2002_biomedica_223[1]

Biomédica Instituto Nacional de SaludVolumen 22, No. 3 - Bogotá, D. C., Colombia - Septiembre, 2002

COMITE EDITORIAL

Elizabeth Castañeda, editoraSantiago Nicholls, editorCarlos Arturo Hernández, coeditorMartha RenzaGerzaín RodríguezJorge BoshellGabriel CarrasquillaNancy Gore SaraviaAntonio IglesiasLeonard E. MunstermannGloria I. PalmaAngela Restrepo

BIOMEDICA

La revista Biomédica del Instituto Nacional deSalud es una publicación trimestral, eminente-mente científica.

Está amparada por la resolución número 003768de 1981, emanada del Ministerio de Gobierno, ycon tarifa postal reducida según resoluciónnúmero 1128 del 5 de mayo de 1982.

Ninguna publicación, nacional o extranjera, podráreproducir ni traducir sus ar tículos o susresúmenes, sin previa autorización escrita deleditor.

Ni la revista, ni el Instituto asumen responsa-bilidad alguna por los puntos de vista expresadospor los autores.

La revista no publicará ningún tipo de propagandacomercial. Los nombres de equipos, materiales yproductos manufacturados que eventualmentepuedan mencionarse, no implican recomendaciónni propaganda para su uso y sólo se mencionaráncomo identificación genérica.

La revista Biomédica forma parte del IndiceNacional de Publicaciones Seriadas Científicas

y Tecnológicas Colombianas de Colciencias yaparece reseñada en el índice de la LiteraturaLatinoamericana en Ciencias de la Salud

(LILACS), en el Sistema de InformaciónBibliográfica Regional Andina (SIBRA), en CABAbstracts, Review of Medical and VeterinaryEntomology, y en el Indice Latinoamericano deRevistas Científicas y Tecnológicas (LATINDEX).

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Avenida Calle 26 No. 51-60Apartado aéreo 80334 y 80080

Zona 6, Bogotá, D.C., Colombia, S.A.

http://www.ins.gov.co

EditorialEducación, ciencia y tecnología

La capacidad de un país o región para producir yasimilar conocimiento es un factor esencial paragarantizar su competitividad. Esto es aún más cierto sise tiene en cuenta el vertiginoso avance de la tecnologíaactual y su siempre más estrecha relación con laciencia. Los países avanzados, al igual que los dereciente industrialización, han hecho grandes esfuerzospara fortalecer su capacidad de producción deconocimiento, convirtiendo a la educación, la ciencia yla tecnología en ejes de su desarrollo.

Tanto en educación como en ciencia y tecnología,Colombia ha logrado avances importantes en lasúltimas décadas, a pesar de los cuales y dado el muybajo nivel inicial, la distancia que nos separa de lospaíses industrializados y de los más avanzados deLatinoamérica es aún muy grande. Cambiar esasituación requiere establecer programas de choque, conmetas bien definidas que busquen alcanzar un 100%de cobertura de la educación básica primaria ysecundaria y un mayor acceso a la educación superior,al igual que un desarrollo real de la investigación básicay aplicada tanto en la universidad como en el sectorproductivo.

Vale la pena, en el momento en que el nuevo gobiernodebe empezar a elaborar el plan de desarrollo quepresentará al Congreso, recoger algunas de lasexperiencias recogidas a lo largo de los más de 10 añosde vida del Sistema Nacional de Ciencia y Tecnología,con el fin de que esos elementos contribuyan en eseproceso.

Como propuestas de política general podemosmencionar las siguientes:

• lograr que el apoyo a la ciencia y a la tecnologíasea una política de Estado y factor estratégico en eldesarrollo del país;

• alcanzar niveles de apropiación social de la cienciay la tecnología comparables con los de los paísesavanzados y acordes con las necesidades delmundo actual;

• consolidar el Sistema Nacional de Ciencia yTecnología y el Sistema Nacional de Innovaciónpara que se conviertan en elementos estratégicospara el desarrollo del país, y

231

• fomentar la regionalización a través de programas que permitan la realización de proyectos deinvestigación en las regiones de menor desarrollo con el apoyo de instituciones de las zonas másavanzadas.

Las acciones específicas que se deberían realizar cubren diferentes aspectos:

Aspectos legislativos:

• reglamentar la Ley 29 de 1990 para tener herramientas de coordinación de todos los actores delSistema Nacional de Ciencia y Tecnología;

• complementar la reglamentación de los Decretos Ley 595, 393 y 585 de 1991;

• en la reforma de la ley de contratación, incluir claramente un régimen especial para la ciencia y latecnología;

• preparar una ley que incluya aspectos institucionales, mecanismos de financiación, sistemas decontratación y estímulos de tipo tributario para el sector de ciencia y tecnología, tales como laexención de IVA y gravamen para las importaciones, descuentos tributarios para inversión ydonación, reglamentación para la transferencia de tecnología, etc., y

• complementar la legislación sobre propiedad intelectual y facilitar el trámite de patentes en elpaís y en el exterior.

Aspectos institucionales:

• fortalecer a Colciencias, aplicando las herramientas que ofrece la Ley 29 de 1990; esta entidaddebe ser la coordinadora de las actividades de ciencia y tecnología financiadas por el Estado ydebería tener participación en el Conpes;

• consolidar las entidades que constituyen los elementos del Sistema Nacional de Ciencia y Tecno-logía para lograr su sostenibilidad a largo plazo, y

• comprometer al gobierno a alto nivel en el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y en losConsejos de Programa con el fin de fortalecer su capacidad de formular políticas en el campo.

Aspectos financieros:

• crear los mecanismos para que, al finalizar el cuatrienio, la inversión nacional total en ciencia ytecnología alcance el 1,5% del PIB; se deben establecer estímulos para que, por lo menos, el40% de esos recursos sean de origen privado;

• a corto plazo, se podría iniciar la negociación de un crédito BID para Colciencias, para lo cualexiste una buena disposición en ese Banco; igualmente, se podría implementar el proyectoMillenium del Banco Mundial para apoyo a centros y grupos de excelencia;

• crear mecanismos para la financiación a largo plazo de programas de investigación básica yaplicada en las universidades y centros de investigación;

• garantizar la sostenibilidad de los centros de investigación, de los centros de desarrollo tecnológicoindependientes, de los centros interactivos y de las incubadoras de empresas de base tecnológica,a través de una financiación de tipo institucional decreciente por períodos que puedan llegarhasta diez años;

• mejorar los estímulos tributarios para inversiones y donaciones en investigación y desarrollo, conel fin de atraer la inversión privada y solucionar los problemas tributarios relacionados con laprestación de servicios tecnológicos;

• financiar sistemáticamente un overhead en todos los proyectos, incluyendo los de investigaciónbásica;

232

• constituir fondos de capital que permitan con sus réditos dar un apoyo básico a los centros deinvestigación y desarrollo;

• integrar los diferentes sistemas de financiación de la ciencia y la tecnología, estableciendo criteriosunificados;

• buscar la posibilidad de que un porcentaje de los recursos del Fondo de Regalías se destine a lainvestigación;

• extender la exención de IVA para las compras de productos tecnológicos de origen nacional;

• en las compras del Estado, dar la debida prioridad a la tecnología nacional y maximizar losprocesos de transferencia cuando aquélla se adquiera en el exterior, y

• canalizar la cooperación técnica internacional hacia proyectos de desarrollo tecnológico de me-diano y largo plazo y establecer los mecanismos de coordinación que se requieran entre losdiferentes sectores.

Sector educativo:

• promover una reforma a fondo del aprendizaje de las ciencias a nivel escolar y universitario,promo- viendo el desarrollo de competencias básicas, de la capacidad de investigación y de lacreatividad;

• introducir masivamente el uso de computadores como apoyo a la enseñanza en todos los nive-les; se debe fijar como meta que todas las escuelas del país tengan acceso a Internet en unplazo muy corto y que los maestros reciban una capacitación adecuada;

• fomentar el uso de laboratorios y talleres escolares y la realización de proyectos que incluyan lafabricación de objetos concretos;

• apoyar la educación no formal e informal como complemento a la educación escolar, y

• consolidar los doctorados nacionales apoyando al mismo tiempo el regreso al país de científicoscolombianos de alto nivel y consolidando la infraestructura de las universidades en lo que atalleres, plantas piloto y laboratorios se refiere, teniendo como meta lograr que el uno por mil dela población esté dedicada a labores de investigación y desarrollo.

Por parte del sector empresarial:

• inducir un proceso de reconversión industrial, fomentando la modernización de las empresasexistentes y la creación de nuevas empresas con mayor contenido de conocimiento;

• fomentar el establecimiento de una cultura de la innovación en las empresas y entidades;

• establecer los mecanismos adecuados para que el sector privado invierta en la sostenibilidad delSistema Nacional de Ciencia y Tecnología;

• a través de la difusión de ejemplos concretos, desarrollar la confianza en la capacidad nacionalde producir conocimiento;

• establecer programas eficaces de comercialización de servicios tecnológicos que se inicien conla realización de inventarios completos de la oferta y la demanda en ese campo;

• fomentar la creación de fondos de capital de riesgo para apoyar la creación de empresas debase tecnológica, y

• favorecer la relación universidad-empresa mediante la consolidación o la creación de interfacestales como los centros de investigación no universitarios o los centros de desarrollo tecnológico.

233

235

Contenido

Editorial ............................................................. 231

Imágenes en biomedicinaAmiloidosis en Didelphis marsupialis infectadoexperimentalmente con Leishmania chagasiDiana Milena Roa, Ladys Sarmiento,Gerzaín Rodríguez ........................................... 237

Artículos originalesPreparación de genotecas de ADNc dePlasmodium falciparum para la búsquedade los genes de proteínas deunión a calmodulina, GOGAT y Pfmyo ADary L. Mendoza, Moisés Wasserman ............ 241

Enquistación in vitro de Giardia lamblia:análisis por electroforesis bidimensionalde proteínas expresadas diferencialmentePaula C. Hernández, María Leonor Caldas,Moisés Wasserman .......................................... 253

Estudio de la variabilidad de seis cepascolombianas de Trypanosoma cruzi mediantepolimorfismos de longitud de fragmentos derestricción (RFLP) y amplificación aleatoriade ADN polimórfico (RAPD)Pilar Rodríguez, Marcela Escalante, Hugo Díez,Claudia Cuervo, Marleny Montilla,Rubén Santiago Nicholls, Ignacio Zarante,Concepción Puerta ........................................... 263

Brote de enfermedad diarreica aguda causadopor Shigella flexneri en una escuela de Madrid,Cundinamarca: caracterización fenotípica ygenotípica de los aislamientosMarylin Hidalgo, María Elena Realpe,Nélida Muñoz, Diego Sicard, Esperanza Silva,Clara Inés Agudelo, Elizabeth Castañeda ....... 272

Presentación de casosInsuficiencia suprarrenal secundaria aparacoccidioidomicosisJosé M. Oñate, Angela María Tobón,Angela Restrepo ............................................... 280

Revisión de temaFiebres hemorrágicas virales en SuraméricaRobert B. Tesh ................................................. 287

Nota técnicaDefinición de las condiciones de temperaturay almacenamiento adecuadas en la detecciónde ADN de Leishmania por PCR en flebotominosOlga L. Cabrera, Leonard E. Munstermann,Rocío Cárdenas, Reynaldo Gutiérrez,Cristina Ferro .......................................................................................... 296

Selecciones del IQENLa mortalidad por sida y su impacto económicoen Cartagena de Indias, Colombia, 1995-2000Nelson Alvis, Juan Correa Reyes,Alvaro Carcamo ................................................ 303

Comentario bibliográfico .................................. 317

Fe de errata ....................................................... 319

Instrucciones para los autores

Anuncio

236

Contents

Editorial ............................................................. 231

Images in biomedicineAmyloidosis in Didelphis marsupialis experimen-tally infected with Leishmania chagasiDiana Milena Roa, Ladys Sarmiento,Gerzaín Rodríguez .......................................... 237

Original articlesScreening for calmodulin, GOGAT and Pfmyo Agenes in Plasmodium falciparum cDNAlibrariesDary L. Mendoza , Moisés Wasserman ........... 241

Giardia lamblia in vitro encystation: two dimen-sional electrophoresis analysis of differences inprotein expressionPaula C. Hernández, María Leonor Caldas,Moisés Wasserman .......................................... 256

Variability of six Colombian Trypanosoma cruzistrains as determined by restriction fragmentlength polymorphisms (RFLP) and randomamplified polymorphic DNA (RAPD)Pilar Rodríguez, Marcela Escalante, Hugo Díez,Claudia Cuervo, Marleny Montilla,Rubén Santiago Nicholls, Ignacio Zarante,Concepción Puerta ........................................... 263

Outbreak of acute diarrhoeal disease caused byShigella flexneri: phenotypic and genotypiccharacteristics of the isolatesMarylin Hidalgo, María Elena Realpe,Nélida Muñoz, Diego Sicard, Esperanza Silva,Clara Inés Agudelo, Elizabeth Castañeda ....... 272

Case presentationSecondary adrenal insufficiency associated withparacoccidioidomycosisJosé M. Oñate, Angela María Tobón,Angela Restrepo ............................................... 280

Topic reviewViral hemorrhagic fevers of South AmericaRobert B. Tesh ................................................. 287

Technical noteStorage conditions for phlebotomine sand fliesnecessary to detect Leishmania DNA by PCROlga L. Cabrera, Leonard E. Munstermann,Rocío Cárdenas, Reynaldo Gutiérrez,Cristina Ferro .......................................................................................... 296

IQEN selected reportsAIDS mortality and its economical impact inCartagena de Indias, Colombia, 1995-2000Nelson Alvis, Juan Correa Reyes,Alvaro Carcamo ................................................ 303

Bibliographic review .......................................... 317

Corrigendum ..................................................... 319

Author's instructions

Announcement

IMÁGENES EN BIOMEDICINA

Biomédica 2002;22:237-40

Amiloidosis en Didelphis marsupialis infectadoexperimentalmente con Leishmania chagasi

Diana Milena Roa 1, Ladys Sarmiento 2, Gerzaín Rodríguez 1,3

1 Laboratorio de Patología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Unidad de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.3 Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C.,

Colombia.

Un Didelphis marsupialis macho capturado en Teruel, Huila, se inoculó intraperitonealmentecon 1x106 promastigotes de Leishmania chagasi (MHOM/CO/84/CL044B). El animal desarrollóleishmaniosis visceral con abundantes amastigotes fagocitados en las células de Kupffer y enlos macrófagos esplénicos; murió 5 semanas después de la inoculación. La autopsia revelóamplios depósitos de amiloide en el hígado y en el bazo, demostrados por sus característicastintoriales y ultraestructurales. La consideramos como una amiloidosis secundaria a la infecciónexperimental, que ocurrió en el transcurso de 5 semanas luego de inoculado el animal.

Palabras clave: Didelphis marsupialis, leishmaniosis visceral, amiloidosis secundaria.

Amyloidosis in Didelphis marsupialis experimentally infected with Leishmania chagasi

A male opossum, Didelphis marsupialis, captured in Teruel (Huila), Colombia, was inoculatedintraperitoneally with 1x106 promastigotes of Leishmania chagasi (MHOM/CO/84/CL044B). Theanimal died 5 weeks after inoculation. Autopsy revealed signs of visceral leishmaniasis alongwith amastigote parasite form in Kupffer cells and spleen macrophages. Amyloid deposits inliver and spleen were demonstrated by histological staining and electron microscopy. The rapiddeath was considered a consequence of a secondary, reactive amyloidosis.

Key words: Didelphis marsupialis, visceral leishmaniasis, secondary amyloidosis.

Un Didelphis marsupialis macho (fara, chucha,zarigüeya) fue capturado por personal del InstitutoNacional de Salud mediante el empleo detrampas en Teruel, Huila; el animal se inoculóintra-peritonealmente con 1 x 106 promastigotesde Leishmania chagasi (MHOM/CO/84/CL044B),cepa procedente de un paciente de Pulí,Cundinamarca; el animal falleció 5 semanasdespués de la inoculación. Las imágenes ilustrancortes de hígado del animal.

En la figura 1a, coloreada con hematoxilina-eosina (HE), se ven abundantes amastigotesfagocitados por las células de Kupffer, parásitos

que se aprecian como estructuras granulares(flechas); es también llamativa la atrofiaimportante de los hepatocitos que estánreducidos a cadenas tenues por la presencia deun material eosinófilo, homogéneo, que delimitalos sinusoides que se ven llenos de eritrocitos.Este material se interpretó como amiloide, lo cualse confirmó con la coloración de rojo Congo quelo tiñó de color caoba (figura 1b) y fuebirrefringente con luz polarizada; además, fuefluorescente con la tioflavina T, técnica con la queel amiloide aparece en forma de cintas verdes(figura 1c). En esta misma figura, el materialautofluorescente amarillento, particulado,corresponde a los eritrocitos dentro de lossinusoides. Por microscopía electrónica seobservaron abundantes amastigotes fagocitadospor las células de Kupffer (figura 2a) y el amiloidemostró aspecto fibrilar con haces de filamentosen forma de agujas entrelazadas, de 7 a 10 nm

Correspondencia:Gerzaín Rodríguez, Laboratorio de Patología, InstitutoNacional de Salud, Avenida Calle 26 No.51-60, Bogotá,D.C., Colombia;teléfono 220 7700; [email protected]

Recibido: 20/06/02; aceptado: 23/08/02

237

Biomédica 2002;22:237-40ROAD.M., SARMIENTO L., RODRÍGUEZ G.

de diámetro, el típico aspecto ultraestructural paratodas las formas de amiloide (figura 2b).

Otros órganos del animal estudiados fueron elbazo y el pulmón. En el bazo también habíadepósitos de amiloide perivasculares, menosnotorios que en el hígado, junto con abundantesamastigotes fagocitados por los macrófagos. En

Figura 1a. Hígado: descripción en el texto. HE, 80X. Figura 1b. Hígado: descripción en el texto. Rojo Congo,80X.

Figura 1c. Hígado: descripción en el texto. Tioflavina T ymicroscopía con luz ultravioleta, 80X.

Figura 2a. Célula de Kupffer en el centro, con numerososamastigotes fagocitados. El material denso fibrilar (A) esamiloide. Escala: 3,6 µm.

Figura 2b. Aspecto fibrilar típico del amiloide, con mayorresolución. Escala: 0,5 µm.

el pulmón no se vieron depósitos de amiloide niinfiltrados inflamatorios con amastigotes.

Comentario

Los Didelphis marsupialis son reservorios devarios agentes infecciosos como los queocasionan la fiebre amarilla (1,2), la leishmaniosisvisceral y la enfermedad de Chagas (3-5);

238

Biomédica 2002;22:237-40 AMILOIDOSIS EN DIDELPHIS MARSUPIALIS

presentan una alta tasa de infección natural porlos parásitos de la familia Trypanosomatide,organismos que se detectan en su sangre (5).

Las amiloidosis incluyen un grupo de entidadesen varios órganos y tejidos, caracterizadas porel depósito extracelular de proteínas de estructurafibrilar, insolubles, de morfología y característicastintoriales semejantes, pero de composiciónquímica distinta (6,7); el depósito puede ser focalo multisistémico, generalizado; en este caso, sealtera la función de órganos vitales como elhígado, el riñón o los vasos sanguíneos,comprimidos o reemplazados por el amiloide, locual conduce a la muerte del hombre o del animalafectado (8,9).

El amiloide está formado por dos elementos biendefinidos: un componente fibrilar y una unidadpentagonal o componente P; ambos han sidoidentificados en todas las amiloidosis y se hademostrado que el componente P es idéntico entodas ellas, mientras que el componente fibrilares característico de cada tipo de amiloidosis,según la proteína que lo origine (6,7).

La clasificación de la amiloidosis se basa en eltipo de proteína precursora que forma el amiloide;los principales tipos son los siguientes (7,8):

AL: el precursor de esta sustancia amiloide es lafracción variable o N-terminal de las cadenaslivianas de las inmunoglobulinas; este depósitose presenta en las amiloidosis primariassistémicas.

AA: el precursor es la proteína sérica A, presenteen el suero normal y en diferentes estadosinflamatorios o tumorales; origina las amiloidosissecundarias a inflamaciones crónicas y tumores.

AFp: su precursor es la prealbúmina sérica,amiloidosis que se asocia con la polineuropatíafamiliar.

AS: denominación para el amiloide senil, que selocaliza en el aparato cardiovascular (ASc) y enel cerebro (ASb).

AEp: amiloide endocrino de los islotespancreáticos. Su precursor es la insulina.

AEt: amiloide endocrino del carcinoma medulardel tiroides, cuyo precursor es la tirocalcitonina.

AD: amiloide de la piel, localizado en la dermispapilar; la proteína precursora es la queratina.

Las amiloidosis más frecuentes en humanos enColombia y en muchos países en desarrollo sonlas secundarias o reactivas, llamadas así porquese desencadenan por la inflamación crónicapersistente en enfermedades como latuberculosis o la lepra, en las cuales la proteínaprecursora es la SAA o proteína amiloide A delsuero, producida en el hígado como respuesta ala inflamación crónica (8,9). En los paísesdesarrollados, la amiloidosis más frecuente enhumanos es la primaria sistémica, cuyosprecursores son las cadenas livianas deinmunoglobulinas (10).

Las coloraciones tradicionales para el amiloidecomo el rojo Congo, la tioflavina T y otrasdispendiosas o poco específicas (6,11) estánsiendo reemplazadas por métodos inmuno-histoquímicos que demuestran la presencia delcomponente AP y la proteína específica de cadatipo de amiloide (6,7).

Aun cuando no demostramos la naturalezaquímica del amiloide del Didelphis marsupialis,pensamos que es secundaria a la infecciónleishmaniósica y que se depositó en un tiempomuy corto, aunque no tenemos una pruebaincontrovertible de esta afirmación porquedesconocemos el estado de salud previo delanimal. No obstante, este depósito de amiloideno ha sido antes observado en Didelphisinfectados naturalmente con diversos agentesanimales que han sido estudiados en elLaboratorio de Patología del INS. Por otra parte,otros animales experimentales como el hámster,desarrollan amiloidosis secundaria sistémica conla leishmaniosis experimental (12,13). En loshumanos deben transcurrir varios años con lainfección crónica para que se deposite el amiloide(9); lo mismo ocurre con los caballos inoculadosrepetidamente para producir sueros antirrábicoso antiofídicos, los cuales desarrollan amiloidosissecundaria sistémica después de varios años deser inoculados con los inmunógenos corres-pondientes (Laboratorio de Patología, INS,observaciones sin publicar).

La amiloidosis secundaria ocurre con regularidaden modelos experimentales de animales quereciben inyecciones reiteradas de antígenos,

239

Biomédica 2002;22:237-40ROAD.M., SARMIENTO L., RODRÍGUEZ G.

como en los hámsteres (12,13), ratones (14) yperros con leishmaniosis visceral (15); losdepósitos se ven en el hígado, el bazo, lasglándulas suprarrenales, el riñón y los testículos(16,17).

En conclusión, un Didelphis marsupialis coninfección experimental por L. chagasi desarrollóamplios depósitos viscerales de amiloide en elhígado y en el bazo que se demostraron por suscaracterísticas tintoriales y ultraestructurales;consideramos esta amiloidosis como secundariaa la infección experimental con este parásito;estos eventos se desarrollaron en 5 semanas.

Referencias

1. Boshell J. Informe sobre la fiebre amarilla silvestre enla región del Meta, desde julio de 1934 hasta diciembrede 1936. Rev Fac Med 1938;6:407-27.

2. Gast-Galvis A. Historia de la fiebre amarilla enColombia. Bogotá: Instituto Nacional de Salud; 1982.

3. Corredor A, Gallego JF, Tesh RB, Peláez D, Díaz A,Montilla M, et al. Didelphis marsupialis, an apparentwild reservoir of Leishmania donovani chagasi inColombia, South America. Trans R Soc Trop Med Hyg1989;83:195.

4. Travi BL, Osorio Y, Guarín N, Cadena H. Leishmania(Leishmania) chagasi: clinical and parasitologicalobservations in experimentally infected Didelphismarsupialis, reservoir of New World visceralleishmaniasis. Exp Parasitol 1998;88:73-5.

5. Travi BL, Jaramillo C, Montoya J, Segura I, Zea A,Goncalves A, et al . Didelphis marsupialis, an importantreservoir of Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi andLeishmania (Leishmania) chagasi in Colombia. Am JTrop Med Hyg 1994;50:557-65.

6. Muñoz J. Diagnóstico y seguimiento de la amiloidosis.Rev Esp Reumatol 1996;23:21-5.

7. ABC Tu Salud. Amiloidosis. 2001; (2 pantallas).Disponible en: URL: http://www.abctusalud.com.

8. Panqueva C, Rodríguez G. Amiloidosis sistémica enautopsias. Revisión de la casuística del Hospital SanJuan de Dios de Bogotá. Acta Med Col 1986;11:87-91.

9. Rodríguez G, Berrío J, Sarmiento L. La lepra y el riñón.Biomédica 1999;19:45-55.

10. Kyle R, Bayrd E. Amyloidosis: review of 236 cases.Medicine 1975;54:271-98.

11. Sipe JD, Cohen AS. Review: history of the amyloid fibril.J Struct Biol 2000;130:88-98.

12. González J, Gallego E, Castaño M, Rueda A.Testicular amyloidosis in hamsters experimentallyinfected with Leishmania donovani. Br J Exp Pathol1983;64:518-23.

13. Sartori A, Oliveira AV, Roque-Barreira MC, Rossi MA,Neto-Campos A. Immune complex glomerulo-nephritisin experimental Kala-azar. Parasite Immunol 1987;9:93-103.

14. Barbosa-Santos E, Goncalves-Da Costa S, AlencarA. Amiloidosis in experimental tegumentaryleishmaniasis in mice. Am J Trop Med Hyg 1984;33:1270-1.

15. Poli A, Abramo F, Mancianti F, Nigro M, Pieri S,Bionda A. Renal involvement in canine leishmaniasis.A light-microscopic, inmunohistochemical and electron-microscopic study. Nephron 1991;57:444-52.

16. Kennedy J, Anderson JD. The effect of treatment ofthe associated disease on the development ofamyloidosis in the experimental animal. J Pathol 1983;141:11-5.

17. González J, Gallego E, Castaño M, Rueda A.Testicular amyloidosis in hamsters experimentallyinfected with Leishmania donovani. Br J Exp Pathol1983; 64:518-23.

240

ARTÍCULO ORIGINAL

Biomédica 2002;22:241-52

Preparación de genotecas de ADNc de Plasmodium falciparumpara la búsqueda de los genes de proteínas de unión a

calmodulina, GOGAT y Pfmyo ADary L. Mendoza 1,2, Moisés Wasserman 1,2

1 Laboratorio de Bioquímica, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Laboratorio de Investigaciones Básicas en Bioquímica, LIBBIQ, Departamento de Química, Facultad de

Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.

Se construyó una genoteca de ADNc representativa de los estadios asexuales de Plasmodiumfalciparum, en el vector λZipLox. Esta genoteca (de la cepa colombiana FCB2) y otra genotecaconstruida en λZAP II (de la cepa Dd2), se rastrearon en busca de genes de proteínas que seunen a calmodulina (CaM) o a proteínas relacionadas con CaM. Para el rastreo se usó tanto elensayo de Hot-start PCR como la hibridización de filtros réplica con sondas radiomarcadas. Seidentificaron clones de actina I, calmodulina (CaM), glutamato sintasa (GOGAT) y las tresmiosinas Pfmyo A, Pfmyo B y Pfmyo C. Se aislaron clones para actina I, CaM y GOGAT en lagenoteca construida en λZipLox y clones para GOGAT y Pfmyo A en la genoteca construida enλZAP II. Uno de los clones de GOGAT contiene un inserto de 2.413 pb que corresponde al24,8% de la secuencia codificante informada. El inserto de Pfmyo A aislado tiene 2.457 pb yrepresenta el mensajero completo del gen. La identidad de este inserto se confirmó medianteanálisis de restricción. Este es el primer informe de un clon de ADNc completo de la miosina Ade P. falciparum. Los clones aislados se utilizarán en estudios futuros, tales como la obtenciónde las proteínas recombinantes, producción de anticuerpos y ensayos de funcionalidad.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, malaria, proteína de unión a calmodulina, glutamatosintasa, miosina, ADNc.

Screening for calmodulin, GOGAT and Pfmyo A genes in Plasmodium falciparum cDNAlibraries

A cDNA library of Plasmodium falciparum (Colombian strain FCB2) asexual stage wasconstructed in the λZipLox vector. The λZipLox library and a λZAPII (Dd2 strain) were screenedfor genes coding for proteins that bind with or are related to calmodulin (CaM). Screening wasaccomplished with Hot start PCR assays and hybridization with radiolabeled probes. Actin I,CaM, glutamate synthase (GOGAT) and the three myosin clones -Pfmyo A, Pfmyo B and PfmyoC- were identified. The clones coding for actin I, CaM and GOGAT were retrieved from theλZipLox library, and the GOGAT and Pfmyo A clones from the λZAP II library. The GOGATclone contained an insert of 2,413 base pairs corresponding to 24.8% of the reported sequence.The Pfmyo A insert was 2,457 base pairs long, and represented the complete mRNA coding forthis gene. Finally, the first report of a complete cDNA clone containing the P. falciparum myosinA is presented.

Key words: Plasmodium falciparum, malaria, calmodulin binding protein, glutamate synthase,myosin, cDNA.

241

Plasmodium falciparum es un parásitoperteneciente al filo de los Apicomplexa y elcausante de la forma más severa de malariahumana. El parásito tiene un ciclo de vidacomplejo durante el cual es transmitido entre el

Correspondencia:Moisés Wasserman: [email protected]


Biomédica 2002;22:241-52MENDOZA D.L., WASSERMAN M.

mosquito vector y el hombre. A pesar de que loseventos morfológicos que ocurren en la invasiónestán bien caracterizados, se sabe poco sobrelos mecanismos moleculares que producen estoscambios y la naturaleza de los mensajerosquímicos que median la comunicación entre lascélulas huésped y el parásito.

