismos capaces de desencadenar una respuesta defensiva en la planta, tales como virus, bacterias, hongos o tratamientos con agentes químicos, además de predadores, insectos y nemátodos. En determinados casos, patógenos y fitófagos pueden activar las mismas respuestas en la planta, mientras que en otros se activan respuestas diferentes. A pesar de esta multiplicidad de respuestas, resulta sorprendente el hecho de que el reconocimiento planta-patógeno sea un proceso altamente específico. Una vez la planta ha activado sus mecanismos de defensa en respuesta a un agente agresor concreto, se da la circunstancia de que estos meca-nismos pueden estar dirigidos, y ser efectivos, frente a una gran variedad de organismos. Esta respuesta de defensa de las plantas sólo se explica por la existencia de múltiples vías de señalización que desencadenan múltiples respuestas que pueden ser efectivas frente a un amplio es-pectro de organismos. Algunos de los componentes individuales que se producen pueden ser específicos mientras que otros pueden no serlo.


3.1.3. Las plantas sintetizan compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida

Las plantas desarrollan diferentes estrategias defensivas que van dirigidas a contrarrestar el paso o penetración del patógeno, o el consumo de las mismas por fitófagos. Una primera línea de defensa frente a patógenos es la creación de barreras físicas, a través del reforzamiento de la pared celular. Por ejemplo, se sabe que el metabolismo de los fenilpropanoides desempeña un papel impor-tante en la respuesta de defensa frente a patógenos (la incorporación de com-puestos fenólicos en la pared celular es una de las reacciones de defensa que ocurre más rápidamente). La lignificación, junto con la incorporación de prote-ínas estructurales en la pared (proteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina), tiene como resultado el reforzamiento de la pared vegetal y por lo tanto tiene un efecto obstaculizador a la penetración del patógeno. La forma-ción de depósitos de callosa en papilas, es una reacción que se observa frecuen-temente, tanto en respuesta al ataque por patógenos como en respuesta a heri-da (efecto que se produce cuando un fitófago se alimenta de la planta).

Asimismo, las plantas tienen la capacidad de sintetizar compuestos, metabo-litos o proteínas, que poseen ya un efecto nocivo directo sobre el organismos agresor, esto es, compuestos con actividad antimicrobiana o insecticida. Desde el punto de vista bioquímico, estos compuestos son de naturaleza muy heterogénea. Las fitoalexinas, compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, son también productos del metabolismo de los fenilpropanoides. Cada especie vegetal produce fitoalexinas características, cuya síntesis depende de la activación transcripcional de los genes que codifican para los diferentes enzimas involucrados en su biosíntesis (fenilalanina.amonio liasa, 4-cumarato:CoA ligasa, etc). Por citar unos ejemplos, la camalexina y la pisatina son fitoalexinas producidas por Arabidopsis y guisante, respectivamente. La síntesis y acumulación de fitoalexinas en los puntos de infección es una respuesta rápida por parte de la planta.

En líneas generales, dentro de la respuesta de defensa que conduce hasta la síntesis y acumulación de productos con actividad antimicrobiana o insecticida pueden distinguirse diferentes etapas:

— Iaetapa: Reconocimiento del organismo agresor por parte de la célula ve-getal. Una respuesta defensiva eficiente frente a un patógeno es depen-diente de la detección rápida de su presencia. Ello se produce a través de la unión de moléculas inductoras a receptores específicos localizados en la membrana de la célula vegetal. Estas moléculas, de naturaleza química muy diversa, pueden tener un origen externo (moléculas provenientes del patógeno), o interno (moléculas derivadas de la pared celular del hués-ped como consecuencia de la actividad degradadora por parte del pató-geno). El resultado de este reconocimiento, es la puesta en marcha de una serie de reacciones en cascada, en la propia membrana plasmática y lúe-


go en el citoplasma, que culminan en el núcleo de la célula vegetal con la inducción de la expresión de genes de defensa (Fig. 2). Las primeras re-acciones que se observan son alteraciones en el flujo de iones a través de la membrana (entrada de H+ y Ca 2+, salida de K+ y Cl~), y producción de moléculas reactivas de oxígeno (por la acción del complejo de oxidasas dependientes de NADPH , y peroxidasas). Más recientemente, se ha po-dido comprobar como el óxido nítrico, un poderoso activador de la res-puesta inmune animal, tiene una función importante en la respuesta de-fensiva de las plantas frente a patógenos. Estas moléculas (especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico), no sólo pueden tener un efecto tóxi-co directo sobre el patógeno, sino que además pueden actuar como mo-léculas señalizadoras para la activación de mecanismos de defensa (res-puesta hipersensible, activación de la expresión de genes de defensa).

— 2a etapa: Transmisión de la señal hasta el núcleo de la célula vegetal. El proceso que se desencadena con el reconocimiento del organismo agre sor al nivel de la membrana citoplasmática, hasta la activación transcripcional de genes de defensa, tiene todavía muchos puntos oscuros. Se sabe que participan procesos de fosforilación y defosforilación de pro teínas, procesos que son dependientes de los niveles de Ca++ citoplas- mático (Fig. 2). Por otra parte, se han identificado factores de transcrip ción que participan en la regulación de la expresión de genes de defensa concretos. La acumulación de los transcritos correspondientes a genes de defensa se detecta ya desde los minutos hasta las primeras horas, en el caso de aquellos genes cuya expresión se activa localmente en torno al lugar de infección o del ataque por un fitófago. En el caso de genes que se expresan sistémicamente, la acumulación de los transcritos de ge nes de defensa se observa desde las primeras horas hasta varios días más tarde. Quedan, sin embargo, muchos aspectos por aclarar para poder co nocer como se integran todos estos procesos dentro de la célula vegetal.

— 3a etapa: Acumulación de compuestos capaces de contrarrestar la pene tración de un patógeno o el consumo por fitófagos. Además de los com puestos anteriormente mencionados, tales como las fitoalexinas, las plan tas sintetizan y acumulan una serie de proteínas que de una manera genérica se han denominado proteínas asociadas a la patogénesis, o pro teínas PR (Pathogenesis-Related). Las proteínas PR son proteínas de la planta huésped cuya expresión se induce en situaciones de patogénesis, o en situaciones relacionadas. Las situaciones de patogénesis incluyen la infección por diferentes tipos de patógenos, virus, viroides, bacterias y hongos. Por situaciones relacionadas se entiende la herida (efecto aso ciado al ataque por predadores) y el tratamiento con agentes químicos u otros agentes inductores. El sistema mejor caracterizado en cuanto a la expresión de proteínas PR es el de la interacción de tabaco con el virus

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Pcroxinlh'ico ___ -.. Rcsistencia Sistemica Adquirida ( mediada por Acido Salicilico )

r Oxido Nitrico

Membrana plasmatica

Acido IInoleico

Figura 2. Componentes principaLes de La cadena que se inicia con el reconocimiento del pat6geno par receptores especfficos de la membrana pLasmatica y conduce hasta La activaci6n de La expresi6n de genes de defensa en el nucleo de la celula vegetal. Adaptado a partir de Somssich y Hahlbrock (1998).

TMV (TMV, «Tobacco Mosaic Virus»). La informacion recogida en el campo de las protefnas PR en muy diferentes sistemas de interaccion planta/patogeno ha permitido agrupar estas protein as en familias independientes, atendiendo a sus secuencias nucleotidicas 0 proteicas, relaciones serologicas 0 a su funcion (Tabla 1). Se ha demostrado la actividad antifungica, tanto in vitro como in vivo (plantas transgenicas), para varias protein as PRo Este serfa el caso de las quitinasas, ~-1,3-glucanasas, defensinas, tioninas y proteinas transportadoras de Ifpidos. Dentro de las proteinas PR, se ha incluido una familia de proteinas, los inhibidores de proteinasas (PR 6), cuya funcion esta directamente relacionada con la proteccion frente al ataque por predadores (insectos, nematodos). 4a etapa: Transmision de la sefial para la activacion de la respuesta de defensa en la planta entera. Las plantas activan sus defensas no solo en el punto concreto en el cual se produce la infeccion 0 el ataque por el fitofago (respuesta local), sino tambien en puntos distantes de la planta (respuesta sistemica). Se han descrito diferentes moleculas que, de una manera u otra, estan implicadas en la activacion de los mecanismos de defensa a escala sistemica. Asi por ejempl0, se sabe que el acido salicflico estimula la respuesta local de defensa de la planta, siendo ademas necesario que se acumule en niveles importantes en los tejidos de la planta para que se

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manifieste la respuesta sistémica adquirida. La posible función de la vía mediada por el ácido salicílico frente a fitófagos es un aspecto más des-conocido. Aunque el ácido salicílico es necesario para que se manifieste la respuesta sistémica adquirida, se piensa que no es la molécula señali-zadora que se mueve a través de la planta. Algunas rizobacterias no pa-togénicas activan una respuesta diferente, no mediada por ácido salicíli-co, y que también protege a la planta frente a virus, bacterias y hongos patogénicos. La particularidad de este mecanismo es que no va asociado a la reacción hipersensible ni a la producción de proteínas PR. Esta res-puesta ha sido definida como resistencia sistémica inducida (ISR, «Indu-ced Systemic Resistance») para diferenciarla del fenómeno de resistencia sistémica adquirida (SAR, «Systemic Adquired Resistance»). Otra vía de señalización de la respuesta de defensa a escala sistémica es-

TABLA 1 Familia de proteínas PR («Pathogenesis-Related»)

Familia Representante Propiedades/actividad

PR-1 PR-la de tabaco Desconocida

PR-2 PR-2 de tabaco (3-1,3-glucanasa

PR-3 Proteína P, Q de tabaco Quitinasa tipo I, II, IV, V, Vi y VII

PR-4 Proteína R de tabaco Quitinasa I y II

PR-5 Proteína S de tabaco Tipo taumatina

PR-6 Inhibidor I de tomate Inhibidor de proteinasas

PR-7 Proteína P69 de tomate Endoproteinasas

PR-8 Quitinasa de pepino Quitinasa tipo III

PR-9 Peroxidasa de tabaco Peroxidasa

PR-10 Proteína PR1 de perejil Tipo ribonucleasa

PR-11 Quitinasa clase V de tabaco Quitinasa tipo I

PR-12 Proteína Rs-AFP3 de rábano Defensina

PR-13 Proteína THI2.1 de Arabidopsis Tionina

PR-14 Proteína LTP4 de cebada Proteína transportadora de lípidos

Tomado de von Loon y col. (1999).


ta mediada por el etileno. Así, en respuesta a infección o herida se ob-serva una producción importante de etileno en la planta, seguido de un incremento de una serie de compuestos de defensa (lignina, proteínas PR, etc.). El ácido jasmónico. un regulador del crecimiento vegetal, tam-bién interviene en la respuesta de defensa de la planta frente a fitófagos y microorganismos. La sistemina. una hormona polipeptídica vegetal, y no el ácido jasmónico, es la molécula señalizadora que se transporta a través de la planta, activando la producción de jasmonatos. Por último, el ácido abscísico. otra fitohormona reguladora de diferentes procesos fi-siológicos de la planta implicada en estrés abiótico (p.e. sequía), también participa en la respuesta de defensa de las plantas frente a herida, pro-bablemente en una etapa anterior a la vía del ácido jasmónico. Depen-diendo de la especie vegetal, se observan diferencias en cuanto a la par-ticipación de cada una de las posibles rutas de señalización indicadas.

En definitiva, frente al ataque por patógenos y fitófagos se produce un re-ajuste importante en los procesos fisiológicos de una planta en el que participan múltiples vías de señalización mediadas por hormonas. Estas mismas hormonas, realizan funciones reguladoras de los procesos fisiológicos propios del desarro-llo de la planta. Por lo tanto, estas hormonas adquieren nuevas funciones con el fin de proporcionar a la planta una defensa rápida y efectiva.Un hecho com-probado es que las diferentes rutas de señalización interaccionan entre ellas, in-teracciones que pueden tener un efecto de sinergismo o de antagonismo. Por ejemplo, en tabaco se observa un efecto sinérgico entre etileno y metiljasmona-to en cuanto a la indución de genes PR. Por otra parte, se ha descrito que el ácido salicílico inhibe la ruta del ácido jasmónico y la acumulación de inhibidores de proteinasas. La existencia de esta multiplicidad de vías de señalización y de conexiones entre las mismas explicaría los efectos de resistencia cruzada que se observan frente a diferentes organismos, patógenos o fitófagos.

3.1.4. Respuesta de defensa frente a insectos

La respuesta que las plantas desarrollan frente al ataque por insectos es una res-puesta altamente sofisticada. Por una parte, se produce una respuesta directa según la cual la planta sintetiza y acumula en sus tejidos proteínas con actividad «insectici-da». Este es el caso de los genes para inhibidores de proteinasas. Estos inhibidores de proteinasas se acumulan de modo natural en órganos de reserva (tubérculo de pata-ta) y en semillas, pero además su expresión se induce en hojas como respuesta a he-rida (ataque por insectos). La función defensiva de estas proteínas reside en su capa-cidad para inhibir actividades proteoliticas de origen animal o microbiano, pero no de proteinasas vegetales. Así, éstos inhibidores de proteinasas inhiben las actividades proteoliticas digestivas de las larvas de insectos, cuando éstas se alimentan de la plan-

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ta, disminuyendo de esta manera la calidad nutricional del material del que se ali-mentan. Ello, además de producir un efecto disuasorio tal que el insecto deja de ali-mentarse, en muchos casos conduce a retrasos importantes en el crecimiento e inclu-so a la muerte del insecto. La inducción de la expresión de los genes de inhibidores de proteinasas se observa tanto a escala local como sistémica. De hecho, este ha sido el modelo más exhaustivamente estudiado en relación con las moléculas señalizadoras implicadas en la respuesta sistémica frente a herida en plantas (ácido abscísico, ácido jasmónico y sistemina). Estos estudios se han realizado fundamentalmente en sola-náceas (patata, tomate). Resulta interesante el hecho de que la ruta biosintética que conduce hasta la síntesis del ácido jasmónico en plantas (ruta de los octadecanoides) es similar a la ruta de biosíntesis de prostaglandinas y leucotrinas en animales. De nue-vo nos encontramos ante un paralelismo entre animales y plantas.

Pero además, las plantas se protegen frente a insectos por una vía indirecta, que consiste en la emisión de compuestos volátiles capaces de atraer a depreda-dores o parásitos que son enemigos naturales del fitófago que se encuentra ata-cando a la planta (Fig. 3). Además, la emisión de estos compuestos al entorno es capaz de activar las respuestas de defensa en las plantas vecinas. Más concreta-mente, se ha podido comprobar que en la saliva de determinados fitófagos se en-cuentran compuestos, p.e. la volicitina de las larvas de la polilla Spodoptera exi-gua, que son capaces de inducir la emisión de compuestos volátiles atrayentes de avispas depredadoras cuando las larvas se alimentan de plantas de maíz. De to-do ello se desprende el hecho de que una planta es capaz de discriminar entre una herida mecánica y el mordisco de un fitófago. Si bien los mecanismos por los cuales la planta regula la síntesis de estos compuestos volátiles no son del todo conocidos, se piensa que la vía de los octadecanoides, vía que la planta utiliza para regular la expresión de los inhibidores de proteinasas, también está implicada en este proceso de liberación de compuestos volátiles al medio ambiente.

3.1.5. Aplicaciones de la resistencia inducida en agricultura

Una práctica común en medicina preventiva es la vacunación o inmunización de pacientes por inoculación con cepas atenuadas de patógenos. Técnicas de «in-munización» han sido aplicadas para la protección de especies vegetales frente a enfermedades, si bien, ésta no es una práctica generalizada. En esta dirección, exis-te la posibilidad de inducir una resistencia de manera artificial en plantas mediante la aplicación de agentes químicos capaces de actuar como inductores de la res-puesta defensiva. La actividad de estos agentes inductores, no es una actividad an-tibiótica propiamente dicha, ni tampoco se debe a una modificación de los mismos hasta compuestos con actividad antimicrobiana. Por el contrario, estos agentes tienen la propiedad de producir un efecto de «vacunación» a través de la inducción de la expresión de los mecanismos naturales de defensa de la planta. De esta manera, la planta se hace más resistente frente a posteriores infecciones por pa-

APLICACIONES BIOTECNOL6GlCAS PARA MEJORAR LA RESISTEN CIA... 91

t6genos. Como ejemplo, cabe citar compuestos como el BTH y eIINA, inductores de la respuesta mediada por acido salicflico, capaces de desencadenar respuestas simi lares a la que se observan en respuesta a infecci6n por pat6genos. Eslas moleculas son ademas inductoras de la resistencia sistemica adquirida y producen un efecto protector frente a un amplio espectro de pat6genos. La utilizaci6n de elicitores qufmicos frente a fit6fagos se encuentra en una fase menos

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Figura 3. Respues ta de defensa de las plantas frent e al ataque por fit6fagos. En respuesla a l ataque por insectos fit6fagos y a la herida se induce la expresi6n de genes que codifican para inhibidores de prole inasas. Estos inhibidores lienen efectos nocivos en el proceso digestivo del insecto. causando el retraso en el crecimiento e incluso la muerte deimismo. Ademas la planta que est a siendo atacada e mile una serie de compuestos volati les que atrae a avis pas, que so n enemigos naturales del fit6fa go que se esta alime ntando de la planta. Adaptado a partir de Pare y Tumlinson (1999) .


desarrollada. Recientemente, se ha comprobado como la aplicación exógena de ácido jasmónico induce resistencia frente a fitófagos en plantas de tomate.

La «vacunación» de una planta con organismos vivos (agentes de control bio-lógico) tiene la ventaja de que proporciona todas las señales ante las cuales la plan-ta reacciona. Sin embargo, la situación más frecuente es que la aplicación de orga-nismos vivos puede resultar de difícil control. De ahí el interés que tiene el desarrollo de métodos de inmunización basados en la utilización de compuestos inductores de la respuesta defensiva en lugar de organismos vivos. A medida que se vaya ampliando nuestro conocimiento acerca de las rutas implicadas en la activación de las respuestas defensivas de las plantas, sin duda se ampliarán las posibilidades para la utilización de inductores químicos en la protección frente a patógenos y/o fitófagos. En último término, la aceptación de agentes químicos como inductores de resistencias en plan-tas por los agricultores vendrá determinada por consideraciones económicas, esto es, dependerá del coste que la utilización de esta estrategia implica para el agricul-tor y de los beneficios que ello representa para las compañías que producen y co-mercializan estos compuestos. Un aspecto negativo acerca del uso de estos com-puestos en agricultura es que su utilización extensiva podría tener consecuencias negativas desde el punto de vista medioambiental.

Sin duda, la utilización de genes de defensa para la transformación de plan-tas y obtención de variedades resistentes a plagas y enfermedades, ha tenido el impacto más importante en la agricultura moderna.

3.1.6. Obtención de variedades transgénicas resistentes a plagas y/o patógenos

Las técnicas de la biología molecular han contribuido enormemente al desa-rrollo y obtención de variedades que presenten mejoradas sus propiedades de re-sistencia frente a infección por patógenos, o frente al ataque por depredadores (insectos, nematodos). En el transcurso de los últimos años se ha recogido una gran cantidad de información acerca de los procesos de defensa naturales de las plantas y se han identificado una colección importante de genes que participan en dichos procesos. Es ahora cuando se están obteniendo los resultados prácticos del trabajo anterior, al aplicarse toda esta información y elementos de trabajo para la mejora genética de especies vegetales de interés en el sector agroalimentario.

De las propias características de la respuesta natural de defensa de las plan-tas, se desprende el hecho de que los genes de defensa vegetales resulten herra-mientas de utilidad en la mejora genética de especies vegetales. Tal y como se ha comentado anteriormente, la expresión de genes PR se induce de manera ines-pecífica no sólo con respecto al agente inductor sino también en cuanto al efecto que producen sobre el organismo agresor. Ello explica el hecho repetidamente observado de que un gen PR obtenido a partir de un sistema de interacción planta-patógeno concreto pueda ser utilizado con éxito para obtener resistencias


frente a otro tipo de patógeno, y ello no únicamente en la especie de la cual pro-viene dicho gen sino también en otras especies. El ejemplo que mejor ilustra es-tos aspectos es la utilización de genes que codifican para quitinasas y |3-l,3-giu-canasas de tabaco, genes cuya expresión se induce en respuesta a infección por el virus del mosaico del tabaco (TMV), y que han sido utilizados para la obtención de resistencias frente a hongos en otras especies, por ejemplo tomate.

Por otra parte, se sabe que la expresión de genes que codifican para proteí-nas de defensa se induce tanto en interacciones de tipo incompatible (resistencia frente al patógeno, incluyendo en respuesta hipersensible) como de tipo compa-tible (susceptibilidad frente al patógeno). Por lo tanto, la resistencia o la suscep-tibilidad frente a un patógeno, es dependiente de diferencias en: a) la intensidad con que se expresan estos genes de defensa; b) el momento o el tiempo durante el cual se expresan; c) los tejidos que los están expresando (expresión local o sis-témica), y d) la correcta combinación de genes que se expresan en cada caso. Por consiguiente, la modificación de cualquiera de estos parámetros (p.e. la sobreex-presión de un gen concreto en la propia planta) nos permite mejorar las propiedades de resistencia de una planta frente a patógenos o ataque por insectos.

La utilización de genes de defensa para la obtención de plantas transgenicas empezó a dar sus frutos en especies dicotiledóneas, debido a la facilidad con que estas especies pueden ser transformadas por una bacteria del suelo, Agrobacteñum. Esta bacteria, que infecta de modo natural muchas especies de plantas dicotiledó-neas, es capaz de integrar en el genoma de la planta huésped fragmentos de ADN, es decir, que lleva a cabo un proceso de transformación genética en la planta hués-ped. Las especies monocotiledóneas, y dentro de ellas especies de evidente interés agro-económico como son los cereales, han sido tradicionalmente especies más di-fíciles de transformar. Así pues, durante varios años la posibilidad de obtener plan-tas transgenicas resistentes de especies monocotiledóneas estuvo frenada por la metodología de la transformación propiamente dicha y por la dificultad de rege-nerar plantas fértiles a partir del material transformado. La técnica de bombardeo con microproyectiles ha venido a solucionar muchos de estos problemas. Así, la po-sibilidad de introducir ADN directamente en células, tejidos u órganos regenera-bles proporciona un método adecuado para la transformación de especies de cultivo. Simultáneamente, se han ido desarrollando las técnicas de transformación mediadas por Agrobacteñum, de manera que se ha ampliado significativamente el número de especies susceptibles de ser transformadas por esta metodología. Por ejemplo, se ha conseguido ya que Agrobacteñum transforme cereales (arroz).

En la literatura son muchos los ejemplos descritos, que demuestran que los genes PR son útiles para la obtención de plantas transgenicas mejoradas en sus propiedades de resistencia frente a patógenos, hongos y bacterias fundamen-talmente. En general, la expresión simultánea de estos genes de defensa, por ejemplo quitinasas junto con [3-1,3-glucanasas, tiene un efecto protector supe-rior al que aporta la expresión individual de cada uno de ellos. En el caso de qui-


tinasas y |3-l,3-glucanasas el mecanismo por el cual se consiguen las resistencias a hongos está claro, ya que los substratos naturales de estas hidrolasas, quitina y [3-1,3-glucano, son los componentes estructurales mayoritarios de la pared de muchas familias de hongos. Para otras proteínas PR, se desconoce el mecanis-mo exacto por el cual se produce esta resistencia.

