TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

Tecnología del DNA recombinante

• Conjunto de técnicas que permiten el aislamiento de genes, su purificación, modificación y expresión en organismos diferentes de aquel de origen.

Herramientas: Nucleasas

• DNA o RNA ss o ds• Endonucleasas: no requiere extremos.• Exonucleasas: substratos con extremos

Endonucleasas. S1 nucleasa

Exonucleasas cadena única

Exonucleasa cadena doble

RNasa H

• Degrada RNA de un híbrido RNA - DNA

Endonucleasas de restricción

• Evolución dotó a las diferentes especies bacterianas con endonucleasas específicas para distinguir su propio DNA del DNA extraño.

• Marcada especificidad para reconocer cortas secuencias de nts.

• Existencia de muchas E.R. c/u reconociendo una secuencia específica.

Tipos de E.R.• Tipo I: reconoce y corta a distancias variables

del sitio de reconocimiento. Mínimo 400 pb y máximo 7 Kb. Corta DNA doble cadena.

• Tipo III: cortan DNA doble cadena aprox. 25 pb de su sitio de reconocimiento.

• Tipo II: cortan DNA en el sitio de reconocimiento. Generan fragmentos reproducibles.

• Tipos I y III: no producen fragmentos reproducibles de DNA.

Secuencias palindrómicas

• Palabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha, que de derecha a izuierda.

• Radar• Anilina• Dábale arroz a la zorra el abad.• T T A G C A C G T G C T A A • A A T C G T G C A C G A T T

Enzimas de restricción

• Por ejemplo:EcoRI

• Otros ejemplos:– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de

Bacillus amyloliquefaciens– SmaI – la primera que se aisló de Serratia

marcesens– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de

Haemophilus influenzae

Escherichia(género)

coli(especie) cepa R

Primera enzima aisladade ese organismo.

Tipos de corte • “Sticky” o pegajosos –

es más fácil para volver a ligarse los extremos.– Ejms.

• EcoRI• Bam HI• HindIII

• “Blunt” o abruptos– Ejm.

• SmaI

E.R: extremos cohesivos

E.R: extremos cohesivos

→

Mapas de restricción

• Analizando los fragmentos producidos por varias E.R en particular y en combinación se consigue deducir el orden de los segmentos dentro de la molécula original.

• Digerir con E.R en forma individual y simultanea, correr en gel y determinar su tamaño.

Mapas restricción

Ejemplos de mapas de restricción

• DNA circular digerido con:• DNA lineal digerido con:

Hacer mapa de restricción

• DNA no digerido 7 Kb.• Hind III 6.2 0.8 Kb.• Sma I 5.8 1.2 kb.• Hind III + Sma I 5.8 0.8 0.4 Kb

Mapa Restricción