El sistema calcio/calmodulina (CaM) cumple unpapel muy importante en la maduración y lainvasión del parásito al eritrocito (1); los estudiosrealizados en nuestro laboratorio indican que esnecesaria una entrada transitoria de calcio paraactivar los eventos moleculares que conducen ala invasión (2). Se cree que el influjo de calcio enel glóbulo rojo puede activar a la CaM o a lasPUCaM (proteínas de unión a calmodulina) y, enconsecuencia, activar procesos regulados por elcalcio relacionados con el crecimiento del parásito(3). Muchas PUCaM están involucradas en laregulación de actividades celularesfundamentales en el citoplasma y la membranaplasmática de las células. Algunas PuCaMdependientes de calcio están relacionadas consistemas de movilidad mediados por actina, comola alfa-espectrina, la cadena liviana de la miosinay la caldesmon; otras están involucradas en lafosforilación y desfosforilación de proteínas, comola proteína cinasa II dependiente de CaM y laproteína fosfatasa calcineurina dependiente deCaM (4). También se ha implicado la participaciónde estas proteínas en la regulación de laexpresión de genes de proteínas delcitoesqueleto (5), en la replicación, transcripcióny reparación del ADN y en la regulación del ciclocelular (6). Hay parásitos, como Trypanosomacruzi (7), para los que se han informadocomplejos perfiles de PUCaM que se expresandiferencialmente en sus estadios celulares.

Recientemente, se aislaron en P. falciparum porcromatografía de afinidad sobre columnas deCaM-agarosa, nueve proteínas del citoesqueletoque se unen a CaM (8). Una de estas proteínas,que tiene un peso molecular de 36,5 kDa, se pudosecuenciar parcialmente y mediante PCR conoligonucleótidos degenerados, diseñados conbase en secuencias peptídicas internas de laproteína; se obtuvo un fragmento de 454 pb quepresentó una alta homología con la secuencia

nucleotídica para la glutamato sintasa (GOGAT)de origen vegetal. En algunos microorganismosy en la mayoría de las plantas superiores, laasimilación de amonio en nitrógeno orgánico esel resultado de la actividad de dos enzimas, laglutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa(GOGAT). La GS cataliza la incorporación deamonio en la posición amida del glutamato paraproducir glutamina. Por su parte, la GOGATcataliza la transferencia reductiva del grupo amidode la glutamina a la posición α-ceto del 2-oxoglutarato, produciéndose dos moléculas deglutamato (9). El resultado de la reaccióncatalizada por estas dos enzimas es similar alproducido por la glutamato deshidrogenasa,excepto por el gasto de una molécula extra deATP por cada glutamato que se produce.

En algunas especies de Plasmodium se haidentificado la actividad de la glutamatodeshidrogenasa (10,11) y, recientemente, se haplanteado la hipótesis de que la GOGAT participaen la interconversión de L-glutamina a glutamato(12). Hasta ahora, únicamente se conoce lasecuencia informada del ARNm de GOGAT deP. falciparum; de aquí la importancia de tener unclon que sirva como herramienta para estudiosfuturos de funcionalidad de la proteína.

Otras de las PUCaM de interés en P. falciparumson las miosinas. Éstas constituyen una diversasuperfamilia de mecanoenzimas que en actividadconjunta con la actina están involucradas enmuchos movimientos celulares esenciales. C.Forero (13) y Pinder y col. (14) con el métododescrito por Bement y col. (15) lograronevidenciar la existencia del gen de la miosina Ade P. falciparum (Pfmyo-A). Ésta es una proteínade ~90 kDa, correspondiente a las miosinas declase XIV; se expresa esencialmente en losestadios maduros del desarrollo asexual y se creeque podría estar participando como motormolecular en el proceso de invasión al eritrocito,puesto que se expresa en el sitio y momentopropicio de la invasión (16). Con base en elproyecto de secuenciación del genoma de P.falciparum se identificaron recientemente tresmiosinas más, llamadas Pfmyo-B (17), Pfmyo-Cy Pfmyo D (18).

El propósito del presente trabajo fue obtener unagenoteca de ADNc representativa de los estadios

242

Biomédica 2002;22:241-52

de vida asexual del parásito P. falciparum y aislaren ella clones de los genes de las PUCaM,GOGAT y Pfmyo A, para la caracterización futurade las proteínas.

Materiales y métodos

Cultivo del parásito

Se hicieron cultivos continuos con la cepa FCB2de P. falciparum (aislada en Colombia) según elmétodo de Trager y Jensen (19). La cepa de P.falciparum se cultivó en medio RPMI (Sigma),suplementado con suero humano al 10% (v/v) yeritrocitos tipo O (+) al 5%. Se recogieronparásitos asincrónicos enriquecidos en formasmaduras y con parasitemias que fluctuaron entre4 y 5%.

Aislamiento del ARN total yseparación del ARNm

Los parásitos se liberaron del eritrocito mediantelisis con saponina al 0,15% w/v en HBS (Hepes20 mM, NaCl 60mM), pH 7,4, y se recolectaronpor centrifugación a 15.000 g por 20 min a 4 °C(Himac centrifuge Hitachi rotor RPR 20-2). Elprecipitado de parásitos se lavó tres veces conHBS (15.000 g durante 5 min a 4 °C).

La extracción del ARN total se hizo siguiendo unprotocolo previamente estandarizado en nuestrolaboratorio (20), que se fundamenta en laextracción del ARN con isotiocianato de guanidinay posterior separación del ADN y las proteínas através de un gradiente isopícnico de cloruro decesio. Se partió de 2 x 109 parásitos, los cualesse lisaron con una mezcla de isotiocianato deguanidina 4M, citrato de sodio 25 mM (pH, 7,0),sarkosyl al 0,5% y beta-mercaptoetanol a 0,1 M.El precipitado se resuspendió y homogeneizó conuna aguja 20G. La separación de las proteínasse hizo por extracción con un volumen de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) ycentrifugación a 8.000 g durante 5 min a 4 °C. Lasolución acuosa se agregó lentamente sobre uncolchón de CsCl 5,7 M, EDTA 10 mM. El ARNtotal se separó por centrifugación a 120.000 g enun rotor swing (PSGST Hitachi) durante 20 horasa 20 °C. El ARN, que aparece en el fondo deltubo de centrífuga como un precipitadotransparente, se resuspendió suavemente en200 µl de Tris-HCI 10 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM,

SDS al 0,1 %. Finalmente, se precipitó yresuspendió en agua libre de RNasa.

Para la separación del ARNm se empleó elmétodo de captura en solución, polyAtractR

RNAm Isolation Systems (Promega). La región3'poliA+ de los ARNm se hibridó con un iniciadoroligo (dT) biotinilado. Los híbridos se capturaronusando estraptavidina acoplada a partículasmagnéticas. El sobrenadante se descartó ymediante lavados con tampón de alta astringencia(SSC 0,5 X y SSC 0,1 X) se eliminó el ARN nomensajero. El ARNm se eluyó con 250 µl deagua libre de RNasa y se precipitó con 0,1volúmenes de acetato de sodio 3M y 0,1volúmenes de isopropanol a -20 °C toda la noche.Luego se centrifugó a 12.000 g durante 10minutos; el precipitado se lavó con 1 ml de etanolal 75% y se secó al vacío. Una forma rápida deevaluar la integridad del ARNm fue haciendo RT-PCR con secuencias conocidas de P. falciparum,como es el caso del gen que codifica para laenzima aldolasa y se obtuvo un resultado positivo(resultados no mostrados).

Síntesis del ADNc

La síntesis de ADNc se realizó utilizando elsistema de síntesis de ADNc de SuperScripta(Gibco-BRL). Se usaron 3 mg de ARNm quefueron transcritos reversamente usando 1,5 µgdel primer-adaptador Not 1, de acuerdo con elmétodo descrito por Gubler y Hoffman (21). Lasíntesis de la primera y la segunda cadena fuecuantificada por la incorporación de [α32P]dCTP(1 µCi/µl; Amersham-Pharmacia Biotech). ElADNc se trató con la T4 ADN polimerasa paradespués ligar a sus extremos adaptadores SalI.Después de la extracción fenol-cloroformo-alcohol isoamílico, el ADNc se digirió con 100unidades de NotI y se purificó por cromatografíade filtración en gel, usando una matriz deSepharose CL-4B. Se eluyó recolectando 16fracciones, las cuales se leyeron en forma directaen un contador de centelleo (Wallac 1409). Secalculó la cantidad de ADNc en las fraccionesque dieron valores por encima de 2 x 104 cpm.

Clonación de ADNc

Se empleó el vector de expresión procarióticoλZipLoxTM (Gibco-BRL). Este vector permite

243


acomodar insertos de hasta 7 kb de tamañodentro de brazos de λ, los cuales poseenextremos NotI y SalI, respectivamente. λ ZipLoxposee un sistema de recombinación sitio-específico que permite recuperar los insertosclonados dentro del plásmido pZL 1 mediante unprotocolo de excisión in vivo. Las genotecasconstruidas en el vector λ ZipLox se puedenrastrear usando sondas fabricadas a partir deoligonucleótidos o con anticuerpos. Los ADNcclonados dentro del sitio del polylinker del vectorresiden dentro del gen lac Z'. Cuando el promotorlac es inducido con IPTG, el gen se expresa comouna proteína de fusión con la porción amino-terminal del fragmento de la β-galactosidasacodificada por lacZ'.

Para la construcción de la genoteca se usaron60-72 ng de ADNc, que se ligaron a los brazosNotI-SalI del vector λZipLox (200 ng), para luegoser empacados en las cabezas y colas del fago(Gigapack III Gold Packaging; Stratagene). Elfago se usó en la infección de la cepa huéspedde Escherichia coli Y1090 (ZL) de Promega.

Además de la genoteca de ADNc de la cepaFCB2 de P. falciparum, se trabajó con otragenoteca de ADNc, representativa de los estadiosde vida asexual, de la cepa Dd2 del parásito(adquirida en el Malaria Research & ReferenceReagent Resource Center, MR4) y construida enel vector λZAPII mediante metodologíapreviamente estandarizada (23), y cuyo título fuede 2 x 105 ufp/ml.

Manejo de la genoteca

La representatividad de la genoteca se calculómediante la formula de Clark y Carbon (22),según la cual el número mínimo de clones totalesrequeridos para construir una genotecarepresentativa del parásito P. falciparum es de16.942. Adicionalmente, esta representatividadse confirmó mediante la búsqueda por PCR declones para genes de copia única, como actina Iy CaM, utilizando oligonucleótidos específicos(cuadro 1). También se buscaron clones de lasPuCaM: GOGAT, Pfmyo A, Pfmyo B y Pfmyo C.Para la búsqueda de un clon de GOGAT, se utilizócomo herramienta una pareja de oligonucleótidosespecíficos diseñados a partir de la secuenciadel gen informada en el GENBANK (número de

acceso, Y17045.1), los cuales amplifican unfragmento de 811 pb que contiene la secuenciaque codifica para la proteína de 36,5 kDa aisladaen nuestro laboratorio. Para la búsqueda declones de las miosinas Pfmyo A, Pfmyo B y PfmyoC se diseñaron oligonucleótidos específicos paracada gen con base en las secuencias informadasen el GENBANK.

La reacción de amplificación se llevó a cabousando 1 µl de cada genoteca y los siguientesreactivos: oligonucleótidos iniciadores (1 µM decada uno), dNTPs (200 µM de cada uno), MgCl22 mM y el tampón de la reacción (Tris-HCl 10mM a pH 9,0, KCl 50 mM, Triton X-100 al 0,1% v/v). Las condiciones de la reacción de PCR fueronlas siguientes: 1 ciclo de 95 °C durante 10 minutosy 72 °C durante 5 minutos con adición de 2,5unidades de Taq ADN polimerasa, seguido de40 ciclos como sigue: temperatura dedenaturación a 94 °C durante 2 minutos,temperatura de anillamiento del oligonucleótidoa 53 °C durante 1 minuto y temperatura deextensión a 72 °C durante 2 minutos. Losproductos de PCR se separaron por electroforesishorizontal y se visualizaron mediante tinción conbromuro de etidio (0,5 µg/ml). La electroforesisse hizo en geles de agarosa al 1% en TBE (Trisbase 890 mM; ácido bórico, 890 mM; EDTA 20mM a pH 8,0). La corrida se hizo a un voltaje de5 V/cm y el gen se sometió a tinción con bromurode etidio de 10 a 20 minutos y se observó con luzUV.

Rastreo y aislamiento de los clones de PuCaM

El rastreo de los clones de GOGAT y de PfmyoA se hizo mediante el ensayo de hibridación defiltros réplicas con sondas de oligonucleótidosmarcadas radiactivamente con 32P y conactividades específicas de en un rango de entre2 y 7 x 109 cpm/µg de ADN. Los filtros réplica sehicieron a partir de cajas sembradas con 2 x 104

ufp. Una vez hecha la búsqueda inicial, seseleccionaron las señales de los posibles clonesrecombinantes para cada gen y se confirmaronpor PCR. Se hicieron tres rondas sucesivas deselección con el fin de obtener clones puros.

Se preparó un lisado de fagos a partir de un cultivolíquido de bacterias E. coli competentes,infectadas con los fagos que tienen el clon puro.

244

GENOTECADS DE ADNc DE P. FALCIPARUMBiomédica 2002;22:241-52

Cuadro 1. Secuencias de los oligonucleótidos diseñados para cada gen y tamaños de los fragmentos amplificadossobre ADN genómico de P. falciparum.

Gen (código Secuencia del oligo Secuencia del oligo Longitud delGENBANK) sentido antisentido

fragmento (pb)

Actina I ACAGGAGTTGCAGGAGATGAT GTAGTTGTGTGGATTCCTGC 800(Af177282)

CaM GGGTATCATCATTTTAACAAAC GTAGTTGTGTGGATTCCTGC 190(M99442)

GOGAT AGAAGGAGGAGAAGCAGAAG GTAGTTGTGTGGATTCCTGC 811(Y17045)

Pfmyo A TCCTCCTTCTGGTTCAATTCTTG GTATTCAATTAGAGGTCCTTCC 725(AF105117)

Pfmyo B GGGTGGTAAATCTAATTGTAGTG CTGATTCAATTAGAGAGGTCCTTCC 440(Af22716)

Pfmyo C GGTAATAATACGCATGATGATCC GAGTAACAACTTATTCGACATGC 453(Af222717)

El ADN del fago se obtuvo a partir de este lisadoutilizando el estuche Wizard Lambda Prepsä(Promega).

Cálculo del tamaño de los insertos clonadosde GOGAT y Pfmyo A

El tamaño de los insertos clonados se calculómediante PCR con oligonucleótidos de lospromotores T7 (Promega) y pUC-M13 (Promega),que flanquean el lugar de inserción, en el casode clones de la genoteca de la cepa FCB2, y conlos oligonucleótidos de los promotores T7 y T3para los clones de la genoteca de la cepa Dd2.También se hizo digestión del ADN de los fagosrecombinantes con endonucleasas de restricciónque flanquean los insertos clonados.

Southern blotting

Se hizo confirmación de los insertos medianteSouthern blotting con sondas marcadas por PCRcon 14-biotín dCTP. Los geles de agarosa setransfirieron a membranas de nylon (Hybondä N;Amersham) mediante protocolo previamenteestandarizado. Las membranas se prehibridarondurante 2 horas a 42 °C con una solución quecontiene: formamida al 50% v/v, SSC 5X , fosfatode sodio 20 mM (pH 6,5), solución Denhardt al5% (Ficoll 400 al 0,2% p/v, polivinilpirrolidona al0,2% p/v, albumina sérica bovina al 0,2% p/v) y

ADN de esperma de salmón denaturado a unaconcentración final de 0,5 mg/ml. Luego, lasmembranas se hibridaron toda la noche a 42 °Ccon la misma solución a la que se le agregó 0,1 a0,5 µg de la sonda biotinilada denaturada. Parala detección de las señales, se siguió el siguienteprotocolo: la membrana se lavó con solucionesde baja astringencia (SSC 2X, SDS al 0,1%) atemperatura ambiente para remover el exceso dela sonda y con una solución de alta astringencia(SSC 0,2 X, SDS 0,1%) a 50 °C para eliminar lasinespecificidades. La membrana se bloqueó conuna solución de BSA al 3% en TBS p/v a 68 °Cdurante 1 hora. Luego se hizo la unión al conjugadoestreptavidina-fosfatasa alcalina (1 µg/ml) en TBSdurante 15 minutos, seguido de lavados con TBS-Tween 20 al 0,1% v/v. Las señales se visualizaroncon NBT (nitroblue tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indol-fosfato).

Secuencia parcial del inserto de GOGAT

Con el fin de confirmar la identidad del clon sehizo secuenciación del inserto. La secuencia serealizó en el Laboratorio de Fisiología Moleculardel Instituto Nacional de Salud, utilizando elestuche Big Dye Terminator y el secuenciadorABI PRISM 310 (Applied Biosystems), quedetecta moléculas marcadas con fluorocromos.La reacción química se basa en el método deldideoxi desarrollado por Sanger y col. (24). La

245


secuencia del inserto se comparó con lainformada para el ARNm de GOGAT de P.falciparum (GENBANK Y17045), a través delprograma BLAST (Basic Local Alignment SearchTool).

Resultados

Construcción de la genoteca de ADNc

Con el objetivo de obtener clones de ADNc delas proteínas GOGAT y Pfmyo A se construyóuna genoteca de ADNc en el vector de expresiónprocariotico λZipLox a partir de ARNm aisladode parásitos asincrónicos de la cepa colombianade P. falciparum, FCB2. Este ARNm se usó parala síntesis de ADNc. En cuanto a los rendimientosobtenidos durante la síntesis del ADNc, al finalse obtuvo 229 ng de ADNc, lo que permitió hacerdos clonaciones, una de las cuales dio origen auna genoteca cuyo título superó dos veces elvalor mínimo de clones recombinantes requeridopara una genoteca representativa del parásito,por lo que se utilizó para la búsqueda yaislamiento de los genes de interés.

Identificación de clones de PuCaM

Mediante PCR, en total se pudo identificar lapresencia de tres clones en la genoteca de la

Figura 1. Resultados obtenidos del PCR realizado para identificar la presencia de clones de GOGAT en las genotecas deADNc. Un volumen de 1 µl de cada genoteca se sometió a una reacción de PCR usando oligonucleótidos específicos queamplifican para un producto de 811 pb de GOGAT. A. Búsqueda del clon en la genoteca de la cepa FCB2. B. Búsqueda enla genoteca de la cepa Dd2.M: marcador de peso molecular Ladder de 1 kb; 1) amplificado sobre la genoteca completa de ADNc; 2) control positivosobre ADN genómico de FCB2; 3) control negativo del PCR sin ADN.

cepa FCB2 de P. falciparum y seis clones en lagenoteca de la cepa Dd2 del parásito. Seidentificaron clones para los genes de actina I,calmodulina (resultados no mostrados) y GOGATen ambas genotecas de ADNc (figura 1).Además, se identificaron clones para las miosinasPfmyo A, Pfmyo B y Pfmyo C en la genoteca deADNc de la cepa Dd2 (figura 2). Los clones paralos genes de actina I, CaM, GOGAT y Pfmyo Ase aislaron mediante hibridación de filtros réplica,obtenidos de las cajas de cultivo con sondasradiactivas marcadas con [α-32P] dCTP.

Cálculo del tamaño del inserto de GOGAT

La reacción de PCR con los oligonucleótidos delos promotores T7 y pUC M13 sobre el ADN delfago recombinante λZipLox-GOGAT dio unproducto de 1.540 bp de los cuales 175corresponden al vector. Esto indica que el clonaislado de la genoteca de la cepa FCB2 contieneinsertos de 1.365 pb, aproximadamente. Seaislaron, además, clones de GOGAT en unagenoteca de ADNc representativa de los estadiosasexuales de la cepa Dd2 del parásito. El tamañodel inserto presente en este clon se estimó porPCR con los oligonucleótidos de los promotoresT7 y T3; el resultado fue un producto de 2.550

246

Biomédica 2002;22:241-52 GENOTECADS DE ADNc DE P. FALCIPARUM

pb, de las cuales 135 pb corresponden al vector.La identidad de este inserto se confirmó porSouthern blotting con una sonda biotinilada de811 pb, cuya identidad había sido previamentecomprobada por secuenciación (figura 3).

Secuenciación parcial del inserto de GOGAT

Se lograron secuenciar 144 pb del extremo 5' y101 pb del extremo 3' de la secuencia parcial delclon de GOGAT aislado de la genoteca de lacepa Dd2 del parásito. Este resultado permitióconfirmar la identidad del clon, definir el tamañodel inserto y su posición con respecto a lasecuencia codificante completa del gen reportadaen el GENBANK y que tiene un tamaño de 9.720pb. El inserto clonado tiene un tamaño de 2.413pb, que es el 24,8% de la secuencia informada yse encuentra entre las posiciones 2.384 y 4.797de ésta. El alineamiento entre las secuencias delos extremos 5' y 3' del inserto con la secuenciainformada en el GENBANK mostró una identidaddel 98 y del 81%, respectivamente (figura 4). Hayque tener en cuenta que durante la secuenciaciónse generan errores en la lectura de algunasbases, lo que se traduce en disminución en losporcentajes de identidad de los alineamientosentre secuencias (acá, por ser sólo una

confirmación, se secuenció una vez y para cadaextremo una sola cadena). Finalmente, ladigestión del ADN del fago recombinante λZAPII-GOGAT con las enzimas de restricción EcoRI yXhoI mostró un patrón de bandas que concuerdacon el análisis de restricción teórico realizadosobre la secuencia codificante del gen con estasenzimas (figura 5).

Cálculo del tamaño del inserto de Pfmyo A

Se hizo PCR con los oligonucleótidos externosde los promotores T7 y T3 para calcular eltamaño del inserto de Pfmyo A clonado. No seobtuvo ningún producto con éstos, pero se logróamplificación con T3 y un oligonucleótido internosentido de Pfmyo A, al igual que con T7 y unoligonucleótido interno antisentido de Pfmyo A.Este experimento permitió calcular el tamaño delinserto en aproximadamente 2.500 pb. Laidentidad de estos productos se confirmó porSouthern blotting con una sonda biotinilada de725 pb, cuya identidad había sido previamentecomprobada por secuenciación (figura 6).

Se hizo, además, digestión del ADN del fagorecombinante de Pfmyo A con las endonucleasasde restricción EcoRI-XhoRI y con NotI- XhoI. Ladigestión con EcoRI-XhoI produjo tres fragmentos

Figura 2. Resultados obtenidos del PCR realizado para identificar la presencia de clones de miosinas Pfmyo A, Pfmyo By Pfmyo C en las genotecas de ADNc. Para la búsqueda de clones de Pfmyo A se utilizaron oligonucleótidos específicosque amplifican un producto de 725 pb; los oligonucleótidos para Pfmyo B amplifican un producto de 440 pb y los de PfmyoC, un producto de 453 pb.M: marcador de peso molecular Ladder de 1 kb; 1) amplificado sobre la genoteca de ADNc de la cepa FCB2; 2) sobre lagenoteca de ADNc de la cepa Dd2; 3) control positivo sobre ADN genómico de FCB2; 4) control negativo del PCR.

247

MENDOZA D.L., WASSERMAN M. Biomédica 2002;22:241-52

cuyos tamaños son: 1.647, 789 y 437 pb. Por suparte, la digestión con NotI-XhoI produjo un sólofragmento de 2.457 pb (figura 7). Estos resultadosconcuerdan con el análisis de restricción teóricoque se hizo con estas enzimas sobre la secuenciacodificante del gen completo de Pfmyo Ainformada en el GENBANK (AF105117).

Discusión

La construcción de las genotecas de ADNc deP. falciparum es una herramienta excelente paraaislar genes que se expresan en estadiosespecíficos de desarrollo del parásito P.falciparum. En este trabajo se construyó unagenoteca de ADNc en el vector de expresiónprocariótico λZipLox, que produce clonesdireccionados, lo que permite tener un rápidoacceso a transcritos abundantes, a la vez quehace posible la subclonación en sistemas deexpresión. Las genotecas construidas envectores derivados del fago λ presentan la ventajade tener una alta eficiencia de empaquetamientoin vitro y produce alta densidad de fagos, factores

importantes para la selección de transcritos pocoabundantes.

En la genoteca se aislaron clones de genes decopia única como actina y CaM. Se aisló tambiénun clon para el gen de la enzima GOGAT. Laactina y la CaM son proteínas que cumplenpapeles fundamentales en los eventos de fuerzaque ocurren durante el ciclo de vida del parásito.Los genes completos de estas proteínas ya sehan informado y es de especial importancia tenerlos clones de ADNc que pueden usarse para suexpresión. Por su parte, GOGAT es una enzimaque ha despertado un gran interés ya que podríaser un excelente blanco terapéutico para lamalaria. Esta enzima no se encuentra en elhumano; su actividad se ha informado enmicroorganismos como E. coli y Azospirilumbrasilense, en levaduras como Sacharomycescerevisiae y en plantas superiores. En P.falciparum, la L-glutamina es un sustratoindispensable para el crecimiento in vitro delparásito. En trabajos previos realizados en el

Figura 3. PCR para calcular el tamaño del inserto de GOGAT del clon aislado de la genoteca de la cepa Dd2. Se utilizócomo plantilla ADN del fago recombinante. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis horizontal engeles de agarosa al 1% (A) y se transfirieron a una membrana de nylon, la cual se hibridizó con una sonda biotiniladaespecífica para GOGAT (B).M: Ladder 1 kb; 1) ADN λZapII-GOGAT; 2 y 3) producto de amplificación con los oligonucleótidos de los promotores T3 yT7; 4) producto de amplificación con oligonucleótidos internos de GOGAT.

248


Laboratorio de Bioquímica del INS, se aisló unaproteína de 36 kDa (que, por trabajos queconocemos ahora, debía ser un producto dedegradación), cuya secuencia presentó una altahomología con la enzima GOGAT de origenvegetal. Recientemente, se informó en elGENBANK la secuencia codificante del gen deGOGAT de P. falciparum, que posee un tamañode 9.720 pb. A pesar de ello, no se sabe nadaacerca del gen ni de la proteína; tampoco se hadefinido si la enzima está activa en el parásito.Por lo anterior, es de gran importancia laobtención de clones de ADNc de GOGAT, queservirían como herramienta para lacaracterización molecular del gen y para losestudios de funcionalidad de la proteína.

En este trabajo se rastreó otra genoteca de ADNcrepresentativa de los estadios asexuales de lacepa Dd2 de P. falciparum. En ella se identificóla presencia de los clones de actina I, CaM,GOGAT, las miosinas Pfmyo A, Pfmyo B y PfmyoC y se aislaron clones de GOGAT y de Pfmyo A.

Los insertos de GOGAT y Pfmyo A clonados seaislaron haciendo una reacción de PCR conoligonucleótidos universales que tienen sitios deanillaje en regiones del vector que flanquean lossitios de clonación, como se describió en lametodología. El clon de GOGAT aislado de lagenoteca de la cepa FCB2 tiene un inserto de1.365 pb. El clon de GOGAT aislado de lagenoteca de la cepa Dd2 tiene un inserto de 2.413pb; su identidad se confirmó por secuenciación ycomprende las posiciones 2.384 y 4.797 de lasecuencia codificante del gen. A pesar de quelos clones de GOGAT encontrados en ambasgenotecas parecen no tener la secuenciacodificante completa (9.720 pb), este resultadoes muy interesante, ya que se logró obtener unfragmento muy grande del gen que estáexpresándose durante el estadio de vida sexualdel parásito. Un ARNm de 9.720 pb, como el deGOGAT, es difícil de aislar en genotecas deADNc y el clon obtenido de la genoteca de la cepaDd2 es el fragmento aislado más grande. Los

Figura 4. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de los extremos 5' y 3' del inserto de GOGAT clonado en lagenoteca de la cepa Dd2 y de la secuencia codificante de NADH-GOGAT de P. falciparum (número de acceso al GENBANKY17045.1). Las bases subrayadas y señaladas en negrilla indican diferencias entre las secuencias. Los huecos (gaps)presentes en las secuencias se indican con un guión.

249


resultados obtenidos en trabajos realizados ennuestro laboratorio mediante experimentos deinmunotransferencia con un anticuerpo policlonaldesarrollado contra GOGAT han permitido ladetección de polipéptidos con tamaños de 70 y160 kDa, las cuales muy probablementecorrespondan a productos de degradación de laproteína GOGAT. Los clones de GOGAT aisladosen este estudio constituyen una valiosaherramienta para la caracterización de la proteína,ya que la expresión de estos fragmentos de ADNcserviría en la producción de anticuerpospoliclonales o monoclonales, que podríanemplearse para determinar la actividad de laproteína en el parásito.

Otro clon que se aisló en la genoteca de ADNcde la cepa Dd2 del parásito fue el de la miosinaPfmyo A. Ésta es otra proteína que se hapropuesto como componente de un motoractomiosina que estaría generando la fuerzarequerida para la invasión del parásito al eritrocito.

El tamaño del inserto de Pfmyo A clonado seestimó en aproximadamente 2.500 pb, queconcuerda con el calculado para la secuenciacodificante completa, que es de 2.457 pb. Losexperimentos con enzimas de restricciónpermitieron confirmar este tamaño.