Mientras que en el campo de las resistencias frente a hongos o bacterias ya se han obtenido resultados importantes mediante manipulación de la expresión de genes que codifican para proteínas de defensa de origen vegetal, no es éste el caso para las resistencias frente a virus. Únicamente, una proteína de la fami-lia de las proteínas inactivadoras de ribosomas (proteínas RIP, o «Ribosome Inactivating Protein»), al ser introducida en plantas de tabaco y patata protege parcialmente frente a varios virus no relacionados. Desgraciadamente, las plan-tas transgénicas muestran fenotipos anormales, aparentemente a causa de efec-tos tóxicos del producto del transgén. Más recientemente se ha comprobado que la expresión en plantas de tabaco de una forma mutada de esta proteína RIP tie-ne efectos protectores frente a virus sin que cause efectos tóxicos para la plan-ta. Los logros más espectaculares obtenidos en la protección frente a virus pro-vienen de estrategias diferentes. En este campo, se han conseguido muy buenos resultados en las resistencias definidas como «resistencias derivadas de patóge-no» («Pathogen Derived Resistance») basadas en la introducción de material ge-nético viral en el genoma de la planta huésped. Así, en 1986 se demostró por pri-mera vez que plantas transgénicas que expresan la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV) mostraban resistencia frente aTMV. Este mecanismo de resistencia determinado por la expresión de la proteína de cu-bierta ha sido observado para otros diferentes virus (CMV, «Cucumber Mosaic Virus», etc.). Se han descrito además resistencias mediadas por la introducción de otras secuencias virales, tanto secuencias codificantes (replicasas, proteínas de movimiento) como secuencias no codificantes (secuencias antisentido, ge-nomas defectivos y secuencias de ARN satélite). Se sabe ahora que en muchos casos estos mecanismos de resistencia se encuentran mediados por ARN. Se trata de procesos de degradación específica de las moléculas de ARN virales como consecuencia de la formación de moléculas híbridas (doble cadena de ARNs), mecanismos similares al fenómeno de cosupresión o silenciamiento post-trans-cripcional de genes endógenos por parte de la célula vegetal.

Sin embargo, las estrategias basadas en la utilización de genes que codifi-can para proteínas con actividad antimicrobiana de origen vegetal no han per-mitido hasta la fecha poder obtener variedades de interés comercial con mayor resistencia a patógenos o plagas, debido sobre todo al limitado espectro de hon-gos fitopatógenos frente a los cuales la planta resulta protegida. Muy probable-mente, ello se debe a que no se conoce todavía cuál es la combinación adecua-da, dentro del conjunto de genes que participan en la defensa, que es efectiva para combatir un número importante de patógenos. Es por ello, que en la ac-


tualidad se está dedicando un esfuerzo importante hacia la identificación de ge-nes de defensa de origen no vegetal para la mejora genética de plantas.

La idea de utilizar genes que codifican para proteínas o péptidos con acti-vidad antimicrobiana, que se producen en la respuesta natural de defensa de otros organismos para aumentar las propiedades de resistencia en plantas am-plia las posibilidades, y representa una estrategia alternativa a la utilización de genes de defensa de origen vegetal. Los organismos que potencialmente pueden resultar de mayor interés como fuente suministradora de genes antimicrobia-nos pueden ser hongos antagonistas o micoparásitos, como es el caso de Tri-choderma spp.. Estos hongos, que por otra parte son frecuentemente utilizados como controladores biológicos de hongos patógenos, han evolucionado específicamente para atacar a otros hongos del suelo, pero no a las plantas. Los genes que codifican para péptidos que participan en la respuesta inmune de insectos (defensinas, cecropinas) son también candidatos válidos para ser utilizados como transgenes en la mejora genética de plantas. A diferencia de lo que se observa con los genes de defensa de origen vegetal, los resultados ya obtenidos con la introducción de genes de defensa de origen no vegetal en plantas indican que las plantas transgénicas quedan protegidas frente a un espectro más amplio de patógenos.

La utilización de genes de origen no vegetal es precisamente una de las es-trategias que ha dado mejor resultado en relación a la protección frente al ata-que por insectos. Este es el caso de los genes que codifican para toxinas con ac-tividad insecticida de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (genes Sí). Así por ejemplo, los genes Bt han sido expresados en diferentes plantas dicotiledó-neas, tabaco, tomate, patata, así como en monocotiledóneas, maíz y arroz. De he-cho, es bien conocido el caso del maíz Bt, cultivo protegido frente al taladro, y uno de los primeros cultivos transgénicos que han sido comercializados.

Se han obtenido también resistencias frente a insectos mediante la intro-ducción de genes concretos de origen vegetal, genes que codifican para inhibi-dores de proteinasas (familia 6 de las proteínas PR). Así por ejemplo se han ob-tenido plantas transgénicas de arroz en las que se ha introducido el genpin2 (gen que codifica para un inhibidor de serín proteinasas de patata) bajo control de su propio promotor (inducible por herida), plantas que muestran resistencia a Sesamia inferens (lepidóptero minador del tallo). Sin embargo, el efecto de pro-tección observado tras introducir el gen de un inhibidor de proteinasas en una planta parece ser transitorio, en el sentido de que con el paso del tiempo los in-sectos han demostrado una capacidad de adaptación a la presencia del transgén en la planta huésped. Esta adaptación resulta del incremento en la producción de actividades proteolíticas no susceptibles de inhibición por el inhibidor so-breexpresado, y que compensan el efecto inhibidor inicial. Ello apunta a que deben emplearse estrategias que garanticen un efecto de protección más duradero, como puede ser la introducción de varios inhibidores de proteinasas que


presenten diferentes propiedades inhibitorias, es decir que inhiban diferentes tipos de actividades proteolíticas digestivas de los insectos.

La línea de investigación más actual va en la dirección de poder manipular mediante transformación genética vías concretas de señalización para la activa-ción de las respuestas de defensa. Ello permitirá regular la expresión de varios genes de defensa simultáneamente. La utilización de esta estrategia requiere no obstante un conocimiento preciso de la ruta de señalización que se desea modi-ficar, así como, de las posibles rutas secundarias que puedan resultar afectadas.

3.1.7. Nueva generación de plantas transgénicas

Son relativamente pocos los años que han transcurrido desde que se intro-dujo en el mercado mundial el primer cultivo modificado genéticamente (1995). En el año 1996, agricultores de Estados Unidos y Canadá sembraron maíz tole-rante al taladro, el maíz Bt. En 1999, aproximadamente el 50% del maíz, algodón y soja cultivado en Estados Unidos ha sido modificado genéticamente (bien para producir la proteína insecticida Bt, bien para introducir resistencia a herbicidas). Los cultivos transgénicos con los que más ensayos de campo se han realizado son algodón, maíz, cañóla, melón, patata, soja, tomate y tabaco. Las ventajas que se derivan de la utilización de estas variedades modificadas genéticamente incluyen el incremento en la producción y la reducción en el uso de productos químicos en el campo (pesticidas), con el consiguiente beneficio que ello supone para la con-servación del medio ambiente y la reducción de los costes de producción.

Paralelamente, durante este corto periodo de tiempo, la biotecnología ve-getal aplicada a la mejora de plantas ha sufrido un espectacular avance. Las ca-racterísticas de las nuevas variedades de plantas transgénicas, están significati-vamente mejoradas con respecto a las que se liberaron inicialmente. Se han superado así algunos de los aspectos criticados sobre la producción de plantas transgénicas que han sido el origen de importantes debates públicos que, en ma-yor o menor grado, dificultan la aceptación de estas tecnologías por la sociedad. En la percepción pública de los cultivos modificados genéticamente existen du-das y preocupaciones, en aspectos que quizás la comunidad científica no ha con-tribuido a aclarar suficientemente, pero ante los cuales existen soluciones con una base científica bien fundada. Sin entrar en detalles técnicos, examinaremos algunos de los aspectos considerados negativos en las plantas transgénicas de primera generación y las soluciones encontradas para cada uno de ellos.

Partiendo de la base de que se dispone de un gen concreto cuyo producto se sabe es efectivo para combatir un patógeno o plaga determinada, y que por tanto su utilización como transgen resulta de interés, el primer objetivo a conseguir es que el gen en cuestión se exprese en niveles adecuados y suficientes para conferir resistencia a la planta transgénica. Este objetivo anteriormente se conseguía me-diante la utilización de promotores (secuencias que dirigen la expresión de un gen)


constitutivos capaces de dirigir la expresión de genes antifúngicos o insecticidas en niveles importantes en los diferentes tejidos de la planta transgénica. Por el con-trario, la nueva generación de plantas transgénicas se basa en la utilización de pro-motores inducibles. De esta manera, el gen se expresará únicamente en aquellos momentos en los que es requerida la presencia de su producto (proteína antifún-gica o insecticida), o sea, cuando la planta se encuentra infectada por un patógeno o cuando es atacada por un fitófago. También con relación al promotor que se emplea para la transformación, otro aspecto al que se presta una atención especial es que el promotor confiera una expresión de tejido controlada, y no una expresión generalizada en todos los tejidos de la planta. Ello permite que la proteína antimicrobiana o insecticida se produzca únicamente en los tejidos de la planta que son susceptibles de ser atacados por el agente agresor, pero no en tejidos u órganos que se destinan al consumo humano. Por citar un ejemplo, es posible obtener una planta transgénica de maíz o arroz que exprese un gen insecticida (gen Bt, gen para un inhibidor de proteinasas) en las hojas y el tallo, tejidos de los que se alimentan las larvas de insectos, pero que dicho gen no se exprese en el grano.

Una crítica muy generalizada en la opinión pública es la incorporación de ge-nes que confieren resistencia a antibióticos en el genoma de las plantas transgéni-cas. La función de estos antibióticos es esencial en la etapa inicial del proceso para la obtención de plantas transgénicas ya que permiten la selección del material que ha sido transformado (permite el crecimiento de las células transformadas, frente a las que no lo han sido, en medios apropiados). Dejando aparte el hecho de que no se ha podido demostrar la existencia de transferencia génica horizontal, es-to es de que un gen de una planta pueda ser transferido a otros microorganismos, se han desarrollado estrategias que permiten prescindir de la utilización de genes de resistencia a antibióticos. Así por ejemplo, se pueden utilizar genes de selección que confieren resistencia a herbicidas o genes que producen fitohormonas. Otra alternativa válida es llevar a cabo la co-transformación del material vegetal con dos vectores diferentes, uno portador del gen de interés (antifúngico, insecticida) y el otro portador del gen para la selección del material transformado. De esta ma-nera, los genes se integran independientemente en el genoma de la célula vegetal para dar lugar a transformantes primarios portadores de ambos genes. Por tanto, es posible segregar (eliminar) el gen de selección de una línea transgénica, que-dando únicamente presente en su genoma el gen de interés, en generaciones pos-teriores. En definitiva, se trata de utilizar técnicas de transferencia de ADN más depuradas, que permitan introducir el gen de interés (angifúngico, insecticida) pe-ro no genes indeseables (p.e. genes de resistencia a antibióticos).

Otra preocupación general en el tema de las plantas transgénicas hace re-ferencia a la posibilidad de transmisión de un transgén a través del polen hasta variedades salvajes relacionadas. Sin embargo, existen metodologías que per-miten eliminar este posible factor de riesgo, como es el caso de la transforma-ción cloroplástica (introducción del gen de interés en el genoma del cloroplas-


to). El genoma de cloroplasto se hereda por vía maternal, de manera que el po-len no contiene ADN de cloroplastos.

Por último, el progreso que se observa en los programas de secuenciación de genomas (Arabidopsis, arroz) así como en la cartografía génica en especies vegetales, van a permitir en muy corto plazo de tiempo identificar nuevos genes, tanto genes de defensa como genes de resistencia, además de genes implicados en la regulación de la expresión de los mismos, y que sin duda van a ser de inte-rés para la mejora de especies vegetales de interés comercial. El reto que nos presenta ahora el siglo XXI es el ser capaces de llevar a cabo la transición hacia una agricultura sostenible que sincronice el nivel de producción agrícola con las necesidades de la población mundial, tanto en los países actualmente desarro-llados como en países subdesarrollados. La diversidad de recursos a nuestra dis-posición, junto con las nuevas técnicas biotecnológicas, nos permiten ser opti-mistas con respecto a la necesidad de alimentos a la que nos enfrentamos. Va a ser necesaria la utilización efectiva y combinada de todos nuestros materiales y recursos tecnológicos para superar este reto. Ello, además de exigir una dedica-ción al tema dentro de la propia comunidad científica, implica la creación de programas para la formación de personal científico y técnico de manera que es-ta metodología pueda introducirse en países en vías de desarrollo.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

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3.2. APROXIMACIONES BIOTECNOLOGÍAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A CONDICIONES AMBIENTALES EXTREMAS*

La disminución en el rendimiento de los cultivos se debe mayoritariamen-te al estrés, que puede ser de tipo biótico (ataque de insectos o patógenos) o abiótico (temperaturas extremas, sequía y salinidad). Este último es, con mucho, el responsable de las mayores pérdidas en la productividad agrícola (Fig. 1). La salinidad y la sequía son problemas especialmente importantes para la agricultura de tierras áridas y semiáridas. Por ejemplo, el problema de la salinidad afecta a 340 millones de hectáreas de suelo cultivado. Los efectos de la sal son lentos y acumulativos, apreciables en plazos que varían desde décadas hasta siglos, y difícilmente reversibles. Solamente el 10% de los terrenos de cultivo en todo el mundo se considera libre de todo tipo de estrés abiótico.

Una manera de incrementar los recursos agrícolas existentes es el empleo de nuevos tipos de cultivo que sean más resistentes a sequía, salinidad, y tem-peraturas extremas, así como la adaptación de nuevos terrenos para el cultivo que permita aumentar la productividad de las especies de interés agronómico.

La mayor dificultad que presenta el abordaje de este problema mediante las técnicas de mejora genética tradicional de las especies es que se trata de un proceso largo y laborioso y que no siempre es posible modificar un carácter de-terminado. Sin embargo la ingeniería genética podrá en breve utilizarse como un método rápido y preciso para conseguir un aumento en la tolerancia al es-trés de la planta. Para ello es necesario conocer los mecanismos básicos que ri-gen la defensa de las plantas frente al estrés y desarrollar estrategias adecuadas para mejorar esta capacidad (Fig. 2).

3.2.1. Respuesta de las plantas al estrés

La sequía, la salinidad y las temperaturas extremas producen en la planta un estrés osmótico directo, mientras que la hipoxia causa un estrés osmótico in-directo debido a alteraciones en la captación y pérdida del agua. La respuesta

* Montserrat Pages. Departamento de Genética Molecular. Instituto de Biología Mo-lecular de Barcelona. Centro de Investigación y Desarrollo. CSIC. Barcelona.

100 BlOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULTURA

Salinidad

~----~---, lones toxicos

Figura J. Los distintos tipos de est res abi6tico son los responsables de las mayo res perdidas en la productiviclad agrico la.

fisiol6gica de la planta al estres osm6tico puede producirse mediante cambios ffsicos a escala celular, como disminuci6n de la turgencia , cambio en el volumen de la celula 0 en el contenido en solutos del citoplasma. Estos cambios activan una ruta de transducci6n de sefial, transformando un estres ffsico en una respuesta bioqufmica. Por la ruta de transducci6n se envfa el mensaje a traves de una cadena molecular en la que intervienen mensajeros secundarios (calcio) , y otros intermediarios como quinasas y fosfatasas, hasta los factores de transcripci6n, que regularan la expresi6n de los genes encargados de la respuesta al estres. La hormona vegetal acido abscfsico (ABA) juega un papel importante en la sefializaci6n del estres osm6tico. Los niveles de ABA aumentan en respuesta al estres hfdrico y participan en la tolerancia de las plantas a sequfa, salinidad y frio. La expresi6n de un gran numero de genes es inducida por ABA y/o estres.

El estudio de promotores ha identificado un numero limitado de elementos cis importantes para la regulaci6n del gen. Entre ellos destacan dos tipos: el elemento ABRE (ABA response element), de respuesta a ABA, y el elemento DRE (Drought Response Element) , de respuesta a sequfa pero independiente de ABA y que tienen un papel preponderante en la regulaci6n genica. El elemento ABRE, esta definido por la secuencia central ACOT y a eJ se linen protefnas del tipo cremallera de leucina (b-Zip). Fue identificado por primera vez en el gen Em del trigo, y se ha demostrado que este elemento es funcional en mafz, trigo, arroz, tabaco y Arabidopsis. Sin embargo, el motivo ACOT se encuentra tambien en otros elementos cis responsables de la respuesta a distintos estfmulos, como luz, auxinas , acido jasm6nico y acido salicflico. Es plies importante determinar los elementos responsables de la especificidad de la respuesta. Es po sible que las secuencias que flanquean la caja ACOT determinen esta especificidad pues diferentes protefnas del tipo bZip, que reconocen la secuencia ACOT, interaccionan con distinta afini-

APROXIMACIONES BTOTECNOLOG ICAS PARA MEJO RAR LA RES ISTENCIA... 101

Elegir organismo 0 tejidos que toleren situaciones extremas

• Aislar y clonar genes

que confieran tolerancia al estres

• Caracterizar el producto genico

y analizar su expresi6n

• Introducir el gen en una planta modelo.

Analisis en situaciones de estres

• Pruebas de campo

en cultivos transgenicos

Figura 2. E squema de L1na aproximaci6n experimental para la obtenci6n de plantas transgenicas mejor adaptadas a condiciones ambientales adversas.

dad con las secuencias que contienen esta caja. En otros casos la especifidad de la respuesta se debe a un segundo elemento de ADN, Hamado CE (coupling element), requerido para la respuesta a ABA. Dos elementos de este tipo se identificaron por primera vez en promotores de genes de cebada. El elemento de respuesta a la sequfa, el elemento DRE (Drought Response Element), fue descrito y caracterizado en un gen de Arabidopsis thaliana cuya expresi6n se induce par estres hfdrico, salinidad y baja temperatura y al que regula mediante una ruta independiente de ABA. En esta especie, se han aislado distintos factores de transcripci6n que se unen ala secuencia DRE y contienen el motivo AP2. Hay otros motivos importantes en la regulaci6n de genes relacionados con el estres osm6tico que han sido descritos en distintos sistemas y se estan caracterizando.

Los productos proteicos de los genes que se inducen par el estres se pueden clasificar en dos grupos, aquellos que protegen directamente del estres ambiental y aquellos que intervienen en la regulaci6n de la expresi6n genica y la transducci6n de la seiial en la respuesta al estres. El primer grupo incluye protefnas que funcionan protegiendo a las celulas contra la deshidrataci6n como por ejemplo las enzimas responsables de la sfntesis de moleculas osmoprotec-


toras (osmolitos), proteínas de la embriogénesis tardía LEA (late embryogene-sis abundant), chaperonas, proteínas anticongelantes, y enzimas detoxificantes. El segundo grupo de productos génicos incluye factores de transcripción, proteína quinasas y enzimas involucradas en el metabolismo de los fosfoinosítidos.

3.2.2. Mejora de la tolerancia al estrés en plantas Para mejorar la tolerancia de la planta al estrés mediante la ingeniería gené-

tica se han utilizado genes que incrementan su expresión en condiciones de se-quía y salinidad, y codifican proteínas relacionadas con la protección de las célu-las frente al estrés. Entre ellos se incluyen genes que codifican enzimas que catalizan la conversión de substratos naturales en productos con propiedades os-moprotectoras, enzimas modificadores de las propiedades de la membrana, proteínas inducidas durante el estrés hídrico etc. Sin embargo, la adaptación al estrés implica cambios en distintos procesos fisiológicos y es por tanto improbable que un único producto génico sea suficiente para solucionar el problema. Como veremos a continuación, en la práctica se han obtenido tolerancias parciales en plantas transgenicas sobreexpresando un único gen protector, por lo que parece que será necesario introducir un grupo de genes en la planta transgénica para conseguir un nivel más elevado de tolerancia al estrés. En principio, la activación simultanea de varios genes involucrados en la resistencia al estrés se puede conseguir mediante la obtención de una planta transgénica que sobre exprese un único gen regulador como una quinasa, una fosfatasa o un factor de transcripción. En este contexto, para aproximaciones biotecnológicas cualquier proteína reguladora de la ruta de transducción desde el receptor de la señal de estrés hasta los factores de transcripción inducibles son potencialmente interesantes. También los genes que controlan el metabolismo del ABA son importantes pues un aumento hormonal puede desencadenar la inducción de los genes involucrados en la tolerancia al estrés. Experimentos recientes utilizando estas estrategias han conseguido resultados importantes que se describen a continuación (Fig. 3 y Tabla 1).

3.2.3. Aumento de la producción de compuestos osmoprotectores Los compuestos osmoprotectores u osmolitos son compuestos de bajo pe-

so molecular que permiten equilibrar el balance hídrico y protegen macromo-léculas, como proteínas y lípidos, del estrés salino, hídrico y térmico, facilitando su estabilización. Estos compuestos pueden acumularse en concentraciones elevadas sin afectar el normal funcionamiento enzimático ni las funciones celulares básicas. Pueden clasificarse en varios grupos: azúcares no reductores, polio-Íes, compuestos de amonio cuaternarios, iones (K+) y compuestos azufrados. En general, son compuestos con carga eléctrica no muy elevada, polares, altamente solubles y con una gran cubierta hídrica en solución. Dos son los mecanismos de protección que se les atribuyen: el aumento del potencial osmótico de la célula (su acumulación retiene el agua, manteniendo la turgencia y el volumen ce-

APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 103

Gen protector

Tolerancia al estn3s Tolerancia al est res

Figura 3. Dos tipos de estrategia para mejorar la tolerancia de la planta a condicones ambientales adversas (Busk, P.; Figueras, M.; Jessop, A .; Goday, A .. y Pages, M. 1998. Regulation of abscisic acid and water slI'ess response genes. Genetic and environmental manipulation of horricultural crops (Cockshull , K.E. ; Seymour, G.B.. yThomas, B. , editores) . pp.143-156. CAB International UK.

lular) y su habilidad para estabilizar membranas y/o estructuras macromoleculares. Debido a la relativa simplicidad de las rutas de sfntesis de los osmolitos, su alteraci6n en plantas transgenicas se ha realizado en distintas especies y ha dado lugar a la obtenci6n de fenotipos con mayor tolerancia a estres. Sin embargo, las concentraciones de solutos alcanzadas no son suficientes para explicar el efecto osmoprotector como unico factor en la tolerancia.

En tabaco se introdujo el gen mltd 1 (manitol-l-fosfato deshidrogenasa) de E. coli , obteniendose una acumulaci6n de 100 mM manitol y una tolerancia moderada a salinidad. Dado que la concentraci6n de manitol alcanzada no es suficientemente alta para explicar un ajuste osm6tico, la tolerancia se atribuy6 a las propiedades osmoprotectoras de este compuesto. Muchos organism os acumuIan prolina en respuesta al estres. La expresi6n en tabaco de I-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS) de Vigna aconitifolia dio como resultado un incremento de prolina y un aumento en la resistencia al estres hfdrico. EI mecanismo por el que la prolina confiere tolerancia a la desecaci6n no ha sido aclarado. Una posible explicaci6n es que la prolina sirva como almacen de carbona y nitr6geno y que facilite la recuperaci6n de las plantas tras el estres. Plantas transgenicas de tabaco que expresan el gen sacB de Bacillus subtilis, que codifica una fructosil transferasa, muestran acumulaci6n de fructanos y un aumento de biomasa que confiere una mayor tolerancia en condiciones de estres hfdrico. La expresi6n heter610ga en plantas de tabaco del gen TPSI (trehalosa-6-fosfato sintetasa) de Saccharomyces cerevisiae produce la acumulaci6n de trehalosa pero en cantidades que no explican la tolerancia como un mero ajuste osm6tico. Las plantas transgenicas presentan alteraciones de varios caracteres (reducci6n en tamafio, hojas lanceoladas, menor contenido en sacarosa) y tolerancia al estres hfdrico. Esto apoya la hip6tesis de que, al margen de una posible funci6n osmoprotectora, la introducci6n en tabaco del gen TPSI altera el metabolismo de carbohidratos y las rutas de sefializaci6n relacionadas con el estres abi6tico.


TABLA 1 Transgenes utilizados en plantas transgénicas para mejorar su tolerancia

a distintos tipos de estrés

Síntesis de manitol 1992 Protección contra estrés por salinidad

Acumulación de fructano 1995 Aumento de la tolerancia a sequía

Acumulación de prolina 1995 Aumento de la tolerancia al estrés por salinidad

Síntesis de glicina betaína 1997 Aumento de la tolerancia al estrés por temperatura y salinidad

Síntesis de proteínas LEA 1996 Protección al estrés por salinidad y sequía

Transportador de potasio 1994 Aumento de la discriminación Na+/K+ en levadura

Síntesis de trehalosa 1996 Aumento de tolerancia a sequía

Aumento de glutatión 1996 Protección contra salinidad y baja temperatura

Acumulación de ononitol 1997 Aumento de tolerancia a sequía y salinidad

Acumulación de sorbitol 1998 Alta acumulación de sorbitol, lesiones necróticas en hojas

Sobre expresión de factores de transcripción

1999 Aumento simultáneo de la tolerancia a distintos tipos de estrés; sequía, frío y salinidad

Adaptado de Bohnert, H.J.; Su, H., y Shen, B. (1999). Molecular mechanisms of salinity tolerance. Molecular res-ponses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants. Shinozaki, K., y Yamaguchi-Shinozaki, K., editores, pp. 29-62. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA.

3.2.4. Sobreexpresión de proteínas inducidas por estrés

Los genes LEA {Late Embryo genesis Abundant) se identificaron por su ex-presión durante la maduración y desecación de la semilla. La semilla de la planta presenta el mayor grado de tolerancia a la desecación pudiendo perder más de un 80% de su peso en agua. Un dato importante que permitió considerar las proteínas LEA como posibles protectores de la estructura celular durante la de-secación, se obtuvo al estudiar su regulación en condiciones de sequía. Se com-probó que los genes LEA también se expresan en tejidos vegetativos en perio-dos de pérdida de agua como consecuencia de estrés hídrico, salino y de frío. Las proteínas LEA se acumulan en concentraciones muy elevadas y han sido de-tectadas en muchos tipos celulares. Su localización subcelular es predominan-temente citosólica, aunque algunas de ellas se encuentran en el núcleo o en el nucléolo. Su función es, en la mayoría de los casos, desconocida.

Una característica general de las proteínas LEA es su composición peculiar en aminoácidos, con ausencia de cisterna y triptófano y abundancia de residuos hidro-fílicos que junto a las características estructurales han permitido asignarles funciones hipotéticas de protección celular. Este posible efecto protector se comprobó con la introducción por ingeniería genética de los genes LEA en distintas especies ve-

APROXIMACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 105

getales. Las plantas transgénicas obtenidas al introducir el gen HVA1 de cebada en arroz, expresan cantidades elevadas de la proteína HVA1 en hojas y presentan una mayor tolerancia al estrés osmótico. El grupo de proteínas LEA al que pertenece HVA1 presentan repeticiones de un motivo compuesto por 11 aminoácidos. Se su-pone que este motivo forma una hélice antipática, la cara hidrofóbica forma pro-bablemente un homodímero, mientras que la cara hidrofílica se encargaría del se-cuestro de iones por lo que su función podría ser la de retener los iones que se acumulan en condiciones de deshidratación celular. Este motivo de 11 aminoácidos se encuentra también presente en proteínas que se inducen por frío y que presen-tan similitud con las proteínas AFPs {antifreezeproteins), aisladas de algunos peces del ártico (platijas), cuya función es la de impedir la formación de cristales de hie-lo en la célula. Sin embargo no se ha conseguido evidenciar una mayor protección a la helada en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan AFPs.

Las proteínas LEA del grupo 2, también llamadas rab (Responsive to ABA) o dehidrinas, poseen un motivo altamente conservado de 15 aminoácidos. Se ha propuesto que puedan tener un papel de agentes solubilizantes con propiedades de chaperonas. En el maíz la proteína rabl7 está fosforilada, y su papel podría ser de mediadora en el transporte de proteínas específicas al núcleo en situacio-nes de estrés. Las plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan la pro-teína rabl7 del maíz en cantidades elevadas en embrión y hojas, presentan una mayor tolerancia al estrés osmótico en las primeras etapas de la germinación.

3.2.5. Mejora de la flexibilidad de la membrana

Existe una alta correlación entre la sensibilidad al frío y el grado de insatura-ción de los ácidos grasos de las membranas plastídicas en plantas superiores. La presencia de dobles enlaces cis en los lípidos de las membranas disminuye la temperatura de transición a 0°C. Así, introduciendo enzimas capaces de catalizar la formación de dobles enlaces en ácidos grasos saturados o mono-saturados, se puede conseguir un fenotipo tolerante a las temperaturas bajas. Esto se comprobó con distintas plantas transgénicas portadoras de dichos enzimas. Plantas transgénicas de tabaco expresando una desaturasa co3 cloroplástica (Fad7) son más resistentes a las temperaturas bajas. Por otra parte, la expresión en plantas transgénicas de una desaturasa inespecífica aislada de Anacystis nidulans que introduce dobles enlaces en distintos lípidos de membrana resultó en un incremento de ácidos grasos D9-monosatura-dos y cuando las plantas transgénicas de tabaco se expusieron a 1°C durante 11 días no se observaron signos de clorosis como sucede en plantas control.

3.2.6. Eliminación de moléculas reactivas

La sequía, salinidad y el frío generan intermediarios tóxicos que dañan mem-branas y macromoléculas y producen un estrés oxidativo. Por ello existe una re-lación entre tolerancia al estrés y el desarrollo de defensas antioxidantes. Du-


rante el estrés hídrico, la pérdida de agua en las hojas y el subsiguiente cierre de los estomas dan lugar a una disminución del CO2 disponible y a la producción de especies activas de oxígeno, como radicales superóxido. El aumento de la ac-tividad fotorespiratoria se acompaña también de elevados niveles de actividad glicolato oxidasa, lo cual da lugar a la producción de H2O2. Plantas transgénicas que sobreexpresan genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo, como peroxidasas, catalasas, glutation reductasas (GR) y superóxido dismutasas (SODs) presentan distintos grados de protección al estrés oxidativo y en algu-nos casos se ha observado una mayor tolerancia al estrés abiótico. Esto puede explicarse como consecuencia de una protección cruzada. Plantas transgénicas que sobreexpresan enzimas detoxificantes presentaron un mejor rendimiento y tolerancia a estrés abiótico en las pruebas de campo debido a un aumento ge-neral del sistema de defensa, provocado por el peróxido producido, que también induce la expresión de varios genes que confieren resistencia al estrés hídrico.

3.2.7. Sobreexpresión de componentes de la ruta de transducción de señal

Las rutas de transducción de señal se han estudiado siguiendo estrategias di-ferentes: por un lado, la identificación de componentes moleculares mediadores en-tre la percepción del estrés por la célula hasta la inducción de los genes de toleran-cia a dicho estrés y por otro la caracterización de los factores de transcripción específicos que se unen a secuencias clave de los promotores y regulan la expresión del gen. La obtención de plantas mutantes con mayor sensibilidad o bien con un in-cremento en la resistencia al estrés, así como la sobreexpresión de proteínas indu-cidas por el estrés, ha permitido identificar genes esenciales en la adquisición de to-lerancia y moléculas diana en la transducción de señal de las rutas de protección.

El proceso de transducción de la señal es complejo y hasta el momento al menos cuatro rutas distintas han sido identificadas, 2 que dependen de ABA y otras 2 independientes de esta hormona. También determinados genes son ca-paces de responder a varios tipos de estrés y por tanto pueden ser activados a través de distintas rutas señalizadoras. Las distintas rutas incluyen elementos comunes y otros específicos para cada tipo de estrés. Entre las proteínas identi-ficadas se encuentran factores de transcripción, quinasas, fosfatasas, y una fos-folipasa C específica de fosfatidilinositoles, enzima involucrado en la síntesis de inositol 1,4,5-trifosfato. El inositol trifosfato estimula la liberación de calcio de su almacenaje intracelular, permitiendo su actuación como segundo mensajero.

La posibilidad de aumentar simultáneamente la tolerancia a distintos tipos de estrés como sequía, salinidad y bajas temperaturas en una planta transgéni-ca se ha intentado recientemente con éxito en Arabidopsis, mediante la transferencia de un único gen que codifica un factor de transcripción inducible por estrés y que regula a su vez la expresión de varios genes, cuyos productos juegan papeles importantes en la tolerancia al estrés. Factores de transcripción que

APROXIMACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA MEJORAR LA RESISTENCIA... 107

se unen a la secuencia de respuesta a sequía (DRE), aislados de Arabidopsis, al ser sobreexpresados aumentan la tolerancia a distintos tipos de estrés en la planta transgénica: CBF1 aumenta la tolerancia a la helada, DREB1A aumenta la tolerancia a sequía, salinidad y frío. Esta tolerancia se consigue por efecto del exceso del factor de transcripción que induce la expresión simultanea de varios genes que contienen el elemento al que el factor se une en la planta transgéni-ca. También la sobreexpresión de otro tipo de factores ha producido resultados interesantes, así plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan el fac-tor ATHB6, también inducible por ABA, muestran un aumento en su resisten-cia a la desecación. La sobreexpresión del factor alfinl en alfalfa aumenta la to-lerancia a salinidad y la del heat shock factor HSF3 aumenta la termo tolerancia.

3.2.8. Perspectivas de futuro

Los recientes avances en el conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta de las plantas a las condiciones ambientales extre-mas, así como la gran variedad de técnicas que permiten tanto la identificación y aislamiento de genes de respuesta al estrés como su introducción por mani-pulación genética en la planta, permiten augurar un avance importante en la ob-tención de plantas mejor adaptadas a condiciones ambientales extremas en un futuro próximo. Uno de los puntos importantes a resolver es el mecanismo de percepción del estrés por la planta, el aislamiento y caracterización de los re-ceptores hormonales involucrados, así como la identificación de nuevas molé-culas integrantes de las rutas de transducción de señal e inducción de la expre-sión génica. También es importante que la activación génica se pueda limitar a aquellos genes que son activados de modo natural en la planta lo que evitará efectos secundarios no deseados. En este sentido un problema técnico impor-tante con el que nos encontramos es la elección del promotor que dirige la ex-presión del transgén. La utilización de promotores constitutivos del tipo 35S (del virus del mosaico de la coliflor) puede causar efectos no deseables (floración temprana, retraso del crecimiento, y graves alteraciones en el fenotipo de la plan-ta) como consecuencia de la expresión constitutiva y ectópica del transgén. Es pues de gran importancia poder controlar tanto el nivel como el momento y te-jido en el que se exprese el transgén. La utilización de promotores inducibles por estrés o ABA parece ser importante para aumentar la tolerancia al estrés sin afectar el crecimiento normal de la planta. Finalmente, la obtención de plan-tas transgénicas portadoras de un único gen regulador bajo el control de un pro-motor inducible que dirija la expresión de varios genes involucrados en la re-sistencia al estrés abre una de las perspectivas de futuro para la que se prevé una mayor aplicabilidad en agricultura. En este contexto las nuevas aproximaciones de la genómica funcional serán de gran ayuda para el descubrimiento de nuevos genes y la determinación de sus funciones en la tolerancia al estrés en la planta.


3.2.9. Agradecimientos

Mi agradecimiento a Laura Frególa y Ángel Sánchez por su ayuda en la ela-boración de este manuscrito. El trabajo de investigación en el estudio de los ge-nes regulados por estrés osmótico en el maíz está financiado por el Plan Nacio-nal de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico con el proyecto BIO 97 1211, por la CIRIT de la Generalitat de Catalunya en el proyecto Suport a Grups de Recerca Consolidats. 1999SGR 00191, y por la Comisión de las Comunida-des Europeas en el programa BIOTECH con el proyecto BI04- CT96-0062.


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3.3. INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS*

La vida de las plantas está condicionada por la existencia de una amplia ga-ma de microorganismos que viven asociados con ellas. Estos microorganismos, actuando principalmente desde la rizosfera, condicionan la nutrición y la salud de las plantas, y por tanto el correcto funcionamiento de toda la biosfera. La ri-zosfera se define como aquella zona de intensa actividad microbiana alrededor de las raíces cuya influencia estimula el crecimiento y aumenta la densidad de microorganismos respecto al resto del suelo. Los microbios en esta zona se pue-den agrupar según su relación con la planta en: a) organismos perjudiciales, in-cluyendo los patógenos que invaden y matan a las plantas y los simplemente oportunistas; b) organismos beneficiosos, a veces simbióticos, que aumentan la fertilidad, estimulan el crecimiento o protegen contra los patógenos, y c) mi-croorganismos sin efecto directo en las plantas, que incluye, entre otros orga-nismos neutros, los organismos saprofíticos que viven sobre material vegetal muerto. Todos estos microbios compiten entre sí por los nutrientes y por el es-pacio, convirtiendo la rizosfera en un campo de batalla donde los mejores es-trategas metabólicos se adaptan, se imponen y medran en un ambiente que cam-bia por efecto de las raíces y de la propia actividad microbiana. Una parte de estos microorganismos ha desarrollado la habilidad de colonizar la raíz, y se co-nocen en su conjunto como rizobacterias. Las rizobacterias beneficiosas que pro-mueven el crecimiento de las plantas, bien específicamente mediante la secre-ción de hormonas o indirectamente inhibiendo organismos fitopatógenos o mejorando la asimilación de nutrientes, principalmente fósforo y nitrógeno, se conocen como PGPR (del inglés «plant growth promoting rhizobacteria»).

Aunque la interacción de algunos grupos particulares de rizomicrobios con las plantas ha sido intensamente estudiada, sólo estamos empezando a entender las complejas interrelaciones metabólicas y ecológicas entre los microorganis- I mos de la rizosfera y el lenguaje de su comunicación con las plantas que resul-

* Tomás Ruiz-Argüeso. Departamento de Biotecnología. ETS de Ingenieros Agró-nomos. Universidad Politécnica de Madrid.


ta al final en efectos beneficiosos o perjudiciales para las cosechas. Uno de los mayores retos de los estudiosos de las interacciones planta-microorganismos es el conseguir una descripción precisa y completa de estos complejos sistemas. Es-te conocimiento permitiría responder a la pregunta de mayor interés práctico: ¿podemos manipular los microorganismos o las plantas para conseguir una óp-tima asociación que resulte en mejoras de la productividad y salud de las cose-chas? A continuación se analizarán las posibilidades biotecnológicas relativas a la mejora de la interacción entre plantas y microorganismos de la rizosfera en cuatro aspectos distintos: fijación biológica de nitrógeno, biocontrol de enfer-medades, absorción de nutrientes por asociaciones micorrícicas, y estimulación del crecimiento por rizobacterias,

3.3.1. Fijación biológica de nitrógeno

El espectacular incremento de los rendimientos de cereales en países desa-rrollados entre 1960 y 1990 es atribuible directamente a un incremento de diez ve-ces en el uso de fertilizantes nitrogenados. En gran parte este aumento se debió al desarrollo de genotipos vegetales con una alta respuesta a la fertilización quí-mica, sobre todo la nitrogenada. Sin embargo este uso masivo de fertilizantes ni-trogenados ha generado toda una serie de problemas de contaminación ambien-tal que junto a una creciente preocupación social por la conservación del medio ambiente, han provocado que el objetivo de conseguir una agricultura sostenible sea tan atractiva como el conseguir incrementos de rendimientos y productividad. En esta corriente se embarca el renovado interés por sistemas agrícolas que acu-mulan alto contenido de nitrógeno mayormente derivado de fijación biológica. Entre estos sistemas la simbiosis entre plantas leguminosas y rizobios tiene cuan-titativamente el mayor potencial y el mayor impacto en agricultura y en el ciclo del nitrógeno. Se estima que aproximadamente 100 leguminosas agrícolamente importantes contribuyen anualmente con casi la mitad del total de nitrógeno fi-jado biológicamente. En el mundo se estima que sólo las leguminosas grano ocu-pan cerca de 150 millones de Ha con una producción anual de 200 millones de to-neladas. Durante más de un siglo, la inoculación de las leguminosas con cultivos seleccionados de rizobios ha sido una práctica agrícola común. No obstante otros sistemas fijadores de nitrógeno tienen también potenciales significativos para sus-tituir a los fertilizantes nitrogenados y contribuir así a la sostenibilidad de los sis-temas agrícolas. Brasil es tal vez el país líder en el mundo en la sustitución de fer-tilizantes nitrogenados. La contribución de la fijación biológica de nitrógeno al cultivo de cosechas importantes como soja, cereales y la caña de azúcar determi-nan que este país exhiba las menores dosis de aplicación de nitrógeno mineral (10 kg/Ha), haciendo de Brasil uno de los países menos contaminados por nitratos.

Los rizobios tienen la capacidad de infectar muchas plantas leguminosas y alguna no leguminosa y establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno. El resulta-

INTERACCIONES BENEFICIOSAS ENTRE PLANTAS Y MICROORGANISMOS 111

do de esta interacción es la formación de un nuevo órgano, el nodulo, donde tie-ne lugar el proceso de reducción de nitrógeno. Esta simbiosis ha sido objeto de detallados estudios a nivel fisiológico, bioquímico y molecular, de los cuales ha resultado un espectacular avance en el conocimiento del funcionamiento de esta simbiosis y ha servido de catapulta para progresar en el conocimiento de otras interacciones planta microrganismos, principalmente las fitopatogénicas. Varias características intrínsecas a ambos socios de la simbiosis, la bacteria y la planta, y diversos factores ambientales limitan el funcionamiento óptimo de la asocia-ción. La presencia en el suelo de cantidades adecuadas de rizobios efectivos y específicos de cada leguminosa es el primer requerimiento para establecer una simbiosis eficiente. Además, para que la bacteria exprese su plena capacidad pa-ra fijar nitrógeno, es necesario que el vigor de la leguminosa no esté limitado por factores ambientales adversos como salinidad, pH desfavorable, deficiencia nutricional, toxicidad mineral, temperatura extrema, baja o excesiva humedad, fotosíntesis inadecuada, enfermedades, etc.

A pesar del altísimo nivel de detalle con que se conoce la fisiología y gené-tica de algunas especies de rizobios (Sinorhizobium meliloti, Rhizobium legu-minosarum o Bradyrhizobium japonicum) no se ha progresado proporcional-mente en la mejora de la inoculación de las leguminosas, y existen cuellos de botella en la producción y aplicación de inoculantes que limitan todavía el uso eficiente y extensivo de esta tecnología. Aunque los mayores esfuerzos para mejorar la simbiosis se han realizado con el componente bacteriano, los investigadores son cada vez más conscientes que una mejora de la simbiosis vendrá por manipulación de la planta hospedadora, y por ello se están realizando crecientes esfuerzos en elucidar a nivel básico los componentes genéticos de la planta que determinan la interacción. A continuación se revisan sucintamente aquellas áreas de investigación de las que se esperan aplicaciones biotecnológicas a medio y corto plazo para mejorar la fijación de nitrógeno por la simbiosis o para extenderla a plantas no leguminosas. Asimismo se analizan los esfuerzos dirigidos a explorar las posibilidades prácticas de otras asociaciones fijadoras de nitrógeno entre microorganismos y plantas.

3.3.1.1. Mejora de la simbiosis con leguminosas

El objetivo biotecnológico a perseguir es la consecución de inoculantes con cepas de rizobios con un comportamiento óptimo en simbiosis con las legumi-nosas a las que se va a aplicar y que compitan con las cepas nativas en un suelo y un clima dados. A pesar del espectacular avance en la fisiología y biología mo-lecular de la simbiosis RhizobiumAegum'mosas se dispone de pocas posibilida-des para mejorar la producción de inoculantes. Las perspectivas más promete-doras de construir mejores inoculantes se centran en la aplicación de la genética molecular a dos estrategias diferentes: primera, mejora de las cepas de rizobios


por su capacidad de fijación de nitrógeno, segunda, mejora de la competitividad por la nodulación de las leguminosas en condiciones de campo.

3.3.1.1.1. Mejora de la eficiencia energética

El ejemplo mejor caracterizado es la construcción de cepas con la capaci-dad de oxidar hidrógeno. Debido a la reducción de protones catalizada por la nitrogenasa, los organismos diazotróficos desprenden gran cantidad de hidró-geno. En la simbiosis (Brady)Rhizobium-legum'mosas la producción de hidró-geno por los nodulos representa una pérdida de energía y la mayor fuente de ineficacia de la simbiosis. Un método de aumentar la eficiencia energética, y por tanto mejorar la productividad de las leguminosas, es construir cepas con hi-drogenasas oxidativas que reciclan el hidrógeno que de otra forma se perdería en el aire. Los determinantes genéticos del sistema de oxidación de hidrógeno (genes hup) se han aislado y caracterizado en B. japonicum y en R. leguminosa-rum. Además de los genes estructurales, otros 16 genes accesorios son necesarios para la síntesis de la hidrogenasa, una metaloenzima que porta Ni y Fe en el centro activo. Mediante la transferencia de la agrupación génica hup completa (fragmento de ADN de aproximadamente 18 kb) a cepas que carecen de la capacidad de oxidar hidrógeno, se han generado cepas hidrogenasa positivas significativamente más eficientes que las cepas parentales en simbiosis con sus respectivas leguminosas hospedadoras (Patente N° P9902189, España). La construcción de cepas capaces de reciclar hidrógeno eficientemente se enfrenta todavía a diversos problemas no resueltos entre los cuales se incluyen la regulación de la expresión de los genes hup en fondos heterólogos y una apropiada provisión de Ni en los bacteroides.