El hallazgo de un clon de ADNc completo dePfmyo A constituye un paso importante parafuturos estudios en el parásito. Este es el primerinforme de un clon de ADNc completo de PfmyoA. La secuencia del gen informada en elGENBANK (AF105117) se logró a partir de unproducto de amplificación por PCR con unoligonucleótido antisentido correspondiente a lacola y un oligonucleótido sentido correspondientea un motivo conservado en el dominio de cabezade las miosinas. La búsqueda de la secuenciade este producto en la base de datos del proyectodel genoma de P. falciparum permitió completarla secuencia del ARNm. Pfmyo A muestra un altogrado de homología con las miosinas de claseXIV de Toxoplasma gondii previamenteidentificadas (25,26). La proteína tiene una masamolecular de 90 kDa, lo que la hace uno de losmotores moleculares más pequeños que se hanidentificado hasta ahora. Las miosinas clase XIVno poseen los motivos IQ que han sido implicadosen la unión a proteínas reguladoras como lacalmodulina y las proteínas relacionadas con lacalmodulina; sin embargo, poseen aminoácidosconservados que podrían representar una formadiversa de motivos IQ (18). Este clon de ADNcde Pfmyo A constituye una valiosa herramientapara realizar estudios de localización, determinarparticularidades de la proteína que la diferenciande las miosinas del hospedero y para llevar acabo estudios fisiológicos y funcionales quepermitan definir su papel durante la invasión.

En este trabajo también se identificó la presenciade clones para los genes de Pfmyo B y Pfmyo Cen la genoteca de ADNc de los estadios de vidaasexual de la cepa Dd2 del parásito. Es de granimportancia que otras miosinas en el parásitotambién se estén expresando durante el estadioasexual. El aislamiento de clones con genes deestas miosinas permitiría definir las actividadesde fuerza que pueden estar progresando a lolargo del desarrollo asexual del parásito; por

Figura 5. Digestión con enzimas de restricción del ADN delfago recombinante λZapII-GOGAT. Se hizo corte con lasenzimas de restricción EcoRI y XhoI al vector con el inserto.El análisis de restricción teórico que se realizó sobre lasecuencia codificante de GOGAT indica que deben liberarsedos fragmentos, uno de 2.081 pb y otro de 332 pb (que selocaliza en el mismo lugar del ARN del fago). Los resultadosse analizaron mediante electroforesis en agarosa al 1,5%en TBE 1X.M: Ladder de 1 Kb. 1) ADN λZapII-GOGAT sin digerir; 2)ADN λZapII-GOGAT digerido con las dos enzimas.

250


Figura 6. PCR para calcular el tamaño del inserto de Pfmyo A del clon aislado de la genoteca de la cepa Dd2. Se utilizócomo plantilla ADN del fago recombinante. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis horizontal engeles de agarosa al 1% (A) y se transfirieron a una membrana de nylon, la cual se hibridizó con una sonda biotiniladaespecífica para Pfmyo A (B).M: Ladder 1 kb; 1) amplificación con los oligonucleótidos de los promotores T3 y T7; 2) producto de amplificación con T3-PfmyoA(s); 3) producto de amplificación con T7-PfmyoA (as); 4) producto de amplificación con oligonucleótidos internosPfmyoA(s)-Pfmyo A(as); 5) control negativo del PCR sin ADN.

Figura 7. Digestión con enzimas de restricción NotI/EcoRI y XhoI del ADN del fago recombinante λZapII-Pfmyo A. Elresultado se analizó mediante electroforesis en agarosa al 1,5%.M: Lambda HindIII; ADN λZapII-Pfmyo A sin digerir; 2. ADN λZapII-Pfmyo A digerido con las dos enzimas. Primer panel,digestión con NotI y XhoI, produjo una banda de 2.457 pb que corresponde al inserto completo de Pfmyo A. Segundopanel, digestión con EcoRI y XhoI, produjo tres fragmentos con los tamaños: 1.647, 789 y 437 pb.

251


tanto, se continuará trabajando en el aislamientoy confirmación de estos clones como parte deotro trabajo de investigación del Laboratorio deBioquímica del INS.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el InstitutoNacional de Salud, la Universidad Nacional deColombia y el Instituto Colombiano para elDesarrollo de la Ciencia y la Tecnología"Francisco José de Caldas" COLCIENCIAS,proyecto BID-Colciencias 2104-04170-95.

Referencias

1. Wasserman M, Alarcón C, Mendoza PM. Effects ofCa2+ on the asexual cell cycle of Plasmodiumfalciparum. Am J Trop Med Hyg 1982;31:711-7.

2. Wasserman M, Vernot SP, Mendoza P. Role of calciumand erythrocyte cytoskeleton phosphorylation in theinvasion of Plasmodium falciparum. Parasitol Res1990;76:681-8.

3. Tinjacá C, Wasserman M. Caracterización parcial dela CaM de Plasmodium falciparum. Biomédica 1995;15:206-14.

4. Cohen P, Klee CB, editors. Calmodulin: molecularaspects of cellular regulation. Volumen 5. Amsterdam:Elsevier Press; 1988.

5. Rasmussen CD, Means AR. Increased calmodulinaffects cell morfology and messenger RNA levels ofcytoskeletal protein genes. Cell Motility andCytoskeleton 1992;21:45-57.

6. Bachs O, Agell N, Carafoli E. Calmodulin andcalmodulin binding-proteins in the nucleus. Cell Calcium1994;16:289-96.

7. Orr GA, Tanowitz HB, Wittner M. Trypanosoma cruzistage expression of clamodulin-binding proteins. ExpParasitol 1992;74:127-33.

8. Vera V. Aislamiento y caracterización de PUCaM enPlasmodium falciparum (tesis). Santa Fé de Bogotá:Universidad Nacional de Colombia; 1999.

9. Beny AG, Boland MJ. Enzymes of nitrogen metabolismin legume nodules. Purification and properties of NADHdependent glutamate synthase from lupine nodules. EurJ Biochem 1977;79:355-62.

10. Sherman LW, Peterson E, Tanigoshi L, Ting IP. Theglutamate dehydrogenase of Plasmodium falciparumlophurae (avian malaria). Exp Parasitol 1971;29:433-9.

11. Roth EF, Raventos-Suarez C, Perkins M, Nagel RN.Gluthathione stability and oxidative stress in P.falciparum infection in vitro: responses of normal andG6PD deficient cell. Biochem Biophys Res Commun1982;109:335-61.

12. Elford BC, Pinches RA. Inducible transport systems inthe regulation of parasite growth in malaria infected.Biochem Soc Trans 1992;20:790-6.

13. Forero de Lleras C. Proteínas de unión a actina enPlasmodium falciparum (tesis). Santa Fe de Bogotá:Universidad Nacional de Colombia; 1996.

14. Pinder JC, Fowler RE, Dluzewski AR, Bannister LH,Lavin FM, Mitchell GH, Wilson RJ, Gratzer WB.Actomyosin motor in the merozoite of the malariaparasite Plasmodium falciparum: implications for red cellinvasion. J Cell Sci 1998;111:1831-9.

15. Bement WM, Hasson T, Wirth JA, Cheney RE,Mooseker MS. Identification and overlapping expressionof multiples unconventional myosin genes in vertebratecell types. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:6549-53.

16. Pinder JC, Fowler RE, Bannister LH, Dluzewski AR,Mitchell GH. Motile systems in malaria merozoites: Howis the red blood cell invaded? Parasitol Today 2000;16:240-5.

17. Dame JB, Ranot DE, Bourke PFl. Current status ofthe Plasmodium falciparum genome project. MolBiochem Parasitol 1996;79:1-12.

18. Hettman C, Herm A, Geiter A, Frank B, Shwarz E,Soldati T, Soldati D. A dibasic motif in the tail of a classXIV apicomplexan myosin is an essencial determinantof plasma membrane localization. Mol Biol Cell 2000;11:1385-400.

19. Trager W, Jensen JE. Human malaria parasites incontinuous culture. Science 1976;193:673-5.

20. Rojas MO, Wasserman MM. Stage-specific expressionof the calmodulin gene in Plasmodium falciparum. JBiochem 1995;118:1118-23.

21. Gubler U, Hoffman BJ. A simple and very efficientmethod for generating cDNA libraries. Gene 1983;25:263.

22. Clark L, Carbon J. A colony bank containing syntheticColE1 hybrids representative of the entire E. coligenome. Cell 1976;9:91-9.

23. Chakrabarti D, Reddy GR, Dame JB, Almira EC,Laipis PJ, Ferl RJ, Yang TP, Rowe TC, Schuster SM.Analysis of expressed sequence tags from Plasmodiumfalciparum. Mol Biochem Parasitol 1994; 66:97-104.

24. Sanger F, Nicklen S, Couson AR. DNA sequencingwith chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA1977;74:5463-7.

25. Heintzelman MB, Schwartzman JD. A novel class ofunconventional myosins from Toxoplasma gondii. J MolBiol 1997;271:139-46.

26. Heintzelman MB, Schwartzman JD. Character-izationof myosin A and myosin C: two class XIV unconventionalmyosins from Toxoplasma gondii. Cell Motility andCytoskeleton 1999;44:58-67.

252

ARTICULO ORIGINAL

CorreLabotelefa

Recib

Biomédica 2002;22:253-62

Enquistación in vitro de Giardia lamblia :análisis por electroforesis bidimensional de proteínas

expresadas diferencialmentePaula C. Hernández 1, María Leonor Caldas 3, Moisés Wasserman 1,2

1 Laboratorio de Investigaciones Básicas en Bioquímica, LIBBIQ, Departamento de Química, Facultad deCiencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D.C., Colombia.

2 Laboratorio de Bioquímica, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.3 Unidad de Microscopía y Análisis de Imágenes, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.

La reconstrucción in vitro del ciclo de vida de Giardia lamblia es un excelente instrumento parael estudio de la biología molecular del parásito. El presente trabajo pretende contribuir aldesarrollo de algunas técnicas por las cuales se puede definir mejor un modelo de diferenciacióncelular del parásito. El estudio presenta un protocolo de enquistación in vitro y establece unmétodo para el aislamiento y la purificación de los quistes producidos, cuyas característicasmorfológicas, por microscopía de luz, coinciden con las de los quistes obtenidos in vivo. Seestudió el mapa de las proteínas de G. lamblia por medio de electroforesis bidimensional dealta resolución y de electroforesis en una dimensión. Estos estudios mostraron que la mayoríade las proteínas del parásito son de carácter ácido. Se amplió, con base en ese resultado, laresolución de la región ácida por medio de un isoelectroenfoque de pH 4-7 en la primeradimensión. Se encontraron diferencias en la expresión de las proteínas durante el proceso deenquistación. Se obtuvieron, además, imágenes por microscopía de luz y electrónica detransmisión que permitieron observar morfológica y ultraestructuralmente las células producidasdurante el proceso de la enquistación.

Palabras clave: Giardia lamblia, enquistación, microscopía electrónica, electroforesisbidimensional, diferenciación, parásito, protista.

Giardia lamblia in vitro encystation: two dimensional electrophoresis analysis ofdifferences in protein expression

The reconstruction of Giardia lamblia life cycle in vitro is an excellent tool for the study of theparasite's molecular biology. The present work describes techniques developed that better defineparasite differentiation. An encystation protocol is presented along with a method for isolationand purification of the produced cysts. The cyst morphology at the light microscopy level isidentical to that of in vivo cysts. A two-dimension protein map obtained by high-resolutionelectrophoresis indicated that most of the parasite's proteins are acid. Based on this result, thetwo dimension gel electrophoresis used a pH 4-7 gradient in the first, isoelectric focusingdimension. Differences in protein expression during the stages of encystation were clearlydiscerned, as well as images of the parasite obtained by light and by transmission electronmicroscopy that describe the morphological and the ultrastructural changes that occur as thecysts are produced in vitro.

Key words: Giardia lamblia, encystation, electronic microscopy, two-dimensional electrophoresis,differentiation, parasite, protista.

253

Giardia lamblia es un parásito protozoarioampliamente diseminado en el mundo, peroespecialmente en las poblaciones másdesprotegidas que no cuentan con serviciossanitarios adecuados. Produce una patología

spondencia:ratorio de Bioquímica, Instituto Nacional de Salud;x 220 0922; [email protected]

ido: 03/05/02; aceptado: 26/08/02

Biomédica 2002;22:253-62HERNÁNDEZ P.C., CALDAS M.L., WASSERMAN W.

intestinal llamada giardiosis que puede conducira problemas de mala absorción y retraso en elcrecimiento. El ciclo de vida de Giardia presentados formas morfológicamente distintas,trofozoítos y quistes. La enfermedad es causadapor el trofozoíto y se presenta frecuentementecon diarrea aguda o crónica. Los trofozoítoscolonizan la parte superior del intestino delgadodel hospedero, donde, por mecanismos des-conocidos, pueden diferenciarse en quistes queluego pueden pasar a las heces (1).

G. lamblia se considera un excelente sistemapara estudiar la evolución de los procesoscelulares fundamentales porque es posiblementeel eucariote vivo más antiguo, un verdadero fósilbiológico (2). Por tanto, es de suponer que losmecanismos de señalización para ladiferenciación son los más fundamentales ysimples y se podría contar con un modelo másdefinido y sencillo para el estudio de problemasque, en otros eucariotes más evolucionados, setornan excesivamente complejos.

Además, en el laboratorio se puede reproducircompletamente el ciclo de vida del parásito contécnicas sencillas de cultivo axénico y, para elcaso que nos interesa en este trabajo, se puedeestudiar la enquistación con el fin de lograr unasimulación de las condiciones medioambientalesdel parásito in vivo.

La enquistación de G. lamblia in vitro se hademostrado mediante criterios morfológicos,inmunológicos y bioquímicos (3). Durante laformación del quiste, los trofozoítos sufrencambios morfológicos y bioquímicos importantes:1) recepción de los estímulos para la enquistacióny la consecuente activación de genes específicos;2) biogénesis de organelos secretorios y síntesis,empaque, transporte y liberación de materialespara la pared del quiste, y 3) ensamblaje de lapared (4).

Sorprendentemente, a pesar de las expectativasseñaladas, G. lamblia se ha estudiado relativa-mente poco y las referencias bibliográficas conlas que se cuenta presentan una imagen a vecescontradictoria e incipiente sobre aspectosmoleculares y bioquímicos de su diferenciación.En este estudio se pretendió llevar a cabo una

estandarización de las condiciones necesariaspara que se realice de una forma eficiente elproceso de enquistación; detectar las proteínasinvolucradas en la diferenciación de trofozoíto aquiste, entre las que se encuentran las CWP1 yCWP2 (cyst wall proteins) (4), por medio deelectroforesis bidimensional (una técnica deanálisis de alta resolución) y obtener imágenespor microscopía electrónica de transmisión de lasdos formas de diferenciación de una cepacolombiana.


Cultivo de parásitos

Los trofozoítos de G. lamblia (cepa MHOM/Co/97/G1, proporcionada por el Laboratorio deParasitología del Instituto Nacional de Salud) secultivaron axénicamente a 34 °C en el medio deDiamond TYI-S-33 (5), suplementado con 0,5 mg/ml de bilis, 10% de suero bovino, 100 U/ml depenicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina yajustado a un pH de 7,0 (6) en tubos deborosilicato de 16 ml.

Enquistación in vitro

El medio básico de enquistación consiste en elTYI-S-33 de cultivo normal ajustado a un pH de7,8. Se probaron diferentes concentraciones debilis bovina (5 a 15 mg/ml). Estos ensayos sellevaron a cabo en tubos de poliestireno de 5 ml.En algunos se evaluó el efecto de la variación dela cantidad de trofozoítos iniciales que sonsometidos al estímulo (2 a 10 x 106 trofozoítos/ml). En los siguientes ensayos, la inducción sellevó a cabo con 107 trofozoítos a 34 °C en elmedio anteriormente descrito, con una duracióndel estímulo de 24 horas (o según lo que se indicaen el texto), al cabo de las cuales se retornaronal medio de crecimiento normal donde fueronincubados durante 24 horas más. Después de laincubación en el medio de enquistación a 34 °C,los parásitos se recolectaron enfriando los tubosen hielo durante 10 minutos y centrifugando a883 g durante 5 minutos. Para lisar los trofozoítosy algunos quistes no totalmente diferenciados,los sedimentos de células se resuspendieronprimero en una solución hipotónica de NaCl 0,8M y posteriormente se lavaron varias veces conagua a 4 °C (hasta lisis completa de los

254

Biomédica 2002;22:253-62 ENQUISTACIÓN IN VITRO DE GIARDIA LAMBLIA

trofozoítos). El sedimento de trofozoítos'fantasma' y quistes se mezcló con 10 ml dePercoll (Pharmacia) a una concentración deNaCl 0,15 M, con una densidad de 1,07 g/ml, yse centrifugó a 18.000 g durante 30 minutos a 4°C en un rotor de ángulo fijo de 35° (centrífugaJouan GR 20 22). La fracción que contenía losquistes libres de trofozoítos (± 1,048 g/ml) serecolectó y resuspendió en 1 ml de aguadoblemente destilada para conteo en hemocitó-metro.

Electroforesis de proteínas

Se corrieron geles unidimensionales de SDS-poliacrilamida (7) de lisados crudos de trofozoítosy células enquistantes. Los geles bidimensionalesse corrieron según Celis et al. (8), utilizando parael isoelectroenfoque (IEF) tiras con gradientelineal preelaborado de pH de 3-10 y 4-7(Amersham Pharmacia) y para la segundadimensión, geles de SDS-poliacrilamida al 10%.En cada caso, la visualización de las proteínasen los geles tanto de una como de dosdimensiones se realizó con solución deCoomassie G-250 (USB), con plata amoniacal(9) y con el colorante fluorescente Sypro OrangeStain™ (Molecular Probes).

Microscopía de luz

Las células, tanto trofozoítos como quistes, sefotografiaron en montajes húmedos en láminaspreparadas directamente del sedimento obtenidopor centrifugación en cada caso, por medio deun microscopio óptico Zeiss Axiophot, conobjetivos Zeiss 10X, 40X y 100X (Unidad deMicroscopía y Análisis de Imágenes, INS).

Microscopía electrónica de transmisión

Alícuotas de 0,1 ml de cada tipo de célula(trofozoítos y quistes) que conteníanaproximadamente 5 x 106 parásitos se lavaronsiete veces con una solución amortiguadora defosfatos, 0,1 M, pH 7,27, para eliminar el mediode cultivo y se recolectaron por centrifugación a2.000 rpm (230 g). El sedimento en seco semezcló con una solución de agarosa al 1% enbuffer fosfato para obtener un material solidificadoque pudiera trabajarse con más facilidad que lascélulas en suspensión. Se realizó una fijacióninmediata del bloque de agarosa conglutaraldehído al 3% en buffer fosfato durante 3

horas a 4 °C y, después, se hicieron 4 lavadoscon buffer fosfato durante tres minutos cada uno.Se realizó una postfijación con OsO

4 al 1% en

buffer fosfato durante dos horas a temperaturaambiente. Se realizaron 5 lavados con el mismobuffer durante 3 minutos, anteriores a lasubsiguiente deshidratación con un gradienteascendente de soluciones de etanol enconcentraciones de 50, 70, 80, 95% durante 10minutos en cada una y, luego, con etanol absolutodurante 20 minutos dos veces.

Adicionalmente, se colocaron las muestras enóxido de propileno durante 20 minutos como pasoprevio a la infiltración con resinas epóxicas. Lainfiltración se llevó a cabo con óxido de propilenoy resina epon-araldita para luego ser colocadasen resina pura, con 2 cambios cada 4 horas atemperatura ambiente. La polimerización de estasmuestras se realizó a una temperatura de 68 °Cdurante 48 horas. Posteriormente, se obtuvieroncortes semifinos de 500 nm y finos de 60 a 90nm en un ultramicrótomo LKB (Ultratome III8802A), los cuales se montaron sobre rejillas decobre que se colocaron con acetato de uranilo al6% en alcohol y citrato de plomo. Los cortes finosse observaron en un microscopio electrónicoZeiss EM-109 en la Unidad de Microscopía yAnálisis de Imágenes del Instituto Nacional deSalud.

Resultados

Enquistación in vitro

Se realizaron ensayos preliminares en los quese hizo un sondeo de cómo reaccionaría la cepafrente al estímulo de enquistación, partiendo deun inóculo de 4,8 x 106 trofozoítos totales en tubosde 5 ml con un medio de cultivo ajustado a un pHde 7,8 y concentraciones de bilis que variaronentre 5 y 15 mg/ml. Se observó el comportamientoque tienen los parásitos al ser sometidos al mediode diferenciación por un período de 48 horas enlas diferentes concentraciones de bilis y elresultado fue una evidente disminución en lacantidad de células totales encontradas al finaldel estímulo. El porcentaje de células totales alfinal del experimento con respecto al inóculoinicial muestra valores que son tan bajos comoel 6% de la población inicial cuando se incubanen medio con 15 mg/ml de bilis (datos no

255


mostrados). Por otro lado, la figura 1B muestraque, para las concentraciones de bilis usadas eneste ensayo, el porcentaje de enquistación oscilaentre 3 y 5% con un rendimiento mayor para laconcentración de 7,5 mg/ml de bilis (5,44%). Sinembargo, hay que tener en cuenta que lascaracterísticas morfológicas de los quistesobtenidos a esta concentración y superiores,sugieren una baja viabilidad comparada con lade los obtenidos a una concentración de 5 mg/ml de bilis (aspecto que será expuesto másadelante).

Como resultó evidente del ensayo anterior quelas concentraciones altas de bilis (≥7,5 mg/ml)son tóxicas para los parásitos, el tiempo deduración del estímulo también resulta ser unfactor clave para la obtención de una tasa altade enquistación. Se logró establecer que al

someter los parásitos a 24 horas en el medio deenquistación y otras 24 con medio de cultivo sepudo lograr una diferenciación del 14% (datosno mostrados).

Un factor importante que podría estar influyendoen la eficiencia de enquistación es la cantidad deparásitos de la que se parte para realizar losdiferentes ensayos debido a que cuando se llegaa una cierta cantidad de trofozoítos en el tubo decultivo el crecimiento se detiene, como lomostraron Bastidas y Santamaría (10) enestudios anteriores con esta cepa, en los cualesla densidad máxima en este punto es 2,2 a 2,8 x106 trofozoítos/ml. Se hicieron ensayos variandoel número de trofozoítos de partida, con unaconcentración de bilis de 5 mg/ml y un tiempo deestímulo de 48 horas (figura 1C y 1D). Losresultados muestran que es evidente el efecto

Figura 1. Efecto de la concentración de bilis en la enquistación. A. Cantidad de quistes resistentes al agua a lasconcentraciones de bilis indicadas. B. Porcentaje de enquistación, calculado según la población total de trofozoítos yquistes obtenida después del estímulo. Efecto del inóculo de trofozoítos de partida en la enquistación. C. Cantidad dequistes resistentes al agua obtenidos con el inóculo indicado. D. Porcentaje de enquistación con respecto a la poblacióntotal al final del estímulo. Ensayos realizados en tubos de 5 ml.

Concentración de bilis (mg/m l)5 7 9 11 13 15

1,20E+05

1,00E+05

8,00E+04

6,00E+04

4,00E+04

2,00E+04

0,00E+00

Qui

stes

res

iste

ntes

al a

gua

A

60000

50000

40000

30000

20000

10000

0

Qui

stes

res

iste

ntes

al a

gua

x 10

4

0 2 4 6 8 10 12

Número de trofozoítos x10 6

4 ,11

5 ,44

4,64

3 ,23

Concentración de b ilis (m g/ml)

% e

nqui

stac

ión

5 7 ,5 10 12,5 15

6

5

4

3

2

1

0

C

256

ENQUISTACIÓN IN VITRO DE GIARDIA LAMBLIABiomédica 2002;22:253-62

que tiene la concentración de células que sonsometidas al estímulo de la enquistación. Seobserva en la figura 1C que una cantidad de 5 a6 x 106 trofozoítos totales en tubos de 5 ml (1 a1,2 x 106 trofozoítos/ml) presenta los mejoresporcentajes de enquistación (4,6%) y que en 10x 106 células totales (2 x 106 trofozoítos/ml) ladiferenciación es mínima (0,05%).

Observaciones morfológicas de los dosestadios de vida

Trofozoítos: en la figura 2A se aprecianclaramente por microscopía de luz lascaracterísticas más generales de los trofozoítos,como su forma de pera, dos núcleos, flagelos ylos cuerpos medianos localizados debajo de losnúcleos. El tamaño es aproximadamente de 10-12 µm de longitud por 7-8 µm de ancho.

Quistes: la pared distintivamente gruesa(aproximadamenrte, 0,4 µm) es notoria en losquistes, así como su forma oval o en algunoscasos redonda, refractilidad y perfiles deorganelos citoplásmicos, como se aprecia en lafigura 2B. Los quistes formados in vitro presentandos tipos morfológicos diferentes, basados en laapariencia de su citoplasma (11). Un fenotipo estácaracterizado por una pared bien definida y unpequeño espacio entre el citoplasma y la pared

que se denomina espacio peritrófico. Otrofenotipo muestra un citoplasma recogido ydistorsionado con un gran espacio peritrófico (ep)que lo separa de la pared, aunque ésta estésiempre intacta, como el quiste marcado con laflecha en la figura 2B.

Un comportamiento especial que tienen losquistes obtenidos mediante diferenciación en ellaboratorio es su tendencia a agruparse en'racimos', lo que posiblemente se deba a uniónpor proteínas de la pared o asociadas con ella,lo cual, aparentemente, no se presenta en quistesaislados de pacientes con giardiosis sintomática.

Microscopía electrónica de transmisión: laultraestructura de los trofozoítos de G. lambliase puede reconocer en las micrografíaselectrónicas de la figura 3. En los trofozoítos sedestacan los dos núcleos con su membrananuclear muy bien definida, axonemas flagelares(Ax) con un arreglo de microtúbulos de 9 + 2,típico en la mayoría de los eucariotes; el discoventral, más detallado en el panel superiorderecho B, en el que se aprecian el conjunto delas microcintas y microtúbulos de los que estácompuesto, así como su forma de copa. Serealizaron mediciones de longitud de los parásitossobre las fotografías de microscopía electrónicay se obtuvo un valor promedio de 8,1 mm de

Figura 2. Micrografías por microscopía de luz de trofozoítos y quistes derivados in vitro de Giardia lamblia. A. Trofozoítos.f: flagelos; N: núcleos, teñidos con Giemsa. B. Quistes. La flecha indica el quiste no viable. P: pared de quiste; T: trofozoíto;ep: espacio peritrófico. Lugol. Barras=5 mm.

257

HERNÁNDEZ P.C., CALDAS M.L., WASSERMAN W. Biomédica 2002;22:253-62

ancho y un diámetro de 1,5 mm por cada uno desus núcleos. Estos valores son muy cercanos alos informados para trofozoítos de cepas aisladasen otros países; sin embargo, hay que señalar elhecho de que este criterio de discriminación esmuy poco específico. Los cortes transversalesde las muestras de quistes obtenidos in vitro(panel C) muestran unas estructuras noreportadas antes en la literatura, las cuales sonuna serie de cuerpos de forma asimétrica conuna delgada membrana bordeada de dupletas demicrotúbulos que se distribuyen uniformementea lo largo de toda la periferia. En el interior seencuentra un aparente núcleo y otros organelosque no son fácilmente distinguibles. Es importanteanotar que estos cuerpos no corresponden ensu morfología a trofozoítos, como se describió

en el panel A; adicionalmente, no se definenestructuras clásicas como el disco ventral ni losaxonemas característicos.

Electroforesis de proteínas: el gel unidimensionalde la figura 4 muestra diferencias notorias entrelos dos carriles, especialmente en los pesosmoleculares cercanos a 30 kDa (encerrados enla elipse), en donde los trofozoítos presentanbandas intensas de 28 y 32 kDa, y de 85, 65, 48y 35 kDa, aproximadamente, que no se ven enlos quistes. Por otra parte, se ve una banda muynotoria en los quistes alrededor de los 73 kDa,que no se observa en el carril de los trofozoítos.

Es evidente que hay una expresión de proteínasdiferentes en el proceso de enquistación que sequiso observar con más detalle usando

Figura 3. Ultraestructura de trofozoíto y quistede Giardia lamblia obtenidos in vitro. A. Perfil desección transversal de trofozoítos. N: núcleos;Ax: axonemas; VLF: flanco ventro-lateral; DV:disco ventral; V: vacuolas. Barra=1 mm. B.Detalle de disco ventral. Barra=0,3 mm. C.Quiste. N: núcleo; m: membrana + microtúbulos.Barra=1 mm.

258


electroforesis de dos dimensiones. Se obtuvo elmapa electroforético bidimensional de trofozoítosen un rango lineal de punto isoeléctrico de 3-10(para la primera dimensión) con el fin de observarla distribución de la expresión de las proteínas(figura 5A). Se observó que la gran mayoría delas proteínas o, por lo menos, las más abundantesen G. lamblia, son de carácter ácido y se localizanen el rango de pH de 3 a 6. Una tinción adicionalcon plata descubrió algunas pocas proteínas enla región de pH 7. Una proteína o grupo deproteínas con un peso molecular aproximado de33 kDa, marcadas en la figura con la flecha a,son especialmente abundantes y, posiblemente,pueden corresponder al grupo de proteínasllamadas giardinas, exclusivas de este parásito,y que componen las microcintas del disco ventral.Se han hallado 23 distintas con puntosisoeléctricos en un rango de pH de 5,0 a 6,5(12,13).

Unas proteínas particulares son las tubulinas quese encuentran alrededor de los 50-60 kDa conun punto isoeléctrico de 5 y que podríancorresponder a las marcadas con la flecha b, queen el parásito se hallan en los microtúbulos quetambién componen el disco ventral, además de

Figura 4. SDS-PAGE de proteínas de Giardia lamblia engel 10%. T: trofozoítos; E: quistes y enquistantes; M:marcador de peso molecular (Gibco), teñido con SyproOrange Stain.

los cuerpos medianos y flagelos. Otras proteínasque se pueden identificar como posibles en estegel, y que se señalan en la figura, son la actina(c) y centrina (d) del citoesqueleto.