3.3.1.1.2. Otras estrategias para mejorar la efectividad

Además de los genes hup, se han descrito también otros genes que mejoran la actividad nitrogenasa o la productividad de las leguminosas. Por ejemplo, se han seleccionado mutantes de B. japonicum generados por mutagénesis quími-ca con capacidades fijadoras de nitrógeno superiores a las cepas silvestres. Uti-lizando alteraciones génicas mas precisas se ha construido una cepa de R. legu-minosarum bv. trifolii tolerante a la acidez que fija cantidades significativamente mayores de nitrógeno que la cepa parental sensible. También se ha propuesto que incrementando la expresión de los genes nifA y dctA y ciertos genes de nodulación se puede incrementar la fijación de nitrógeno en alfalfa aunque no se ha publicado una demostración definitiva de estas posibilidades. Asimismo, se ha generado un gen nodD híbrido que no requiere flavonoides para inducir la expresión de los genes nod, y la cepa de Rhizobium que contiene este gen híbrido exhibe una mayor actividad nitrogenasa en los nodulos. En la misma dirección, la adición exógena de flavonoides a los inoculantes para incrementar la


nodulación de ciertas leguminosas aparece como un método prometedor y ba-rato de aumentar la eficacia de inoculantes comerciales.

La posibilidad de mejorar la fijación de nitrógeno por manipulación gené-tica sigue animando a los investigadores a la búsqueda de genes que codifican pasos limitantes en la efectividad de la simbiois. Así, recientemente se ha de-mostrado que la mutación de genes de ciertos citocromos de R. leguminosarum y R. etli aumenta espectacularmente la capacidad de fijación de nitrógeno de las cepas alteradas respecto a las cepas silvestres. El efecto es probablemente de-bido a una canalización del poder reductor en los bacteroides a través de cade-nas respiratorias energéticamente más eficientes en el ambiente microaeróbico de los nodulos. En la mayoría de los casos mencionados la capacidad simbióti-ca superior de las cepas alteradas se ha demostrado en ausencia de cepas nati-vas de rizobios. Sin embargo su comportamiento en condiciones de campo se desconoce en la mayoría de los casos y por tanto su verdadero valor agrícola puede estar limitado por su capacidad de competir con poblaciones de rizobios nativos.

3.3.1.1.3. Competitividad por la nodulación

El valor agrícola de una cepa rizobiana, previamente seleccionada por su capacidad de fijación de nitrógeno, depende de su habilidad para establecer una nodulación efectiva con la leguminosa a la que se aplica en condiciones de cam-po. La inoculación fracasa frecuentemente por la presencia en el suelo de cepas nativas que compiten con la cepa introducida en la nodulación de la legumino-sa huésped. La capacidad de competir con otras cepas por la nodulación de las raíces se conoce con el nombre de competitividad y es un proceso complejo que depende de múltiples factores y cuyas bases moleculares se desconocen en gran medida. Para resolver el problema económicamente importante de la competi-tividad de los rizobios se están siguiendo diversas estrategias que se recogen en revisiones recientes. La mayoría se basa en el uso de técnicas de genética mole-cular y enfocan el problema desde dos perspectivas diferentes.

Nodulación restringida por la leguminosa hospedadora

Implica la caracterización de los genes que determinan en los rizobios y en las leguminosas hospedadoras la especificidad por la nodulación con el fin de construir leguminosas que restrinjan la nodulación de cepas nativas y permitan la nodulación por las cepas inoculadas. Persiguiendo esta estrategia se han iden-tificado parejas de genes en los rizobios y en las leguminosas que interaccionan de forma sorprendentemente similar a la interacción «gen a gen» descrita en muchos sistemas patogénicos. Por ejemplo, un gen de guisantes, sym2, interac-ciona con un gen, nodX, presente sólo en cepas de R. leguminosarum bv. viciae que nodulan la variedad Afganistán. Similarmente, dos loci de la cepa R. legu-


minosarum bv trifoliTAl,nodMy csn-7, interaccionan con un gen recesivo,rwt, de la variedad Woogenellup de trébol restringiendo su nodulación por esta ce-pa a 28°C. También, se han identificado genotipos de soja que restringen la no-dulación de cepas de B. japonicum del serotipo 123 y otros serotipos. La res-tricción es causada por el alelo Rj4 presente en estos genotipos de soja, y se sabe que la restricción del serogrupo 123 puede ser salvada por la presencia del gen rizobiano nolA, que es un regulador negativo de los genes nod en la cepa US-DA110 de B. japonicum.

Genes bacterianos implicados en competitividad

Se han identificado múltiples genes de bacterias endosimbióticas que pa-recen determinar de alguna forma la capacidad competitiva por la nodulación de las leguminosas. Entre ellos, genes implicados en la síntesis de componentes celulares de superficie como los exopolisacáridos (EPS) y lipopolisacáridos (LPS) de las membranas externas, genes de movilidad, genes de eficiencia (nfe) y ve-locidad de nodulación, genes de utilización de prolina, y sobre todo genes de an-tibiosis. La posibilidad de utilizar cepas que producen antibióticos para inhibir la nodulación por cepas nativas de rizobios ha sido explorada frecuentemente. El sistema mejor caracterizado es la producción de trifolitoxina por la cepa ine-fectiva pero muy competitiva T24 de R. leguminosarum bv. trifolii. Este anti-biótico inhibe el crecimiento de distintos grupos de oc-proteobacterias, inclu-yendo Rhizobium y Agrobacterium. Los genes que determinan la síntesis de trifolitoxina han sido aislados, y se ha demostrado que su transferencia a cepas efectivas de rizobios aumenta la competitividad de las cepas receptoras en sue-lo estéril y, lo que es más prometedor, también en condiciones de campo como indican ensayos recientes con el sistema R. etli /judías. Sin embargo, una seria objeción al uso de este sistema radica en su impacto en las poblaciones micro-bianas de la rizosfera ya que se ha observado un efecto inhibidor sobre otros grupos de bacterias Gram-negativas beneficiosas para el agroecosistema.

La capacidad de algunas cepas de metabolizar compuestos secundarios ex-cretados por las raíces o nodulos de ciertas leguminosas constituye una estrate-gia prometedora para competir con las poblaciones nativas de rizobios por los sitios de nodulación. El mejor ejemplo es la producción y catabolismo de rizo-pinas por el 10% de las cepas nativas ensayadas de S. meliloti y el 14% de las cepas de R. leguminosarum. Las rizopinas son carbohidratos derivados del inosi-tol que son producidos en los nodulos y utilizados por las correpondientes cepas en vida libre en la rizosfera o en los hilos infectivos. Se han aislado los genes responsables de la síntesis de rizopina (genes mos) y de su catabolismo (moc), y se ha demostrado que los mutantes en estos genes, que se localizan en el plásmido simbiótico, son menos competitivos que las cepas silvestres. Al menos teóricamente debe ser posible mejorar la competitividad y persistencia de inoculantes


rizobianos en el suelo mediante la incorporación a los mismos de los genes mos y moc. Otros metabolitos secundarios producidos por leguminosas y utilizados por cepas de rizobios como fuente de energía durante el proceso de infección son la mimosina, una toxina antimitótica excretada por raíces, hojas y semillas de Leucaena, y la trigonellina, una betaína excretada por raíces de muchas le-guminosas. Se conocen los genes del catabolismo de la trigonellina en cepas de 5. meliloti y se sabe que están ligados a otros genes simbióticos y que se inducen en todas las fases de infección de raíces de alfalfa.

3.3.1.2. Extensión de la fijación de nitrógeno a cereales

En suelos deficientes en nitrógeno, las plantas que tienen la capacidad de formar endosimbiosis diazotróficas tienen una gran ventaja sobre las que no for-man nodulos fijadores de nitrógeno. Sin embargo en la mayoría de las cosechas importantes, como los cereales, la fijación simbiótica no ocurre de forma natu-ral. Por ello, la consecución de cereales fijadores de nitrógeno es un viejo sue-ño. Aunque todavía es muy pronto para acometer este objetivo directamente, la aparición de datos nuevos sobre la interacción de rizobios con leguminosas y el descubrimiento de nuevas asociaciones diazotróficas naturales de bacterias en-dotróficas con cereales mantienen viva la investigación con este objetivo.

3.3.1.2.1. Explotación de asociaciones naturales de bacterias diazotróficas

Bacterias epifíticas

El potencial efecto beneficioso de ciertas bacterias diazotróficas de la ri-zosfera, como Azospirillum sp., que viven asociadas a las raíces de gramíneas tropicales, incluyendo algunos cereales, fue inicialmente propuesto por el gru-po de Johanna Dobereiner en Brasil. Desde entonces se han aislado cepas de al menos 11 géneros diferentes a partir de gramíneas tropicales, de regiones sub-tropicales y de zonas templadas, incluyendo cereales. En esta asociación, cono-cida cono simbiosis asociativa o rizocenosis, las bacterias colonizan la superfi-cie de las raíces donde aprovechan azúcares y otros compuestos exudados por la planta y en el ambiente microaeróbico de la rizosfera fijan ciertas cantidades de N que eventualmente son asimiladas por la planta. Su contribución agrícola ha sido analizada en muy diversas condiciones de cultivo y áreas geográficas, y la conclusión general es que su mayor efecto sobre el crecimiento de las plantas se debe a su capacidad de producción de fitohormonas y estimulación del cre-cimiento radicular más que a su diazotrofía. Un intento de mejorar este tipo de asociación consiste en forzar la adhesión de las bacterias a las raíces mediante la manipulación de genes de lectinas en las plantas. El interés por este tipo de asociación se ha incrementado al demostrarse un efecto positivo sobre el creci-miento de leguminosas por la co-inoculación de Rhizobium y Azospirillum. El

1 16 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA AGRICULTURA

efecto parece derivar de un mayor desarrollo radicular, del aumento de la no-dulación y de la fijación de nitrógeno como resultado de la doble inoculación.

Bacterias endofiticas

Un mayor interés ha despertado el descubrimiento de un creciente número de bacterias diazotróficas que penetran y viven en el interior de gramíneas en contraste con la vida epifítica de las bacterias anteriores. Bacterias endofiticas son potencialmente todas aquellas que permanecen en las raíces después de su esterilización superficial. En general estas bacterias colonizan espacios in-tercelulares pero no penetran en células vivas por lo que no puede hablarse de endosimbiosis. Primero se identificaron varias cepas de Acetobacter y Herbas-pirillum que son endofitos de la caña de azúcar y contribuyen significativamente a la economía nitrogenada de estas plantas. A. diazotrophicus vive en la solución azucarada de los espacios intercelulares de la caña de azúcar y probablemente se mueve por los vasos del xilema. Similarmente, las bacterias del género Azoarcus son capaces de invadir las raíces de la pratense Kallar (Lep-tochloafusca),y del arroz, especialmente la zona de elongación y diferenciación. La bacteria invade los espacios intercelulares de la corteza de estas plantas sin que se produzca reacción marcada de hipersensibilidad. También se ha descubierto recientemente que Azorhizobium caulinodans, una bacteria capaz de formar nodulos aéreos y radiculares en la leguminosa tropical Sesbania rostrata, invade las raíces de cereales como el trigo, penetrando a través de grietas y colonizando los espacios intercelulares y ciertas células muertas debajo de la epidermis. Cuando se realizaron ensayos de campo con trigo inoculado con esta bacteria se obtuvieron sorprendentes incrementos de los rendimientos de grano respecto a los controles, lo que ha despertado fundadas expectativas sobre su potencial. Se han descrito recientemente otras bacterias diazotróficas potencialmente endofiticas de plantas de arroz. Entre ellas se han identificado cepas de Burkholderia, una bacteria que además de endofito del arroz y otras gramí-neas, forma endosimbiosis con hongos micorrícicos, y varias cepas de R. legu-minosarum bv. trifolii, el microsimbionte natural del los tréboles. Algunas de estas cepas de Rhizobium aumentan la productividad de ciertas variedades de arroz en condiciones agronómicas, y existe un razonable optimismo de que se pueda reducir el uso de fertilizantes nitrogenados en el arroz a través de la manipulación de este tipo de asociaciones naturales.

Todas las asociaciones de gramíneas con bacterias diazotróficas endofiticas tienen un gran potencial práctico y pueden servir de guía para el futuro desa-rrollo de sistemas similares con cereales de importancia agronómica. Sus venta-jas sobre la fijación asociativa radican en que sufren menor competencia por nu-trientes, y están mejor protegidas de cambios en el medio ambiente. Sin embargo muchas de las preguntas que la identificación de estas bacterias plantea sobre su


ecología, la naturaleza de la interacción y sobre todo su contribución real a la productividad de las gramíneas todavía carecen de respuesta. Para mejorar su aplicación a cosechas importantes es crucial entender su interacción con la plan-ta hospedadora, en particular el mecanismo de su especificidad, invasión y com-patibilidad, así como definir los nichos colonizados dentro de la planta. El uso de marcadores delatores para detectar la presencia de las bacterias y la expresión génica puede ayudar sustancialmente en esta tarea. Algunas, como Azoarcus o Acetobacter diazotrophicus nunca se han aislado del suelo, mientras que otras, aisladas de maíz o algodón, son habitantes normales del suelo. La evidencia de que su diazotrofía contribuye a la economía nitrogenada de las gramíneas es to-davía circunstancial. Sería necesario comparar el crecimiento de plantas infec-tadas con cepas silvestres y con mutantes deficientes en genes de la fijación de nitrógeno. Posiblemente la disponibilidad de oxígeno y las variaciones de su con-centración dentro de la planta para la generación de energía y para el funciona-miento de la nitrogenasa son cruciales en su fisiología. Dado que existen claras diferencias varietales en la respuesta de las gramíneas a la infección es probable que la eficiencia de la asociación se pueda mejorar por cruces y selección. Final-mente, no debe olvidarse que en el campo de la moderna ecología se conoce que muchos de los microorganismos existentes no se pueden cultivar por los méto-dos conocidos (bacterias viables pero no cultivables). Esta observación parece ser también cierta para las bacterias asociadas con plantas ya que, por ejemplo, en raíces de arroz se identifican secuencias de nitrogenasa que no corresponden con ninguno de los aislamientos diazotróficos obtenidos de estas raíces.

3.3.1.2.2. Creación de nuevas simbiosis: Nodulación de cereales

Es posible que la estrategia más racional para conseguir un cereal fijador de nitrógeno sea la formación de estructuras similares a nodulos ya que sólo en tales estructuras se suministran simultáneamente bajos niveles de oxígeno, ener-gía y una eficiente conversión y transferencia del nitrógeno a la planta. Sin em-bargo, el establecimiento de endosimbiosis con bacterias diazotróficas y cerea-les similares a los nodulos de las leguminosas con rizobios implica el conocimiento previo de una serie de cuestiones básicas sobre la biología de la planta. La primera es tal vez por qué los factores de nodulación no inducen mor-fogénesis en plantas no leguminosas a excepción de Parasponia andersonni, la única no-leguminosa nodulada por Rhizobium. A este respecto es muy intere-sante la observación reciente hecha con plantas mutantes que indica que cier-tos genes esenciales para la nodulación por Rhizobium son también necesarios para la formación de una micorriza vesiculo-arbuscular. Dado que los mismos hongos son capaces de micorrizar plantas no-leguminosas, esta observación im-plica que al menos varios genes de nodulación están también presentes en ce-reales como el arroz o el trigo. Además, al menos el arroz parece que contiene


también parte del mecanismo de transducción de la señal de nodulación como se deduce de experimentos llevados a cabo por varios grupos de investigadores. En estos experimentos se transfirió un gen de nodulina de alfalfa (enodl2), fu-sionado a un gen delator (gus), a plantas de arroz y se observó que se expresa-ba en las raíces de las plantas transgénicas en respuesta al tratamiento con fac-tores de nodulación y en presencia de la auxina 2,4-D que genera raíces engrosadas. Este resultado indica que el arroz posee una cadena de reconoci-miento de los factores de nodulación y transducción de la señal que conduce a la expresión del gen de la nodulina EÑOD12.

Otras preguntas básicas se refieren al modo de acción de las fitohormonas en plantas no leguminosas respecto a leguminosas y a las reacciones de hiper-sensibilidad patogénica. La primera porque la iniciación del nodulo requiere división celular y ésta es mediada por el balance de fitohormonas. La segunda porque en condiciones normales la célula hospedadora infectada es destruida o porque la bacteria no sobrevive en la célula infectada. Si el microsimbionte pudiera ser encerrado en un compartimento como la membrana peribacteroidal de los simbiosomas, esta reacción antimicrobiana podría evitarse.

Una estrategia alternativa para nodular plantas no leguminosas consistente en forzar el establecimiento de asociaciones simbióticas no ha producido toda-vía resultados satisfactorios. El tratamiento de las raíces con auxinas, particular-mente con 2,4-D, y posterior infección con ciertas cepas de Rhizobium, Azospi-rillum o Azorhizobium conduce a la formación de estructuras nodulares conocidas como pseudonódulos o paranodódulos. Algunas de estos paranódulos reducen acetileno, pero no existe evidencia de que las células infectadas sobrevivan o de que se forme una membrana peribacteroidal. Similarmente, las expectativas de éxito se han diluido también en aquellas estrategias que utilizaban tratamientos de raices con celulasas y pectinasas antes de la infección con rizobios, incluyendo aquellos que nodulan plantas no-leguminosas como Parasponia.

3.3.1.2.3. Transferencia de los genes nif

Aunque no parece que existan razones definitivas por las que las plantas no puedan fijar su propio nitrógeno, no es posible predecir cuántos obstáculos de-ben salvarse para conseguir este fin. La construcción de un cereal fijador es una tarea extremadamente compleja que requiere la expresión coordinada y regula-da de al menos 16 genes de la fijación (genes nif) en un ambiente celular apro-piado. Aunque este ambicioso objetivo no pueda alcanzarse a corto plazo, sí se están realizando esfuerzos en la consecución de aspectos parciales como la ex-presión de los genes nif en células vegetales. Dos grupos de investigadores han conseguido recientes éxitos en la expresión de genes nif en procariontes. Los gru-pos de I. Potrycus en Zurich y R. Dixon en Norwich consiguieron expresar la di-nitrogenasa reductasa en cloroplastos de Chlamydomonas reinhardtii mediante


la sustitución del gen chlL por nifH de Klebsiella pneumoniae. La idea de utili-zar cloroplastos como nicho para la expresión de actividad nitrogenasa se basa en el modelo del heterocisto, células especializadas de cianobacterias filamento-sas donde la fijación de nitrógeno tiene lugar al lado de células fotosintéticamente activas. Los cloroplastos pueden generar abundante ATP y poder reductor y sus genes codifican para metaloproteinas parecidas a las de la nitrogenasa.

3.3.2. Control microbiano de enfermedades de las plantas

El control de las enfermedades de las plantas es una necesidad apremiante para la agricultura del siglo XXI. Las prácticas actuales para combatirlas se ba-san mayormente en conferir resistencia genética a la planta o en el uso de pes-ticidas químicos. Obviamente es necesario aportar nuevas soluciones que suministren un control efectivo de las enfermedades a la vez que minimizan las consecuencias negativas para la salud y el medio ambiente. El control biológico, usando microorganismos para suprimir el efecto deletéreo de los patógenos, constituye una poderosa alternativa al uso de pesticidas sintéticos. Dada la diversidad metabólica del mundo microbiano, el potencial de los microorganismos como agentes de biocontrol es enorme. Basta con incrementar la densidad de una cepa particular en la rizosfera o en vecindad de tallos, hojas o frutos para suprimir una enfermedad sin producir efectos persistentes en la comunidad microbiana o en otros organismos del ecosistema.

Cerca de 40 productos están actualmente disponibles comercialmente para el control de organismos fitopatógenos (visitar www.barc.usda.gov/psi/bpdl/bpdl-prod/bioprod.htm/). Los microorganismos implicados se recogen en la tabla 1, e incluyen especies de hongos y bacterias.

3.3.2.1. Pseudomonas

De entre los microorganismos usados en biocontrol, los pseudomonas fluo-rescentes son los mejor caracterizados, produciendo una amplia gama de meta-

TABLA 1 Lista de organismos usados en biocontrol

Hongos Bacterias

Ampelomyces Agrobacterium radiobacter Candida oleophila Bacillus subtilis Coniothyrium minitans Burkholderia cepacia Fusarium oxysporum Pseudomonas fluorescens Gliocladium virens Pseudomonas syringae Phlebia gigantea Streptomyces griseoviridis Pythium oligandrum Trichoderma harzianum y otras especies


bolitos con capacidad antimicrobiana. Los mecanismos usados por las PGPR para suprimir enfermedades se basan fundamentalmente en tres estrategias: competencia por nutrientes, inducción de resistencia en la planta y antibiosis. En la primera, la producción de compuestos que secuestran hierro, llamados si-deróforos, es el proceso mejor caracterizado. El grupo de pseudomonas producen una amplia gama de sideróforos, algunos de los cuales, como las pseudo-bactinas de P. putida que son fluorescentes y específicos, no pueden ser usados por microorganismos patógenos ni por otros pseudomonas. Su función en bio-control está bien demostrada por evidencias genéticas y bioquímicas, y su mayor potencial se manifiesta en la rizosfera en condiciones de bajo hierro, donde compiten eficientemente por este nutriente con los patógenos.

La inducción de resistencia sistémica en plantas por bacterias, y en parti-cular por diferentes cepas PGPR del género Pseudomonas spp, está bien docu-mentada en la literatura pertinente. La resistencia se dispara por componentes del lipopolisacárido de las membranas externas de la pared de los pseudomo-nas. Aunque existe especificidad, algunos pseudomonas fluorescentes inducen resistencia sistémica en una amplia gama de cultivares con diferente suscepti-bilidad a la enfermedad y en más de una especie cultivada contra varios pató-genos. La inducción microbiana de resistencia sistémica en plantas es muy atrac-tiva desde un punto de vista medioambiental ya que no inhibe o mata el patógeno directamente con un metabolito tóxico, sino que restringe su penetración en la planta optimizando su sistema de defensa.

La tercera estrategia, producción de antibióticos, es frecuente entre bacte-rias de la rizosfera y en particular en el grupo de pseudomonas fluorescentes. Entre los compuestos antimicrobianos producidos destacan las fenazinas, 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), pioluteorina y ácido cianhídrico, efectivos contra diversas enfermedades fúngicas como el mal del pie del trigo, la caída de plántula en la remolacha y el algodón, causados por especies de Pythium, o la podredumbre negra de la raíz del tabaco causada por Thielaviopsis basteóla.

El uso de mezclas de cepas nativas y la generación de cepas genéticamente modificadas para alterar la producción de metabolitos antimicrobianos impor-tantes son las dos estrategias más atractivas para mejorar la capacidad de las PGPR como agentes de biocontrol. Respecto a la primera, la existencia de efec-tos sinergísticos de las mezclas de cultivo en el control de ciertos patógenos está demostrada por numerosas publicaciones. Respecto a la segunda, se han uti-lizado técnicas genéticas y de ADN recombinante para construir, por ejemplo, mutantes desregulados con un fenotipo constitutivo, independiente de la con-centración de hierro, para la producción de sideróforos, o cepas superproduc-toras de DAPG y pioluteorina, derivadas de cepas nativas P. fluorescens (CHAO, F113) que son más efectivas en la supresión del mal de pie del trigo y la caída de plántula de la remolacha, respectivamente, que las cepas silvestres. Aunque el análisis de los determinantes genéticos de las rutas metabólicas que condu-


cen a la producción de antimicrobianos en PGPR y la regulación de su expre-sión está todavía en sus inicios, los resultados obtenidos son prometedores.

3.3.2.2. Bacterias Gram positivas

Frente a la atención predominante que se ha dedicado en la literatura a los pseudomonas fluorescentes como agentes de biocontrol, las bacterias Gram po-sitivas del género Bacillus y Streptomyces han recibido menor atención en parte debido a las dificultades de manipulación genética y al desconocimiento de los mecanismos de biocontrol. En la búsqueda de nuevos agentes de biocontrol a partir de bacterias del suelo, y de la rizosfera en particular, se han identificado nuevas cepas de estos géneros que poseen una eficacia notable para suprimir enfermedades de las plantas. Aparte de B. thuringensis, un agente de biocontrol tradicional en los últimos 25 años que representa actualmente el 90% del mer-cado de bioinsecticidas mundial, otras especies de Bacillus forman parte de pro-ductos de biocontrol que han llegado también al mercado. Bacillus subtilis in-cluye cepas efectivas contra patógenos de Fusarium y Rhizoctonia, y cepas de Bacillus cereus se han revelado como agentes eficaces en el tratamiento del mar-chitamiento de la alfalfa y la podredumbre radicular de la soja producidos por cepas de Phytophthora.

Entre los estreptomicetos del suelo, varias cepas de Streptomyces suprimen eficazmente la roña de la patata producida por cepas de una especie próxima, Streptomyces scabies. La mayoría de estas bacterias Gram positivas producen antibióticos como mecanismo de control de la enfermedad. Sin embargo, la in-teracción con el patógeno y el proceso de biocontrol parece diferir del estable-cido para pseudomonas. Así, la densidad de la población en el suelo y el nivel de inhibición del patógeno observada «in vitro» no son suficientes para explicar su efectividad supresora de la enfermedad. Bacillus cereus es más efectivo cuando coloniza las raíces a bajas densidades, y combinaciones de cepas de Streptomy-ces son más eficaces que formulaciones con una sola cepa debido a incrementos en la producción de antibiótico que dependen del intercambio de complejas se-ñales de comunicación entre las cepas. Estas observaciones deben estimular la investigación sobre bacterias Gram positivas que interaccionan con plantas pa-ra mejorar nuestro conocimiento de la interacción y poder diseñar productos nuevos de biocontrol de patógenos en el agroecosistema.

El éxito en la utilización de un microorganismo potencialmente útil en bio-control es frecuentemente impredecible. Una de las razones más frecuentes del fracaso es la falta de conocimiento del mecanismo de antagonismo con el pató-geno y la interacción del agente de biocontrol con la planta, la comunidad mi-crobiana y el ambiente. Este conocimiento es necesario para poder manipular el agente de tal forma que exprese su máximo potencial de biocontrol. A veces es la capacidad del agente de biocontrol para colonizar las raíces o la rizosfera


el factor limitante; pero otras lo son factores extrínsecos como la sensibilidad a inhibidores de las semillas en el caso de Bacillus cereus UW85. Otra de las ra-zones de frecuentes fracasos es la dificultad en encontrar una formulación ade-cuada para su aplicación. Lo más habitual es utilizar polvos o granulos aplica-bles bien en suelo, semillas o sistemas de irrigación. Los microorganismos que esporulan, como los Gram positivos del género Bacillus, pueden formularse fá-cilmente como polvos por la tolerancia de las esporas al calor y la sequía. En cambio para asegurar la viabilidad de las bacterias Gram negativas como Pseu-domonas sp. se requieren preparados celulares concentrados y congelados y almacenamiento en hielo seco.

3.3.3. Hongos micorrícicos

3.3.3.1. Naturaleza de la simbiois

En la naturaleza la mayoría de las plantas no sólo tienen raíces sino tam-bién micorrizas, una asociación mutualista-simbiótica entre hongos del suelo y las raíces. Los hongos micorrícicos, presentes en casi todos los suelos, colonizan la raíz y forman un manto externo de hifas que conecta la planta con el micro-hábitat que rodea las raíces. Esta asociación es crucial en la asimilación de nutrientes y en la protección contra efectos ambientales adversos, bióticos y abió-ticos. Entre los cinco tipos diferentes de micorrizas conocidos, las ectomicorrizas y las endomicorrizas arbusculares son las de mayor importancia agroforestal. Los hongos de las ectomicorrizas son Basidiomycetos y Ascomycetos que colonizan el tejido cortical de las raíces de un 3% de las plantas superiores, principalmente árboles forestales, y se caracterizan por una falta de penetración in-tracelular.

La mayoría de las plantas de importancia en sistemas agrícolas forman mi-corrizas vesículo-arbusculares (VAM). En este tipo de micorrizas, ciertos hon-gos biotrofos obligados del orden Glomales crecen hacia las células internas de la corteza donde se diferencian en estructuras ramificadas conocidas como ar-búsculos que penetran en las células a la vez que mantienen una estructura mi-celiar en el exterior de la planta. Esta organización permite conectar el interior de la planta con el suelo y facilitar la toma de agua y nutrientes de baja movilidad o de baja concentración en el suelo, principalmente fósforo, amonio, y algunos micronutrientes. Dado que además la simbiosis VAM favorece el desarrollo radicular y la salud de las plantas, existe un interés creciente en evaluar su efectividad en sistemas agrícolas concretos y en explorar su posible manipulación para asegurar su eficaz funcionamiento mediante prácticas agrícolas normales.

El establecimiento de la simbiosis micorrícica se visualiza hoy, similarmen-te a la simbiosis de rizobios con leguminosas, como el resultado de un diálogo molecular entre el hongo y la raíz. El resultado de este diálogo, mediado por intercambio de señales de reconocimiento y aceptación, depende en último tér-


mino de la expresión de genes de ambos socios. Desafortunadamente, ninguna cepa de las cerca de 150 especies sistematizadas del orden Glomales ha podido ser cultivado axénicamente, lo cual ha dificultado su manejo y análisis biológi-co. La consecuencia práctica más importante de estas peculiaridades es la difi-cultad encontrada en la preparación de inoculantes comerciales.

3.3.3.2. Inoculantes micorrícicos

Dados los efectos de las VAM como biofertilizantes y bioprotectores de los cultivos, se asume que el manejo apropiado de esta simbiosis puede reducir el uso de fertilizantes químicos y fitofármacos. La posibilidad de utilizar masiva-mente inoculantes micorrícicos está alimentada por la creciente preocupación social por la contaminación ambiental asociada a una agricultura intensiva y se integra en el concepto de una agricultura más sostenible. Además, un interés añadido a la utilización de inoculantes micorrícicos es la capacidad de las plan-tas micorrizadas para superar situaciones de estrés sobre todo en suelos degra-dados por procesos erosivos, incendios forestales, laboreo excesivo y agotamiento de nutrientes, sequía, salinidad, contaminación industrial o minera, etc. La mi-corrización aparece así como una atractiva práctica para recuperar (biorreme-diación) suelos degradados mediante la introducción de plantas mejor capacitadas para la adaptación a esos suelos.

Debido al carácter de simbiontes obligados y a las dificultades para su cul-tivo axénico, la multiplicación de los hongos micorrícicos y la producción de ino-culantes de alta calidad requiere procedimientos específicos, y esto ha consti-tuido una limitación importante para la aplicación de las VAM. Los mayores beneficios sólo se obtendrán tras una cuidadosa selección los hongos más efi-cientes y de combinaciones planta/hongo/substrato. Estas limitaciones y las ex-periencias preliminares disponibles hacen esperar los mayores éxitos en culti-vos en los que es necesaria una fase de transplante, como el caso de Fruticultura, Horticultura y Floricultura. Las limitaciones mas importantes afectan a la se-lección del hongo, producción del inoculo y su aplicación.

a) Selección del hongo. Aunque no existe una especificidad parecida a la de los rizobios y cualquier cepa del orden Glomales puede infectar una planta susceptible, la experiencia indica que existen grandes diferen cias entre cepas en el establecimiento de la simbiosis y en la efectivi dad de la respuesta de la planta. La selección implica el aislamiento de hongos de plantas micorrizadas y el planteamiento de experimentos de invernadero aplicando los criterios de compatibilidad funcional.

b) Producción de inoculo. Desde un punto de vista comercial la clave es ta en la producción masiva de un inoculo de alta calidad que sea fácil mente transportable y aplicable. Dado que los hongos micorrícicos no pueden multiplicarse en laboratorio como las bacterias endosimbióti-


cas, es necesario ineludiblemente utilizar una planta hospedadora. El substrato sobre el que se cultiva la planta debe asegurar además de un aceptable crecimiento de la misma, la producción por el hongo de abun-dantes propágulos, esporas y micelio, que produzcan una adecuada mi-corrización cuando, mezclados con las raíces, se utilicen como inoculo. En la corta experiencia de uso de las AM en la práctica, los cultivos ae-ropónicos y los cultivos sobre substratos sólidos han dado los mejores resultados. El método de cultivos aeropónicos requiere crecer las raíces en la oscuridad alimentadas con pulverizaciones de solución nutritiva, lo cual demanda una técnica sofisticada y mano de obra especializada. El inoculo que se obtiene después del procesamiento y fragmentación fina de las raíces resulta con un precio elevado y justificable solo en casos concretos. Por ello, los métodos basados en el uso de soportes sólidos son más comunes. Se usan bien suelo o substratos alternativos más ligeros entre los que se incluyen vermiculita, perlita, arcillas calcinadas o expandidas, material de origen volcánico (picón). La mezcla triturada de estos substratos sobre los que ha crecido la planta contiene fragmentos de raíces micorrizadas, esporas y fragmentos de micelio. Utilizando este tipo de inóculos en ensayos experimentales se han micorrizado con éxito plantas de cítricos, aguacates y olivos. c) Aplicación del inoculo. El principal problema es hacer compatible la micorrización con los protocolos de producción de planta así como con los intereses económicos de los viveristas. Algunos de los factores a considerar incluyen i) adaptación a las operaciones de transplante del material vegetal, realizándose preferencialmente la micorrización al inicio de la formación de las raíces tróficas, y ii) evitar el contacto del inoculo con dosis agronómicas de fertilizantes, particulamente fosforados, y fitosanitarios, en especial antifúngicos, que inhiben la micorrización o antagonizan con los hongos micorrícicos. Parece recomendable utilizar conjuntamente micorrizas y otros microor-

ganismos con efectos antifitopatogénicos para suministrar una acción integra-da de fertilización y protección de las plantas. Entre estos últimos se ha mos-trado especialmente eficaces algunas PGPR particularmente ciertas bacterias (Pseudomonas, Bacillus etc.) y hongos (Trichoderma, Glyocadium, etc.).

3.3.4. Microorganismos productores de reguladores del crecimiento vegetal: fitoestimuladores

Aunque como definimos anteriormente, bacterias promotoras del creci-miento vegetal (PGPR) incluyen todas aquellas rizobacterias que de forma directa o indirecta estimulan el crecimiento de las plantas, en esta sección nos concentraremos en aquellos microorganismos que primariamente actúan esti-


mulando el crecimiento por la excreción de fitoreguladores. Muchos de estos microrganismos fitoestimuladores tienen también efecto contra microrganismos patógenos y son útiles como agentes de biocontrol, y eventualmente contribu-yen también a la asimilación de nutrientes, como fósforo, o a la fijación de ni-trógeno. Los reguladores del crecimiento vegetal son sustancias naturales que afectan a procesos fisiológicos a concentraciones mucho menores que los nu-trientes y las vitaminas. Pueden ser producidos endógenamente por las plantas, en cuyo caso se habla de fitohormonas, o externamente por la microbiota de la rizosfera, denominándose entonces reguladores del crecimiento vegetal (PGRs). Existen cinco clases bien definidas de PGRs (auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno y ácido abscísico) y la mayoría de las rizobacterias son capaces de pro-ducir «in vitro» una o mas de estas PGRs. Aunque esta observación sugiere que estas sustancias está implicadas en la interacción planta-microorganismos, su producción en la rizosfera está poco documentada.

Los géneros mejor estudiados para la producción de fitohormonas son Azo-tobactex y Azospirillum, pero esta capacidad se ha demostrado también en especies de muchos otros géneros como Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia, Alcaligenes, Klebsiella, Enterobacter, Herbaspirillum, Xanthomonas y Bacillus. La produción de reguladores del crecimiento vegetal se ha demostrado también en organismos simbióticos como rizobios y hongos micorrícicos, y parecen jugar un importante papel en las simbiosis. Sin embargo la pregunta pertinente es si la producción de fitohormonas por estas y otras rizobacterias incrementa el crecimiento de las plantas. Existe una considerable cantidad de información sobre la capacidad de mejorar el crecimiento y desarrollo de las cosechas mediante inoculación con Azotobacter y múltiples especies de Azospirillum y otras rizo-bacterias así como también en la inoculación de árboles de interés forestal. Varias cepas de Bacillus se han usado comercialmente en China desde los años 80 para incrementar la productividad y se han aplicado a más de 40 millones de Ha. Las especies más frecuentes son B. cereus y B. subtillis.

Inicialmente se supuso que el efecto estimulador del crecimiento asociado a la inoculación con Azotobacter y Azospirillum sp. se debía al aporte nitroge-nado suministrado por estos diazotrofos, pero hoy se piensa que es debido a la producción de compuestos biológicamente activos. Entre ellos está bien docu-mentada la producción de auxinas, giberelinas y citoquininas por estas bacte-rias. Varias rutas metabólicas conducen a la producción de acido indol acético (AIA) desde L-triptófano, y los genes implicados han sido aislados en múlti-ples bacterias, por ejemplo en A. brasilense y P. fluorescens. Aunque se dispo-ne de mutantes en estos genes, no es fácil aislar mutantes completamente defi-cientes en la producción de AIA debido a las múltiples rutas metabólicas, algunas de las cuales son independientes de triptófano, y por ello es difícil re-lacionar directamente los efectos beneficiosos observados con la producción bacteriana de AIA.


Por manipulación genética se ha conseguido crear cepas superproductoras de AIA en Pseudomonas fluorescens y A. brasilense, pero la conclusión de los experimentos dirigidos a demostrar el efecto sobre el crecimiento vegetal son que el rango de concentraciones de AIA a las que este efecto es positivo es muy estrecho (del orden nM). Altas concentraciones de AIA (microM), producidas por las cepas superproductoras y supercolonizadoras, tienen claros efectos ne-gativos sobre el crecimiento radicular. Este hecho limita el potencial de mejora del valor agrícola de las rhizobacterias manipuladas genéticamente para sobre-producir AIA.

Numerosos aspectos importantes de la respuesta de las plantas a los fitore-guladores de origen microbiano son todavía deconocidos. Entre ellos se incluyen los factores ambientales que afectan a su síntesis en la rizosfera, la relación entre su concentración y respuesta de la planta, su estabilidad física y biológica en el suelo, y su efecto sobre otras sustancias biológicamente activas y sobre las comunidades microbianas. Es necesario disponer de mutantes de plantas y de PGPR deficientes en la síntesis de fitohormonas para poder elucidar el mecanismo de acción de las fitohormonas microbianas y su interacción con las plantas.

3.3.5. Conclusión y perspectivas

Durante los últimos 15-20 años se han realizado considerables esfuerzos para identificar microorganismos rizosféricos beneficiosos, incluyendo PGPR y mi-corrizas, y los mecanismos por los que estos organismos promueven el crecimiento de las plantas. En el contexto de una agricultura sostenible este esfuerzo ha despertado un gran interés comercial y, aunque todavía se dispone de pocos productos en el mercado, es de esperar que su número aumente en los próximos años.

Como ha evidenciado esta revisión, los organismos de la rizosfera que for-man asociaciones beneficiosas con plantas son funcional y filogenéticamente muy diversos. Esta diversidad aumentará probablemente con la identificación de nuevos microorganismos asociados a plantas ya que la exploración de nue-vas interacciones planta-microorganismos es uno de los retos futuros del cam-po. Otros objetivos incluyen: a) Esclarecimiento de los mecanismos de la inte-racción a nivel molecular. El análisis genómico de la planta hospedadora y del componente microbiano permitirá identificar los genes implicados en la inte-racción así como sus funciones. Este objetivo puede verse facilitado por la exis-tencia de aspectos comunes en los diferentes interacciones como la existencia de señales moleculares similares en la simbiosis Rhizobium-legummosas y mi-corrizas o el papel predominante que juegan la capacidad competitiva y la capacidad de colonización de los microbios en diversas interacciones, b) Evaluación precisa de las respuestas de las plantas a la asociación con los microorganismos como base para la manipulación y explotación de esta inte-racción. De nuevo la identificación de genes claves de la interacción ha de faci-


litar esta labor proporcionando mutantes mejorados de cepas PGPR existentes y la construcción por ingeniería genética de nuevas cepas con características su-periores. Un último obstáculo a salvar antes de la explotación comercial de un microorganismo con interés agrícola es la formulación de un inoculante y su apli-cación de forma que permitan predecir su efecto en condiciones de campo.


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3.4. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD DE LOS PRODUCTOS AGRARIOS*

Los primeros logros de la Biotecnología de Plantas han sido el incremento en la producción de las cosechas y la disminución en el uso de plaguicidas y her-bicidas. Los primeros beneficiados aparentes de estos logros han sido los agri-cultores, aunque el conjunto de la sociedad también se ha beneficiado al dispo-ner de mayor cantidad de alimentos, más económicos, y con un sistema de producción más limpio desde el punto de vista medioambiental. Sin embargo, la presión social está determinando que los objetivos de mejora por ingeniería ge-nética se dirijan a aspectos que incidan de forma más directa en el beneficio de los consumidores. Estos objetivos no son otros que la obtención de productos con menos contaminantes agroquímicos y de mejor calidad. En estos casos los beneficios se distribuyen a otros sectores de la sociedad, como son los produc-tores, los distribuidores y la industria relacionada con el procesamiento y trans-formación de los alimentos. La calidad de un producto viene determinada no só-lo por sus propiedades intrínsecas sino también por su apariencia externa y su capacidad de conservación, entre otros aspectos. De todos ellos trata el presen-te capítulo, si bien de forma resumida, habida cuenta del amplio abanico de po-sibilidades que entraña el término calidad y de los numerosos avances que la Biotecnología de Plantas ha conseguido en este campo.

3.4.1. Mejoras en el valor nutritivo de los alimentos

Uno de los primeros casos de aplicación en este aspecto ha sido el cambio en la composición de aminoácidos de las proteínas presentes en los productos de origen vegetal que se utilizan como alimentos, tanto humanos como anima-les. Se sabe que algunos de los 20 aminoácidos que forman parte de las proteí-nas no son sintetizados por algunos mamíferos, entre los que se encuentra la es-pecie humana. Estos aminoácidos se denominan aminoácidos esenciales y deben ser ingeridos en la dieta. Así pues, el valor nutritivo de la dieta proteica aumen-

* Victoriano Valpuesta. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Uni-versidad de Málaga. Málaga.

130 BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULT URA

tara en la medida que es mayor el contenido en aminoacidos esenciales, tales como por ejemplo lisina y metionina. Un caso de aplicaci6n de la biotecnologfa en este campo ha sido la obtenci6n de un aumento en el contenido de lisina en las semillas de una especie tan importante como es la soja. La lisina se sintetiza en una via metab61ica que se inicia en otro aminoacido, el acido aspartico. Los pasos metab61icos se indican de forma esquematica en la figura 1. Dos enzimas de dicha via, la aspartato quinasa (AK) y la dihidropicolinato sintasa (DHDPS) son inhibidas por el producto final, lisina, en un mecanismo bastante comun de regulaci6n de vias metab6licas. Para aumentar el contenido de lisina era suficiente abolir la inhibici6n de estas enzimas por el producto final, la lisina. Asi se ha conseguido en soja cuando esta especie se transform6 con un vector binario cuya regi6n T con tenia los siguientes genes: el gen lysCM4 de E. coli que es una versi6n mutada del gen que codifica la enzima AK de esta bacteria y cuya mutaci6n la hace insensible a la inhibici6n por lisina, y el gen dapA de Corynebacterium que codifica la enzima DHDPS de este organismo que no es sensible a la inhibici6n por lisina. El resultado es que la planta transformada tenia una via metab6lica de sintesis de lisina duplicada, una de ella desregulada al ser insensible a la inhibici6n por lisina. La soja transgenica obtenida con tenia hasta 100 veces mas lisina libre en sus semillas.

Ademas de los aminoacidos, los lfpidos con componentes importantes de la dieta y se ingieren en forma de margarinas, aceites 0 ingredientes alimentarios.

Treonina

~ Isoleucina

Aspartato

~ Af< ..... -- ---------- ------------------ --- ----- -- ---,

~-aspartartil fosfato

~ ~-semialdehfdo aspartico

Metionina ...... ..------'1 L----. ~~;---~~~i-~~~~i~~~i-~~;~-------- - ---l j l ~ l ~ Metionina Lisina ______ ___ ___________ 1

Figura 1. Ruta metab61ica de biosfntesis de los aminoacidos isoleucina , metionina y Iisina a partir del aminoacido aspartato. Las lfneas discontinuas indican inhibici6n por la lisina de los pasos que conducen a su sfntesis. AK: aspartato quinasa. DRDPS: dihidropicolinato sintasa.

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD... 131

El consumo de grasas de origen vegetal aumenta de forma continua en detri-mento de las grasas de origen animal. Los ácidos grasos son componentes esen-ciales de estas grasas, siendo los principales los ácidos palmítico, esteárico, olei-co, linoleico y linolénico, los dos primeros saturados y los tres últimos insaturados. La insaturacion, presencia de dobles enlaces en los ácidos grasos, se ha asociado a una mayor calidad de los alimentos debido a su efecto beneficioso en el mantenimiento de la integridad celular y la prevención de enfermedades de tipo cardiovascular. La insaturacion de un ácido graso ocurre por la acción de una enzima desaturasa sobre el precursor saturado. Así el ácido oleico (de 18 átomos de carbono con una insaturacion entre los carbonos 9 y 10) procede del ácido esteárico (saturado de 18 átomos de carbono) por acción de la correspondiente desaturasa. Usando la ingeniería genética, es decir transformando con el gen que codifica la enzima desaturasa, se han obtenido plantas transgénicas de colza con un contenido en ácido oleico que constituye el 80% del total de ácidos grasos de sus semillas. Este valor es muy superior al del aceite de colza natural, y es comparable al de otros aceites vegetales de procedencia diferente, como puede ser el aceite de oliva.