En el panel B de la figura 5 se muestran lasproteínas de trofozoítos en un gel cuya primeradimensión se corrió entre pH 4 y 7; se tienen (a)giardinas y (b) tubulinas como referencia generalpara comparar el patrón de expresión. Losparásitos que son sometidos a un estímulo deenquistación de 48 horas (panel C, figura 5) nomuestran, en las regiones de pH de 5 a 6 y en elrango de peso molecular de 50-70 kDa, lasmismas proteínas que los trofozoítos. Esto seevidencia también en los trofozoítos enquistantesde 24 horas (figura no mostrada) en los cualesestas proteínas disminuyen o no aparecen.Además, se observan, en las célulasenquistantes, nuevas proteínas muy intensas enun peso molecular de ~60 kDa con puntosisoeléctricos de 4,8 y 7,0 asignadas a lasproteínas CWP1 y CWP2, respectivamente.Estas proteínas son carac-terísticas del quiste,las más prominentes de su pared; por tanto, unarazón de mucho peso para su identificación.

Es evidente que el patrón de expresión de lasproteínas en los dos estadios es diferente.Resulta notorio que para el quiste -que es la formade vida latente del parásito- hay un silencio odisminución de la síntesis de proteínas. Estehecho se debe investigar con más profundidad.

Discusión

Una primera aproximación in vitro a lacomprensión de la enquistación de Giardia es lasimulación de aquellas condiciones a las que seve sometido el parásito en el sistema digestivodel hospedero, que promoverían sucesosmoleculares que lo llevarían a diferenciarse. Unade esas condiciones es la presencia de bilis. Ennuestros experimentos, la adición de bilis bovinaal medio TYI-S-33 indujo la enquistación encultivos axénicos de Giardia. En este trabajoencontramos un rango amplio de concentraciónde bilis, de 5 a 7,5 mg/ml, que indujoeficientemente (~5-13%) la enquistación, datosque están de acuerdo con lo informado por Gillinet al. (14). En otros ensayos se pudo obtener altaenquistación con concentraciones tan bajas como

259


1,5 mg/ml. Se notó en nuestros experimentos queel número total de células (trofozoítos másquistes) decreció con concentraciones de bilissuperiores a 2 mg/ml (datos no mostrados). Estosresultados parecerían indicar que es necesarioque los parásitos estén en buenas condicionesfisiológicas y que se puedan dividir para enquistar,de tal forma que la eficiencia óptima deenquistación se logra en la concentración másalta de bilis que aún no disminuye el crecimientodel cultivo.

La duración del estímulo de la enquistaciónresultó ser un factor importante en el proceso.Con un método adaptado a partir del informadopor el grupo de Kane et al. (15), se concluyó queuna limitada exposición al medio de enquistación

(24 horas) seguida de un retorno al medio decrecimiento normal, que no es tóxico, puede sersuficiente para inducir la diferenciación al valormáximo sin afectar la viabilidad del parásitoenquistado. Se observó, igualmente, que laenquistación in vitro se ve afectada por el tamañodel inóculo de trofozoítos de partida que van aser sometidos a la diferenciación, como semuestra en las figuras 1A y 1B, donde losinóculos muy grandes (2 x 106 trofozoítos/ml)resultaron ineficientes, seguramente debido aque se encuentran cercanos a la densidadmáxima del cultivo y no permiten una divisiónde todos los trofozoítos durante el período deinducción. Los inóculos que oscilaron entre 1y 1,2 x 106 trofozoítos/ml resultaron ser los más

Figura 5. Separación bidimensional de proteínas de Giardia lamblia. A. Proteínas de trofozoíto en gel 15% pH 3-10, teñidocon Sypro Orange Stain. B. Proteínas de trofozoíto en gel 10%, pH 4-7, teñido con plata. C. Células enquistantes con 48horas de estímulo en gel 10%, pH 4-7, teñido con plata. PM, peso molecular en kDa.

260


convenientes para alcanzar niveles deenquistación aceptables.

La apariencia morfológica general de G. lambliase observó por medio de microscopía de luz yelectrónica de transmisión, antes, durante ydespués de la enquistación. Los trofozoítos tienenun tamaño de 8 µm de ancho x 12 µm de largo,aproximadamente, forma de pera y sondistinguibles los dos núcleos característicos, loscuerpos medianos y los flagelos (figura 2). Lasmedidas y características de algunos organelosse corroboraron por medio de micrografíaselectrónicas de transmisión (figura 3), en dondese detallaron las estructuras componentes deldisco ventral (conjunto de microcintas ymicrotúbulos) que es indispensable para laadhesión de Giardia a la mucosa intestinal y losaxonemas flagelares, las vacuolas periféricas ylos núcleos.

En los quistes de G. lamblia obtenidos in vitro sepueden observar dos morfologías claramentedistinguibles de acuerdo con la apariencia de sucitoplasma. Esto podría concordar con lo referidopor Gillin et al. (14), quienes los discriminaron enlos grupos I y II (viables y no viables, respectiva-mente). En el primer grupo clasificaron los quistesde apariencia lisa, forma oval y con un espacioperitrófico pequeño, como se observa en la figura3B, mientras que a la segunda categoríapertenecen los quistes con citoplasma recogido,un amplio espacio peritrófico a la pared, como elmarcado con flecha en la figura citada.

Aunque la morfología ultraestructural de losquistes de Giardia sólo se pudo definirparcialmente, se encontraron elementosestructurales novedosos, distintos a losinformados por otros grupos. Los quistesobservados tenían pocos organelos distinguibles,los más claros son los núcleos y una larga hilerade estructuras aparentemente microtubularesque bordean internamente la membrana (figura3, panel c). Esto puede ser interesante y es unproblema en el cual el grupo de investigacióncontinuará indagando.

El análisis electroforético de las proteínas de G.lamblia mostró aspectos interesantes en el patrónde expresión de los dos estadios de vida y

corroboró algunos resultados ya disponibles enbases de datos proteómicas. En una apreciacióngeneral de las proteínas de Giardia, se encontróque la gran mayoría son de naturaleza ácida enun rango de puntos isoeléctricos entre 3 y 7 (figura5A). Como el objetivo del presente trabajo eraobservar las diferencias en la expresión deproteínas en los dos estadios de vida, sólo sepudieron hacer aproximaciones a la identidad dealgunas proteínas encontradas. Una carac-terización más amplia requeriría métodosespeciales como espectrometría de masas ysecuenciación de proteínas, entre otros, que nohacen parte de los alcances de esta investigación.

Las giardinas están localizadas en las microcintasdel disco ventral de Giardia; los estudiosrealizados por el grupo de Clark y Holberton (16)encontraron que estas proteínas estabandefinidas en 5 bandas en electroforesis SDS-PAGE unidimensional, como las que se muestranencerradas en la elipse de la figura 4, con masasmoleculares cercanas a ~30 kDa. Durante laenquistación, el trofozoíto debe realizarimportantes cambios, incluidos la división nuclear,el desmantelamiento y empaque de organelos,tales como el disco adhesivo, y la producción,procesamiento y transporte de los componentesde una pared protectora característica del estadiode quiste. Se observó un cambio en el patrón deexpresión de las proteínas en puntos claves delproceso, como lo muestra la figura 5. Hay unadisminución general de las proteínas encontradasen el rango de pl estudiado en las célulasenquistantes de 48 horas, en las que muynotoriamente sucede una síntesis de proteínasnuevas que se señalan en la figura con flechasmarcadas y concuerdan con CWP1 y CWP2. Estaasignación se realizó porque éstas son proteínasexclusivas del quiste de Giardia. Son proteínasricas en leucina, se dirigen a una vía secretoriapor medio de un péptido señal amino-terminal yse ha postulado que la conformación de susrepetidos de leucina promueven las interaccionesproteína-proteína (15). Los genes CWP1 y CWP2predicen proteínas de naturaleza ácida conmasas moleculares de 26 y 39 kDa,respectivamente; tienen una identidad en lasecuencia de aminoácidos del 61% en el

261


fragmento de 26 kDa que tienen en común, perola CWP2 tiene una extensión C-terminal de 121residuos. Es rica en aminoácidos básicos, lo quehace que esta proteína tenga un pl calculado de12 (4). Los resultados exhibidos en este estudiomuestran que la CWP1 y la CWP2 tienen unamasa aproximada de ~60 kDa con pI de ~4,8 y>7,0, respectiva-mente. Se ha encontrado quese pueden presentar entrecruzamientosintermoleculares y una alta glicosilación de estasproteínas (posiblemente por N-acetil-galactosamina, el azúcar mayoritario de la pared,en los abundantes sitios potenciales de O- y N-glicosilación), lo que hace que se vean como unamancha intensa de alto peso molecular ymovilidad relativa cercana a los ~55 kDa (4). Estasituación puede explicar el resultado obtenido quehace que las proteínas migren de una formaalterada en geles SDS-poliacrilamida.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Sofía Duque y AdrianaArévalo del Laboratorio de Parasitología delInstituto Nacional de Salud por su invaluableayuda en el manejo del cultivo de los parásitos ya Yolanda Porras por su asistencia técnica enmicroscopía. Este trabajo fue financiado por laUniversidad Nacional de Colombia (DIB), por elInstituto Nacional de Salud y por el InstitutoColombiano para la Promoción de la Ciencia"Francisco José de Caldas" COLCIENCIAS,proyecto 1101-05-10060.

Referencias

1. Adam RD. The biology of Giardia spp. Microbiol Rev1991;5:706-732.

2. Sogin ML. Early evolution and the origin of eukaryotes.Curr Opin Genet Dev 1991;1:457-63.

3. Gillin FD, Reiner DS, Gault MJ, Douglas H, Das S,Wunderlich A, et al. Encystation and expression of cystantigens by Giardia lamblia in vitro. Science 1987;235:1040-3.

4. Lujan HD, Mowatt M, Nash T, Conrad J, Bowers B .Identification of a novel Giardia lamblia cyst wall protein

with leucine-rich repeats. J Biol Chem 1998;270:29307-13.

5. Diamond LS, Harlo, DR, Cunnick CC. A new mediumfor the axenic cultivation of Entamoeba histolytica andother Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg 1978;72:431-2.

6. Keister D. Axenic culture of Giardia lamblia in TYI-S-33medium supplemented with bile. Trans R Soc Trop MedHyg 1983;77:487-8.

7. Coligan JE, Dunn BM, Speicher DW, Wingfield D,editors. Current protocols in protein science. New York:John Wiley & Sons; 1995.

8. Celis J, Ratz G, Basse B, Lauridsen J, Celis A. Highresolution two-dimensional gel electrophoresis ofproteins: isoelectric focusing (IEF) and non-equilibriumpH gradient electrophoresis (NEPHGE). Cell biology: alaboratory handbook. San Diego, CA: Academic Press;1994.

9. Morrissey JH. Silver stain for proteins in poly-acrylamidegels. A modified procedure with enhanced uniformsensitivity. Ann Biochem 1981;117:307-10.

10. Bastidas A, Santamaría L. Caracterización bioquímicade las fases preliminares al proceso de enquistación deGiardia lamblia (tesis). Bogotá, D.C.: UniversidadNacional de Colombia; 2001.

11. Schupp D, Erlandsen S. A new method to determineGiardia cyst viability: correlation of fluorescein diacetateand propidium iodide staining with animal infectivity. ApplEnviron Microbiol 1987;53:704-7.

12. Peattie D, Alonso R, Hein A, Caulfield J. Ultrastructurallocalization of giardins to the edges of disk microribbonsof Giardia lamblia and the nucleotide and deducedprotein sequence of alpha giardin. J Cell Biol1989;109:2323-35.

13. Heyworth M, Foell J, Sell T. Giardia muris: evidencefor a b-Giardin homologue. Exp Parasitol 1989;91:284-7.

14. Gillin F, Boucher S, Rossi S, Reiner D. Giardia lamblia:the roles of bile, lactic acid, and pH in the completion ofthe life cycle in vitro. Exp Parasitol 1989; 69:164-74.

15. Kane A, Ward H, Keush G, Pereira M. In vitroencystation of Giardia lamblia: large-scale productionof in vitro cysts and strain and clone differences inencystation efficiency. J Parasitol 1991;77:974-81.

16. Clark J, Holberton D. Triton-labile antigens in flagellaisolated from Giardia lamblia. Parasitol Res 1988;74:415-23.

262

ARTÍCULO ORIGINAL

Biomédica 2002;22:263-71

Estudio de la variabilidad de seis cepas colombianas deTrypanosoma cruzi mediante polimorfismos de longitud defragmentos de restricción (RFLP) y amplificación aleatoria

de ADN polimórfico (RAPD)Pilar Rodríguez 1, Marcela Escalante 1, Hugo Díez 1, Claudia Cuervo 1, Marleny Montilla 2,

Rubén Santiago Nicholls 2, Ignacio Zarante 3, Concepción Puerta 1

1 Laboratorio de Parasitología Molecular, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, UniversidadJaveriana, Bogotá, D.C., Colombia.

2 Laboratorio de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.3 Instituto de Genética, Facultad de Medicina, Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

La enfermedad de Chagas, causada por el hemoflagelado Trypanosoma cruzi, constituye unproblema de salud pública en Colombia en donde diferentes informes indican la presencia deheterogeneidad entre poblaciones del parásito. En este estudio se analizaron seis cepascolombianas de T. cruzi, procedentes de distintas regiones geográficas del país, huéspedes yciclos de transmisión, mediante las técnicas de amplificación aleatoria de ADN polimórfico(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD), isoenzimas y polimorfismo de longitud defragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP), usando comosonda el gen de 1,2 kb que codifica para la histona H2A del parásito. Se encontró que lasdistancias genéticas entre los aislados varían considerablemente, ubicándose en el rango de0,61 a 0,99, para el caso de los perfiles de RAPD (cebadores M13F y M13R), de 0 a 0,81, parael caso de los perfiles de RFLP (5 endonucleasas) y de 0,10 a 0,55, para el caso de las isoenzimas(13 sistemas enzimáticos). El elevado grado de variabilidad exhibido por los aislados colombianosdel parásito podría estar implicado en el amplio espectro clínico de presentación de la enfermedadde Chagas en Colombia.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, RAPD, RFLP, histona H2A, isoenzimas, polimorfismo.

Genetic variability in six Colombian Trypanosoma cruzi strains detected by restrictionfragment length polymorphisms (RFLP) and random amplified polymorphic DNA (RAPD)

Chagas disease, caused by the hemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a public health problemin Colombia. Previous reports have indicated the presence of heterogeneity among parasitepopulations. Six Colombian T. cruzi strains were obtained that differed by host, geographicalregion and transmission cycle. The genetic variability of each was compared by random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD), and isoenzymes. A restriction fragment length polymorphism (RFLP)was extracted using the 1.2 kb unit encoding the parasite's H2A histone as a probe. Geneticdistances between the isolates varied greatly, from 0.611 to 0.99 as determined by RAPD profiles(M13F and M13R primers), between 0 and 0.81 by RFLP profiles ( 5 endonucleases), andbetween 0.10 and 0.55 by isoenzymes (13 enzymatic systems). Genetic distance matrixes derivedfrom each of the three methods showed that Colombian strains exhibit a high degree of geneticdifferentiation. This may account for the broad clinical spectrum of Chagas disease in Colombia.

Key words: Trypanosoma cruzi, RAPD, RFLP, histone H2A, isoenzymes, polymorphism.

263

RODRÍGUEZ P. ESCALANTE M., DÍEZ H., CUERVO C., et al. Biomédica 2002;22:263-71

Trypanosoma cruzi es el agente causal de laenfermedad de Chagas, enfermedad altamenteprevalente en países tropicales y subtropicalesde Latinoamérica, en donde afecta a más de 20millones de personas, en tanto que otros 90millones se encuentran en riesgo de adquirir lainfección (1).

T. cruzi es un parásito altamente pleomórfico conun complejo ciclo de vida que infecta un ampliorango de especies mamíferas domésticas ysilvestres, las cuales constituyen reservorios delmismo. Los parásitos son transmitidos por variasespecies de insectos triatomíneos y los síntomasy severidad de la enfermedad varían en distintasregiones geográficas, desde una infecciónasintomática hasta cardiomiopatías y mega-síndromes intestinales (2-4).

En Colombia, esta enfermedad se caracteriza portener una presentación variable con un amplioespectro clínico que abarca tanto pacientesinfectados asintomáticos que no desarrollan laenfermedad (estado I), como pacientes queúnicamente desarrollan una sintomatología levecompatible con el estado II y pacientes quepresentan falla cardíaca y muerte súbitasecundaria a una cardiomiopatía dilatada (estadoIII) (5).

Esta variabilidad en la presentación clínica de laenfermedad puede deberse tanto a la diversidadgenética de la población humana comprometida,como a la heterogeneidad presentada por lasdiferentes cepas del parásito (2,6).

Es así como los estudios de isoenzimas (3,7,8),esquizodemas (9,10), cariotipos (6,11,12),polimorfismos de longitud de fragmentos derestricción (Restriction Fragment LengthPolymorphisms, RFLP) (11,12) y, másrecientemente, amplificación aleatoria de ADNpolimórfico (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) (13,14) han demostrado la diversidadfenotípica y genotípica de T. cruzi.

Estudios previos de nuestro laboratoriodemostraron variabilidad isoenzimática en sietecepas colombianas de T. cruzi, con un máximode cuatro alelos diferentes por locus (15). En estetrabajo se extendió dicho estudio de variabilidadal análisis de polimorfismo del ADN usando lastécnicas de RAPD y RFLP y comparando loshallazgos obtenidos con los resultados delanálisis isoenzimático.


Parásitos

El origen y las características de las cepasutilizadas se muestran en el cuadro 1. Todas lascepas estudiadas habían sido caracterizadaspreviamente por isoenzimas y correspondieronal zimodema I (15). Los epimastigotes secultivaron en medio REI modificado,suplementado con 2% de suero bovino fetal(SBF) y 100 mg/ml de gentamicina a 24 °C. Comocepa de referencia se empleó la cepa Y de Ríode Janeiro (Brasil), aislada de humano porxenodiagnóstico, perteneciente al zimodema ZII(16).

Ensayos de RAPD

El ADN de los parásitos se extrajo según loindicado por Escalante et al. (17). Su pureza,integridad y concentración se aseguraronmediante electroforesis en geles de agarosa al0,8% y por medición de la absorbancia a 260 y280 nm (18).

Se utilizaron como iniciadores los oligonucleótidosuniversales M13 forward (M13F): 5'-d(GTTTTCCCAGTCACGAC)-3' y M13 reverse(M13R): 5'- d(CAGGAAACAGCTATGAC)-3'. Lareacción de amplificación se realizó en un volumenfinal de 10 µl que contenía: Tris-HCl (pH 8,4), 20mM, KCl, 50 mM, MgCl2, 1,5 mM, dGTP, dATP,dTTP y dCTP, 200 µM cada uno y Taq ADNpolimerasa (Promega), 2,5 unidades. Eloligonucleótido se adicionó a una concentraciónde 6,4 pmoles y se ensayaron cantidadesvariables de ADN: 1, 5, 10 y 20 ng. Como controlse utilizó la misma mezcla de reacción pero sinADN. La reacción anterior se llevó a untermociclador (Perkin Elmer) y se sometió, enprimer lugar, a un ciclo de desnaturalización a95 °C durante 5 minutos, seguido por dos ciclos,

Correspondencia:Concepción Puerta: Carrera 7 N° 43-82, Laboratorio 124,Bogotá, D.C., Colombia; teléfono: (571) 320 8320, extensión4138; fax: (571) 320 8320, extensión 4021; [email protected]


264

Biomédica 2002;22:263-71 VARIABILIDAD DE CEPAS COLOMBIANAS DE T. CRUZI

con el siguiente perfil de temperaturas: 95 °Cdurante 30 segundos para desnaturalización; 30°C durante 2 minutos para anillaje y 72 °C durante1 minuto para extensión. Posteriormente, lareacción se sometió a 33 ciclos, durante loscuales la temperatura de anillaje se incrementó a40 °C. En el último ciclo, la extensión se aumentóa 5 minutos. A continuación, una alícuota de 5 µlde la reacción anterior se analizó mediante gelesde agarosa al 1,6%, teñidos con bromuro de etidio(18). Los geles se fotografiaron y se determinó lapresencia de las bandas en cada una de las cepascon base en su resolución, intensidad yreproducibilidad en reacciones de amplificaciónseparadas (19). El porcentaje de bandascomunes entre las cepas se definió según lasiguiente fórmula: %(p)= 100 nab/(na+nb), donde(na) y (nb) representan el número de bandas encada una de las cepas a y b; (nab) correspondeal número de bandas compartidas entre (a) y (b).

Ensayos de RFLP

Dos µg de ADN de los parásitos fueron digeridoscon ocho enzimas de restricción: BamHI, BstEII,EcoRI, HindIII, KpnI, NotI, SalI y StyI, según lascondiciones especificadas por la casa comercialfabricante (Gibco-BRL). La totalidad de ladigestión se aseguró por rehibridación de lasmembranas con el gen codificante para 1F8 deT. cruzi (20). Los fragmentos resultantes sesepararon mediante electroforesis horizontal engeles de agarosa al 0,8% y se transfirieron amembranas de nylon (Magnagraph MSI, Fisher),siguiendo el protocolo de transferencia salina (21).A continuación, las membranas fueronprehibridadas a 42 °C durante 2 horas en unasolución de formamida 50%, Na2HPO4 (pH 7,2),0,12 M, NaCl 0, 25 M, SDS 7%, EDTA 1 mM, y200 µg/ml de ADN de esperma de salmónpreviamente desnaturalizado. La hibridación serealizó durante toda la noche a 42 °C, usandocomo sonda el inserto del clon pBSTcH2A1,correspondiente a la unidad de 1,2 kb de lahistona H2A de T. cruzi (22) marcado con biotina,según las indicaciones de la casa fabricante(Gibco-BRL). Posteriormente, los filtros seenjuagaron brevemente en SSC 2X (soluciónsalina citrato 1X: NaCl 0,15 M, citrato de sodio0,015 M, pH 7,0) y lavados durante 15 minutos

con SSC 1X, SDS 0,5% a 42 °C; SSC 0,5X, SDS0,5% a 50 °C y SSC 0,1X, SDS 0,5% a 65 °C.

A continuación, las señales se detectaron con elconjugado fosfatasa alcalina-estreptavidina(GIBCO-BRL) y reveladas con el sustrato clorurode nitroazul de tetrazolio (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3-indol-fosfato disódico (BCIP) (Gibco-BRL), según las indicaciones de la casafabricante.

Análisis de datos

Los análisis de variabilidad se basaron en los locide la histona H2A (RFLP) y dos cebadores(RAPD), teniéndose en cuenta solamente lapresencia o ausencia de los fragmentosreproducibles e inequívocos obtenidos con cadauno de los dos métodos. Las matrices dedistancia genética entre las diferentes cepas segeneraron utilizando la distancia de Jaccarddefinida como D=1-[C/(2N-C)], donde C es elnúmero de bandas en común entre dos cepas yN es el número total de bandas diferentes (23).Adicionalmente, los resultados de isoenzimasobtenidos previamente (15) se analizaron segúnla distancia de Manhattan, teniendo en cuentasolamente las cepas incluidas en este estudio.La agrupación de los datos se realizó según elmétodo jerárquico UPGMA (unweighted pairgroup method using arithmetic averages) con elprograma NTSYSpc versión 2.02 (24).

Resultados

Perfiles de RAPD

Se seleccionaron 52 bandas obtenidas conambos iniciadores con base en su resolución,intensidad y reproducibilidad en reacciones deamplificación separadas.

Dichas bandas, ubicadas dentro de un rango depeso molecular de 300 a 4.000 pb, se codificaroncon letras mayúsculas y se tabularon (cuadro 1).Tal como se muestra en la figura 1, los iniciadoresgeneraron patrones polimórficos para un total de14 RAPDemos y se obtuvo una diversidadgenética de 6/6=1 por iniciador.

Por otra parte, el análisis de bandas amplificadascompartidas mostró que con ambos iniciadoreslas cepas colombianas del parásito compartenalrededor de un 13% de los fragmentos

265


amplificados, mientras que al comparar las cepascolombianas con la brasileña Y, dicho porcentajese reduce a un 10%.

Patrones de RFLP

De las ocho enzimas de restricción analizadas,se encontró que con dos de ellas, BamHI y BstEII,

Cuadro 1. Características de las cepas de Trypanosoma cruzi estudiadas y de sus respectivos fragmentos de ADNamplificados mediante RAPD.

Cepas y código Procedencia Origen M13F M13R

No. 3 Zulia, Didelphis CEGIÑSUVWYZ DFIOQS(MDID/CO/87) Norte Santander marsupialis (fara),

silvestre

Ikiakarora Catatumbo, Rhodnius prolixus, BDHJLLNQTVW DHJKMPS(IRHO/CO/95) Norte Santander silvestre YZ

Shubacbarina Catatumbo, Rhodnius prolixus, CGIÑSUXYZ DFHILOR(IRHO/CO/95) Norte Santander silvestre

M. Rangel Chiriguaná, Humano, LZ V(MHOM/CO/86) Cesar domiciliario

B.M. López Paratebueno, Humano, BGIOSUWYZ ABCDFGHILLMNÑOSTU(MHOM/CO/87) Cundinamarca domiciliario

Munanta Guateque, Rhodnius prolixus, DFKPS -(IRHO/CO/85) Boyacá domiciliario

Y Rio de Janeiro, Humano ALMR BEI(MHOM/BR/00/Y) Brasil

Las letras mayúsculas representan los fragmentos amplificados con el iniciador M13 forward y M13 reverso.

Figura 1. Perfiles de RAPD con el uso del oligonucleótidoM13 forward. 10 µl de la reacción de PCR fueron corridosen un gel de agarosa al 1,6%, coloreado con bromuro deetidio. Carriles: 1) patrón de peso molecular 1 kb (Gibco-BRL), cuyos fragmentos se indican en pb; 2) No. 3 (MDID/CO/87); 3) Ikiakarora (IRHO/CO/95); 4) Shubacbarina(IRHO/CO/95); 5) M. Rangel (MHOM/CO/86); 6) B.M. López(MHOM/CO/87); 7) Munantá (IRHO/CO/85), y 8) Y (MHOM/BR/00/Y).

hay diferencias en el tipo de unidades H2Ageneradas. La enzima BamHI libera dos unidadesde 1,2 y 0,7 kb en la cepa Ikiakarora, mientrasno liberó ninguna en el resto de las cepasanalizadas y solamente liberó la unidad de 1,2kb en la cepa del Brasil. Por su parte, la enzimaBstEII liberó las dos unidades en las cepas M.Rangel e Ikiakarora y solamente la unidad de 1,2kb en las cepas B.M. López, No. 3 y Y Brasil.Adicionalmente, con la mayoría de laendonucleasas que tienen sitio de corte dentrode las unidades, tal como BstEII (figura 2a), KpnI,BamHI y StyI, se detectó la presencia de bandasmúltiplos de las unidades de repetición,correspondientes a polimorfismo en la secuenciaentre las unidades de una misma cepa. Por otraparte, la enzima EcoRI no corta dentro de lasunidades, pero genera un patrón polimórfico conbandas de alto peso molecular (figura 2b) quecontribuye a la variabilidad detectada en estascepas. Es así como, finalmente, se obtuvieron 6RFLDemos, para una diversidad genética de 6/7=0,85, la cual es ligeramente menor de laobtenida con el uso de los RAPD como marcador.

Análisis de la variabilidad

La variabilidad o polimorfismo del ADN entre lascepas se analizó mediante la construcción dedendogramas individuales basados en la

266


distancia genética de Jaccard para los estudiosde RAPD y RFLP y la distancia de Manhattanpara las isoenzimas. Llamativamente, el análisisde RAPDemos muestra una gran heterogeneidadentre todas las cepas colombianas del parásito,con una distancia de Jaccard mínima de 0,6071y máxima de 0,99, siendo las cepasShubacbarina, No. 3 y B. M. López las máscercanas (figura 3a). Por su parte, cuando seanaliza el dendograma obtenido con losRFLPDemos, se encuentra nuevamente que lascepas colombianas varían entre sí con unadistancia de Jaccard mínima de cero y máximade 0,81, siendo las cepas Munantá yShubacbarina las más cercanas, seguidas de M.Rangel, B. M. López y No.3 (figura 3b).Finalmente, el análisis de isoenzimas tambiénmostró variabilidad entre las cepas colombianas,pero con distancias genéticas menores entreellas, las cuales se sitúan en un rango de 0,1 a0,55 (figura 3c).

Adicionalmente, vale la pena destacar que si bienla asociación entre las cepas Shubacbarina, B.M. López y No.3 se mantuvo en los tresdendogramas, la topología de los mismos varió.Por ejemplo, la primera agrupación en el análisisde isoenzimas mostró a M. Rangel separada delresto de cepas, mientras que en el análisis de

Figura 2. Patrones de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción después de la digestión con a) BstEII y b)EcoRI. 2a. Carriles: 2 µg de ADN de epimastigotes de T. cruzi de las cepas: 1) Shubacbarina (IRHO/CO/95), 2) Munantá(IRHO/CO/85), 3) M. Rangel (MHOM/CO/86), 4) Ikiakarora (IRHO/CO/95), 5) No. 3 (MDID/CO/87) y 6) B.M. López (MHOM/CO/87) fueron digeridos con la enzima BstEII e hibridados con la unidad 1,2 kb codificante para la histona H2A de dichoparásito, marcada con biotina. 2b. Carriles: 2 µg de ADN de epimastigotes de T. cruzi de las cepas: 1) Y (MHOM/BR/00/Y), 2) Shubacbarina (IRHO/CO/95), 3) Munantá (IRHO/CO/85), 4) M. Rangel (MHOM/CO/86), 5) Ikiakarora (IRHO/CO/95),6) No. 3 (MDID/CO/87) y 7) B.M. López (MHOM/CO/87) fueron digeridos con la enzima EcoRI e hibridados con la unidad1,2 kb codificante para la histona H2A de dicho parásito, marcada con biotina. A la derecha se indican los tamaños en pbde los fragmentos HindIII del fago λ gt11.