En el caso de los ácidos grasos también hay trabajos en los que se ha in-tentado conseguir un elevado contenido de un ácido graso saturado tal como el ácido esteárico. La producción de margarinas y de diversos componentes de re-postería requiere grasas saturadas que mejoran las propiedades de textura y tac-to en la boca. La saturación se hace por hidrogenación de las grasas vegetales, en un proceso puramente químico. Dicha hidrogenación produce con frecuen-cia también ácidos grasos insaturados «trans», cuya presencia se ha asociado a alto riesgo de enfermedades coronarias por su potencial aumento en el coleste-rol total y las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Los ácidos grasos insaturados naturales son «cis». Para evitar someter las grasas al proceso de hidrogenación química se han obtenido plantas transgénicas superproductoras de grasas ricas en ácido esteárico. Así se han obtenido plantas de otra variedad de colza transformadas con el gen FatAl de Garcinia mangostata, que codifica la enzima tioesterasa de acil-ACP, que participa en la síntesis de este ácido. El procedimiento fue mejorado mediante mutagénesis dirigida del transgén, con el resultado de un incremento entre el 55 y el 68% de ácido esteárico en las semillas de las plantas transgénicas.

Otros casos de mejora de valor nutritivo incluyen lo que se denomina el re-forzamiento para incrementar algunos componentes esenciales para la dieta ta-les como las vitaminas y los oligoelementos. En el primer caso se encuentra la vitamina A, cuya deficiencia se considera hoy una epidemia a escala global (250 millones de niños tienen riesgo de esta epidemia). La mejor fuente de vitamina A son los carotenos, especialmente el P-caroteno, presente en muchas frutas y hortalizas. Estos carotenos son convertidos en vitamina A después de ser inge-ridos por el ser humano. Sin embargo las frutas y hortalizas con alto caroteno


no son siempre asequibles para la población que sufre la deficiencia de esta vi-tamina. La transformación genética de la colza con el gen que codifica la fitoe-no sintasa, enzima clave en la síntesis de carotenos, ha producido colza transgé-nica cuyo aceite contiene hasta 5 veces más carotenos que otra fuente natural de aceite para estas poblaciones como es el aceite de palma (Tabla 1). No es la colza la única especie transgénica que sobreproduce p-caroteno, también se ha producido arroz transgénico, obviamente con un atrayente color amarillo-dorado. Este arroz transgénico contiene suficiente cantidad de (3-caroteno para suministrar él solo todo el precursor de la vitamina A que requiere un ser humano alimentado con una dieta de este cereal.

Otro problema nutritivo importante, que se estima que afecta al 30% de la población mundial, es la deficiencia de hierro. Aunque algunas plantas que son importantes para el consumo humano, como son las legumbres, tienen alto con-tenido en hierro, sin embargo contienen también ácidos como el oxálico que dis-minuyen la biodisponibilidad de este nutriente. Entre los componentes mole-culares que regulan el contenido de hierro está la proteína conocida como ferritina. Esta proteína, compuesta por 24 unidades polipeptídicas ensambladas en un complejo de 450 kDa, almacena hasta 4.500 átomos de hierro en su cavi-dad central. Se ha probado que el tratamiento de ratas anémicas con una dieta enriquecida en esta proteína es efectivo en corregir la deficiencia. El gen co-rrespondiente ha sido aislado de diversas especies vegetales tales como la soja, la alfalfa, el guisante y el maíz. Recientemente se han obtenido plantas trans-génicas de arroz que han sido transformadas con el gen aislado de la soja. En la transformación se ha utilizado un promotor específico de proteína de reserva de semilla de arroz, GluB-1 de la glutelina, lo que determina que el gen se ex-

TABLA1 Composición en carotenoides y tocoferoles del aceite de palma y el de colza transgénica

con fitoeno sintasa

Aceite de palma (ug/g)

Aceite de colza transgénica ("g/g)

Total carotenoides — |3-caroteno — a-caroteno — Licopeno — Luteína — Fitoeno

480-672 280-392 175-245 7-9 10-15

2.025-2.466 690-920 470-530 8-33 85-196 760-820

Tocoferoles 90-150 400-500

Tocóles 600-1.000 400-500

Tomado de Kishore y Shewmaker, 1999. PNAS 96: 5968.


prese de forma preferente en la semilla. El contenido de hierro en las semillas del arroz transgénico fue hasta 3 veces superior al del arroz sin transformar. El secuestro del hierro por parte de la ferritina, puede tener un efecto positivo adi-cional para el cultivo de la especie transgénica, y es que la producción de espe-cies reactivas de oxígeno, nocivas en muchos casos para los tejidos vegetales, de-pende de la disponibilidad de hierro libre. Las plantas de tabaco expresando ectópicamente un gen de ferritina de alfalfa están más protegidas frente al da-ño oxidativo causado por diferentes tipos de estrés.

3.4.2. Aumento del dulzor

Un elemento esencial de aceptación de un producto alimentario es su sa-bor, en el que a su vez se han identificado diferentes componentes. Uno de los componentes primarios es el dulzor y es el que ha sido objeto de mejora por bio-tecnología, probablemente porque es el más fácil de abordar desde el punto de vista técnico. En unos casos se ha intentado aumentar el dulzor, en otros el ob-jetivo es disminuirlo, mientras que en otros se han utilizado las plantas como biorreactores para producir edulcorantes. Un ejemplo conocido en el primer ca-so es el incremento del dulzor producido en los frutos de tomate. Con este pro-pósito se ha conseguido expresar en esta especie el gen de una proteína que tie-ne propiedades edulcorantes. Así se sabía que una proteína, denominada monelina, de la planta Dioscorephylum cumminsii era aproximadamente unas 100.000 veces más dulce que la sacarosa, en una base molar. La proteína activa es un dipéptido de las cadenas polipeptídicas A y B, de 45 y 50 aminoácidos res-pectivamente, unidas por interacciones débiles. Al tratarse de dos polipéptidos la transformación del tomate había de ser con dos genes. Así fue y en la cons-trucción preparada para tal efecto en el vector binario también se incluyó el pro-motor del gen E8 de tomate que determina una expresión específica en el fruto de los transgenes. Se obtuvieron frutos de tomate con altos contenido de mo-nelina y con un dulzor significativamente superior. En general, hay que indicar que hay una serie de proteínas, conocidas como tipo taumatina, que también pre-sentan propiedades edulcorantes para el ser humano y cuyos genes han sido clo-nados en diversas especies. Este es sin duda un camino abierto en el que se si-gue avanzando.

El objetivo en otros casos ha sido la disminución del dulzor al considerar-se éste indeseable en el alimento en cuestión. Tal es el caso de la patata cuando se almacena en frío durante un periodo prolongado, algo que es muchas veces inevitable en la producción de este cultivo. Con el frío, el almidón de la patata se convierte en azúcares solubles, lo que produce un dulzor indeseable en este alimento que afecta también a su procesamiento. La acumulación de hexosas en estas circunstancias se debe a un desequilibrio entre la velocidad de degrada-ción del almidón y la velocidad de la glicolisis, lo que produce una acumulación

134 BIOTECNOLOGIA APLICADA A LA AGRICULTURA

de sacarosa, que posteriormente se convierte en glucosa y fructosa por accion de la invertasa (Fig. 2). Dos estrategias se han utilizado para evitar la acumulacion de hex os as durante el almacenamiento en frio. La primera es la inhibicion de la degradacion del almidon 0 el aumento de su sfntesis. La segunda consiste en impedir la hidrolisis de la sacarosa inhibiendo la actividad invertasa en las plantas transgenicas. La invertasa, enzima que cataliza la hidrolisis de la sacarosa en glucosa y fructosa, presenta varias formas celulares especfficas de los compartimentos donde se encuentra (Fig. 2) . La inhibicion de la actividad invertasa se ha conseguido, a su vez, de dos formas diferentes: transformando las plantas de patata con una construccion antisentido del gen que codifica la isoforma vacuolar de la invertasa inducida por el frio y en otro caso transforman-

Invertasa APOPLASTO

Hexosa ----- Sacarosa

CITOSOL

Sacarosa sintasa

PGMIPGI L-- Hexosa-6-fosfato ... ~ Glucosa-1-fosfato T I ~~ ~~

GLUCOLISIS ~

VACUOLA \... /

HK " PGMIPGI " Glucosa --I~~ Hexosa-6-fosfato'" ~ Glucosa-1-fosfato

~ +ADPGPPasa

Almid6n ... ADP-glucosa AMILOPLASTO

Figura 2. Pasos metab61icos de interconversi6n de almid6n y hexosas en los diversos compartimentos de la celula vegeta l. Las enzimas c1aves estan indicadas como sigue: HK: hexoquinasa. PGM: fosfoglllcomlltasas. PGI: fosfogilicoisomerasa. ADPGPPasa: ADP glucosa pirofosfatasa.


do la patata con el gen Nt-inhh de tabaco que codifica una proteína inhibidora de la invertasa. La transformación con el antisentido de la invertasa sólo pro-dujo un máximo de un 34% reducción en el contenido de hexosas inducidas por el frío en el tubérculo, a pesar de que la actividad endógena de la invertasa se había reducido en un 90%. La explicación es que la actividad invertasa restante (10%) era suficiente para causar la hidrólisis de la sacarosa. En el segundo caso, la utilización del gen codificante del inhibidor de la invertasa de tabaco {Nt-inhh) redujo la cantidad de hexosas hasta un 75%. La reducción del conte-nido en hexosas que se producen en el tubérculo después de su almacenamien-to en frío en las plantas transgénicas tiene una ventaja adicional para la indus-tria de los alimentos procesados. En efecto, las hexosas que se producen en el tubérculo tras su almacenamiento reaccionan con los aminoácidos libres pro-duciendo aminoazúcares. Al freírse las patatas para la preparación de «chips» estos compuestos dan un color marrón indeseable a las patatas fritas. Este pro-blema también fue evitado al impedir la acumulación de hexosas por el frío en las patatas transformadas con el gen codificante del inhibidor de la invertasa.

El tercer caso que se puede referir de mejora de la calidad de un producto en relación con el dulzor es el anteriormente mencionado de utilizar la planta como fuente de edulcorante, es decir como biorreactor. El edulcorante más usa-do en la industria alimentaria sigue siendo la sacarosa. Sin embargo, su alto va-lor calórico y su asociación al desarrollo de caries dentales han provocado un cambio en la preferencia de los consumidores hacia otros edulcorantes. Una de las alternativas elegida en Biotecnología ha sido la producción de fructanos de bajo peso molecular. Estos fructanos, que son polímeros de fructosa, se aseme-jan a la sacarosa en sus propiedades organolépticas pero tienen sobre ésta las ventajas de que no pueden ser usados como fuente de carbono por las bacterias cariogénicas ni ser degradados por las enzimas digestivas humanas. Los fructa-nos se producen de forma industrial en biorreactores a partir de la sacarosa, uti-lizando la enzima fructosil transferasa de Aspergillus niger. Sin embargo, los cos-tes de producción son muy elevados al necesitarse una purificación del producto, del que ha de separarse la glucosa que se produce en el proceso. La especie ve-getal elegida para producir fructanos ha sido la remolacha. La elección de esta especie se ha hecho en base a sus características agronómicas, puesto que su ren-dimiento en la producción de carbohidratos está entre los más elevados (7-1 OTm de sacarosa/hectárea), y además en base a sus características bioquímicas, pues la sacarosa se almacena en las vacuolas de las células de raíz hasta una concen-tración de 0,5 M. El gen utilizado para transformar la remolacha procedía de otra especie, Helianthus tuberosus, y codificaba la enzima l-sacarosa:sacarosa fructosil tranferasa (1-sst) que convierte la sacarosa en fructanos de bajo peso molecular. Las plantas transgénicas convierten la sacarosa almacenada en la raíz en fructanos de bajo peso molecular, sin cambio visible en el fenotipo de las plantas transgénicas.


3.4.3. Obtención de frutos partenocárpicos

Las plantas que pueden desarrollar frutos sin fertilización previa (frutos partenocárpicos) son atractivas desde el punto de vista de aceptación por el con-sumidor debido al hecho de que estos frutos no tienen semillas, además que ha-cen más fácil y menos costoso el manejo en muchas especies hortofrutícolas. La polinización y la fertilización aumentan el nivel de fitohormonas en el ovario, estimulan la división celular y permiten el cuajado del fruto y su crecimiento. Los métodos asequibles para producir frutos partenocárpicos han sido la utili-zación de fitorreguladores, la disponibilidad de mutantes o la obtención de plan-tas con un nivel de ploidía alterado. Se sabe que el óvulo en desarrollo es una fuente de la fitohormona auxina, y que la aplicación exógena de esta hormona puede reemplazar al óvulo para mantener el crecimiento del fruto. Con el pro-pósito de obtener frutos partenocárpicos la práctica ha consistido en tratar las yemas florales con fitorreguladores. Esta práctica, además de ser costosa, utiliza productos sintéticos que son rechazados por el consumidor. Por tanto, un au-mento de la síntesis endógena de auxina en el óvulo durante las primeras fases del desarrollo floral y del crecimiento del fruto puede ser suficiente para man-tener el cuajado y crecimiento del fruto sin polinización. La construcción qui-mérica utilizada en la transformación incluía el gen iaaM de Pseudomonas sy-ringae pv. savastanoi, y el promotor del gen DefH9 de Antirrihinum majus. El producto del gen iaaM cataliza la síntesis de indolacetamida, que es un compuesto precursor de la hormona auxina, y el promotor de DefH9 incluía las secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen en óvulo. La especie transformada con esta construcción quimérica fue la berenjena. Las plantas trans-génicas sin polinizar producen frutos partenocárpicos con propiedades y apariencia normales.

3.4.4. Extensión de la vida post-cosecha

La apariencia externa es un elemento de calidad esencial para el consumi-dor al ser uno de los primeros factores que determinan su elección. Sin embar-go, todo producto en su recorrido desde el campo hasta el consumidor sigue una serie de pasos que incluyen la recolección, el transporte, la conservación y la dis-tribución, que pueden dañar de una u otra forma al fruto. Es más, la posibilidad de almacenar un fruto por periodos prolongados sin deterioro aparente del mis-mo es una cualidad añadida que busca el consumidor. No en vano éste ha sido uno de los primeros logros de la biotecnología de plantas en lo que se refiere al aumento de la calidad de los productos.

El fruto recolectado es un órgano vivo que aún respira y que se encuentra en un estado de senescencia cuyo destino final es la dispersión de las semillas que permitirá la propagación y supervivencia de la especie. Este estado de se-nescencia es continuación del estado anterior de maduración de los frutos y, en

APLICACIONES BIOTECNOL6GICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD... 137

cierto modo, esUin regulados de forma conjunta. En much os frutos, los denominados climatericos, hay una hormona vegetal, el etileno, que inicia y contribuye al desarrollo de los procesos fisiologicos que tienen lugar en este organo durante su maduracion y senescencia. De esta forma, controlando la produccion endogena de etileno en un truto se podrfa controlar el proceso de maduracion y senescencia, y consecuentemente todos los cambios inherentes a estos procesos. Este control pOl' etileno ha permitido que frutos tfpicamente climatericos como el pl<itano se hay an podido recolectar en estadios previos a su maduracion, siendo esta inducida en el fruto almacenado en una atmosfera con etileno 10 que permite su maduracion separado de la planta. La ruta metabolica de produccion de etileno es relativamente simple pues se inicia en el aminoacido metionina y en tres pasos metabolicos se produce el etileno (Fig. 3). Los dos ultimos pasos estan catalizadas por las enzimas ACC sintasa y ACC oxidasa. Se han realizado intentos de manipulacion de estas enzimas pOl' ingenierfa genetica, es decir inhibiendo su actividad en plantas transformadas con los genes antisentido. Sin embargo, al ser esta hormona importante en otra serie de procesos fisiologicos la supresion completa de su sfntesis endogena no es siempre la mejor solucion. Mejores resultados se consiguen cuando solo se suprime parcialmente la sfntesis del etileno. Con tal proposito se han utilizado genes que producen enzimas que degradan intermediarios de la sfntesis del etileno. Entre estos esta el gen que codifica la actividad ACC desaminasa de la bacteria del suelo Pseudomonas (Fig. 3). La reduccion del etileno en las plantas transgenicas de tomate que

Adenosina

I

H

S-adenosilmetionina

.. , , , ,

ACCdeaminasa (Pseudomonas)

CO2 +NH 3

+HCOOH

ACC

Figura 3. Ruta biosintetica del etileno en tejidos vege tales a partir del precursor S-adenosilmetio nin a. La enzima ACCdeam in asa no es vegetal, sino de Pseudomonas. ACC: acido aminociclopropano carboxflico.


sobreexpresaban este gen bacteriano no causaron ninguna anormalidad apa-rente en la planta, pero los frutos maduraron más tarde y permanecieron firmes, una vez recolectados, al menos 6 semanas más que los frutos no transgénicos.

En otros casos, la mejora en la conservación del fruto recolectado no se ha realizado modificando genes cuyos productos son importantes en el control del proceso, tal como los que alteran la síntesis de etileno, sino teniendo como dia-nas genes cuyos productos participan en los procesos finales de la senescencia del fruto. La maduración y senescencia de los frutos va acompañado de un re-blandecimiento de los mismos, lo que es una de las principales causas de su de-terioro en las manipulaciones que sufre durante y tras su recolección. Este re-blandecimiento se produce, mayoritariamente, como consecuencia de la degradación de las paredes celulares del fruto. La degradación de las paredes es, a su vez, una consecuencia de la acción de enzimas hidrolíticas tales como la poligalacturonasa, la endoglucanasa, la pectato liasa, la pectin esterasa, la ga-lactosidasa, que catalizan la degradación de los componentes de la pared celular. Así pues, la modificación de estas actividades en frutos se ha intentado, con diferente éxito, como otra alternativa para extender su vida postcosecha. En tomates, ya hay variedades transgénicas comercializadas desde hace años donde la actividad poligalacturonasa endógena se ha reducido a menos del 1% de su valor en frutos normales, utilizando el silenciamiento del gen endógeno. Esta variedad transgénica produjo frutos de tomate más resistentes al daño mecánico. Indirectamente también se produjo una mejora en el sabor y la calidad, concretamente cuando se utilizada para producir pastas de tomate, pues el contenido de sólidos solubles fue superior al del tomate sin transformar. En tomate también se han producido plantas transgénicas con niveles disminuidos de otra de las enzimas hidrolíticas, la pectin esterasa. En conjunto, los resultados no han sido completamente satisfactorios en lo que se refiere al control completo del reblandecimiento, sin duda alguna por la complejidad de la pared celular y la ausencia de un conocimiento exhaustivo sobre su degradación durante la maduración del fruto. Lo que sí es cierto es que el proceso de hidrólisis de los componentes de las paredes celulares puede variar según las especies, pues si la poligalacturonasa es importante en tomate, parece que no interviene en otro fruto como es la fresa. En este fruto un papel más relevante lo desempeñan otras enzimas hidrolíticas tales como la pectato liasa, las endocelulasas y, posiblemente, la expansina, que no es una enzima hidrolítica.

3.4.5. Cambios en el tamaño del fruto

Entre los elementos de apariencia externa que determinan la elección por el consumidor de forma importante está el tamaño del fruto. Esto lo conocen des-de hace tiempo tanto los agricultores, en especies tales como las manzanas, las peras, los cítricos, etc., como los responsables de las cadenas de distribución. De


esta forma, los programas de mejora de estas especies han ido seleccionando va-riedades de mayor aceptación. En algunos casos se busca aumentar el tamaño, al ser éste un carácter asociado a la sanidad del producto, y en otros casos lo que se busca es disminuir el tamaño, al constituir un elemento de calidad. Esto último puede ser importante en la industria de transformación donde se valora positi-vamente la presencia de los frutos enteros, o al menos fragmentos identificables de los mismos, que se utilizaron en la preparación de la pasta o mermelada. Los principales intentos de manipulación del tamaño se han hecho buscando alterar en la planta las relaciones fuente-sumidero. En las plantas hay tejidos que son exportadores netos de carbohidratos (fuente) o importadores netos (sumidero). La capacidad de un tejido que es sumidero de retirar y metabolizar fotoasimila-dos, en competición con los otros sumideros de la planta, influencia de forma importante el tamaño final del sumidero. En la mayoría de las plantas de interés agrícola el producto final de la fotosíntesis en los órganos/tejidos fuente es la sacarosa, siendo este compuesto la forma de distribución de carbohidratos dentro de la planta. La sacarosa que llega al órgano sumidero es hidrolizada por la acción de la invertasa o por la actividad sacarosa sintasa, dependiendo de la especie vegetal de que se trate (Fig. 2). Modificando estas actividades se podría modificar la fuerza como sumidero de un órgano y consecuentemente su tamaño, como se ha conseguido en patatas que, aunque no es un fruto, es un sumidero con características comparables a los frutos en algunos aspectos. En esta especie la actividad de hidrólisis de la sacarosa en el tubérculo se debe a la sacarosa sintasa. Por este motivo se transformó esta especie de forma que sobreexpresara una invertasa procedente de otro organismo como la levadura. La transformación se hizo utilizando un promotor específico de tubérculo (promotor de la patatina clase I, B33) de manera que la expresión del transgén solo ocurriera en este órgano. Con este promotor se utilizaron dos construcciones alternativas de invertasa que determinaban que la expresión ocurriera en citosol o en el apoplasto. Aunque hay evidencia de que el suministro de sacarosa desde el floema a las células del parénquima de almacenamiento de los tubérculos ocurría de forma directa célula a célula a través de los plasmodésmos (vía simplástica), no se desechaba la posibilidad de algún suministro de sacarosa por la vía extracelular (vía apo-plástica). El resultado es que las plantas transgénicas de patata con mayor actividad invertasa citosólica reducían el tamaño del tubérculo, lo que se compensaba con un mayor número de tubérculos por planta. Por el contrario, la invertasa aumentada en el apoplasto tenía como consecuencia un mayor tamaño del tu-bérculo y un menor número de éstos por planta.

3.4.6. Mejora en la calidad para el procesado

Aunque ya se han indicado algunos casos donde el uso de la ingeniería ge-nética en plantas ha afectado las propiedades del fruto para su procesamiento


(pastas de tomate con mayor contenido de sólidos solubles, frutos con menores tamaños), hay casos donde el objetivo primario la sido la mejora del producto para su procesamiento. Así, las proteínas del gluten del trigo tienen unas pro-piedades biomecánicas poco corrientes que le confieren una elasticidad y una extensibilidad (viscoelasticidad) a la masa preparada a partir de este cereal. Esto le permite ser un ingrediente importante no sólo en la preparación del pan, sino en otros muchos productos entre los que se encuentran los bizcochos y di-versos tipos de pasta. En cada caso se requiere un balance preciso de elasticidad y extensibilidad. El gluten es una mezcla compleja de más de 50 proteínas, sien-do la mayoría pertenecientes al grupo de las prolaminas. Entre éstas hay un gru-po que son especialmente importantes en determinar la elasticidad pues forman polímeros de alto peso molecular (por encima de 1 x 106 kDa) que están estabi-lizados por enlaces disulfuros. Se han identificado seis genes correspondientes a esas prolaminas de alto peso molecular. Cada una de estas proteínas repre-senta el 2% del total de proteínas del grano, por lo que una variación cuantita-tiva en cualquiera de ellas afecta las propiedades de la masa obtenida a partir del grano. La transformación del trigo con genes adicionales correspondientes a estas proteínas del tipo prolaminas de alto peso molecular ha permitido obte-ner variedades transgénicas con diferentes valores de elasticidad de la masa pre-parada a partir del grano de cereal transgénico. Este caso es una muestra de me-jora de propiedades del cultivo para su procesamiento posterior, al variarse las propiedades funcionales de la masa obtenida a partir de la harina de un grano con diferente contenido de prolaminas.

3.4.7. Plantas ornamentales

Dentro del mundo de la producción agrícola el mercado de plantas con fi-nes puramente ornamentales ocupa un lugar cada vez más importante, sobre to-do en las sociedades desarrolladas. En este campo la mejora tradicional ha sido capaz de desarrollar miles de variedades con una amplia gama de formas, colo-res y arquitecturas. Sin embargo, el proceso ha sido lento y la Biotecnología ha irrumpido en algunos de los aspectos de la mejora de estas especies ornamen-tales. Concretamente dos aspectos han sido mejorados, uno se refiere al color de las flores y otro a su conservación después de cortada.

Las antocianinas constituyen el pigmento más común de los pétalos y sé-palos de las flores, en tonos de colores que varían desde el rojo al azul. El color está determinado por las cadenas laterales de las estructuras de estas antocia-ninas, desde los derivados de cianidina que dan color rojo intenso hasta los de-rivados de delfinidina que dan color azul. Las antocianinas son sintetizadas a partir del aminoácido fenilalanina en una ruta metabólica bien conocida. El co-nocimiento de esta vía metabólica en diversas especies permitía la posibilidad de su manipulación por transgénesis y, consecuentemente, la generación de pro-

APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS PARA LA MEJORA DE LA CALIDAD... 141

duelos finales diferentes. El caso más conocido se ha presentado en petunia. En esta especie una de las enzimas de la vía metabólica, la dihidroflavonol reduc-tasa (DFR) produce los derivados de cianidina y delfidina, lo que determina que en estas especies se produzcan flores rojas y azules. Sin embargo, se conocía que un gen DFR de maíz favorecía la formación de derivados de pelargonidina, que dan un color rojo-ladrillo. Al transformar petunia con esta DFR de maíz se obtuvieron flores de este color rojo-ladrillo, no naturales en la especie.

El 70% del comercio de flor cortada a escala mundial está ocupado por cua-tro especies: rosas, claveles, tulipanes y crisantemos. Un elemento de calidad in-discutible en estas especies es la longevidad de las flores una vez en el mercado. En términos fisiológicos se trataría de inhibir o retrasar la senescencia de los ór-ganos y tejidos florales, proceso que se acelera cuando la flor se separa de la planta. Al igual que en frutos, las especies se consideran climatéricas o no cli-matéricas en función de que la hormona etileno ejerza una función iniciadora y reguladora del proceso de senescencia de la flor. En este sentido hay que indi-car que hay algunas variedades de rosa y, sobre todo, de claveles que son muy sensibles a pequeñas concentraciones de etileno, endógeno o exógeno. La prác-tica comercial ha utilizado, y aún utiliza, con éxito el tratamiento con tiosulfato de plata que es un inhibidor de la acción del etileno, pues llega a prolongar la vida comercial de los claveles hasta 2-3 veces. Sin embargo, la alta toxicidad de este compuesto y la preocupación medio-ambiental obligan a buscar alternati-vas a esta práctica comercial. La aproximación biotecnológica ha sido, como se ha hecho en frutos, el control de la producción de etileno endógeno en este ór-gano. Así se han obtenido plantas transgénicas de clavel portadoras del gen an-tisentido de la ACC-sintasa (Fig. 3). La producción endógena de etileno dismi-nuye significativamente en algunas líneas transgénicas que aumentaron su valor comercial al prolongar su frescura por periodos superiores al de las variedades no transformadas.

3.4.8. Perspectivas

Los párrafos precedentes de este capítulo han ido desgranando diversas aplicaciones de la Biotecnología de Plantas dirigidas a una mejora de la calidad del producto. En ellos se ha podido constatar que dichas mejoras han benefi-ciado a diferentes sectores implicados en la utilización por el ser humano de la riqueza vegetal de la biosfera. Hay mejoras que han beneficiado al distribuidor al aumentar la vida postcosecha, otras al que procesa los alimentos como la pre-paración de pastas de tomate, la obtención de frutos más pequeños o de trigos mejorados para la preparación de masas, pero la gran mayoría han ido dirigidas a la mejora del producto para el consumidor. En todos los casos se ha benefi-ciado el agricultor al disponer de variedades con propiedades mejoradas para el consumo y, por tanto, más valiosas. Sin embargo, no ha sido la búsqueda de la


calidad el factor más importante en el desarrollo de la Biotecnología. Esta ten-dencia parece estar cambiando, debido fundamentalmente a la presión social. La pauta la marcarán, como ha sido hasta ahora, los movimientos sociales de los países desarrollados. En este contexto es donde hay que situar las perspectivas del futuro de esta tecnología aplicada al mundo vegetal. Parece más que proba-ble que el énfasis continúe en el desarrollo de nuevos productos cuyos primeros beneficiarios sean los consumidores de estas sociedades desarrolladas. Es decir, el factor calidad será esencial. Hay aspectos de esta calidad como son el de las propiedades organolépticas de los productos que se exigen de forma inmedia-ta, pero cuya posibilidad técnica está lejos en estos momentos. Pero hay otros elementos de calidad, como aquellos que sean compatibles con un desarrollo sostenido y con respeto al medio ambiente, que ya se están abordando. Los que mueven el motor de la Biotecnología deberán pensar en nuevos productos con beneficios incuestionables en lo que se refiere a la salud, el medio ambiente y la conservación de la biodiversidad. El nuevo contrato social entre investigadores y sociedad, que propugna ésta, marcará de forma importante los nuevos avan-ces de la Biotecnología que, sin duda, veremos aflorar en los próximos años.


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3.5. LAS PLANTAS COMO BIOFACTORIAS*

3.5.1. Introducción

Las plantas han sido desde siempre, y especialmente desde el desarrollo de la agricultura, fuente de alimentos, combustible y fibras para los seres humanos. Los recientes avances en la manipulación in vitro del ADN y en la transformación y regeneración de diferentes especies vegetales han permitido la creación de plan-tas transgénicas con modificaciones en su genoma que incrementan su utilidad. La mayor parte de los esfuerzos iniciales han ido encaminados al desarrollo de plantas con características agronómicas mejoradas: plantas tolerantes a herbici-das, y resistentes a insectos y virus, fundamentalmente. Sin embargo, ha habido también abundantes abordajes, alguno llevado con éxito hasta la etapa de co-mercialización, encaminados a mejorar de alguna forma el producto extraído de la planta (tomates de maduración retrasada, lípidos con contenidos en ácidos gra-sos modificados, patatas más ricas en almidón, etc.). Yendo aún más lejos, dadas las claras ventajas de las plantas sobre otros sistemas en cuanto a economía de costes de producción y a reducidos riesgos de toxicidad, es posible pensar en las plantas como factorías en las que producir diferentes compuestos de interés, par-cialmente o totalmente ajenos a ellas. En este sentido, existen ya evidencias sóli-damente documentadas sobre la posibilidad de producir en plantas enzimas in-dustriales, plásticos fácilmente biodegradables, antígenos para vacunas, anticuerpos para inmunoterapia pasiva, otros péptidos de uso farmacéutico, etc

Los primeros compuestos que se están produciendo en plantas son enzimas de aplicación industrial. Muchos procesos industriales que pretenden explotar productos específicos de plantas se enfrentan a la necesidad de degradar gran-des polímeros para incrementar la accesibilidad de los compuestos deseados y para facilitar la eliminación de los residuos celulares. Por esta razón, muchos abordajes para producir proteínas de uso industrial en plantas se están centrando en enzimas que degradan paredes celulares, almidón o fitato. Así, hay numero-sos proyectos encaminados a la producción de amilasas, glucanasas, quitinasas, xilanasas o fitasas. Además, éstas son proteínas que no precisan para su uso de

* Juan Antonio García Álvarez. Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). Campus de la Universidad Autónoma de Madrid. 28049 Madrid.


un alto grado de pureza, por lo que se aprovecha ampliamente la ventaja del ba-jo coste de producción en plantas, que se perdería en caso de ser necesarios cos-tosos procesos de purificación de las sustancias deseadas. Hay otras proteínas de aplicación industrial que se están empezando a producir en plantas transgé-nicas. Así, dos proteínas producidas en maíz que se espera sean comercializadas próximamente son la avidina de pollo y la (3-glucuronidasa de Escherichia coli. La otra gran ventaja de las sustancias producidas en plantas es la seguridad sanitaria derivada de la ausencia de agentes infecciosos u oncogénicos que pue-den contaminar cultivos animales o bacterianos. Es por ello que hay un crecien-te interés en la producción en plantas de polipéptidos de aplicación farmacéuti-ca tales como factor de crecimiento epidérmico, eritropoyetina, interferón, proteína C humana, glucocerebrosidasa humana etc. Se está dedicando una aten-ción especial a la producción en plantas de antígenos y anticuerpos para inmu-nización activa y pasiva, respectivamente. Por motivos de claridad y ahorro de espacio, este artículo se centrará en la revisión de los esfuerzos que se están re-alizando en este último campo, aunque mucho de lo que se discuta aquí podría ser aplicable a la producción en sistemas vegetales de otras sustancias de interés.

3.5.2. Sistemas de expresión en plantas

Existen dos estrategias generales para obtener en plantas productos de in-terés (Fig. 1). Una es la ya mencionada transformación genética del genoma de las plantas, mediante el uso del plásmido Ti de la bacteria Agrobacterium tume-faciens o por otros métodos, que da lugar a plantas transgénicas que producen el compuesto extraño en el contexto general de la expresión génica de la planta. La segunda consiste en la expresión transitoria del gen heterólogo mediante el uso de vectores extracromosómicos; para este objetivo se están empleando actualmente vectores virales, pero resultados recientes sugieren que A. tumefa-ciens puede ser también útil para este tipo de abordaje. Las principales ventajas de las plantas transgénicas son la posibilidad de transmitir, por propagación vegetativa o sexual, el carácter adquirido a sucesivas generaciones después de seleccionar líneas con altos niveles de expresión, y la capacidad de producir más de una proteína foránea mediante cruces genéticos de diferentes plantas transgénicas. Por otra parte, no parece haber límites a la capacidad codificante del gen transferido. Como contrapartida, la generación de plantas transgénicas transformadas de manera estable requiere una considerable inversión en tiempo y esfuerzo, sobre todo teniendo en cuenta el elevado número de líneas transgénicas que hay que analizar a causa en la extrema variabilidad de fenotipos que resultan de cada ensayo de transformación. Además, la capacidad de transformación y regeneración varía mucho no sólo entre diferentes especies, sino incluso entre variedades de una misma especie, de forma que desarrollar un procedimiento eficiente de transformación para una determinada planta puede resultar muy complicado, cuando no imposible.

LAS PLANTAS COMO BIOFACTORfAS 145

Las principales ventajas de replicones basados en virus respecto a las plantas transgenicas son,junto con la mayor sencillez y rapidez experimental, la expectativa de mayores niveles de produccion de la protefna heterologa, por ser muy alto el numero de copias genomicas que la codifican, y la posibilidad de inducir su expresion en una fase precisa del desarrollo de la planta, eligiendo el momenta de inoculacion del vector viral que se considere oportuno. Esto podrfa permitir la produccion de compuestos toxicos 0 dafiinos, que impedirfan la germinacion y de-

A

Transformacion

Agrobacterium tllmefaciells

planta transgenica

1 • • •• • ••••

Proteil1a heter610ga

B

Vectores de expresi6n basados en virus

~ T i

gen herer61ogo expresado como producto indepcndiente

1 Secuencia hetcr610ga

fusion ada a sccucnClas virales

planta infectada

Virion

• • • •• •

1

Proteina heter610ga

Virion presentando secuencias heter610gus

Figura I. Expresi6n de proteina heter6logas en plantas. A) Construcci6n de plantas transgenicas par transformaci6n con Agrobacteriwn tumefaciens (tambien existen metodos para transformaci6n con ADN desnudo). B) Estrategias para expresi6n mediada por factores virales. Otras estrategias para expresi6n transitoria en plantas se describen en el texto. Figura tomada de M. Fernandez Fernandez . Tesis doctoral. Universidad Aut6noma de Madrid , 1999.


sarrollo de las plantas transgénicas que los sintetizaran de manera constitutiva. Es importante destacar, sin embargo, que el reciente desarrollo de promotores de planta inducibles, permite actualmente generar plantas transformadas con trans-genes que codifican a proteínas tóxicas, que sólo se producen cuando se añade el inductor apropiado. Otra ventaja de los vectores de expresión virales es el amplio espectro de huéspedes de muchos virus y la disponibilidad de muchos virus con diferentes espectros de huéspedes, de manera que casi cualquier planta podría ser infectada por algún vector viral. Por contra, la capacidad de información genéti-ca extraña que pueden incorporar los vectores virales parece ser bastante reduci-da, y cuando se quiere expresar más de un producto extraño es necesario diseñar estrategias especiales, cuyas expectativas de éxito disminuyen drásticamente cuan-do aumenta el número de genes foráneos a expresar.

3.5.3. Plantas transgénicas Probablemente la obtención de vacunas destinadas a la prevención de en-

fermedades animales y humanas constituya el área más competitiva de la pro-ducción de proteínas xenogénicas en plantas. Aunque la primera demostración de que una vacuna producida en plantas podía ser efectiva empleaba un antí-geno expresado con un vector viral (se discutirá en el siguiente apartado), la ma-yor parte de los estudios más avanzados acerca de la producción de antígenos en plantas para producir vacunas se han hecho en plantas transgénicas (tabla 1).

En los primeros trabajos, los antígenos de interés se produjeron en plantas de tabaco, debido a su facilidad de transformación y regeneración. Sin embar-go, como el objetivo final es la obtención de vacunas comestibles, y las hojas de tabaco contienen alcaloides tóxicos, se ha pasado a utilizar plantas más apro-piadas, también relativamente fáciles de transformar, como la patata. También se empiezan a describir trabajos que emplean plantas perennes, como la alfalfa, que permiten una producción estable y continua del antígeno de interés.

Se necesita superar varios listones para crear una vacuna basada en plantas con valor comercial. En primer lugar, es necesario producir en la planta suficiente can-tidad del antígeno elegido. En segundo lugar, este antígeno debe estimular una res-puesta adecuada de anticuerpos en el huésped tratado. En tercer lugar, la respues-ta de memoria del antígeno debe ser capaz de proteger al huésped frente a la inoculación del patógeno. Finalmente, es necesario incrementar la escala de pro-ducción y procesar de manera adecuada el producto para su comercialización. Se han descrito bastantes casos de producción en plantas de antígenos capaces de in-ducir anticuerpos específicos cuando se les administraba por vía parenteral a ani-males de experimentación. En algunos casos se ha comprobado que estos animales adquirían niveles de protección, más o menos significativos, frente al patógeno co-rrespondiente. Sin embargo, el objetivo fundamental de expresar antígenos en plan-tas es producir vacunas activas por vía oral. Los patógenos responsables de la ma-yoría de las enfermedades infecciosas entran en contacto con su huésped a través

TABLA 1 Vacunas y anticuerpos producidos en plantas transgenicas

Antígeno Anticuerpo Planta huésped Vía de administración

Organismo ensayado*

Efecto

CP del virus de Norwalk Tabaco Patata

Intubación gástrica Alimentación

Ratón IgGs** en suero e IgAs en mucosas

GlicoproteínaSdeTGEV Maíz Alimentación ND En progreso Arabidopsis Parenteral Ratón Anticuerpos neutralizantes en suero

(sin especificar clase) Patata Alimentación Ratón Anticuerpos no neutralizantes en suero

(sin especificar clase) Proteína VP1 de FMDV Arabidopsis Parenteral Ratón Anticuerpos en suero (sin especificar clase).

Protección frente a FMDV Alfalfa Alimentación

ProteínaVP60deRHDV Patata Parenteral Conejo Anticuerpos en suero (sin especificar clase). Protección frente a RHDV

Subunidad B de la toxina del cólera

Patata Alimentación Ratón Anticuerpos en suero (IgGs, IgAs e IgMs) y en mucosas (IgGs e IgAs). Protección frente a toxina

del cólera Subunidad B de la entero-toxina LT de E. coli

Patata Alimentación Ratón IgGs en suero e IgAs en mucosas. Protección frente a toxina LT

Humano ASCs. Anticuerpos neutralizantes en el suero (IgGs e IgAs) e IgAs en mucosas

Hepatitis B Callo de altramuz Alimentación Ratón IgGs en suero Lechuga Alimentación Humano

Auloantígenos causantes de diabetes

Patata y tabaco bajo en alcaloides

Alimentación Ratón Atenuación y retraso del desarrollo de la enfermedad

mAb contra HSV-2 Soja Tópico Ratón Protección SIgA/G contra

Streptococcus mutans Tabaco Tópico Humano Protección

MAb contra IgGs Alfalfa In vitro Humano Herramienta de diagnóstico

> ti >

O O

O 2 o

2

* El organismo ensayado no es siempre el sujeto real de la enfermedad. ** Igs en este apartado siempre se refiere a Igs específicas del antígeno ad-ministrado. ND: no descrito. Mab: anticuerpo monoclonal. Ig: inmunoglobulina. SIg: inmunoglobulina secretable. CP: proteína de la cápsida. ASC: células intestinales secretoras de anticuerpos. HSV-2: virus herpes simplex 2.TGEV: virus de la gastroenteritis porcina transmisible. FMDV: virus de la fiebre aftosa. RDHV: virus de la enfermedad hemorrágica de los conejos.

2 o o


de una mucosa, ya sea del tracto respiratorio, gastrointestinal o genital. Por ello, es especialmente deseable el desarrollo de una respuesta inmune, de fuerza y calidad suficientes para proteger frente a la enfermedad, en estos sitios de entrada. Dado que la inmunización parenteral raramente induce respuesta inmune en mucosas, mientras que la inmunización en mucosas puede inducir tanto respuesta inmune hu-moral y celular sistémica como respuesta inmune local, el segundo tipo de admi-nistración del antígeno es, en general, preferible. Además, la administración oral de vacunas es más económica y más segura desde el punto de vista sanitario (jeringas y agujas son caras y, si no se mantiene su esterilidad, pueden ser vehículos de en-trada de graves enfermedades). Sin embargo, los antígenos no vivos administrados por vía oral son normalmente poco inmunogénicos. De hecho, la respuesta por de-fecto del sistema inmune intestinal a los antígenos de la comida es la tolerancia. Esta tolerancia oral evita el desarrollo de respuestas inmunes indeseadas frente a los alimentos que ingerimos. Sin embargo, la respuesta inmune a las vacunas clásicas que se administran por vía oral y a ciertas toxinas bacterianas demuestra que no to-dos los antígenos ingeridos se perciben por el sistema inmune como comida. Las su-bunidades B de la toxina del cólera (CT-B) y de la enterotoxina lábil al calor de E. coli (LT-B) continúan siendo inmunogénicas, aunque carecen de toxicidad. La administración a ratones por vía oral de patatas transgénicas que producen estas proteínas inducía el desarrollo de anticuerpos tanto en el suero como en la mucosa del intestino. Se comprobó, además, que los animales inmunizados mostraban cierta protección frente a las toxinas activas. En el primer estudio en humanos de una vacuna hecha en plantas, voluntarios adultos ingirieron patatas transgénicas que contenían proteína LT-B. Se observó, en el intestino de los individuos tratados, la aparición de células secretoras de anticuerpos (ASC), típicas de la activación del sistema inmune en mucosas, específicas del antígeno administrado. Los sueros de la mayoría de los individuos inmunizados contenían IgGs e IgAs específicas y mostraban capacidad neutralizante. Además, se pudo detectar la presencia de IgAs en las heces del 50% de los voluntarios que ingirieron las patatas transgénicas.

En principio se pensó que los positivos resultados de las inmunizaciones con LT-B y CT-B podían deberse a su especial capacidad para inducir respuesta inmu-ne en el aparato digestivo. Sin embargo, se ha comprobado que otras proteínas son también capaces de inducir una respuesta inmunológica local y sistémica cuando se administran por vía oral como parte de una planta transgénica. Este es el caso de proteínas estructurales de otros agentes infecciosos que causan diarreas, como el virus de Norwalk y el virus de la gastroenteritis porcina transmisible (TGEV), pero también el de proteínas de virus cuya actividad infecciosa no se centra en el aparato digestivo, como el virus de la fiebre aftosa (FMDV) y el de la hepatitis B.

Como he mencionado más arriba, un antígeno administrado oralmente pue-de, en lugar de estimular una respuesta inmunológica en su contra, generar to-lerancia. Se ha demostrado que, explotando esta propiedad, es posible usar plan-tas transgénicas en la terapia de enfermedades autoinmunes. La ingestión

LAS PLANTAS COMO BIOFACTORÍAS 149

continuada de tabaco o patatas transgénicas que expresan descarboxilasa del ácido glutámico (un autoantígeno relacionado con diabetes) a ratones NOD (diabéticos no obesos) impedía, en la mayoría de los casos, la aparición de la en-fermedad. Un estudio semejante mostraba una reducción sustancial de la infla-mación de los islotes del páncreas y un retraso de la progresión de la diabetes clínica en ratones NOD que habían sido alimentados con patatas que expresa-ban una proteína de fusión de la insulina y la proteína CT-B.

Otra aplicación de las plantas transgénicas, cuya utilidad aparece cada vez más clara, es la producción de anticuerpos para ser usados en inmunoterapia pa-siva o en diagnóstico. Son muchos los casos descritos de producción en plantas transgénicas de minianticuerpos que constan de una única molécula formada por la fusión, mediante un péptido flexible, de los dominios variables de las ca-denas ligera y pesada del anticuerpo (scFv). Estos scFvs pueden tener interés por su actividad dentro de la planta que los produce, aumentando su resistencia a patógenos o modificando sus propiedades fisiológicas, o por aplicaciones en otros sistemas de su capacidad de reaccionar con su molécula diana.

En general, sin embargo, es preferible la expresión de anticuerpos completos, debido a la presencia de dos dominios de unión, sobre todo si se requiere una inac-tivación muy eficiente de la proteína diana. La necesidad de introducir dos genes, los que codifican a las cadenas ligera y pesada, dificulta la obtención de plantas transgénicas que expresen anticuerpos completos. Sin embargo, se ha comproba-do que transformando de manera independiente con los dos genes y cruzando se-xualmente las plantas resultantes es posible obtener plantas que produzcan abundantemente el anticuerpo funcional procesado y plegado correctamente. La glicosilación del anticuerpo producido en plantas difiere algo de la de la molécula producida en células de mamífero, sin embargo ésto no parece afectar a la actividad del anticuerpo ni conferirle propiedades alergénicas preocupantes.