RAPD la primera agrupación separó a la cepaMunantá del resto del grupo y por RFLP fueronlas cepas Y e Ikiakarora las que primero sesepararon del grupo en general.

Discusión

En este trabajo se realizó un análisis devariabilidad de seis cepas colombianas de T. cruzimediante RAPD (cebadores M13F y M13R) yRFLP (gen de la histona H2A, unidades de 1,2 y0,76 kb, endonucleasas: EcoRI, BamHI, KpnI,BstEII y StyI), como ampliación de un estudioprevio de isoenzimas (15). Si bien Saravia et al.(25), Márquez et al. (26) y Ruiz et al. (27), entreotros, han estudiado la variabilidad genética deun mayor número de cepas colombianas, estosestudios se han centrado en el análisis de lospatrones isoenzimáticos, metodología superadapor el RAPD para la determinación depolimorfismo y correlación con el comportamientobiológico de cepas del parásito (28).

Los resultados obtenidos en este estudioevidencian cómo, en primer lugar, las cepascolombianas exhibieron un elevado grado deheterogeneidad entre ellas y, en segundo lugar,que las distancias genéticas entre ellas variaronsegún el método de análisis empleado. Estos

267


resultados sugieren que el comportamiento delparásito en Colombia difiere del de los otrospaíses de Suramérica, especialmente de lospaíses del Cono Sur, en donde diferentesestudios muestran correlación entre losresultados de isoenzimas y los de RAPD(13,14,29-31). Adicionalmente, vale la penaresaltar cómo si bien todas las cepas analizadaspertenecen al zimodema ZI, no se presentaronperfiles de RAPD iguales entre ellas, lo cual indicaque su heterogeneidad es muy alta, a diferenciade los estudios de Brisse et al. (32) y Bosseno etal. (33), quienes informaron un alto grado dehomogeneidad entre los RAPD de cepaspertenecientes al zimodema I.

El elevado grado de polimorfismo exhibido porlas cepas colombianas de T. cruzi, encomparación con las cepas de otros países, sepuede deber tanto a las condiciones geográficasy topológicas específicas del país, como a lapresencia simultánea de los ciclos de transmisióndoméstico y selvático en el país y a las diferenciasdictadas por las características genéticas de loshospederos, reservorios y vectores a partir delos cuales fueron aisladas, que podríanseleccionar poblaciones del parásito (34). A esterespecto, es importante anotar cómo variosestudios de RAPD indican variabilidad genéticatanto entre los vectores transmisores de laenfermedad en el norte del Brasil (35) como entrelos vectores Rhodnius prolixus y Rhodniuscolombiensis en Colombia (36).

Por otra parte, teniendo en cuenta los informesprevios de estructura clonal del parásito, tantopara cepas oriundas de otros países deLatinoamérica (8,14) como para las de Colombia(26,27), las discrepancias entre los diferentesmétodos de análisis empleados se puedenenmarcar dentro de una o varias de las siguientessituaciones: 1) los marcadores analizados poseendiferentes tasas de mutación entre ellos; porejemplo, para el caso de las histonas, se conoceque estos genes son altamente conservados alo largo de la escala filogenética (37), o 2) algunode los marcadores puede estar sometido apresiones selectivas, como puede ser el caso delas isoenzimas (38). Sin embargo, tampoco sepuede descartar la recombinación genética entre

Figura 3. Dendogramas obtenidos según los perfiles de a)RAPD, b) RFLP y c) isoenzimas. 3a. Dendograma basadoen la distancia genética de Jaccard, obtenida según losperfiles de RAPD y agrupadas según el programa UPMGA/NTSYS. 3b. Dendograma basado en la distancia genéticade Jaccard, obtenida según los perfiles de RFLP yagrupadas según el programa UPMGA/NTSYS. 3c.Dendograma basado en la distancia genética de Manhattan,obtenida según los perfiles de isoenzimas y agrupadassegún el programa UPMGA/NTSYS.

D istanc ia de Jaccard

M .Rangel

Shubacbarina

B.M. López

M unanta

No. 3

Ikiakarora

Y

0 .61 0.70 0.80 0 .89 0 .99

3a

0.00 0.20 0 .41 0 .61 0.81

D istanc ia de Jaccard

M .Rangel

Shubacbarina

B.M. López

M unanta

No. 3

Ikiakarora

Y

3b

D istanc ia de M anhattan0.12 0.23 0.34 0.45 0.56

M .Rangel

B.M. López

Shubacbarina

M unanta

N o. 3

Ikiakarora

3c

268

VARIABILIDAD DE CEPAS COLOMBIANAS DE T. CRUZIBiomédica 2002;22:263-71

poblaciones naturales del parásito, tal como loindican los trabajos de Carrasco et al. (29) yStothard et al. (39).

Adicionalmente, vale la pena destacar cómo lapresencia de variabilidad entre las cepascolombianas del parásito se evidencia de maneramás contundente con el estudio de RAPD (cuadro1, figura 1). De acuerdo con lo anterior, cuandose analizó el porcentaje de bandas compartidasen el RAPD entre las cepas colombianas seobtuvo un porcentaje muy bajo, (13%), si setienen en cuenta los datos previos de 74% deDuarte et al. (30) y de 60% de Steindel et al. (13)para cepas brasileñas pertenecientes alzimodema ZI, hecho que igualmente destaca laelevada heterogeneidad de las cepascolombianas en comparación con cepas de otrospaíses.

Por otra parte, tal como se ha descrito para lamayoría de los genes repetidos en tándem detripanosomátidos, los ensayos de RFLP muestranque los genes codificantes para la histona H2Ade T. cruzi presentan polimorfismo en su secuenciade nucleótidos. Las variaciones encontradas secentran en las regiones intergénicas de las unidadesy, por tanto, no afectan el producto proteicocodificado. Adicionalmente, vale la pena resaltar lapresencia de bandas múltiplos de las unidades de1,2 y 0,7 kb en los patrones obtenidos con algunasde las enzimas, las cuales corresponden apolimorfismos entre las unidades dentro de unamisma cepa, variaciones intra-individuo quetambién han sido descritas en los genescodificantes para las histonas de eucariotessuperiores (37). Este elevado polimorfismo en lashistonas llama la atención, por cuanto estasproteínas se conservan altamente a lo largo dela escala evolutiva.

Finalmente, teniendo en cuenta que los genescodificantes para la histona H2A de T. cruzitambién varían en el número de copias relativasde las unidades, en la expresión y en laorganización cromosómica (40), se sugiere quela plasticidad de estos genes puede obedecer aun proceso evolutivo lento, en el cual se hanacumulado mutaciones puntuales al azar,combinado con rearreglos cromosomalesgruesos.

En conclusión, se confirma que las cepascolombianas de T. cruzi, aisladas de diferenteshospederos y regiones geográficas, son variantesgenotípicas que podrían estar relacionadas conel espectro de las presentaciones clínicas de laenfermedad de Chagas en Colombia. A esterespecto, es importante tener en cuenta losestudios de Andrade et al. (41) quienesencontraron que dos poblaciones del parásito,JG y Coll.7G2, con perfiles diferentes de lareacción en cadena de la polimerasa de bajaastringencia varían en su distribución tisular ypatogenicidad en ratones crónicamenteinfectados. Igualmente, de Lana et al. (42)informaron que los genotipos clonales de T.cruzidifieren significativamente en su infectividad enratones, demostrándose así, en los dos estudios,una asociación entre diversidad genotípica,tropismo y patogenicidad del parásito.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado parcialmente por elFondo para la Promoción de la Investigación y laTecnología del Banco de la República deColombia, contrato No. 960006.

Referencias

1. Organización Mundial de la Salud (OMS). Control dela enfermedad de Chagas. Informe de un Comité deExpertos. Serie de Informes Técnicos No.811. Ginebra:OMS; 1991.

2. Dvorak JA. The natural heterogeneity of Trypanosomacruzi: biological and medical implications. J Cell Biochem1984;24:357-71.

3. Miles MA, Lanham SM, de Souza AA, Povoa M.Further enzymatic characters of Trypanosoma cruzi andtheir evaluation for strain identification. Trans R Soc TropMed Hyg 1980;74:221-7.

4. Tanowitz HB, Kirchhoff LV, Simon D, Morris SA,Weiss LM, Withner M. Chagas disease. Clin MicrobiolRev 1992;5:400-9.

5. Rosas F. Cardiomiopatía de Chagas en Colombia. En:Vallejo GA, Carranza JC, Jaramillo JC, editores.Memorias del Curso Taller Internacional de Biología,Epidemiología y Control de la TripanosomiosisAmericana y Leishmaniosis. Ibagué: LITO-Ediciones;2000. p.11-8.

6. Henriksson J, Pettersson U, Solari A. Trypanosomacruzi: correlation between karyotype variability andisoenzyme classification. Exp Parasitol 1993;77:334-8.

269


7. Miles MA. The epidemioloy of South Americantrypanosomiasis: biochemical and immunologicalapproaches and their relevance to control. Trans R SocTrop Med Hyg 1983;77:5-23.

8. Tibayrenc M, Ayala FJ. Isozyme variability inTrypanosoma cruzi, the agent of Chagas' disease:genetical, taxonomical and epidemiological significance.Evolution 1988;42:277-92.

9. Alves AM, De Almeida DF, von Kruger WM. Changesin Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA minicirclesinduced by environmental conditions and subcloning. JEukaryot Microbiol 1994;41:415-9.

10. Avila H, Goncalves AM, Nehme NS, Morel CM,Simpson L. Schizodeme analysis of Trypanosoma cruzistocks from South and Central America by analysis ofPCR-amplified minicircle variable region sequences. MolBiochem Parasitol 1990;42:175-88.

11. Wagner W, So M. Genomic variation of Trypanosomacruzi: involvement of multicopy genes. Infect Immun1990;58:3217-24.

12. Dos Santos WG, Buck GA. Polymorphisms at thetopoisomerase II gene locus provide more evidence forthe partition of Trypanosoma cruzi into two major groups.J Eukaryot Microbiol 1999;46:17-23.

13. Steindel M, Dias Neto E, de Menezes CL, RomanhaAJ, Simpson AJ. Random amplified polymorhic DNAanalysis of Trypanosoma cruzi strains. Mol BiochemParasitol 1993;60:71-9.

14. Tibayrenc M, Neubauer K, Barnabe C, Guerrini F,Skarecky D, Ayala FJ. Genetic characterization of sixparasitic protozoa: parity between random-primer DNAtyping and multilocus enzyme electrophoresis. Proc NatlAcad Sci USA 1993;90:1335-9.

15. Rodríguez P, Montilla M, Nicholls RS, Zarante I,Puerta C. Isoenzymatic characterization of Colombianstrains of Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz1998;93:739-40.

16. Silva LH, Nussensweig V. Sobre uma cepa altamentevirulenta para o camundongo branco. Folia Clin Biol1953;20:191-207.

17. Escalante M, Montilla M, Nicholls RS, Del Portillo P,Puerta CJ. Extracción de ADN de Trypanosoma cruzimediante tratamiento con bromuro de hexadecil-trimetil-amonio. Biomédica 1997;17:120-5.

18. Sambroock J, Maniatis T, Fritsch E. Molecular cloning.A laboratory manual. Second edition. New York (NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. p:6.2-6.19.

19. Stevens JR, Tibayrenc M. Detection of linkagedisequilibrium in Trypanosoma brucei isolated fromtsetse flies and characterized by RAPD analysis andisoenzymes. Parasitol 1995;110:181-6.

20. Gonzalez A, Lerner TJ, Huecas M, Sosa Pineda B,Nogueira N, Lizardi PM. Apparent generations of a

segmented mRNA from two separate tandem genefamilies in Trypanosoma cruzi. Nucleic Acids Res1985;13:5789-804.

21. Southern EM. Detection of specific sequences amongDNA fragments separated by gel electrophoresis. J MolBiol 1975;98:503-7.

22. Puerta C, Martin J, Alonso C, López MC. Isolationand characterization of the gene encoding histone H2Afrom Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 1994;64:1-10.

23. Jaccard P. Nouvelles recherches sur la distributionflorale. Bull Soc Vaudoise Sci Nat 1908;44:223-70.

24. Sokal RR, Sneath, PH. Principles of numericaltaxonomy. San Francisco (CA): W.H. Freeman andCompany; 1973. p.537.

25. Saravia NG, Holguin AF, Cibulskis RE, D´AlessandroA. Divergent isoenzyme profiles of sylvatic anddomiciliary Trypanosoma cruzi in the Eastern plains,piedmont, and highlands of Colombia. Am J Trop MedHyg 1987;36:59-69.

26. Marquez E, Arcos-Burgos M, Triana O, Moreno J,Jaramillo N. Clonal population structure of Colombiansylvatic Trypanosoma cruzi. J Parasitol 1998;84:1143-9.

27. Ruiz M, Montilla M, Nicholls RS, Angarita L, AlvarezD. Genetic relationships and spatial genetic structureamong clonal stocks of Trypanosoma cruzi in Colombia.Heredity 2000;85:318-27.

28. Martínez-Diaz RA, Escario JA, Nogal-Ruiz JJ, Gomez-Barrio A. Relationship between biological behaviour andrandomly amplified polymorphic DNA profiles ofTrypanosoma cruzi strains. Mem Inst Osw Cruz2001;96:251-6.

29. Carrasco HJ, Frame IA, Valente SA, Miles MA. Geneticexchange as a possible source of genomic diversity insylvatic populations of Trypanosoma cruzi. Am J TropMed Hyg 1996;54:418-24.

30. Duarte C, Fonseca SM, Penna I, Percival L, VidigalPG, Steindel M, et al. Characterization of Trypanosomacruzi strains isolated from chronic chagasic patients,triatomines and opossums naturally infected from theState of Rio Grande do Sul, Brazil. Mem Inst OswaldoCruz 1997;92:343-51.

31. Murta SMF, Gazzinelli RT, Brener Z, Romanha AJ.Molecular characterization of susceptible and naturallyresistant strains of Trypanosoma cruzi to benznidazoleand nifurtimox. Mol Biochem Parasitol 1998;93:203-14.

32. Brisse S, Dujardin JC, Tibayrenc M. Identification ofsix Trypanosoma cruzi l ineages by sequence-characterized amplified region markers. Mol BiochemParasitol 2000;111:95-105.

33. Bosseno MF, Barnabe C, Magallon E, Lozano F,Ramsey J, Espinoza B, et al. Predominance of

270


Trypanosoma cruzi lineage I en Mexico. J Clin Microbiol2002;40:627-32.

34. De Luca-D'Oro GM, Gardenal CN, Perret B, CrisciJV, Montamat EE. Genetic structure of Trypanosomacruzi populations from Argentina estimated from enzymepolymorphism. Parasitology 1993;107:405-10.

35. Borges EC, Romanha AJ, Diotaiuti L. Use of randomamplified polymorphic DNA (RAPD) in the populationalstudy of Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Cad SaúdePublica 2000;16:97-100.

36. Jaramillo C, Montana MF, Castro LR, Vallejo GA,Guhl F. Differentiation and genetic analysis of Rhodniusprolixus and Rhodnius colombiensis by rDNA and RAPDamplification. Mem Inst Osw Cruz 2001;96:1043-8.

37. Maxson R, Cohn R, Kedes L, Mohun T. Expressionand organization of histone genes. Ann Rev Genet1983;17:239-77.

38. Alves AM, Tanuri A, De Almeida DF, von Kruger WM.Reversible changes in the isoenzyme electro-phoretic

mobility pattern and infectivity in clones of Trypanosomacruzi. Exp Parasitol 1993;77:246-53.

39. Stothard JR, Frame IA, Miles MA. Genetic diversityand genetic exchange in Trypanosoma cruzi: Dual drug-resistant "progeny" from episomal transformants. MemInst Osw Cruz 1999;94:189-93.

40. Thomas MC, Olivares M, Escalante M, Marañon C,Montilla M, Nicholls S, et al. Plasticity of the histoneH2A genes in a Brazilian and six Colombian strains ofTrypanosoma cruzi. Acta Trop 2000;75:203-10.

41. Andrade LO, Machado CR, Chiari E, Pena SD, MacedoAM. Differential tissue distribution of diverse clones ofTrypanosoma cruzi in infected mice. Mol BiochemParasitol 1999;100:163-72.

42. de Lana M, da Silveira Pinto A, Bastrenta B, BarnabeC, Noel S, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: infectivityof clonal genotype infections in acute and chronic phasesin mice. Exp Parasitol 2000;96:61-6.

271

272

ARTÍCULO ORIGINAL

Biomédica 2002;22:272-9HIDALGO M., REALPE M.E., MUÑOZ N., SICARD D., et al

Brote de enfermedad diarreica aguda causado porShigella flexneri en una escuela de Madrid, Cundinamarca:caracterización fenotípica y genotípica de los aislamientos

Marylin Hidalgo 1, María Elena Realpe 1, Nélida Muñoz 1, Diego Sicard 2, Esperanza Silva 3,Clara Inés Agudelo 1, Elizabeth Castañeda 1

1 Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Instituto del Seguro Social, Madrid, Cundinamarca, Colombia.3 Laboratorio de Salud Pública de Cundinamarca, Bogotá, D.C., Colombia.

La shigelosis es una enfermedad diarreica aguda (EDA) que causa alta morbimortalidad enpaíses en vías de desarrollo. En 1997, el Grupo de Microbiología inició un programa en red conlos Laboratorios de Salud Pública (LSP) del país para la vigilancia de los principales patógenoscausantes de la EDA. Como actividad de este programa, en mayo de 2001, el LSP deCundinamarca estudió e informó un brote de intoxicación alimentaria en una comunidad escolaren Madrid. El objetivo de este estudio fue caracterizar con técnicas fenotípicas y genotípicaslos aislamientos recuperados en el brote, con el fin de establecer la relación clonal entre ellos.Se realizaron coprocultivos en 22 de 195 individuos afectados; los aislamientos se identificaronbioquímica y serológicamente y se determinó el patrón de susceptibilidad antimicrobiana acloranfenicol, trimetoprim-sulfametoxasol (SXT), tetraciclina, cefotaxima, gentamicina, ampicilinay ciprofloxacina. Se realizó electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) según la metodologíadescrita por los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de Atlanta, con el empleo dela enzima de restricción XbaI y se utilizó como cepa control Shigella sonnei CDC F2353 y comomarcador de peso molecular el fago lambda. En 15 (68,2%) pacientes se identificó Shigellaflexneri serotipo 6, biotipo Newcastle, con patrón de resistencia a cloranfenicol, SXT y tetraciclina.La PFGE reveló que 3 (20%) aislamientos fueron idénticos (distancia genética de 100%) y los12 (80%) restantes estuvieron estrechamente relacionados (distancia genética de 86 a 100%).El sistema de vigilancia en red con los LSP permitió recuperar los aislamientos y los estudiosfenotípicos y genotípicos permitieron establecer la relación clonal de los aislamientosinvolucrados en el brote.

Palabras clave: intoxicación alimentaria, shigelosis, brote de EDA, PFGE, relación clonal.

Outbreak of acute diarrhoeal disease caused by Shigella flexneri : phenotypic and genotypiccharacteristics of the isolates

Shigellosis is an acute diarrhoeal disease that is the main cause of morbidity and mortality indeveloping countries. In 1997, the Colombian Instituto Nacional de Salud Microbiology Grouporganized a network surveillance program with the country's Public Health Laboratories (PHLs)to monitor the principal etiological agents responsible for acute diarrhoeal disease. In May,2001, the PHL of the state of Cundinamarca reported a food poisoning outbreak involving anelementary school community. The main goal of the Microbiology Group involvement was toestablish the molecular relationships among the isolates from the outbreak by phenotypic andgenotypic methods of characterization. Stool cultures were obtained from 22 of 195 affectedindividuals. The Microbiology Group confirmed the identification of the isolates by biochemicaland serological probes. The antimicrobial susceptibilities were tested against the following batteryof antibiotics: chloramphenicol, trimehoprim-sulfamethozazole, cefotaxime, gentamicin, ampicilinand ciprofloxacin. The isolates were subjected to pulsed field gel electrophoresis (PFGE) usingthe following CDC (U.S. Centers for Disease Control) protocols: XbaI restriction enzyme, Shigellasonnei CDC F2353 as the reference standard, and lambda phage as a molecular weight marker.

Biomédica 2002;22:272-9 BROTE DE EDA POR SHIGELLA FLEXNERI

In 15 of 22 (68%) stool cultures Shigella was recovered, all isolates were identified as Shigellaflexneri serotype 6 biotype Newcastle with the same antimicrobial susceptibility profile. PFGEshowed that 3 (20%) isolates were identical (100% genetic similarity) and the other 12 (80%)were very closely related (genetic similarity between 86-98%). The network system permittedthe INS ready access to the isolates and the implementation of the PFGE permitted a quantitativecharacterization of the clonal relationship among the isolates from the outbreak.

Key words: Shigella, PFGE, outbreak, molecular epidemiology, food poisoning.

La shigelosis es una enfermedad diarreica aguda,de tipo inflamatorio, ocasionada por Shigella sp.;es considerada como una de las principalescausas de morbilidad y mortalidad en niños condiarrea en países en vía en desarrollo (1,2).Según la Organización Mundial de la Salud, elnúmero anual de episodios de infección porShigella sp. que se producen en todo el mundose estima en 164,7 millones de casos, 163,2(99,1%) en países en desarrollo y 1,5 (0,9%) enlos países desarrollados (1). La mortalidad totalasociada con Shigella en los países en desarrollose estima en 1,3 millones. De estos episodios, el69% ocurren en niños menores de cinco años yconstituyen el 61% de todas las defunciones enese grupo de edad (1).

La shigelosis se caracteriza por la presencia dediarrea acuosa sanguinolenta, acompañada defiebre y calambres abdominales y puedeprogresar a una disentería clásica con heces quecontienen sangre, moco y pus (2). Los alimentoso el agua contaminadas con la bacteriaconstituyen el principal factor de riesgo paraadquirir la infección; adicionalmente, elhacinamiento y las pobres condiciones de higienepermiten la transmisión de persona a persona y,por tanto, la mayor posibilidad de diseminación(2,3).

Con base en los antígenos somáticos en elgénero Shigella, se han descrito 49 serotipos ycuatro serogrupos: el serogrupo A (S.dysenteriae), el B (S. flexneri), el C (S. boydii) yel D (S. sonnei) (4). Los cuatro serogrupos deShigella sp. pueden causar enfermedad, ya seacomo casos esporádicos o en brotes (2,3,5).

Correspondencia:Marylin Hidalgo, Grupo de Microbiología, Instituto Nacionalde Salud, Avenida Calle 26 #51-60, Bogotá, D.C., Colombia;teléfono 220 7700, extensión 445; [email protected]


Son pocos los datos publicados sobre laprevalencia de Shigella como agente causal deEDA en Colombia; en un estudio realizado en elValle del Cauca por Newell y colaboradores en1976, se informó una positividad del 1,3% en 837coprocultivos realizados; de las 11 Shigella spp.aisladas, 45,6% fueron S. boydii; 27,2%, S.flexneri y 27,2% otros serogrupos (6). En otroestudio realizado en Antioquia, de 1993 a 1996,se encontró una positividad de 2,7% en 874muestras de pacientes con EDA (7); sin embargo,no se determinó el serogrupo. Recientemente,los datos obtenidos de 1997 a 2001 en elprograma de vigilancia por el laboratorio de losserogrupos y susceptibilidad antimicrobiana delos patógenos causantes de EDA que realiza elGrupo de Microbiología con los Laboratorios deSalud Pública del país (LSP), señalan que de 560aislamientos de Shigella sp. 55% son S. flexneri;40%, S. sonnei; 0,8%, S. dysenteriae; 3,2%, S.boydii, y 1% no serotipificables. El 60,3% de estosaislamientos se han recuperado de niñosmenores de 5 años (8,9).

Para la vigilancia de estos patógenos y,especialmente, para el estudio de los brotesepidémicos es necesario emplear una serie demarcadores fenotípicos como lo son el biotipo, elserotipo y el antibiotipo, entre otros (10). Noobstante, estas técnicas adolecen de limitacionespor lo que es necesario interpretar con prudenciasus resultados. Recientemente, la aplicación delas técnicas de biología molecular, con las cualesse estudia directamente el ADN, ha permitidocomplementar el conocimiento de laepidemiología de las enfermedades infecciosas(10,11 ).

En este artículo se describe un brote por Shigellaflexneri que se presentó en mayo de 2001 en unacomunidad escolar, el cual afectó una parteconsiderable de la población expuesta. El objetivo

273

HIDALGO M., REALPE M.E., MUÑOZ N., SICARD D., et al Biomédica 2002;22:272-9

de este trabajo fue caracterizar por técnicasfenotípicas y genotípicas los aislamientosrecuperados de los pacientes que sufrieron laintoxicación, con el fin de establecer si existíauna relación clonal entre ellos.


Lugar: el 24 de mayo de 2001 se presentó unaintoxicación alimentaria en una concentraciónescolar del municipio de Madrid, Cundinamarca,12 horas después de que el personal recibióalimentos en el restaurante de la concentración.

La concentración tiene dos jornadas académicas,una en la mañana a la cual asisten 350 alumnosy una en la tarde con 230 alumnos; además,cuenta con 22 docentes, 1 ecónoma y 2 auxiliaresde cocina para un total de 605 personas.

Estudios clínicos, microbiológicos y epidemio-lógicos: de acuerdo con el informe suministradopor la Oficina de Epidemiología de la Secretaríade Salud de Cundinamarca, las personasafectadas fueron atendidas y tratadas en elHospital Santa Matilde, en el centro de AtenciónAmbulatorio del Seguro Social y en el Centro deSalud de El Sosiego de la Secretaría de Saludde Madrid, donde se les realizó una evaluaciónclínica.

Se llevó a cabo una visita al restaurante escolary a los establecimientos donde se adquirieron losalimentos. Se tomó una muestra de agua de unode los grifos de la concentración y 4 salchichasde un paquete de 2,5 libras suministrado por elproveedor, las cuales se enviaron al LSP deCundinamarca para hacer el estudio decoliformes y enteropatógenos.

Por otra parte, se indagó acerca de la dieta y seobtuvieron datos demográficos que incluyeronedad y género; se evaluaron los procedimientosde limpieza del restaurante de la concentraciónescolar. Además, se realizaron visitas a losestablecimientos en donde fueron adquiridos losalimentos.

En 195 pacientes se realizó un examencoprológico; de 22 (11,3%) se obtuvo unamuestra de materia fecal para coprocultivo. Lasmuestras fueron procesadas por el LSP de

Cundinamarca donde se realizaron losprocedimientos de identificación inicial.

Los 15 aislamientos obtenidos de los copro-cultivos, identificados como Shigella sp. fueronenviados al Grupo de Microbiología del INS paraconfirmación, serotipificación y determinación dela susceptibilidad antimicrobiana.

La confirmación se realizó con las técnicasbioquímicas estandarizadas; la serotipificación sehizo por aglutinación en lámina con antisuerosde grupo y de serotipo (Difco) (4,5,13); lasusceptibilidad antimicrobiana se determinó porel método de Kirby-Bauer a ampicilina (10 µg),cloranfenicol (30 µg), trimetoprim-sulfametoxasolSXT (1,25/23,75 µg), tetraciclina (30 µg),ciprofloxacina (5 µg), gentamicina (10 µg),cefotaxima (30 µg) y ácido nalidíxico (30 µg),(Becton Dickinson, USA); se utilizaron losparámetros de lectura e interpretación de laNCCLS (14).

PFGE: se realizó con el procedimientoestandarizado en el CDC en el programa devigilancia de las enfermedades ocasionadas poringestión de alimentos contaminados, el cual esconocida como PulseNet, The National MolecularSubtyping Network for Foodborne DiseaseSurveillance (15,16). Las colonias se obtuvieronde un cultivo de 18 horas en agar Luria Bertani(LB) y se suspendieron en solución tamponada(Tris 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8,0) hastaobtener una lectura de 1,3-1,4 DO a una longitudde onda de 610 nm. Para la elaboración de losdiscos, la suspensión celular se mezcló conagarosa de bajo punto de fusión (Bio-Rad) y 0,5mg/ml de proteinasa K (Boehringer Manheim).Posterior-mente, los discos se sometieron a lisiscelular en una solución tamponada (Tris 50 mM,EDTA 50 mM, pH 8,0, sarcosil 1%, proteinasa Ka 0,1 mg/ml) a 54 °C en un baño de María conagitación constante a 200 rpm por un período de2 horas, después se realizaron 5 lavados con TE(Tris 10 mM, EDTA 1 mM) a 50 °C por 15 minutoscada lavado. Para la digestión in situ del ADNcromosómico de Shigella embebido en la agarosase utilizó la enzima de restricción XbaI (Promega).Para la realización del gel se utilizó agarosa 1%p/v (PFGE-grade, Bio-Rad). La electroforesis se

274

BROTE DE EDA POR SHIGELLA FLEXNERIBiomédica 2002;22:272-9

realizó en el equipo CHEF DR II (BioRad) con untiempo inicial de 2,2 s, tiempo final 54,2 s, voltaje6 V/cm, tiempo de corrido 22 h a 14 °C. Comomarcador de peso molecular se empleó el fagolambda (Biolabs, New England).

Después de la electroforesis el gel se tiñó conbromuro de etidio (1 µg/ml) por 30 minutos. ElADN se visualizó en un transiluminador con luzUV y se tomó la foto (Polaroid).

Los patrones de ADN generados por la PFGE seanalizaron por dos criterios que incluyeron lavisualización del número y la posición de lasbandas y la interpretación según el criterio deTenover et al. (17). Este permite agrupar losaislamientos en indistinguibles, cuando el númeroy la ubicación de las bandas en la electroforesises igual, lo que indica que no existen diferenciasgenéticas entre ellos; estrechamente rela-cionados, cuando se presentan 2-3 bandasdiferentes lo que señala 1 diferencia genética;posiblemente relacionados, cuando haydiferencias en 4-6 bandas lo que señala laexistencia de dos diferencias genéticas yaislamientos diferentes cuando existen 7 o másbandas de diferencia entre los aislamientos lo queindica la existencia de 3 o más eventos genéticosdiferentes (17). El segundo criterio se realizó conel programa diversidad en las bases de datos(Diversity database, Bio-Rad-Laboratories). Lacorrelación entre las bandas se llevó a caboteniendo en cuenta únicamente su posición(coeficiente de Dice) y el árbol filogenético fueobtenido por Unweighted Pair Group Method(UPGMA) (18). En el dendograma se consideró,que los aislamientos que presentaban unasimilitud de 100% eran idénticos; de 85%estrechamente relacionados; entre 75-84%probablemente relacionados, y ≤75%, diferentes.

Se incluyeron para la PFGE, 5 aislamientos deS. flexneri recuperados de coprocultivos (INS Shf-321, Shf-323, Shf-248, Shf-260 y Shf-275), conel mismo patrón de serotipificación ysusceptibilidad antimicrobiana, con el fin deobservar si existía relación genética entre ellos ycon los aislamientos del brote. Cuatro de estosaislamientos fueron recuperados en Bogotá, dosde ellos (Shf-321, Shf-323) en el 2001, los dosrestantes (Shf-260 y Shf-275) en el 2000; el

aislamiento Shf-248 se recuperó en Medellín en2000. Tres de los aislamientos fueronrecuperados de niños menores de 3 años deedad, el cuarto de un paciente de 20 años y delaislamiento restante no se tenía dato de edad.Se empleó como cepa de referencia S. sonneiF2353 CDC, gentilmente enviada por E. Ribot delCDC.

Resultados

De las 605 personas que ingirieron alimentos enel restaurante escolar, se enfermaron 195, lo querepresentó una tasa de ataque de 32,2%. Todoslos pacientes presentaron un cuadro clínico consíntomas comunes como vómito, diarrea, fiebreno cuantificada, escasa tolerancia a la vía oral ydolor abdominal de 12 horas de evolución.

Una vez establecido el diagnóstico clínico, todoslos pacientes fueron tratados con sales derehidratación, trimetoprim-sulfa y acetaminofén.Se procedió al manejo de la comunidad, coneducación a los padres de familia para loscuidados en caso de deshidratación y seestableció una vigilancia epidemiológica continua.

Ninguno de los 195 niños afectados requirióhospitalización, los casos agudos fueronmanejados en las salas de observación de cadauno de los centros de atención y no se registróninguna complicación en ellos.

Los 15 aislamientos se confirmaron bioquímica-mente como Shigella sp. y al realizar laserotipificación y la biotipificación, se establecióque todos eran S. flexneri serotipo 6, biotipoNewcastle; todos mostraron el mismo patrón deresistencia a cloranfenicol, SXT y tetraciclina ysensibilidad a ciprofloxacina, cefotaxima, ácidonalidíxico, gentamicina y ampicilina. Los 15aislamientos fueron codificados por el Grupo deMicrobiología como INS-Shf 324 a INS-Shf 337e INS-Shf 340.

La muestra de agua fue negativa para coliformestotales y enteropatógenos y en las salchichas serecuperó Escherichia coli.

En la investigación epidemiológica se encontróque la dieta suministrada el día antes de laintoxicación fue torta de habichuelas con pollo,salchicha y zanahoria, papa, arroz blanco y aguade panela.

275


Figura 1. PFGE de Shigella flexneri digerido con la enzima XbaI. Carriles 1 y 24: marcador de peso molecular, fagolambda; carriles 2 y 23: cepa de referencia CDC SF2353; carriles 3-17: aislamientos INS Sh-340, INS Shf-324-INS Shf 337(aislamientos relacionados con el brote); carriles 18-23 INS Shf-321, INS Shf-323, INS Shf-248, INS Shf-260 y INS Shf-275 (aislamientos no relacionados).

Se obtuvieron datos demográficos, edad ygénero, únicamente de los 15 pacientes a quienesse les aisló Shigella sp. De estos 15 pacientes, 6(40%) tenían entre 5-8 años de edad y 9 (60%)entre 9-12 años; 12 (80%) pacientes eran delgénero masculino y 3 (20%) del femenino.

En el restaurante se encontró que la limpieza delos utensilios se realizaba con agua filtrada y elaseo con hipoclorito de sodio (Clorox) y con undetergente a base de carbonato y silicato(Axión). Los tanques de almacenamiento delagua están al alcance de los niños y no seencuentran tapados. Hay dos vendedores decomestibles, uno que atiende la jornada de lamañana y el otro la de la tarde, pero no sepudieron entrevistar.

En la visita realizada a uno de losestablecimientos donde se obtuvieron los

alimentos (expendio de salchichas) no se logróidentificar el lote del producto ni su marca y, enel otro (el expendio del pollo), de acuerdo con lainformación suministrada por la ecónoma de laconcentración, por la alarma ocasionada en elbarrio donde estaba ubicada la concentraciónescolar, realizaron limpieza del refrigerador ycolocaron un producto fresco, de un lote diferenteal que había estado implicado en el brote.

La digestión enzimática del ADN de los 15aislamientos del brote y de los 5 no relacionadosgeneró 17 bandas por PFGE que oscilaron ensus pesos moleculares entre 48,5 y 727,5 kb; deacuerdo con los criterios de Tenover, los 15 aisla-mientos del brote fueron indistinguibles (figura 1). Deigual manera, 2 de los aislamientos de Bogotá(Shf-260 y Shf-275) y 1 de Medellín (Shf-248),recuperados en el 2000, fueron indistinguibles delos aislamientos del brote. Los 2 aislamientos

276


restantes, recuperados en el 2001 seconsideraron como diferentes ya que poseíandiferencias en más de 7 bandas.

El análisis del dendograma y de la similitudgenética reveló que 3 (20%) aislamientos delbrote fueron idénticos (similitud genética, 100%)y 12 (80%) estuvieron estrechamenterelacionados (similitud genética entre 86-97%).Tres de los aislamientos (Shf-248, Shf-260, Shf-275) no relacionados con el brote tambiénpresentaron una estrecha relación (similitudgenética, 86-97%). Los dos aislamientosrestantes (Shf-321 y Shf-323) no estabanrelacionados ya que el análisis reveló unasimilitud menor del 75% (figura 2).

Discusión

Los sistemas de vigilancia en red permitenconocer los serotipos y patrones de suscepti-bilidad más frecuentes de los enteropatógenos yla introducción de técnicas de biología molecularcomplementa esta información al establecer larelación clonal de los aislamientos involucradosen brotes (13).

Los aislamientos analizados en este trabajofueron identificados en el programa de vigilancia,lo cual demuestra la utilidad de estos sistemas

Figura 2. Dendograma obtenido del análisis de la PFGE de20 aislamientos de Shigella flexneri; 15 aislamientos (INSShf-340, INS Shf-324 a INS Shf-337), marcados con unasterisco*, fueron recuperados del brote; 5 aislamientos (INSShf323, INS Shf-323, INS Shf 248, INS Shf-248, INS Shf-260 e INS Shf-275) no estuvieron relacionados con el brotey la cepa control S. sonnei (CDC SF2353). Basado en elcoeficiente de Dice y construido por UPGMA (Diversity-Database Bio-Rad).

en red, ya que permiten detectar rápidamente losagentes relacionados con un brote.Adicionalmente, el programa de vigilancia en redha permitido establecer que S. flexneri es elprincipal serogrupo del género Shigella aisladoen nuestro país (8).

En Colombia, en 1997, el 50% de los egresoshospitalarios por EDA eran debidos a Salmonellaspp. y Shigella sp. lo cual concuerda con estudiosrealizados en Brasil en los que se informa comoel segundo agente etiológico causante deenfermedad diarreica aguda en niños mayoresde dos años, en un grupo de aislamientosobtenidos de 1994 a 1997 (19,20).

Las intoxicaciones alimentarias, como la descritaen este brote, ocasionadas por Shigella sp. sonmás comunes en la población que asiste aguarderías, comunidades militares o escuelas,debido a la facilidad de transmisión por losalimentos y el agua, ya que una baja dosis demicroorganismos (de 10 a 200 unidadesformadoras de colonias) es capaz de producir lainfección, aun más si las condiciones de higieneson deficientes y el control de los alimentos noes el óptimo; además, en niños, las deficienciasen los mecanismos de inmunidad intestinalcontribuyen a que sea una de las poblacionesmás afectadas (2,5,21-24).

En la literatura médica están descritos muchosbrotes ocasionados por S. sonnei, S. flexneri, S.dysenteriae 1 y en la mayoría de ellos estáimplicada la población infantil; en paísesindustrializados se ha observado que elserogrupo más frecuente es S. sonnei; encontraste, S. flexneri es el más frecuente enpaíses en vías de desarrollo, lo que indica queesta patología es de distribución mundial, perocausada por diferentes serogrupos. Todos losaislamientos de este brote correspondieron a S.flexneri, lo que concuerda con la literatura(2,4,5,8,9,23,25).

El objetivo de tipificar las bacterias implicadas enun brote es proporcionar al laboratorio y a losepidemiólogos la información sobre la relacióngenética de los aislamientos (26,27). La PFGEes considerada como la técnica de oro de losmétodos de tipificación molecular por su altopoder discriminatorio, buena reproducibilidad intra

277


e interlaboratorios, fácil interpretación y costomoderado (13). Con la adición de programascomputarizados y escáner de las imágenes esposible crear bancos de datos de patrones dePFGE para todos los microorganismos (13). LaPFGE se puede aplicar a pequeños grupos deaislamientos, preferiblemente menor o igual a 30,epidemio-lógicamente relacionados (26).También ha sido empleada para caracterizargeno-típicamente otras especies de Shigellacomo S. sonnei. En este estudio se confirmó elpoder discriminatorio de la técnica (26).

Algunos autores como Yuk-Fong Liu et al. (27),señalan como inconvenientes de la técnica eltiempo requerido para su ejecución y la dificultaden su realización (27). Cabe destacar que latécnica estandarizada por la red denominadaPulseNet liderada por el CDC y empleada en esteestudio no fue considerada como laboriosa nidispendiosa y se obtuvieron resultados en untiempo máximo de 24 horas. El objetivo de la redPulseNet es el de incrementar la vigilancia debrotes ocasionados por alimentos contaminados,identificar la fuente de la infección y establecerelectrónicamente la comparación de huellasgenómicas (15). Otros estudios han confirmadola utilidad de la PFGE no solamente con grupospequeños de aislamientos, sino en estudios devigilancia que involucran aislamientos de muchosaños, obteniendo excelentes resultados (10,27,28).

Aunque la investigación clínica, epidemiológicay de laboratorio clínico permitió estudiar este brotede EDA y determinar la clonalidad de su agenteetiológico, no se pudo identificar la fuente común,lo que no permitió caracterizarlo completamente.

Esto señala la necesidad de mejorar la calidaddel sistema de vigilancia de las enfermedadestransmitidas por alimentos, para que lasdiferentes áreas de los LSP trabajen en formacoordinada con la Oficina de Epidemiología delos Servicios de Salud Pública. Así se podráidentificar la causa de las intoxicaciones ydesarrollar planes de acción claros y consistentespara el manejo y control de este tipo de brotes y,además, proponer medidas adecuadas paraevitar futuros problemas de esta índole.

En resumen, la técnica de PFGE estandarizadaen el Grupo permitió establecer una relaciónepidemiológica y genética entre los aislamientosinvolucrados en un brote ocasionado por S.flexneri en una concentración escolar. Tambiénse logró establecer la clonalidad de losaislamientos de S. flexneri no vinculadosepidemiológicamente con el brote, lo que abrenuevas posibilidades de estudio para generarconocimiento sobre la circulación de clones deS. flexneri en nuestro medio.

Agradecimientos

Agradecemos especialmente a Efraín Ribot, jefedel laboratorio de desarrollo y validación demetodos de la red de electroforesis de campopulsado PulseNet, Sección de Enfermedades deIntoxicación Alimentaria y Diarrea de los Centersfor Disease Conrol and Prevention (CDC),Atlanta, por el envío de los protocolos de latécnica de PGFE, la cepa control y por susvaliosos comentarios.

Referencias

1. Kotloff KL, Winickoff JP, Ivanoff B, Clemens JD,Swerdlow DL, Sansonetti PJ et al. Global burden ofShigella infections: implications for vaccine developmentand implementation of control strategies. Bull WHO1999;77:651-66.

2. Benenson AS, editor. Shigellosis. En: Control ofcommunicable diseases in man. Fifteenth edition.Washington, D.C.: American Public Health Association;1990. p.391-4.

3. Posada B. Shigelosis. En: Restrepo A, Robledo J,Bedoya VI, Restrepo M, Botero D et al., editores.Fundamentos de medicina. Quinta edición. Medellín:CIB; 1996. p.430-2.

4. Cherly AB, Frances WB, Joy GW, Nancy AS.Escherichia, Shigella, and Salmonella. En: Murray PR,Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, editors.Manual of clinical microbiology. 7th. edition. Washington,D.C.: ASM Press; 1999. p.459-66.

5. Koneman EW, Allen SD, Janda WM,Schreckenberger PC, Winn WC Jr, editors. TheEnterobacteriaceae. En: Color atlas and textbook ofdiagnostic microbiology. 5th Edition. Philadelphia, PA:Lippincott Williams & Wilkins; 1997. p.171-241.

6. Newell KW, Dover AS, Clemmer DI, D'Alessandro A,Dueñas A, Gracián M, et al. Diarrheal diseases ofinfancy in Cali, Colombia: study design and summaryreport on isolated disease agents. Bull Pan Am HealthOrgan 1976;10:143-55.

278


7. Jaramillo E, Estrada S, Ospina S. Etiología de laenfermedad diarreica aguda (EDA) de origen bacteriano,utilizando un protocolo estandarizado de laboratorio.Infectio 1999;3:95-9.

8. Muñoz NE, Agudelo CI, Ovalle MV, Realpe ME.Vigilancia en red de los serotipos y la susceptibilidadantimicrobiana de Salmonella sp., Shigella sp. y Vibriocholerae 01, 1997-1999. Biomédica 2000;20:210-7.

9. Muñoz N, Agudelo CI, Realpe ME, Ovalle MV. Vigilanciaen red de la susceptibilidad antimicrobiana y de losserotipos de Salmonella spp., Shigella sp. y Vibriocholerae : informe de 2000-2001. Inf Quinc EpidemiolNac 2002;7:177-192.

10. Coll P. Interés de las técnicas de biología molecular enel estudio de las infecciones nososcomiales. EnfermInfecc Microbiol Clin 1994;12:369-71.

11. Chiou CS, Hsu WB, Wei HL, Chen JH. Molecularepidemiology of a Shigella flexneri outbreak in amountainous township in Taiwan, Republic of China. JClin Microbiol 2001;39:1048-56.

12. Ewing WH. Edward's and Ewing's identification ofEnterobacteriaceae. 4th. ed. New York, NY: ElsevierSciencie Publishing Co. Inc.; 1986.

13. Olive M, Bean P. Principles and applications of methodsfor DNA-based typing of microbial organisms. J ClinMicrobiol 1999;37:1661-9.

14. National Committee for Clinical LaboratoryStandards. Performance standards for antimicrobialtesting. Eighth informational supplement. NCCLSdocument M100. Wayne, PA: NCCLS; 2001.

15. Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV,CDC PulseNet task force. PulseNet: the molecularsubtyping network for foodborne bacterial diseasesurveillance, United States. Emerg Infect Dis2001;7:382-90.

16. Centers for Disease Control and Prevention.Standardized molecular subtyping of foodborne bacterialpathogens by pulsed field gel electrophoresis: a manual.Atlanta: National Center for Infectious Diseases; 1996(updated 2000).

17. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA,Murray BE, Persing DH, Swaminathan B. Interpreting

chromosomal DNA restriction patterns produced bypulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterialisolate typing. J Clin Microbiol 1995;33: 2233-9.

18. Hall BG. Phylogenetic trees made easy. A how-tomanual for molecular biologists. Sunderland, MA:Sinauer Associates, Inc.; 2001.

19. Cazentini MI, Nogueira S, Da Silva P, Capuano D,Errera MC, Fernandes S, et al. Etiology of acutediarrhea among children in Ribeirao Preto, SP, Brazil.Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2001;43:1-8.

20. Cáceres DC, Acosta J. Evaluación de la situación decólera en Colombia. Inf Quinc Epidemiol Nac 1998;4:18.

21. Sack RB, Rahman M, Yunus M, Khan EH. Antimicrobialresistance in organisms causing diarrheal disease. ClinInfect Dis 1997;24(Suppl. 1):102-5.

22. Tuttle J, Thomas KW, Tauxe RV. Shigellosis: treatmentand prevention in native American communities. TheProvider. Indian Health Service 1992;17:117-8.

23. DuPont HL, Levine MM, Hornick RB, Formal SB.Inoculum size in shigellosis and implications for expectedmode of transmission. J Infect Dis 1989;159: 1126-8.

24. Trevejo RT, Abbott SL, Wolfe MI, Meshulam J, YongD, Flores JR. An untypeable Shigella flexneri strainassociated with an outbreak in California. J Clin Microbiol1999;37:2352-3.

25. Morera MA, Espejo E, Coll P, Simón M, Uriz MS,Llovet T, et al. Epidemic outbreak of shigellosis followingwater intake. Enfer Infect Microbiol Clin 1995;13:160-5.

26. Yuk-Fong P, Lau YJ, Hu BS, Shyr JM, Shi ZY, TsaiWS et al. Analysis of clonal relationships among isolatesof Shigella sonnei by different molecular typing meth-ods. J Clin Microbiol 1995;33:1779-83.

27. Lima AAM, Sidrim JJC, Lima NL, Titlow W, EvansME, Greenberg RN. Molecular epidemiology of multipleantibiotic-resistant Shigella flexneri in Fortaleza, Brazil.J Clin Microbiol 1997;35:1061-5.

28. Houang ETS, Chu YW, NG TK, Cheng FB. Study ofthe relatedness of isolates of Shigella flexneri andShigella sonnei obtained in 1986 and 1987 and in 1994and 1995 from Hong Kong. J Clin Microbiol 1998;36:2404-7.

279

PRESENTACIÓN DE CASOS

Biomédica 2002;22:280-6

Insuficiencia suprarrenal secundaria a paracoccidioidomicosisJosé M. Oñate 1, Angela María Tobón 2, Angela Restrepo 2

1 Universidad del Valle, Cali, Colombia.2 Grupo de Micología Médica, Corporación para Investigaciones Biológicas, Medellín, Colombia.

La paracoccidioidomicosis se asocia en 10 a 15% de los casos con insuficiencia suprarrenal e,inclusive, puede ser la primera manifestación de la enfermedad. Para determinar la frecuenciade la anterior relación en nuestro medio, se revisó el archivo de historias clínicas del Serviciode Micología de la Corporación para Investigaciones Biológicas y se encontró que de 207pacientes con diagnóstico de paracoccidioidomicosis, 6 (2,9%) presentaban insuficienciasuprarrenal. Los pacientes eran del sexo masculino con una edad promedio de 67,2 años (rango:48-75) y la mayoría eran agricultores. El tiempo promedio de duración de los síntomasrelacionados con la insuficiencia fue de 4,1 meses (rango: 2-6). Todos los pacientes habíanperdido peso, tenían adinamia y, además, radiología pulmonar anormal. El tratamiento conitraconazol, prednisolona y fluorocortisona resultó en mejoría clínica y en disminución de lostítulos de anticuerpos contra Paracocidioides brasiliensis. Puesto que se ha demostrado quelas alteraciones morfológicas y funcionales de las glándulas suprarrenales pueden desaparecersi se inicia prontamente el tratamiento, sería de vital importancia detectar precozmente elhipoadrenalismo en pacientes provenientes de áreas endémicas para esta micosis y, de talmanera, evitar daños mayores y acortar el tratamiento esteroideo en los pacientes afectados.

Palabras clave: paracoccidioidomicosis, P. brasiliensis, suprarrenales, enfermedad de Addison,cortisol, itraconazol.

Secondary adrenal insufficiency associated with paracoccidioidomycosis

Paracoccidioidomycosis is regularly associated with adrenal insufficiency in 10-15% ofsymptomatic cases, and in some instances, diagnosis of the mycosis precedes the adrenalmanifestation. To establish the frequency of this association, records were reviewed of 207cases diagnosed with mycosis at the Mycology Service of the Corporación para InvestigacionesBiológicas. Six cases (2.9%) were found to have adrenal insufficiency. Patients were all maleswith a mean age of 67.2 years (range 48-75) and most worked in agriculture. The duration of thesymptoms of adrenal damage was 4.1 months (range 2-6). All patients experienced weight lossand malaise; all had abnormal lung X-rays. Major clinical improvement was recorded after initiationof the specific treatments consisting of itraconazole, prednisolone and fluorcortisone. Diminishedantibody titers against Paracoccidioides brasiliensis were also recorded after treatment. Prompttreatment re-established adrenal function and effected recovery of normal gland morphology.Consequently, early detection of hypoadrenalism in patients living in the endemic areas isnecessary to avoid further adrenal damage and permits a shorter hormonal treatment period inpatients afflicted by the mycosis.

Key words: Paracoccidioidomycosis, P. brasiliensis, adrenal glands, Addison's disease, cortisol,itraconazole.

En 1855, Thomas Addison describió carac-terísticas clínicas comunes consistentes enadinamia, anemia, marcada 'debilidad cardíaca',irritabilidad gastrointestinal y un peculiar cambiode pigmentación de la piel en 11 pacientes con

Correspondencia:José M. Oñate: Carrera 72 A # 78 B-141, Barrio Robledo,Medellín, Colombia; teléfono (4) 441 0855; fax: (4) 441 [email protected]


280

PARACOCCIDIOIDOMICOSIS E INSUFICIENCIA SUPRARRENALBiomédica 2002;22:280-6

tuberculosis suprarrenal bilateral y con carcinomametastásico en las glándulas suprarrenales (1-2).

Actualmente, la prevalencia de la enfermedad deAddison se calcula en 117 casos por millón,siendo la etiología autoinmune la causa másfrecuente y la que explica el 90% de los casos(1). Una proporción menor de casos se atribuyea enfermedades infecciosas, especialmente a latuberculosis, cuyo diagnóstico se debeconsiderar aun en los países desarrollados (2).En Sur-américa, donde la incidencia de paracoc-cidioidomicosis es alta y su agente causalmuestra marcado tropismo por el tejidosuprarrenal, esta micosis representa otra causaimportante de insuficiencia suprarrenal (3-5). Enefecto, las glándulas suprarrenales son el cuartoórgano afectado después del pulmón, el sistemalinfático y los tegumentos (4).

La paracoccidioidomicosis tiene una mayorrepresentación en el sexo masculino, es pocofrecuente en niños y el 70% de los pacientesafectados tiene como antecedente las labores decampo (5-7). La infección y la enfermedad hansido reconocidas como formas diferentes de lamicosis. La primera ocurre en aquellos individuosque han tenido contacto previo con el hongo deacuerdo con una prueba cutánea positiva a laparacoccidioidina, pero que no presentanmanifestaciones clínicas; en cambio, laenfermedad es sintomática y se agrupa en formajuvenil y forma crónica del adulto (5-7). Deacuerdo con el número de órganos afectados,esta última se subdivide en unifocal y multifocal.La afección pulmonar puede pasardesapercibida, pero la radiografía de tórax esanormal en la mayoría de los pacientes; además,el diagnóstico micológico puede comprobarse porKOH, cultivos o pruebas inmunológicas, las queson altamente sensibles (5-7).

Se presentan a continuación los datos clínicosrelevantes de varios pacientes con paracoc-cidioidomicosis e insuficiencia suprarrenal.

Descripción de casos

Se revisaron las historias existentes en losarchivos de la Corporación para InvestigacionesBiológicas, CIB, correspondientes a 207pacientes con paracoccidioidomicosis. Se

encontró que 6 (2,9%) correspondían a pacientesque presentaban simultáneamente insuficienciasuprarrenal y cuyo diagnóstico se comprobó porpruebas micológicas, endocrinas y radiológicas.Todos fueron tratados en esta Institución yseguidos por un promedio de 28 mesesposterapia (rango: 8-74 meses). Se analizaronlos datos demográficos, los antecedentesepidemiológicos, los signos y síntomas en elmomento del diagnóstico, los resultados de losexámenes micológicos utilizados en eldiagnóstico, incluidos los estudios inmunológicosen suero (inmunodifusión y fijación delcomplemento) (6-7). Además, se revisaron losresultados de las pruebas de ACTH disponiblesy la tomografía computadorizada (TC) de lasglándulas suprarrenales, esta última ordenada entres casos.

Todos los pacientes eran hombres con una edadpromedio de 67,2 años (rango: 48-75 años),procedentes de zona rural; cinco de ellos eranagricultores y la mayoría (5 de 6) fumadores; endos pacientes se había establecido ya eldiagnóstico de paracoccidioidomicosis crónicamultifocal, con manifestaciones tegumentarias(lesiones ulceradas en mucosa oral); los cuatropacientes restantes fueron diagnosticados sólodespués de presentar síntomas compatibles concrisis suprarrenal (cuadro 1). El hongo fue aisladoen cultivo en todos los casos.

En cuanto a los síntomas relacionados con la fallasuprarrenal, los pacientes consultaron por uncuadro clínico de 4,1 meses de evolución (rango:2-6 meses); todos ellos presentaban síntomasconstitucionales tales como pérdida de peso de8 kg en promedio (rango: 2-15 kg) y adinamiapersistente; además, se anotó fiebre y diarrea enalgunos casos. La revisión de síntomas porsistemas reveló que cinco tenían síntomasrespiratorios; tres, alteraciones neurológicas(obnubilación y coma), relacionadas conhiponatremia (sodio sérico<135 mEq/l). Trespacientes tenían hiperpigmentación de la piel.Todos tenían infiltrados pulmonares en elmomento del diagnóstico (cuadro 1). Con estossignos y síntomas se realizó cortisol basal oprueba de ACTH, que demostró hipofunciónsuprarrenal, representada por niveles basales decortisol por debajo del límite inferior normal (<5

281

Biomédica 2002;22:280-6OÑATE J.M., TOBÓN A.M., RESTREPO A.

µg/dl) en cinco de los pacientes o escasoincremento en los niveles de cortisol luego delestímulo con ACTH, demostrado en dos pacientes,en uno cortisol sérico de 2 µg/dl y post-ACTH de6,23 µg/dl y en el otro 5,5 µg/dl y 5,10 µg/dl,respectivamente. En tres pacientes, los hallazgosde hipofunción suprarrenal se corroboraronmorfológicamente con los resultados de la TC querevelaron aumento de tamaño y densidadheterogénea de las glándulas suprarrenales (figura1).

Se instauró tratamiento con itraconazol a dosisde 200 mg/día, por vía oral, por 7,3 meses (rango:4-12 meses); el tiempo de terapia se definió conbase en la evolución clínica y en los resultados delos estudios micológicos y serológicos. Seinstauró, además, reemplazo hormonal conprednisolona, 30 mg/día, por vía oral, asociadocon fluorocortisona, 0,2 mg/día por vía oral. Entodos los casos se observó mejoría clínicaimportante con control de la micosis, de acuerdocon los niveles de anticuerpos anti-P. brasiliensis.Sin embargo, no se realizaron controles de funciónsuprarrenal post-ACTH al culminar el tratamientoCuadro 1. Características demográficas y clínicas observadas en 6 pacientes con paracoccidioidomicosis e insuficienciasuprarrenal.

Características Paciente 1 Paciente 2* Paciente 3** Paciente 4*** Paciente 5 Paciente 6

Edad (años) 63 52 52 75 48 48

Tiempo de evolución 6 3 6 4 4 2de hipoadrenalismo(meses)

Pérdida de peso (kg) 15 3 2 10 13 5

Síntomas generales Adinamia Adinamia Adinamia Adinamia Adinamia Adinamiay fiebre y fiebre

Hiperpigmentación Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausentecutánea

Estado de consciencia Obnubilado Consciente Estupor Obnubilado Coma Consciente

Lesiones de la Ninguna Úlcera en Úlcera en paladar Ninguna Ninguna Ningunamucosa oral labio inferior y mucosa yugal

Síntomas Tos Tos Tos Tos Ausente Tosrespiratorios productiva productiva productiva no productiva productiva

Radiografía del tórax Retículo nodular Reticular difuso Reticular en Reticular en Retículo- Reticular(tipo de infiltrado) difuso en ambos en ambos lóbulos inferiores lóbulos inferiores nodular difuso difuso en

pulmones pulmones bilateral bilateral en ambos ambospulmones pulmones

* Sin seguimiento continuo en la CIB** Falleció a causa de cáncer broncogénico.*** Falleció a causa de cáncer de próstata.

antifúngico. Durante el período de seguimientono se presentaron recaídas de la micosis, perodos pacientes fallecieron a causa de patologíaneoplásica (cáncer broncogénico metastásico ycáncer de próstata).

Discusión

Anatómicamente, la corteza suprarrenal sedivide en tres zonas independientes morfológicay fisiológicamente: glomerulosa, fasciculada yreticulada, las que son responsables de laliberación y síntesis a partir de la conversión delcolesterol de mineralocorticoides, glucocor-ticoides y andrógenos suprarrenales (1,8). Lasmanifestaciones clínicas debidas al déficit de losesteroides se reflejan en síntomas inespecíficostales como debilidad, anorexia, fatiga al menoresfuerzo, pérdida de peso y alteraciones delestado mental, al igual que trastornosmetabólicos como hipoglicemia, hiponatremia ehipercalemia. Ocasionalmente, se presentadolor abdominal tipo cólico, referido como'calambres', a veces asociado con deposicionesdiarreicas; éstas predicen crisis suprarrenal

282

Biomédica 2002;22:280-6 PARACOCCIDIOIDOMICOSIS E INSUFICIENCIA SUPRARRENAL

aguda (8). Es frecuente la hiperpigmentación enáreas expuestas a la luz solar, secundarias a unincremento en la liberación de corticotropina(ACTH), la cual estimula los melanocitos yaumenta la síntesis de melanina, responsablefinal de la hiperpigmentación (1,2,8); los pacientescon paracoccidioidomicosis aquí analizados, asícomo los restantes en otras series (3,9-11),presentaban todos, en mayor o menor grado, losanteriores síntomas, los cuales orientaron eldiagnóstico clínico.