Por otra parte, la forma de anticuerpo más abundante en las secreciones de las mucosas, la principal barrera defensiva contra la entrada de patógenos al organis-mo, es la conocida como inmunoglobulina A secretable (SIgA). Las SIgAs son com-plejos proteicos constituidos por dos moléculas de IgA (cada una formada por una cadena ligera y una pesada) unidas por el péptido J que hace de cadena entre am-bas, y un cuarto polipéptido, el componente secretor (SC). La síntesis de estas mo-léculas en el aparato digestivo es complicada, ya que necesita células plasmáticas que secretan la forma dimérica de IgAs, y células epiteliales que expresan un re-ceptor de Igs y llevan a cabo un elaborado proceso que comienza con la endocito-sis de los dímeros de IgA y acaba con la liberación del complejo SIgA. Se ha comprobado que es posible ensamblar en plantas transgénicas complejos SIgA funcionales, en concreto una SIgA/G (la Ig es híbrida entre A y G) que reconoce a la proteína de adhesión de la superficie celular de Streptococcus mutans (Fig. 2). Para ello, se generaron cuatro plantas transgénicas de Ñicotiana tabacum que expresaban una cadena ligera kappa y una cadena pesada híbrida yl-a de un anticuerpo


monoclonal de ratón, un péptido J también de ratón y una proteína SC de conejo. Por medio de cruces sexuales sucesivos fue posible obtener una planta transgénica que expresaba los cuatro polipéptidos y era capaz de ensamblarlos en complejos funcionales. Los primeros ensayos en voluntarios humanos han demostrado la ca-pacidad de estos anticuerpos producidos en planta de impedir la colonización de dientes y encías por S. mutans, el mayor agente causante de caries dental.

Otro trabajo publicado describe la producción en soja transgénica de un an-ticuerpo monoclonal humanizado contra el virus del herpes simplex 2 (HSV-2). Los anticuerpos purificados de las plantas eran similares a los procedentes de cultivos celulares humanos en cuanto a capacidad de neutralización del virus, estabilidad en semen o mucus cervical humanos, y eficacia para prevenir infec-ciones vaginales por HSV-2 en ratón.

La inmunoterapia con anticuerpos producidos en plantas no tiene que re-ducirse al control de enfermedades infecciosas. Por ejemplo, existe un proyecto en marcha para la producción en maíz de anticuerpos contra el semen, con po-sible utilidad como anticonceptivos.

Los anticuerpos producidos en plantas pueden tener aplicaciones distintas a la inmunoterapia. Así, se ha descrito la producción en alfalfa de un anticuer-po monoclonal anti IgGs humanas. Este tipo de anticuerpos es de uso habitual en los bancos de sangre para la detección de anticuerpos no aglutinantes. Los autores del trabajo estiman que el precio del anticuerpo producido en plantas puede descender a 500 euros por gramo, frente a los 5.000 Euros por gramo del anticuerpo producido con el sistema actual de hibridomas.

3.5.4. Vectores de expresión transitoria

El uso de virus de plantas como vectores de expresión ha suscitado desde hace tiempo un considerable interés tanto científico como comercial. La tabla 2 resume algunos casos de expresión de antígenos y anticuerpos en plantas usan-do vectores virales.

La posibilidad de utilizar técnicas de ingeniería genética directamente so-bre ADN convirtió a los virus con este tipo de genomas en los primeros candi-datos para ser usados como vectores de expresión. Sin embargo, el escaso nú-mero de virus de plantas con genomas ADN y sus restringidos espectros de huéspedes, junto con sus estrictos requerimientos en tamaño y expresión genó-micos, han limitado considerablemente la utilidad de estos virus para producir en plantas productos foráneos.

Más del 80% de los virus de plantas tienen como genoma ARN de banda sen-cilla con polaridad de mensajero. Debido a la imposibilidad de usar técnicas de in-geniería genética directamente sobre el genoma de estos virus, no se creyó inicial-mente que pudieran ser buenos vectores de expresión. Posteriormente se comprobó que era posible clonar copias ADN de estos genomas ARN, manipularlas adecúa-

LAS PLANTAS COMO BIOFACTORIAS 15 1

damente in vitro, y convertirlas de nuevo en ARN infeccioso por transcripci6n in vitro, usando promotores de bacteri6fagos, 0 in vivo, usando promotores reconocidos por una ARN polimerasa de la planta. Esto ha permitido el desarrollo de vectores de expresi6n basados en un amplio numero de virus con genom a ARN.

Hay tres estrategias generales para la inserci6n de genes extranos en genomas virales: i) reemplazamiento genico, don de genes virales no esenciales son re-

( pesada

IgA completa

/

ligera

cadena J.

IgA dlmerica componente secretor

IgA secretable

Figura 2. Cruces sexuales entre plantas transformadas con los genes de las cadenas ligera y pesada, cadena J y componente secretor para construir una planta que expresa IgA secretable completa. Figura adaptada de Whitelam y Cockburn, 1996. Trends in Plant Science 1: 268-272.

TABLA 2 Vacunas y anticuerpos producidos en plantas con vectores de expresión transitoria

Antígeno Anticuerpo Vector Planta huésped Vía de administración

Organismo ensayado*

Efecto

Proteína VP1 de FMDV TMV Nkotkna benthamkim Parenteral Ratón Anticuerpos en suero (sin especificar dase). Protección frente a FMDV

Péptido de la proteína VP2 deMEV

CPMV Chícharo Parenteral Visón Anticuerpos en suero (sin especificar clase). Protección frente a MEV

Péptido de la proteína F de Pseuioinonas «eruginosa

CPMV Chícharo Parenteral Ratón IgGs** en suero, atenuación de la enfermedad pulmonar causada por P. aemgiimsa

Péptido de la proteína FnBP de Staphilococcm auras

CPMV Chícharo Intranasal Ratón Suero con IgGs que inhibe la unión de fibronectina humana a FnBP de 5. airas. IgGs e IgAs en mucosas

Péptido de la glicoproteína del virus de la rabia

A1MV en TMV

JV. bentkmkna Parenteral Ratón Anticuerpos neutralizantes en suero (IgGs). Protección frente a dosis letal del virus de la rabia

Intubación gástrica Ratón IgGs e IgAs en suero e IgAs en mucosas. Atenuación de síntomas causados por virus de la rabia poco virulento

Espinacas Alimentación

Péptido de la proteína VP2 deCPV

PPV JV. deveknáii Parenteral Ratón y conejo Anticuerpos neutralizantes en suero (sin especificar clase)

Péptido de glicoproteína gpl20 de HIV

TBSV JV. bmthamkna Parenteral Ratón Anticuerpos en suero (sin especificar clase)

Péptidos de la proteína CS de Pksmoiium vivía ■jP.yoéi

TMV Tabaco Parenteral Ratón Anticuerpos en suero (sin especificar clase)

Péptido de la proteína ZP3 de la zona pelúcida murina

TMV Tabaco Parenteral Ratón Autoanticuerpos detectados in vivo en la zona pelúcida de animales inmunizados

ScFv derivado de un linfoma de ratón

TMV JV. bentkmknii Parenteral Ratón IgGs en suero. Protección frente a una dosis letal de células tumorales

O w o o o o > r ñ > >

> o 2 o ¡

TABLA 2 (continuación) Vacunas y anticuerpos producidos en plantas con vectores de expresión transitoria

Anlígeno Anticuerpo Vector Planta huésped Vía de administración

Organismo ensayado*

Efecto

ScFv contra herbicida diuron

PVX («overcoat»)

¡V. demlanáü In vitro Diagnóstico

Mab contra un antígeno de un cáncer de colon

TMV N. bmthamkiui NE NE NE

ScFv contra un antígeno

carcinoembriónico humano

Agróbacie-ráffli

(agroinfil-tración)

Tabaco NE NE NE

* El organismo ensayado no es siempre el sujeto real de la enfermedad. ** Igs en este apartado siempre se refiere a Igs específicas del antígeno ad-ministrado. NE: no ensayado. Mab: anticuerpo monoclonal. Ig: inmunoglobulina. ScFc: minianticuerpo con las dos regiones variables en una sola cadena. A1MV: virus del mosaico de la alfalfa. CPMV: virus del mosaico del chícharo. CPV: parvovirus canino. FMDV: virus de la fiebre aftosa. HIV: virus de la inmunodeficiencia adquirida humana. PPV: virus de la sharka. TBSV: virus del achaparrado peludo del tomate. TMV: virus del mosaico del tabaco.

>

>

O O

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emplazados por el gen de interés; ii) inserción génica, donde el gen extraño se ex-presa bajo el control de un promotor subgenómico adicional, o como parte de una poliproteína de la que se libera por procesamiento proteolítico; y iii) fusión génica, donde la secuencia proteica extraña se produce como un producto de fu-sión con una proteína viral. Son pocos los genes dispensables en virus con geno-ma ARN de plantas. En principio, es posible emplear abordajes de sustitución gé-nica reemplazando genes indispensables, si su producto proteico se suministra en trans en una planta transgénica. Aunque hay publicaciones que demuestran que esta estrategia es factible, no se ha seguido en demasiados casos. Así, la inserción génica es la estrategia que ha dado lugar a resultados más satisfactorios cuando se pretendía expresar secuencias codificantes grandes. Las fusiones génicas se han usado principalmente para incluir secuencias extrañas en la proteína de la cápsida (CP) y han dado muy buenos resultados para la presentación de peque-ños péptidos antigénicos en la superficie de las partículas virales.

Son abundantes los casos que, usando genes delatores, han demostrado la capacidad de diferentes virus con genoma ARN de producir proteínas extrañas en plantas. Además, se han empleado con éxito en diferentes tipos de experi-mentos científicos algunos virus recombinantes, sobre todo derivados del virus del mosaico del tabaco (TMV) y del virus X de la patata (PVX), con secuencias extrañas insertadas en su genoma. La primera sustancia farmacéutica con posi-ble valor comercial que se produjo con un vector basado en un virus de plantas con genoma ARN fue una proteína inactivadora de los ribosomas eucarióticos, la a-trichosantina, que procede de las raíces de una planta medicinal china lla-mada Trichosanthes kirilowii. La secuencia que codifica a esta proteína se clonó en TMV bajo el control de un promotor subgenómico adicional (procedente de un tobamovirus distinto, para evitar recombinación homologa entre secuencias repetidas). La a-trichosantina se acumulaba en hojas de Nicotiana benthamiana infectadas sistémicamente hasta representar más del 2% de la proteína soluble de la planta, estaba correctamente procesada y era biológicamente activa.

Este mismo tipo de vector se ha utilizado para la producción de un minian-ticuerpo tipo scFv derivado de la inmunoglobulina producida por un linfoma de células B. La vacunación de ratones con la scFv producida en plantas protegía frente a la inoculación con células tumorales, demostrando que este tipo de abordaje puede ser de gran utilidad para la producción rápida de vacunas para el tratamiento de tumores malignos. Vectores basados en TMV pueden usarse también para producir en cantidades elevadas proteínas antigénicas susceptibles de ser usadas en la elaboración de vacunas contra el patógeno correspondiente. Así, se ha conseguido proteger a ratones contra el virus de la fiebre aftosa (FMDV) por inmunización con extractos foliares de plantas infectadas con un virus recombi-nante derivado de TMV que expresaba la proteína estructural de FMDV VP1.

El sistema de expresión basado en TMV no sólo es capaz de producir ca-denas polipeptídicas sencillas. Se ha comprobado que también sirve para pro-


ducir complejos multiproteicos. Así, formas completas de un anticuerpo mono-clonal dirigido a un antígeno de cáncer de colón se ensamblaban correctamente cuando sus cadenas ligeras y pesadas se expresaban en la misma planta a partir de dos vectores independientes.

Un sistema de expresión de secuencias extrañas clonadas en virus de plan-tas que puede considerarse intermedio entre la inserción y la fusión génicas es el denominado «overcoat» que se ha desarrollado para PVX. En este caso la se-cuencia del gen que se desea expresar se fusiona a la de la CP del virus, interca-lando entre ellas la secuencia que codifica a los 16 aminoácidos del péptido 2A de FMDV. Esta secuencia induce el procesamiento proteolítico en su extremo carboxilo, en un cierto porcentaje de las proteínas de fusión. De esta forma, se produce un número de moléculas de CP libre suficiente para el ensamblaje de partículas virales infecciosas. Estas partículas incluyen también moléculas del producto de fusión no procesado, presentando, por tanto, en su superficie la se-cuencia proteica extraña. Usando este sistema, ha sido posible producir en ho-jas de N. benthamiana un anticuerpo scFv funcional (que reconoce al herbicida diuron) expuesto en la superficie de las cápsidas de PVX.

Como he mencionado más arriba son numerosos los casos en que las cápsidas virales se han usado como presentadores antigénicos de pequeños epítopos extra-ños insertados en la CP viral. Entre los virus que se han empleado con esta finali-dad se pueden destacar TMV, virus del mosaico del chícharo (CPMV), virus del mosaico amarillo del nabo (TYMV), virus de la sharka (PPV), virus del mosaico de la alfalfa (A1MV) y virus del achaparrado peludo del tomate (TBSV). En la ma-yor parte de los casos el objeto de las partículas quiméricas era inducir una res-puesta inmune defensiva frente al patógeno del que deriva el epítopo expresado. Entre los antígenos que se han estudiado se encuentran péptidos de virus huma-nos y animales como los de la inmunodeficiencia humana (HIV), rinovirus, FMDV, rabia, diferentes parvovirus etc., de bacterias como Pseudomonas aeruginosa y Stap-hilococcus aureus, o de protozoos como diferentes especies de Plasmodium. Hay que destacar que también se han preparado partículas virales quiméricas, derivadas de TMV, que expresan un epítopo murino de una proteína de la zona pelúcida del oocito; aunque la inmunización parenteral de ratones con estas partículas inducía una respuesta específica de autoanticuerpos que se detectaban in vivo en la zona pelúcida de las ratones hembras, en contra de lo esperado, no se apreció en este estudio un impacto significativo sobre la fertilidad de los animales tratados.

Los avances más significativos hacia el desarrollo de vacunas basadas en partículas virales quiméricas producidas en plantas se han llevado a cabo con vectores de expresión derivados de CPMV. Se han purificado en gran cantidad, a partir de plantas infectadas de Vigna unguiculata, viriones de CPMV que ex-ponen en su superficie un epítopo lineal de la proteína VP2 del virus de la en-teritis del visón (MEV). Una sola inyección subcutánea de estas partículas pro-tegía a los visones frente a la infección por MEV con una eficiencia sólo


ligeramente inferior a la de una vacuna convencional. Como el epítopo intro-ducido estaba conservado en tres parvovirus diferentes (MEV, parvovirus cani-no y panleucopenia felina) la misma vacuna podría ser usada en tres huéspedes económicamente importantes (visones, perros y gatos).

Más recientemente se ha logrado conferir a ratones cierto nivel de protec-ción frente a la infección pulmonar por P. aeruginosa, mediante la administra-ción parenteral de cápsidas de CPMV que presentan en su superficie un epíto-po de la proteína F de la membrana externa de esta bacteria.

Las partículas quiméricas derivadas de CPMV son también capaces de in-ducir una respuesta inmune eficiente en mucosas. La inmunización por vía in-tranasal con cápsidas de CPMV formadas por moléculas de CP que tenían insertado un péptido de la proteína FnBP de S. aureus, no sólo primaba células T específicas de CPMV y generaba altos títulos de IgGs específicas de CPMV y FnBP en suero, sino que, además, inducía la secreción de IgAs e IgGs específicas de CPMV y FnBP en los fluidos bronquiales, intestinales y vaginales. El suero inhibía por completo la unión de fibronectina humana a la proteína FnBP de S. aureus (aunque los títulos de bloqueo eran menores que los logrados con IgGs de ratones inmunizados subcutáneamente). La inmunización oral con las partículas quiméricas daba lugar a títulos de anticuerpo en el suero menores y más variables que los generados por la ruta intranasal, y no parecía inducir niveles de secreción apreciables de IgAs específicas de FnBP en el intestino.

Otro estudio que ha comparado la eficiencia de inmunización de partículas virales quiméricas por vía oral o parenteral ha empleado cápsidas formadas por una CP híbrida de A1MV que incluía dos epítopos del virus de la rabia, expresa-da en N. benthamiana y espinacas con un vector basado en TMV Después de tres dosis de cápsidas purificadas administradas intraperitonealmente, un 40% de los ratones inmunizados quedaban protegidos frente a una dosis letal de virus viru-lento. La respuesta parecía menos eficiente cuando se administraban partículas purificadas por intubación gástrica, o se añadían al alimento hojas de espinacas infectadas. Aún así, se apreciaba en los animales sometidos a estos tratamientos la aparición de IgGs e IgAs específicas en el suero (más en los animales inmuni-zados por intubación gástrica) y la secreción de IgAs en la mucosa intestinal (más en los animales alimentados con espinacas infectadas). En ambos casos de inmu-nización oral se apreciaba una cierta atenuación de los síntomas clínicos causa-dos por una infección intranasal con una raza poco virulenta del virus de la rabia.

Aunque la mayoría de los ensayos de producción de compuestos foráneos en plantas por medio de expresión transitoria han empleado vectores basados en virus, se han desarrollado también otros sistemas. La transferencia de ADN des-nudo a plantas por bombardeo de partículas es útil para un test rápido de la sín-tesis de la proteína deseada previo a la transformación estable, pero no es ade-cuado para la producción de grandes cantidades de proteína. Un sistema que, por el contrario, parece ofrecer mejores perspectivas para producir en plantas en un


tos de la proteína extraña. Una causa importante de este problema es que ni si-quiera mecanismos de expresión muy eficientes serían capaces de compensar tanto una deficiente compatibilidad del gen extraño con la maquinaria biosin-tética de la planta en la que está clonado como la falta de estabilidad de la proteína transgénica en la célula vegetal. Es por esta razón por la que existe una tendencia a editar los genes que se pretende expresar en la planta, adaptando el uso de codones al preferido por la planta, eliminando señales de procesamiento o inestabilidad del ARN, o añadiendo marcas a la proteína que la dirigen a compartimentos subcelulares donde puede ser más estable. Es de prever que cuando se conozca más acerca de los factores que influyen en la estabilidad de las proteínas en las células vegetales, se pueda modificar las proteínas que se pretenda producir en plantas para limitar su degradación sin alterar el resto de sus propiedades. Por otra parte, se ha demostrado recientemente que en muchos casos, tanto los transgenes como genes endógenos homólogos de ellos resultan silenciados transcripcionalmente o post-transcripcionalmente. Parece que altos niveles de transcripción, junto con otros factores de estructura del locus de inserción del transgén, facilitan el silenciamiento post-transcripcional. También los virus inducen una respuesta defensiva de la planta que está estrechamente relacionada con el silenciamiento post-transcripcional, pero han desarrollado diferentes estrategias para suprimirla o escapar de ella. Los futuros progresos en el conocimiento de los mecanismos del silenciamiento y de su supresión serán fundamentales para poder desarrollar fitofactorías de alto rendimiento.

La mayor parte de los primeros ensayos para producir en plantas compuestos foráneos han empleado plantas fácilmente transformables y susceptibles a mu-chos virus, como varias especies del genero Nicotiana. Como he mencionado más arriba, ya en estos momentos está habiendo un movimiento hacia especies más adecuadas para los objetivos deseados. Producción en plantas que sean directa-mente comestibles puede ser de gran utilidad para vacunas o para aditivos ali-mentarios. Otro aspecto a considerar es que la acumulación del producto en ma-terial vegetal almacenable por tiempos prolongados, como semillas y tubérculos, añade valor comercial al sistema. Patata, algunas leguminosas y maíz se en-cuentran entre las especies más prometedoras. Por otra parte, especies peren-nes podrían, idealmente, convertirse en fuentes estables eternas de moléculas recombinantes. Es por esto por lo que la alfalfa, que puede cosecharse durante varios años consecutivos, se ha convertido también en un sistema atractivo. Es previsible que los progresos, tanto científicos como técnicos, que se realicen en los próximos años permitirán el incremento del número de especies y varieda-des susceptibles a transformación y regeneración, lo que hará más fácil encon-trar plantas con las características fisiológicas y agronómicas adecuadas para la producción de cada compuesto. Futuros desarrollos de promotores específicos de tejido y de promotores inducibles por tratamientos exógenos permitirán un diseño más racional de los sistemas de expresión.


Otra posibilidad para incrementar el nivel de expresión de plantas trans-génicas que está siendo explorada es la transformación de los genomas plastí-dicos en lugar del nuclear. Como cada célula de mesófilo puede tener más de cien cloroplastos, cada uno con aproximadamente cien copias del genoma plas-tídico, la producción de líneas de plantas homotransplastómicas (en las que todos los genomas plastídicos han sido transformados) ofrece un enorme potencial de sobreexpresión.

Hasta ahora la mayor parte de los intentos de producir sustancias extrañas en células vegetales han empleado plantas completas. No obstante, hay ya tra-bajos que parecen indicar que el empleo de cultivos celulares en suspensión pue-de resultar una alternativa satisfactoria. Explotar estos cultivos celulares es cla-ramente más costoso que cultivar plantas, pero los cultivos de células vegetales son mucho más económicos que los de células animales y siguen careciendo de los peligros de contaminación con agentes patógenos de estos últimos. Sin em-bargo, para que se extienda el uso de suspensiones de células de planta en la pro-ducción de sustancias recombinantes de interés comercial será necesario un ma-yor desarrollo de las técnicas de cultivo a gran escala y de los métodos de procesamiento posterior del material vegetal. Otra nueva tecnología que podría emplearse para la producción de proteínas de alto valor, es la rizosecreción. En esta tecnología, la proteína de interés es secretada al medio de cultivo por las raíces de plantas cultivadas hidropónicamente. El sistema permite producir la proteína de interés de manera continua, sin necesidad de destruir la planta, ob-teniéndose así un rendimiento global mayor. Por otra parte, resulta mucho más sencillo purificar la proteína de interés a partir de un simple medio hidropóni-co que de complejos extractos de plantas.

Las diferencias que existen en los patrones de glicosilación de mamíferos y plantas podría representar una importante limitación para el uso en terapia in vivo de glicoproteínas recombinantes de mamífero, como las inmunoglobulinas, produ-cidas en plantas. Como ya he mencionado en otro apartado, los experimentos efec-tuados hasta la fecha parecen indicar que estas diferencias no afectan ni a la activi-dad de la molécula ni a su inmunogenicidad. Sin embargo, no es descartable que en algunos casos, algunas estructuras de oligosacáridos específicas de plantas, como las que contienen residuos de (3(1,2)-xilosa y a(l, 3)-fucosa, pudieran resultar altamente inmunogénicas en mamíferos. Por esta razón, se hace necesario desarrollar plantas con modificaciones en sus rutas de glicosilación que permitan obtener glicoproteí-nas con carbohidratos más similares a los de las células de mamífero.

Finalmente, es importante no perder de vista que para que se extienda el uso de proteínas recombinantes producidas en plantas es preciso que tengan aceptación social. La aceptación por el público de este tipo de productos no será automática. Para conseguirlo, será necesario que pasen controles rigurosos que demuestren su inocuidad, y que haya una información clara y detallada acer-ca de estos controles, así como sobre las ventajas de los nuevos productos.


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