La inmunodepresión local resultante de laelevada concentración de glucocorticoidesconvierte el tejido suprarrenal en un 'foco de bajaresistencia', y lo hace vulnerable a ladiseminación hematógena o linfática de ciertosmicroorganismos, entre ellos los hongos, los quecomparten su tropismo por la glándulasuprarrenal (1,2,8). Como resultado, se presentacrisis suprarrenal aguda o insuficienciasuprarrenal crónica (1,2,8). Los principaleshallazgos histopatológicos están representadospor áreas de necrosis y fibrosis que pueden serfocales, unilaterales y, en ocasiones, bilaterales,los cuales resultan en aumento del tamaño

suprarrenal (3). Microscópicamente, se observanlesiones granulomatosas y hay necrosis decaseificación en el parénquima (3,4,8). Laintensidad del daño se traduce en la severidaddel cuadro y en el curso de la enfermedad (1,8).En la TC son frecuentes el aumento del tamañode la glándula, irregularidades en su contorno ydeformidad en su estructura, ya que elparénquima normal está obliterado (áreas dehipodensidad); la presencia de calcificaciones,tan frecuentes en la tuberculosis suprarrenal, esinfrecuente en las micosis (3,8). Los trespacientes de la presente serie en los que sedispuso de análisis tomográfico presentabanalgunas de las anteriores anormalidades; sinembargo, en uno de los casos existíancalcificaciones en el parénquima, como se ilustraen la figura 1.

La prevalencia de insuficiencia suprarrenal en laparacoccidiodomicosis ha sido objeto decontroversia. De acuerdo con Tendrich (3), losestudios iniciales basados en los hallazgosmorfológicos consignados en 23.215 autopsias,indicaron una prevalencia de 48,2%. Igualproporción hallaron Del Negro et al. (12) al medir

Figura 1. Tomografía computarizadade las glándulas suprarrenales. Seobservan lesiones hipodensas quecomprometen las glándulas suprarre-nales de manera bilateral (flechaslargas). Nótese la presencia decalcificaciones en la glándulasuprarrenal izquierda (flecha corta).

283


los metabolitos del cortisol en orina. Sin embargo,los análisis prospectivos más recientesinformaron una frecuencia menor (10-15%) alutilizar la prueba de ACTH en suero (9). Ennuestra serie encontramos una incidencia másbaja (2,9%) de hipoadrenalismo, lo cual se podríaexplicar por el hecho de que esta condición sólose investigó cuando había manifestacionesclínicas aparentes, sin analizar la funciónsuprarrenal en los restantes pacientes.

La valoración del compromiso suprarrenalcomprende medición de niveles séricos decortisol o de sus metabolitos en orina.Actualmente, el método empleado consiste enmedir los niveles basales de cortisol en suero y,luego, administrar 250 µg intravenosos ointramusculares de cosintropina (ACTH sintética);60 minutos después se cuantifican los niveles decortisol, los cuales deben mostrar un incrementomayor de 20 µg/dl (2,8). Es de resaltar que antesde la prueba, los pacientes pueden haber estadoen tratamiento con dexametasona, pero no serecomienda el uso previo de hidrocortisona ocortisona, ya que al convertirse éstos en cortisol,alteran el valor de la prueba (8). Algunos autorespreconizan la determinación de los niveles séricosde ACTH como método de evaluación, dada suvida media corta y su correlación temprana conla afección, por lo que representa una prueba detamizaje efectiva (8,9). En efecto, la medicióntemprana de ACTH puede detectar la hipofunciónsuprarrenal en un estadio subclínico,especialmente en la forma crónica multifocal dela micosis, lo que permite el reemplazo hormonalinmediato y evita la morbimortalidad asociada conla crisis suprarrenal aguda cuando los pacientespresentan otras infecciones, traumas o sufranestrés quirúrgico (9).

Se ha informado que los pacientes conparacocci-dioidomicosis suelen presentar un nivelbasal de cortisol más elevado que las personasnormales debido al reto ejercido por la invasiónmicótica (9,10); sin embargo, en nuestro estudio,cinco de los pacientes presentaron niveles decortisol sérico por debajo del límite inferioraceptado, lo cual está en desacuerdo con losdatos anteriores. Esta diferencia pudiera estribaren el grado del daño suprarrenal.

En esta entidad, la principal herramientaterapéutica son los derivados azólicos, si bien elitraconazol ha demostrado ser el más eficaz detodos y el que posee menor índice de recaídas,3-5% (13); no obstante, el costo del fármacorepresenta un inconveniente mayor por lo quese usa ketoconazol como tratamiento de segundalínea (14,15). La farmacodinamia de este últimocompuesto se debe tener en cuenta, ya que nosólo es antifúngico sino también inhibidor de la21-α-hidroxilasa, principal enzima en la esteroi-dogénesis (14,15). Abad y colaboradoresdemostraron la presencia de insuficienciasuprarrenal subclínica en 23% de los pacientescon paracoccidioidomicosis tratados conketaconazol; esta tasa aumentó al 44% luego deltratamiento (16). Por tal razón, estos pacientesameritan mayor seguimiento y control de sureserva suprarrenal (13,16). Por ello, se debeinsistir en el tratamiento con itraconazol para estegrupo particular de pacientes, no sólo para evitarla exacerbación de la disfunción suprarrenal, sinotambién porque el tratamiento con ketoconazolno logra controlar la infección del parénquima dela glándula suprarrenal, aumentando así laposibilidad de reinfección endógena de origensuprarrenal (16). Adicionalmente, se requieremayor tiempo de tratamiento y aumento de ladosis, lo que multiplica los costos de la terapia yla morbilidad asociada con la misma (13,14). Laforma adecuada de estudiar y seguir a estospacientes, se presenta en el algoritmo (figura 2).

El reemplazo hormonal depende de la severidadde las manifestaciones; se recomiendan lossiguientes pasos: en la crisis suprarrenal aguda,suministrar 100 mg de hidrocortisona intravenosacada 6 horas, con 2-4 litros de solución salinanormal 0,9%, en las primeras 12 horas. Lamejoría es pronta y dramática; sin embargo, serecomienda continuar esta dosificación hastacontrolar el evento precipitante (1,8,9). La terapiade mantenimiento debe administrase a razón de20-25 mg/día de cortisona y, en caso necesario,de fluorocortisona, 0,2 mg/día (1,2,8). El principalinterrogante lo constituye la duración deltratamiento de reemplazo hormonal, dado que losglucocorticoides conllevan efectos secundariosa largo plazo (1,2,8).

284

Biomédica 2002;22:280-6 PARACOCCIDIOIDOMICOSIS E INSUFICIENCIA SUPRARRENAL

No

Considerar o tra e tio logía e interconsultar con

endocrino log ía

¿Tom ografía co m putarizada de g lándu las suprarrenales con cam bios morfo lógicos ?

In iciar tra tam ien to conitraconazo l de 6-12 meses

Sí

¿Respuesta c lín ica,m ico lógica y sero lógica

adecuada?

No

Sí

Suspender itraconazol

¿ Interacc ionesm edicam entosas?

Realizar cortiso l basal y prueba de ACTH y suspender estero ides s i

exis te adecuada reserva suprarrenal

Suspender in teracc iónfarm acológ ica

So licitar n iveles de itraco nazo l

Aum entar dosis yv ig ilanc ia estrecha d e

los n iveles

Pro longar t iem po de tra tam ien to y seguim iento

m ás estric to

¿Nive les de itraconazol en ran go terapéutico?

No

No SíSí

Sí No

So licitar cortisol basal y p rueba de ACTH

In iciar azólicos

¿Sín tom as de fa lla suprarrenal?

In iciar azólicos yso lic itar cortiso l basal

y prueba de ACT H

¿Adecuada reserva suprarrenal?

In icio deg lucocorticoides y

m ineralocort ico ides

NoSí

SíNo

Histor ia c línica de paracoccid io idom icos is

¿Forma crón icam ult ifoca l?

Continuar m anejo ,segu im iento clín ico

y sero lóg ico

Figura 2. Algoritmo: manejo de insuficiencia suprarrenal en paracoccidiodomicosis.

285


En regiones donde la prevalencia de para-coccidioidomicosis es alta debería considerarsela insuficiencia suprarrenal primaria debida a P.brasiliensis. La identificación precoz dehipoadrenalismo mejora el pronóstico, dado quees posible detener el daño suprarrenal con eltratamiento antifúngico temprano, evitando así losefectos colaterales de los corticoides a largo plazo(8,9,17,18).

Agradecimientos

A Mónica Zambrano y al Grupo de MicologíaMédica y Experimental de la CIB, por sucolaboración en la elaboración de estemanuscrito.

Referencias

1. Winqvist O, Rorsman F, Kämpe O. Autoinmuneadrenal insufficiency. Biodrugs 2000;13:107-14.

2. Oelkers W. Adrenal insufficiency. New Eng J Med 1996;16:1206-12.

3. Tendrich M, Wanke B, Del Negro G, Wajchenberg B.Adrenocortical involvement in paracoccidioidomycosis.En: Franco M, Da Silva C, Restrepo A, Del Negro G,editores. Paracoccidioidomycosis. Boca Ratón, Florida:CRC Boca Ratón; 1993. p.303-10.

4. Lacaz C, Porto E, Costa Martins J. Paracoccidio-domicose. En: Micología médica. Sao Paulo: Sarvier;1991. p.248-97.

5. Brummer E, Castañeda E, Restrepo A. Paracocci-dioidomycosis: an update. Clin Microb Rev 1993;6:89-117.

6. Restrepo A. Paracoccidioides brasiliensis . En:Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principlesand practice of infectious diseases. Fifth edition. NewYork: Churchill Livingstone; 2000. p.2768-72.

7. Restrepo A. Paracoccidioidomicosis: pasos para sudiagnóstico. Medicina & Laboratorio 1998;1:9-18.

8. Orth D, Kovacs W. The adrenal cortex. En: WilsonJ, Foster D, Kronenberg H, Larsen P, editors. William'stextbook of endocrinology. Ninth edition. Philadelphia:W.B. Saunders; 1998. p.517-664.

9. Colombo A, Faical S, Kater C. Systematic evaluationof the adrenocortical function in patients withparacoccidioidomycosis. Mycopathología 1994;127:89-93.

10. Marsiglia I, Pinto J. Adrenocortical insufficiencyassociated with paracoccidioidomycosis. J ClinEndocrinol Metab 1996;26:1109-15.

11. Moreira A, Martinez R, Castro M, Elias L.Adrenocortical dysfunction in paracoccidioidomycosis:comparision between plasma beta lipotrophin/adrenocorticotrophin levels and adrenocortical tests.Clin Endocrinol 1992;36:545-51.

12. Del Negro G, Wachenberg BL, Pereira VG, ShnaiderJ, Ulhoa-Cintra AB, Assis LM, et al . Addison's diseaseassociated with South American blastomycosis. AnnIntern Med 1961;54:187-97.

13. Tobón A, Gómez I, Franco L, Restrepo A.Seguimiento post-terapia en pacientes con paracocci-dioidomicosis tratados con itraconazol. Rev ColombNeumol 1995; 7:74-8.

14. Terrell C. Antifungal agents. Part II: The azoles. MayoClin Proc 1999;74:78-100.

15. Feldman D. Ketoconazole and other imidazolederivatives as inhibitors of steroidogenesis. EndocrinolRev 1986;7:409-20.

16. Abad A, Gómez I, Vélez P, Restrepo A. Adrenalfunction in paracoccidioidomycosis: a prospective studyin patients before and after ketoconazole therapy.Infection 1986;14:22-6.

17. Osa S, Peterson R, Roberts R. Recovery of adrenalreserve following treatment of disseminated SouthAmerican blastomycosis. Am J Med 1981;71:298-301.

18. Do Valle A, Guimaraes M, Cuba J, Wanke B, TendrichM. Recovery of adrenal function after treatment ofparacoccidioidomycosis. Am J Trop Med 1993;48:626-9.

286

REVISION DE TEMA

Biomédica 2002;22:287-95

Viral hemorrhagic fevers of South America

Robert B. Tesh

Department of Pathology and Center for Tropical Diseases, University of Texas Medical Branch, Galveston,Texas, USA.

This paper reviews the epidemiology and distinguishing features of three viral hemorrhagic fevers(dengue hemorrhagic fever, yellow fever and arenaviral hemorrhagic fever) that have emerged asimportant public health problems in South America. Although the etiology, natural history andcontrol of the three diseases are different, their clinical manifestations and histopathology findingsare similar and can be difficult to differentiate. Consequently, early recognition and correct diagnosisare essential for effective control measures to be initiated.

Key words: viral hemorrhagic fever, dengue, yellow fever, epidemiology, clinical pathology,arbovirus diseases.

Fiebres virales hemorrágicas en Suramérica

El artículo revisa la epidemiología y rasgos distintivos de tres fiebres virales hemorrágicas (denguehemorrágico, fiebre amarilla y fiebre hemorrágica por arenavirus), que han emergido como seriosproblemas de salud pública en Suramérica. Aunque la etiología, la historia natural y el control deestas tres enfermedades difieren, sus manifestaciones clínicas y los hallazgos histopatológicosson similares y pueden ser difíciles de diferenciar. En consecuencia, la detección temprana y eldiagnóstico correcto son esenciales para la aplicación de medidas de control.

Palabras clave: fiebre viral hemorrágica, dengue, fiebre amarilla, epidemiología, patología clínica,enfermedades por arbovirus.

During the last several decades, three viralhemorrhagic fevers have emerged as importantpublic health problems in South America: denguehemorrhagic fever, yellow fever and arenaviralhemorrhagic fever. Although the causativeagents, epidemiology and control of thesediseases are quite different, their clinicalmanifestations and histopathological findings areoften similar and difficult to differentiate. Thus,correct diagnosis and early recognition areessential for effective control measures to beinitiated. The emergence of these hemorrhagicdiseases in the region has resulted in part fromchanging health priorities, human migration,population growth and urbanization, and changingland use patterns. In this review, the epidemiology

of the three hemorrhagic fevers will be reviewedas well as their distinguishing features andcauses.

Dengue hemorrhagic fever

Dengue is a mosquito-transmitted viral diseasewhich is now common in tropical and subtropicalregions of South America (1,2). The diseaseexists in two clinical forms: classical dengue fever(CDF) and dengue hemorrhagic fever/dengueshock syndrome (DHF). There are four denguevirus serotypes, designated dengue 1, 2, 3 and4. All are members of the genus Flavivirus, familyFlaviridae. Infection with one dengue virusserotype provides lifelong protection to thehomologous serotype, but not to the other threeheterologous dengue serotypes. Consequently,people can have dengue several times in theirlife, if they are infected with different dengue virusserotypes. Each of the four dengue virusserotypes can produce CDF and DHF. The

Correspondencia:Center for Tropical Diseases, Keiller Building 1.116, 301University Boulevard, Galveston, Texas, 77555-0609; tel.(409) 747 2431; fax (409) 747 2429; [email protected]


287

TESH R.B. Biomédica 2002;22:287-95

frequency of DHF in persons infected with denguevirus is relatively low (~1:2,000); but consideringthe total number of persons in the world who areinfected with dengue viruses each year (estimated>100 million), DHF has become a major publichealth problem. The reasons why some denguevirus infections result in DHF, but most do not, isstill uncertain. Various risk factors have beenproposed to explain the development of DHF;these include prior infection with other denguevirus serotypes, immune enhancement, virulenceof the infecting dengue virus genotype, and hostfactors (1,3,4).

In the Americas, dengue viruses are transmittedmainly by Aedes aegypti mosquitoes. The A.aegypti mosquito is peridomestic and breeds inartificial containers in and around humandwellings. In addition, this mosquito preferentiallyfeeds on humans, which is one reason why it issuch an efficient disease vector. The recentemergence of DHF in South America can beexplained in large part by the reintroduction ofthis vector into areas previously free of themosquito, and by human migration, populationgrowth and urbanization which have createdconditions for enhanced breeding of A. aegypti(1,2).

Figure 1 shows the distribution of A. aegypti inthe Americas in 1930, in 1970 and in 1998. Duringthe 1930s, the vector was widely distributed incities and towns in tropical America. Then, duringthe 1940s and 1950s, the Pan American HealthOrganization began an ambitious A. aegyptieradication program which was originallydesigned to permanently eliminate urban yellowfever from the region. This eradication programwas quite successful, and by 1970, the mosquitohad been eliminated from most countries in SouthAmerica. The elimination of A. aegypti alsostopped dengue virus transmission in areas freeof the vector. However, during the 1970s, supportfor mosquito surveillance and control programsdecreased and many countries were reinfestedwith A. aegypti. This mosquito has now returnedto its original distribution in South America.

Because dengue fever and DHF are now commonin tropical America, these diseases are often over-diagnosed; consequently, many non-specificfebrile illnesses and hemorrhagic diseases areincorrectly diagnosed as 'dengue fever' and 'DHF',respectively. Various studies have demonstratedthat the clinical diagnosis of dengue is not veryaccurate (5,6). But, the laboratory confirmation

Figure 1. Distribution of Aedes aegypti in 1930, in 1970 and in 1998 (1).

TESH R.B.

288

Biomédica 2002;22:287-95 VIRAL HEMORRAGIC FEVER

of DHF may also be difficult, because it is oftennot possible to isolate dengue virus from casesof DHF and the results of serologic tests onpatients with multiple dengue virus infections arenot easy to interpret. Furthermore, the laboratoryand histopathologic findings in patients with DHFcan mimic those of severe cases of yellow fever(YF) and arenaviral hemorrhagic fever (AHF). Allthree of these diseases can produce leukopenia,thrombocytopenia, elevated serum transaminaselevels, liver necrosis, and Councilman bodies(eosinophilic depositions in hepatocytes) (7-17).This is an important consideration, since correctdiagnosis and early recognition of any of thesediseases is essential for their treatment, as wellas for the appropriate public health response.

Yellow fever

Yellow fever (YF) remains an important cause ofmorbidity and mortality in South America. Duringthe 10-year period from 1986 to 1995, the PanAmerican Health Organization reported a total of2,022 cases of YF from the region (18). Figure 2shows the number of officially reported YF casesin South America during that 10-year period bycountry. Undoubtedly, these are underestimates,since milder cases of the disease are notrecognized or reported. Based on the high case-fatality rates in South America, Monath hasestimated that the true incidence of the diseasein the continent is actually 5-10 times higher (18).

Like dengue, YF is caused by another mosquito-transmitted flavivirus, the yellow fever virus. Thevirus has two distinct cycles in South America: 1)an endemic or sylvan cycle, thought to involvemonkeys and tree-hole breeding forestmosquitoes of the genera Haemagogus andSabethes; and 2) an epidemic or urban cycle,involving humans and the domestic mosquitovector, A. aegypti (19). In fact, it was Jorge BoshellManrique who first demonstrated whereHaemagogus mosquitoes lived in the forestcanopy and that they were the principal vectorsof sylvan YF in the Americas (20).

During the 17th., 18th. and 19th. centuries, YFcaused major urban epidemics in Africa,European port cities and the Americas (19). Theliterature suggests that the mortality rate in natural

YF infection is in the range of 20-25%. YF, andfear of the disease, played an important role inthe settlement and commerce of the New Worldduring that period. Two years ago, at theInternational Congress of Tropical Medicine, Dr.Hernando Groot gave an interesting historicalaccount of how an outbreak of YF decimated theattacking forces of the English pirate HenryMorgan, and saved Cartagena from capture.There is just one example of how YF influenceddevelopment and commerce in the New World.

Because of the high mortality resulting from urbanYF epidemics in the Americas and the successof United States' efforts in controlling the diseasein Cuba and Panama by sanitation and vectorcontrol, the Brazilian Government began a nation-wide campaign to eradicate A. aegypti in the1930s (19). The early success of that programand the introduction of DDT led the Pan AmericanSanitary Bureau to initiate the hemisphere-wideA. aegypti eradication campaign mentionedbefore. Between 1947 and 1972, this mosquitowas eliminated from Central America and mostof South America, and urban YF disappeared. The

192

371

50

1,365

44

Figure 2. Distribution of officially reported yellow fever casesby country during the decade, 1986-1995 (18).

289


last documented A. aegypti-associated epidemicof YF occurred in Acre State in the BrazilianAmazon in 1942 (19).

The development of an effective, inexpensivevaccine also played an important role inelimination of the urban YF from the Americas.The 17D YF vaccine was first used in Brazil in1937; and during the next 30 years, many millionsof persons throughout the Americas received thevaccine (19). However, following the eradicationof A. aegypti and the disappearance of urban YF,many South American countries stopped massvaccination campaigns. The current policy in mostcountries of the region is to wait for theappearance of sylvan cases, and then tovaccinate around them in order to contain theoutbreak and prevent spread to urban areas.

Ironically, during the last 25 years as many SouthAmerican countries discontinued or de-emphasized YF vaccination campaigns, the urbanYF vector A. aegypti was reinfesting the samecountries. The mosquito now occupies its pre-eradication geographic distribution in theAmericas (figure 1). The reemergence of dengueand DHF in South America during the past twodecades attests to the current widespreaddistribution and abundance of A. aegypti in thehemisphere (22). Dengue also is now endemic inmany cities in the Amazon Basin, such as Belemand Manaus in northern Brazil; Iquitos, Tarapotoand Pulcalpa in eastern Perú, and Santa Cruz ineastern Bolivia demonstrating that A. aegypti nowexists in close proximity to areas where sylvanYF occurs. The continued presence of sylvan YFin South America constitutes a real threat as asource of introduction into the urban environment(23). Given the continuing encroachment ofpeople into the sylvan habitat of YF fever virus, itwould seem inevitable that the virus will eventuallybe introduced into an urban community and thatepidemic YF will reappear.

Two recent outbreaks in Perú and Bolivia illustratethe potential danger of YF being introduced intourban areas. Ten or 15 years ago, when theSendero Luminoso (Shining Path) terrorist groupwas active in the Andean foothills of eastern Perú,many civilians fled the region. After the defeat of

the Sendero Luminoso group in the early 1990's,people began to move back into the region andto reclaim their land. Thousands of contractworkers were recruited from impoverishedhighland communities and brought to workclearing land in the jungle. Most of these peoplehad never been vaccinated against YF. In 1995,Perú reported more than 500 cases of YF; mostof these cases were among contracted workersfrom the highlands. A similar scenario could occurin Colombia, when peace finally comes to thenation and people begin to return to rural areaswhere sylvan YF is still present.

Actually, a small urban outbreak of YF occurredrecently in Santa Cruz, Bolivia. In the early 1990's,the Bolivian government privatized most of themines in the highlands. With privatization, manynon-productive mines were closed, and massiveunemployment among miners resulted. Many ofthese workers and their families moved to lowlandareas where more jobs were available. Some ofthese people settled in Santa Cruz where theyestablished 'colonias' around the city. They foundwork as agricultural workers on surrounding farmsin a region where YF is endemic. BetweenDecember 1998 and June 1999, 6 cases of YF(5 fatal) were reported among residents of SantaCruz, now a city of about one million inhabitants(24). At the time of this outbreak, dengue wasendemic in Santa Cruz, A. aegypti mosquitoeswere abundant, and the level of YF immunityamong the resident population of the city was onlyabout 30%. Fortunately, the YF cases wererecognized early, and a mass vaccinationcampaign and A. aegypti control program wererapidly initiated by local authorities. A majorepidemic of urban YF was probably averted. Butthis situation illustrates the danger of theintroduction of YF into an urban area wheredengue occurs, and the difficulty in differentiatingDHF from YF initially.

Clinically, the two diseases may be similar:acutely ill patients with fever, leukopenia andhemorrhagic manifestations (7-13). Although YFpatients often have icterus, this is not always obviousin people with dark skin. The histopathologicaldiagnosis of YF is also sometimes difficult, unlessspecial staining procedures are used. Typically infatal cases of YF, one sees midzonal hepatocytenecrosis, microvesicular steatosis, pyknotic

290


nuclei, and acidophilic or eosinophilic depositionswithin the cytoplasmic of dying liver cells (figure 3).These eosinophilic depositions or so-calledCouncilman bodies were once thought to bediagnostic of YF; but it is now known thatCouncilman-like bodies can be seen in a number ofdiseases where liver cell necrosis or apoptosisoccurs. This includes DHF (8,9) and AHF (14-17).

We have recently developed a new hamstermodel of fulminant YF, which shows many of theclinical and pathologic features of the severedisease in humans (12,21). After infection,hamsters develop a high YF viremia that peakson day 3 and that lasts 5 or 6 days (21). Antibodies(hemagglu-tination inhibition and IgM) first appearbetween day 4 and 5. About 20% of adulthamsters die from YF infection; death usuallyoccurs in the animals on day 5 or 6, as in severehuman cases of the disease. These animals alsohave elevated serum transminase and bilirubinlevels (21).

Arenaviral hemorrhagic fevers

To date, a total of 17 different indigenousarenaviruses have been identified in the Americas(25-27). Most of the New World arenaviruses occurin South America. In general, they have a ratherrestricted geographic distribution; and most of theviruses are associated with a single vertebratespecies, usually a rodent (25-27). The natural rodentreservoirs of arenaviruses usually develop apersistent infection and continuously shed virus intheir urine, feces and saliva (25,28). Humaninfection is thought to result primarily frominhalation of aerosols of infected rodent excreta,although venereal transmission and nosocomialinfections have also been reported (16,25).

Four of the South American arenaviruses havebeen associated with severe hemorrhagic disease(AHF) in humans (25). Each of these arenavirusesis associated with a disease of a different name:Junin virus with Argentine hemorrhagic fever(AgtHF); Machupo virus with Bolivian hemorrhagicfever (BHF); Guanarito virus with Venezuelanhemorrhagic fever (VHF), and Sabia virus withBrazilian or Sao Paulo hemorrhagic fever. In reality,the clinical manifestations and laboratory findingsin the four diseases are indistinguishable. Afteran incubation period of 7-14 days, AHF begins

insidiously with progressive development of fever,chills, malaise, anorexia, myalgia and sore throat(16,25,29). During the first 3-5 days, the signsand symptoms are indistinguishable from a varietyof other non-specific viral and bacterial illnesses.As the disease progresses, patients developweakness, arthralgia, back pain, nausea,vomiting, epigastric pain, dizziness, conjunctivitis,flushed face and bleeding gums. By the 6th. or7th. day, the patients are usually acutely ill withdehydration, disorientation and frequentlyhemorrhagic and/or neurological manifestations.If death occurs, it usually results from massivehemorrhage and/or shock. If the patient survivesthis period, improvement begins about the 10th.or 12th. day and a slow convalescence ensues.The mortality rates in patients with untreated AHFrange from about 10 to 33%. Mortality rates ofAHF decrease with early hospitalization andintensive supportive care, including immunehuman plasma or the antiviral drug ribavirin (16).

The frequency of the South American AHFs varywidely, and less is known about theirepidemiology than is known about DHF and YF.To date, only 4 cases of Sao Paulo hemorrhagicfever have been reported; two natural cases andtwo accidental infections among laboratorypersonnel working with Sabia virus (25).

The first documented outbreak of BHF occurredbetween 1962 and 1964 in the town of SanJoaquín in the Beni department of northeasternBolivia (16,25). About 1,000 human casesoccurred during that initial outbreak. Since thattime, only sporadic cases of BHF have beenreported. However, cases still do occur; we madean isolate of Machupo virus from a human caseof BHF last year.

The two AHFs that have been most thoroughlystudied are (AgtHF) and VHF. AgtHF was firstrecognized as a distinct entity during the 1950sin an agricultural region north of Buenos Aires(25). From 1958 to 1994, more than 24,000human cases were reported with annual totalsranging from 200-3,000 cases (25). AgtHF affectsmostly adult male agricultural workers. Cases ofthe disease occur mainly during the harvestseason, with a peak incidence in May. Since the

291


introduction of the Candid-1 vaccine in 1991, theannual incidence of the disease has decreaseddramatically (25).

VHF was first recognized in 1989 in an agriculturalregion of Portuguesa state (29). BetweenSeptember 1989 and August 1998, more than 200cases of VHF were reported. The disease hasoccurred in a sporadic cyclical manner; caseshave been reported in every month of the year,but the majority have occurred in the months ofNovember, December and January (29). Thisperiod corresponds with the end of the rainyseason and beginning of the dry season in theendemic region, and it is a period of intenseagricultural activity. During the past dry season(November 2001- January 2002), another 30 casesof the disease were reported. Like the patternobserved with AgtHF, VHF occurs mainly amongadult male agricultural workers, suggesting thatinfection occurs outside of the home in rodent-infested fields and grasslands (29).

One of the interesting questions about VHF is whywere cases not recognized until 1989. The answerseems largely related to human migration andland use patterns in the affected region. Duringthe period from 1985-2000, there was a majormovement of people into the llanos of Venezuela,especially Portuguesa and Barinas states. Muchof this land was originally forested; but withdevelopment, the forest was removed and wasreplaced by agricultural fields and pastures(25,30). This ecologic change provided increasedhabitat for certain grassland rodents, one beingZygodontomys brevicauda, the reservoir ofGuanarito virus. Thus, there were increasednumbers of infected rodents, and increasednumbers of susceptible people living in the sameregion. A similar pattern was observed inArgentina when intensive agriculture (soy beansand corn) was developed in the Pampa regionwhere AgtHF now occurs (16,25,31). Cultivatedfields and the surrounding grasslands providedhabitat for the rodent reservoirs of Junin virus (31).The arenaviruses are very old and probablyevolved with their rodent hosts; but when peoplechange the ecology, allowing an increase in theabundance of the rodent hosts, the risk of human-virus contact increases (25).

As noted before, the initial clinical manifestationsof AHF are indistinguishable from a variety ofother non-specific viral and bacterial illnesses(16,25). In fact, the first two isolates of Guanaritovirus were made from fatal cases initiallydiagnosed as DHF (29). Table 1 shows the clinicaldiagnosis of 56 confirmed VHF cases at the timeof the patients' hospitalization (25). Despite therelative frequency of VHF in the endemic region,it is a difficult diagnosis to make. Patients withVHF appear at a clinic or hospital with a 4-5 dayhistory of progressively severe febrile illness; theyusually have leukopenia and thrombocytopenia,and sometimes hemorrhagic manifestations arepresent. Laboratory studies may indicateelevated serum transaminase levels. But, at thispoint, the illness cannot be differentiated fromDHF or YF.

Despite the severity of the illness, patients dying ofAHF show surprisingly little pathology. The mostconsistent findings at autopsy are in the liver andhave been described as multifocal hepatocyticnecrosis, usually without significant inflammatoryreaction (14,32,33). Focal hepatocyte necrosis canbe seen as well as Councilman bodies. We recentlydescribed a hamster model of AHF, using Piritalvirus. Hamsters inoculated with Pirital virus developa progressively severe, fatal illness of about 7 daysduration; the pathologic features are similar to thoseobserved in fatal human cases of AHF (17). Figure4 shows a H&E stained section of liver from ahamster experimentally infected with Pirital virus.

Table 1. Clinical diagnoses in 56 confirmed cases ofVenezuelan hemorrhagic fever at time of patients’hospitalization.

Diagnosis No. of confirmedcases of VHF

Viral syndrome 16Classic dengue fever 11No diagnosis 7Venezuelan hemorrhagic fever 6Hemorrhagic virosis 5Dengue hemorrhagic fever 4Tonsilitis/pharyngitis 2Convulsive syndrome 1Bronchopneumonia 1Gastrointestinal hemorrhage 1Sepsis 1Febrile syndrome 1

292


Seven days after infection focal hepatocyticnecrosis can be seen with scattered acidophilicbodies.

Because of the non-specific nature and highmortality of viral hemorrhagic fever, the diagnosisand etiology are often not determined untilautopsy. As noted before, the major pathologyobserved at necropsy in cases of DHF, YF andAHF is in the liver. However, using a standardH&E stain, it is difficult to determine the preciseetiology. Figure 3 shows a liver section from afatal case of presumed viral hemorrhagic fever inEcuador. It would be difficult for a pathologist tosay with certainty whether this person died ofDHF, YF or AHF. Furthermore, culture of theaffected tissues may not be much more helpful.

Dengue and YF viruses are infrequently culturedfrom tissues at the time of death, probably becausethe patient already has developed antibodies to theinfecting agent. The arenaviruses can be culturedfrom tissues at death; but they usually do not formviral cytopathic effect in mammalian cell cultures,so an indirect method (immunofluorescence, RT-PCR, etc.) must be used to confirm their presence.

Figure 5 shows liver tissue from the sameEcuadorian patient stained by the immuno-peroxidise technique, using a YF mouse immuneserum. The brown-staining material within theinfected hepatocytes is YF viral antigen and isdiagnostic. Figure 4 shows an H&E-stainedsection of liver from a hamster infected with Piritalvirus. Focal hepatocyte necrosis is visible, but the

Figure 3. Photomicrograph of liver from fatal human caseof yellow fever showing hepatocytic necrosis, microvesicularsteatosis, pyknotic nuclei and eosinophilic depositions(Councilman bodies) (100X magnification).

Figure 4. Focal hepatic necrosis with scattered eosinophilicbodies in a hamster, seven days after infection with Piritalvirus (50X).

Figure 5. Immunohistochemical staining for yellow fever viralantigen (reddish brown color) in liver of fatal yellow fevercase (100X).

Figure 6. Immunohistochemical staining in liver of hamsterinfected with Pirital virus; viral antigen appears as diffusebrown color (model of AHF) (100X).

293


etiology is uncertain unless an immunostainingtechnique is used. Figure 6 shows a liver sectionof the same animal stained with the immuno-peroxidase method and a Pirital mouse immuneserum.

In summary, three viral hemorrhagic fevers occurin tropical regions of South America. At present,DHF is by far the most common; YF and AHF areless frequent but have a significantly highermortality rate. The introduction of YF into an urbanarea in tropical America could have grave publichealth consequences because of the low level ofimmunity among most urban residents of theregion, the abundance and wide distribution ofthe mosquito vector, and a relative shortage ofthe 17-D vaccine worldwide. AHF is an endemicdisease and does not have the same epidemicpotential as dengue or YF, although a number ofnosocomial outbreaks have been reported amonghospital personnel attending AFH patients (16).Also AHF is a treatable disease if therapy isinitiated during the first 6 days of the illness (16).Thus, correct diagnosis and early recognition ofthese diseases are essential for effective controlmeasures to be initiated.

References

1. Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. ClinMicrobiol Rev 1998;11:480-96.

2. Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever; itshistory and resurgence as a global public health problem.In: Gubler DJ, Kuno G, editors. Dengue and denguehemorrhagic fever. Oxon, UK: CAB International; 1997.p.1-22.

3. Kouri GP, Guzman MG, Bravo JR, Triana C. Denguehemorrhagic fever; dengue shock syndrome: lessonsfrom the Cuban epidemic, 1981. Bull WHO 1989;67:375-80.

4. Paradoa Perez ML, Trujillo Y, Basanta P. Associationof dengue hemorrhagic fever and the HLA system.Hematologia 1987;20:83-7.

5. Dietz VJ, Gubler DJ, Rigau-Perez JG, Pinheiro FP,Schatzmayr HG, Bailey R, et al . Epidemic dengue 1 inBrazil, 1986: evaluation of a clinical based denguesurveillance system. Am J Epidemiol 1990;131:693-701.

6. Kouri G, Guzman MG, Valdes L, Carbonel I, delRosario D, Vazquez S, et al . Reemergence of denguein Cuba: 1997 epidemic in Santiago de Cuba. EmergInfect Dis 1998;4:89-92.

7. Kuo CH, Tai DI, Chang-Chien SC, Lan CK, Chiou SS,Liaw YF. Liver biochemical tests and dengue fever. AmJ Trop Med Hyg 1992;47:265-70.

8. Muerre MR, Lan NT, Marianneau P, Hue NB, Khun H,Hung NT, et al . Liver histopathology and biologicalcorrelates in five cases of fatal dengue fever inVietnamese children. Virchows Arch 2001;438:107-15.

9. Rosen L, Khin MM. Recovery of virus from liver ofchildren with fatal dengue: reflections on thepathogenesis of the disease and its possible analogywith that of yellow fever. Res Virol 1989;140:351-60.

10. Bugher J. The pathology of yellow fever. In: Strode G,editor. Yellow fever. New York: McGraw-Hill; 1951.p.137-63.

11. del Rio C, Meier F. Yellow fever. In: Nelson A,Horsburgh CJ, editors. Pathology of emerging infections2. Washington, D.C.: American Society for Microbiology;1998. p.13-41.

12. Elton N, Romero A, Trejos A. Clinical pathology ofyellow fever. Am J Clin Path 1955;25:135-46.

13. Xiao SY, Zhang H, Guzman H, Tesh RB. Experimentalyellow fever virus infection in the golden hamster(Mesocricetus auratus). II. Pathology. J Infect Dis 2001;183:1437-42.

14. McCormick JB, Walker DH, King IJ, Webb PA, ElliottLH, Whitfield SG, et al . Lassa virus hepatitis: a studyof fatal Lassa fever in humans. Am J Trop Med Hyg1986;35:401-7.

15. Johnson KM, Halstead SB, Cohen SN. Hemorrhagicfevers of Southeast Asia and South America: acomparative appraisal. Prog Med Virol 1967;9:105-58.

16. Peters CJ. Arenavirus diseases. In: Porterfield JS,editor. Exotic viral infections. London: Chapman andHall; 1995. p.227-46.

17. Xiao SY, Zhang H, Yang Y, Tesh RB. Pirital virus(Arenaviridae) infection in the Syrian golden hamster,Mesocricetus auratus: a new animal model for arenaviralhemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg 2001;64:111-8.

18. Monath TP. Epidemiology of yellow fever: current statusand speculations on future trends. In: Saluzzo JR, DodetB, editors. Factors in the emergence of arbovirusdiseases. Paris: Elsevier; 1997. p.143-56.

19. Monath TP. Yellow fever. In: Monath TP, editor. Thearboviruses: epidemiology and ecology. Vol. 5. BocaRatón (FL): CRC Press; 1989. p.139-231.

20. Boshell J. Informe sobre la fiebre amarilla silvestre enla región del Meta, desde Julio de 1934 hasta diciembrede 1936. Rev Fac Med (Bogotá) 1938;6:407-27.

21. Tesh RB, Guzman H, Travassos da Rosa APA,Vasconcelos PFC, Dias LB, Bunnell JE, et al.Experimental yellow fever virus infection in the goldenhamster (Mesocricetus auratus). 1. Virologic,

294

VIRAL HEMORRAGIC FEVERBiomédica 2002;22:287-95

biochemical, and immunologic studies. J Infect Dis 2001;183:1431-6.

22. Monath TP. Yellow fever and dengue - the interactionsof virus, vector and host in the re-emergence of epidemicdisease. Semin Virol 1995;5:133-45.

23. Robertson SE, Hull BP, Tomori O, Bele O, LeDucJW, Esteves K. Yellow fever. A decade of reemergence.JAMA 1996;276:1157-62.

24. Van der Stuyft P, Gianella A, Pirard M, Cespedes J,Lora J, Peredo C, et al. Urbanization of yellow fever inSanta Cruz, Bolivia. Lancet 1998;353:1558-62.

25. Tesh RB, Salas RA, Fulhorst CF, de Manzione N,Duno G, Weaver SC, et al. Epidemiology ofarenaviruses in the Americas. In: Saluzzo JF, Dodet B,editors. Emergence and control of rodent-borne viraldiseases (hantaviral and arenaviral diseases). Paris:Elsevier; 1999. p.213-24.

26. Moncayo AC, Hice CL, Watts DM, Travassos da RosaAPA, Guzman H, Calampa C, et al. Allpahuayo virus:a newly recognized arenavirus (Arenaviridae) fromarboreal rice rats (Oecomys bicolor and Oecomysparicola) in northeastern Peru. Virology 2001; 284-277-86.

27. Fulhorst CF, Bennett SG, Milazzo ML, Murray HG,Webb JP, Bradley RD. Bear Canyon virus: anarenavirus naturally associated with Peromyscus

calfornicus (California mouse). Emerg Infect Dis 2002;8:717-20.

28. Fulhorst CF, Ksiazek TG, Peters CJ, Tesh RB .Experimental infection of the cane mouse Zygodontomysbrevicauda (family Muridae) with Guanarito virus(Arenaviridae), the etiologic agent of Venezuelanhemorrhagic fever. J Infect Dis 1999;180: 966-9.

29. de Manzione N, Salas RA, Paredes H, Godoy O, RojasL, Araoz F, et al. Venezuelan hemorrhagic fever:clinical and epidemiologic studies of 165 cases. J InfectDis 1998;26:308-13.

30. Utrera A, Duno G, Ellis BA, Salas, RA, de ManzioneN, Fulhorst CF, et al. Small mammals in agriculturalareas of the western llanos of Venezuela: communitystructure, habitat associations, and relative densities. JMamm 2000;81:536-48.

31. Mills JN, Ellis BA, McKee KT, Maiztegui JI, ChildsJE. Habitat associations and relative densities of rodentpopulations in cultivated areas of central Argentina. JMamm 1991;72:470-9.

32. Child PL, Mackenzie RB, Valverde LR, Johnson KM.Bolivian hemorrhagic fever. A pathologic description.Arch Pathol 1967;83:434-45.

33. Walker DH, Murphy FA. Pathology and pathogenesisof arenavirus infections. Curr Topics Microbiol Immunol1987;133:89-113.

295

2

NOTA TÉCNICA

1

Biomédica 2002;22:296-302

Definición de las condiciones de temperatura yalmacenamiento adecuadas en la detección de ADN de

Leishmania por PCR en flebotominosOlga L. Cabrera 1, Leonard E. Munstermann 2, Rocío Cárdenas 1, Reynaldo Gutiérrez 3, Cristina Ferro

1 Laboratorio de Entomología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, D.C., Colombia.2 Departamento de Epidemiología y Salud Publica, Escuela de Medicina, Yale University, New Haven,

EE.UU.3 Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, CINTROP, Universidad Industrial de Santander,

Bucaramanga, Colombia.

Para estudios epidemiológicos y programas de control de las leishmaniasis es importante ladeterminación taxonómica del insecto vector y del agente etiológico causante de estaenfermedad. Por su eficacia y sensibilidad, la utilización de técnicas moleculares, como lareacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido avances en entomología médica. Lametodología tradicional usada para la búsqueda de infección en los flebótomos es un métododispendioso que requiere mucho tiempo y capacitación para emitir un diagnóstico acertado. Enel presente trabajo se evaluaron las condiciones y prácticas adecuadas para el almacenamientode flebótomos con el propósito de aplicar la PCR. Hembras de Lutzomyia longipalpis de lacolonia del Instituto Nacional de Salud se infectaron experimentalmente con una cepa deLeishmania chagasi del valle alto del río Magdalena (Quipile, Cundinamarca). Los insectosinfectados se preservaron en tres soluciones: etanol al 100%, etanol al 70% y en buffer Tris-EDTA (TE); submuestras de cada una se almacenaron a -80 °C, -20 °C y a temperatura ambiente.Para determinar los porcentajes de infección, algunas de las hembras se disecaron para buscarlas formas flageladas al microscopio. La extracción del KADN se realizó con Chelex 100. Para laamplificación se utilizaron los iniciadores OL1 y OL2 de Leishmania con electroforesis en gelesde agarosa al 1%. En cada una de las condiciones descritas se logró la amplificación de unfragmento de ≈120 pb, correspondiente a Leishmania spp. Estos resultados muestran la ventajade incorporar como técnica de rutina la PCR para detectar flebótomos infectados de zonasendémicas de leishmaniasis visceral. Por costo-efectividad, se concluyó que las muestrasentomológicas para estudios de incriminación vectorial utilizando la PCR, se pueden preservara temperatura ambiente en etanol al 70%.

Palabras clave: Lutzomyia, Leishmania, preservación, PCR, Chelex 100.

Definition of temperature and storage adequate conditions in Leishmania DNA detectionby PCR in phlebotomine samples

For epidemiological studies and control programs of leishmaniasis, taxonomic identification ofthe etiologic agent of the disease in the insect vector is of critical importance. The implementationof molecular techniques such as the polymerase chain reaction (PCR) has permitted greatadvances in the efficacy and sensitivity of parasite identification. Previously, these investigationsinvolved labor-intensive dissections and required expert personnel. The present work evaluatesthe effects of storage methods of phlebotomine samples in the optimization of PCR identificationof Leishmania. Females of Lutzomyia longipalpis, from the colony of the Instituto Nacional deSalud, were experimentally infected with Leishmania chagasi (=L. infantum), from the upperMagdalena Valley (Quipile, Cundinamarca, Colombia). The infected insects were preserved inthree solutions: 100% ethanol, 70% ethanol, and TE; subsamples of each class were stored at-80 °C, -20 °C and room temperature. To determine infection rates, samples were dissected andscreened microscopically. Chelex 100 was used for extraction of total Leishmania DNA. ForPCR amplification, the kinetoplastic minicircle DNA primers OL1 and OL2 of Leishmania wereused, and the products were visualized by electrophoresis in 1% agarose gels. For each of the

96

Biomédica 2002;22:296-302 DETECCIÓN DE ADN DE LEISHMANIA EN FLEBÓTOMOS, POR PCR

3 storage conditions, amplifications were successful, producing a ≈120 base pair product uniqueto Leishmania. The results demonstrated the advantage of PCR as a routine screening methodfor detecting infected flies in endemic foci of visceral leishmaniasis. Since storage method didnot affect PCR amplification success, the most cost effective method -70% ethanol at roomtemperature- is the option recommended for storing entomological samples in vector incriminationstudies.

Key words: Sand fly, Leishmania, preservation, PCR, Chelex 100.

La leishmaniasis visceral es una enfermedadespecialmente importante en salud pública por suasociación con mortalidad infantil en ausencia detratamiento. En Latinoamérica la causan parásitosLeishmania infantum (=L. chagasi) y se transmite alos humanos por la picadura de pequeños dípteroshematófagos de la familia Psychodidae. Lasespecies del complejo Lutzomyia longipalpis sonconsideradas los vectores más importantes (1-3).Se encuentran distribuidas en la mayoría de losfocos endémicos de la enfermedad en Centro ySuramérica (4). Como vector alterno del parásito,en algunos países se ha señalado a Lutzomyiaevansi. En Colombia, el comportamiento de L.evansi como vector de L. chagasi se demostró enSan Andrés de Sotavento, Córdoba (5). En CostaRica se ha registrado como la segunda especie másabundante después de L. longipalpis (6). EnVenezuela, en un estudio llevado a cabo enGuayavita, Aragua, L. evansi fue la especie másabundante y se encontró naturalmente infectada conLeishmania spp. (7). En localidades donde estasdos especies, L. longipalpis y L. evansi, presentandistribución simpátrica, se ha sugerido unaalternancia estacional entre ellas, ya que los picosde abundancia máxima de estas poblaciones noson simultáneos, por efecto de las variablesclimáticas en las poblaciones de estos insectos,especial-mente en las de L. longipalpis.

En estudios de incriminación vectorial, la presenciadel parásito en el insecto es uno de los cuatrocriterios propuestos por Killick-Kendrick comoindispensables para considerar un flebótomo comovector de Leishmania (8). La metodologíaampliamente usada para la búsqueda de infecciónen los flebótomos, por lo menos hasta la década

Correspondencia:Cristina Ferro, [email protected]


pasada, se basaba en el hallazgo de las formasflageladas en el intestino de los probables vectores.Este es un método dispendioso que requieremucho tiempo y capacitación para emitir undiagnóstico acertado (9,10).

La incorporación de técnicas de biologíamolecular, calificadas como altamente sensiblesy relativamente rápidas, ha permitido diferenciarentre especies y subespecies del géneroLeishmania en el flebótomo, utilizando pocascantidades de ADN mitocondrial. La PCR comouna de estas técnicas con capacidad de producircientos de copias de ADN se ha utilizado enestudios entomológicos con diferentes fines(11,12).

Con relación a los medios de almacenamiento parala preservación de las muestras entomológicas apartir de las cuales se obtiene el ADN blanco paraaplicación de pruebas moleculares, en 1998 Uezatoet al. (13) evaluaron tres formas diferentes depreservación de biopsias de piel humana paradeterminar por PCR las tasas de infección conLeishmania. Parte de las muestras fueroncongeladas, otras embebidas en formol y unatercera parte en etanol al 100%. Concluyeron quepara el diagnóstico de leishmaniasis por PCR, lapreservación de las muestras en etanol al 100% esadecuada tanto para su transporte como para sualmacenamiento.

En cuanto a la temperatura en la cual se mantienenlas muestras para diagnóstico por PCR, se hanseñalado especialmente las siguientes: temperaturaambiente, -20 °C y -70 °C (14-16).

Para la extracción del ADN, el método fenol-cloroformo se describe con más frecuencia (17-19). Sin embargo, para la obtención del ADN deprotozoarios a partir de biopsias de mamíferos yde intestinos infectados de mosquitos del géneroAnopheles, existen otros métodos que se han

297

CABRERA O.L., MUNSTERMANN L.E., CÁRDENAS R., GUTIÉRREZ R., FERRO C. Biomédica 2002;22:296-302

usado con buenos resultados, como lacromatografía de intercambio iónico (15) yextracción con Chelex 100 (20). En los últimosaños, el Laboratorio de Entomología del InstitutoNacional de Salud estandarizó la técnica deextracción con Chelex 100 al 5% del ADN deLeishmania presente en el intestino de insectosdel género Lutzomyia (21).

En el presente trabajo se evaluaron lascondiciones de temperatura y almacenamientoadecuados para detectar el ADN de Leishmaniaen el vector por la técnica de PCR. Hembras deLutzomyia longipalpis infectadas experimental-mente se preservaron en: etanol al 100%, etanolal 70% y buffer Tris-EDTA (TE), bajo lassiguientes temperaturas: -80 °C, -20 °C ytemperatura ambiente. Se concluyó que todas lascondiciones evaluadas son adecuadas. Porcostos, facilidad de adquisición y manejo de lasmuestras en condiciones de campo, serecomienda utilizar etanol al 70% a temperaturaambiente para estudios de incriminación devectores de leishmaniasis.


Infección de Lutzomyia longipalpis conLeishmania chagasi

Hembras adultas de una colonia de L. longipalpisde tres días de nacidas fueron alimentadas conuna mezcla de promastigotes de L. chagasi yglóbulos rojos lavados en una proporción 2:1, através de membrana de pollito de dos días deedad. El volumen final de esta mezcla fue de 3ml y la cantidad ingerida por insecto fue de 0,5 µlaproximadamente (22). Los parásitos y losinsectos provenían originalmente del focoendémico de leishmaniasis visceral ubicado enel valle alto del río Magdalena en el departamentode Cundinamarca; la cepa de Leishmania, delmunicipio de Quipile (4° 44' 03" LN, 74° 33' 47"LO), y los flebótomos de la vereda El Callejón enel municipio de Ricaurte (4° 18' LN, 74° 42' LO )(23). Las hembras alimentadas, es decir, aquéllasen las que se podía observar la ingestión desangre, se pasaron a una jaula de muselina de20 x 20 cm, a una temperatura entre los 22 y 25°C. La jaula con las hembras se introdujo en unabolsa de plástico para mantener la humedad

relativa (70%). Como fuente de carbohidrato, seofreció diariamente a las hembras una soluciónazucarada (saturada) embebida en motas dealgodón colocadas en la parte superior de la jaula.La presencia de flagelados se confirmó porobservación directa con ayuda de un microscopiode luz a 400X, el día siete postalimentación. Losintestinos positivos y negativos se preservaronpara los ensayos de PCR.

Entre ocho y doce días después de la comidainfectiva, el resto de las hembras se retiró de lasjaulas y se preservaron individualmente en lostubos de reacción, en tres soluciones diferentes:etanol al 100% (41 muestras), etanol al 70% (51muestras) y buffer Tris EDTA (TE pH 8) (93muestras). Submuestras de las muestrasanteriores, en cada una de las soluciones, sepreservaron a -80 °C, -20 °C y temperaturaambiente.

Extracción del ADN

Uno o dos días antes de la extracción, lashembras individualizadas y sin disecar, setrituraron manualmente para romper los tejidos.Con ayuda de una varilla de vidrio muy fina (0,1cm), cada hembra se molió en el mismo tubo, enel medio de almacenamiento en el que fueronpreservadas. Después del proceso, los tubos conlas muestras se colocaron nuevamente a latemperatura correspondiente. El protocolo parala obtención del ADN fue el siguiente: 1)centrifugación durante 3 minutos a 10.000 rpm;2) eliminación del sobrenadante; 3) adición de100 µl de Chelex 100 al 5%; 4) incubación de lasmuestras a 56 °C durante 30 minutos en bañoMaría; 5) agitación en vórtex durante 10segundos; 6) ebullición durante 8 minutos; 7)agitación en vórtex durante 10 segundos; 8)centrifugación durante 3 minutos a 10.000 rpm,y 9) obtención del ADN del sobrenadante comoplantilla para la PCR.

Amplificación por PCR del ADN mitocondrial

La amplificación se realizó utilizando comoiniciadores un par de oligonucleótidos universalespara Leishmania diseñados sobre un área de laregión conservada de los minicírculos del

KADN,

OL1: GGG GAG GGG CGT TCT GCG AA (16) yOL2: CCG CCC CTA TTT TAC ACC AAC CCC

298


(15,24,25), que produce una banda de ≈120pares de bases. EL volumen final por tubo dereacción fue de 50 µl, de los cuales 4 µlcorrespondían a la plantilla de ADN de cada unade las muestras y 46 µl de la mezcla de reacción,que contenía 400 ng de cada iniciador, 2,0 mMde MgCl

2, 0,05 mM de dNTPs, 0,05 U de Taq

polimerasa y el buffer (Promega) 1X, el cualcontiene 10 mM de Tris-HCl (pH 9,0 a 25 °C), 50mM KCl y 0,1% de Triton R X-100.

El proceso de amplificación se realizó en untermociclador Perkin-Elmer 2.400 bajo lassiguientes condiciones: predenaturación durante4 minutos a 94 °C, seguido por 30 ciclos dedenaturación a 94 °C durante 30 segundos,anillaje a 55 °C durante 30 segundos y extensióna 72 °C durante 30 segundos, con una extensiónadicional de 10 minutos a 72 °C. Como controlde reacción se utilizó la misma cepa de L. chagasisuministrada a los insectos en el proceso deinfección y como control negativo se preparó eldía de la extracción un intestino de L. longipalpisde colonia con 48 horas de nacido, siguiendo elmismo procedimiento descrito para las muestras.

Del producto amplificado se tomaron 12 µl y semezclaron con 4 µl de buffer de carga, el cualcontenía azul de bromofenol al 0,1%. Laelectroforesis se realizó en geles de agarosa al1%, teñidos con bromuro de etidio y visualizadoscon luz UV. Como marcador de peso molecularse empleó el fago x174 digerido con Hae lll.

Resultados

De las 185 hembras alimentadas con la mezclaparásito y sangre, se disecaron 40 (21,6%) y losintestinos se observaron directamente almicroscopio de luz, registrando un porcentaje depositividad superior al 95%. El resultado de laPCR fue negativo para los intestinos señaladoscomo negativos por observación directa (3,5%)y positivo para los intestinos infectados conpromastigotes (96,5%).

Una submuestra de 21 hembras de las 145alimentadas y no disecadas se incluyeron en losensayos de PCR. La positividad fue del 81%.

Usando la reacción en cadena de la polimerasase obtuvo la banda esperada a partir de material

preservado en etanol al 100%, etanol al 70% yen buffer Tris EDTA (TE, pH 8). Se observaronúnicamente bandas de ≈120 pares de basescorrespondientes al fragmento de la regiónconservada del

KADN de Leishmania.

La obtención del ADN por el método descritoresultó adecuada y eficiente, permitiendo lavisualización de la banda esperada en geles deagarosa después de 30 ciclos de amplificación.Todos los productos mostraron una intensidaduniforme sugiriendo una concentración similar enestas muestras. La figura 1 permite observarproductos amplificados de las muestrasalmacenadas en los tres medios a temperaturaambiente. La figura 2 enseña los productos delas muestras de ejemplares completos,almacenados en cada uno de los medios y bajolas tres temperaturas establecidas.

Discusión

Actualmente, la detección de parásitos del géneroLeishmania en los insectos incluye métodos quevan desde la búsqueda directa de los flageladosen el tracto digestivo del insecto hasta técnicasmoleculares que usan principalmente

KADN

(12,26-30). La técnica de reacción en cadena dela polimerasa (PCR), por su alta sensibilidad yespecificidad, ha facilitado adelantar estudios eco-epidemiológicos en áreas de alta endemicidad,suministrando datos más precisos en periodos detiempo más cortos (17,29). Aunque la correctaamplificación del ADN depende especialmente dela apropiada selección de los iniciadores, en losestudios de incriminación vectorial, el método dealmacenamiento de la muestra y el proceso deextracción son dos aspectos importantes quecontribuyen al éxito de esta amplificación. Loanterior teniendo en cuenta que, además del ADNdel parásito, existe la posibilidad de contar conla presencia de ADN de tejidos del insecto, deotros parásitos o de microorganismos que puedeninhibir o interferir en la reacción.

En el presente estudio se evaluó la PCR comouna técnica útil en la detección de parásitos deLeishmania presentes en el insecto vector. Laincorporación del uso del Chelex 100 en elproceso de extracción de ADN de protozoarios apartir de muestras de pequeños insectos es una

299

Biomédica 2002;22:296-302CABRERA O.L., MUNSTERMANN L.E., CÁRDENAS R., GUTIÉRREZ R., FERRO C.

alternativa práctica y eficiente frente a otrosprotocolos (31). La experiencia de Schriefer etal. (20) es diferente a la nuestra respecto a laextracción de ADN con Chelex 100, considerandoque ellos tuvieron algunas dificultades paradetectar infección con parásitos de malaria tantoen mosquitos individuales como en pequeñosvolúmenes de sangre. En nuestro ensayo, el ADNde Leishmania en flebótomos infectadosexperimentalmente se pudo visualizar sin ningúnproblema (figura 1).

En cuanto a los medios de almacenamiento adiferentes temperaturas en este ensayo, losresultados demostraron que no hay alteración delADN del parásito en los insectos infectadosexperimentalmente en ninguna de lascombinaciones realizadas (figura 2). Teniendo encuenta que los resultados obtenidos con etanolal 70% a temperatura ambiente son iguales, porun lado, a los obtenidos con esta misma solucióna -20 °C y -80 °C y, por el otro, con los de lasotras dos soluciones, etanol al 100% y con TE(buffer Tris-EDTA), en las tres temperaturasevaluadas. Por costos, facilidad de adquisición ymanejo de las muestras en condiciones decampo, para estudios de incriminación de

Figura 1. Resultados de las muestras en diferentes mediosa temperatura ambiente. Carril 1: MPM; carril 2: controlpositivo, cultivo L. chagasi; carril 3: control negativo, intestinode un insecto alimentado con la mezcla infectiva; carril 4:intestino con flagelados en TE, con visualización de labanda; carril 5: muestra de un insecto expuesto al alimentoinfectivo sin visualización de la banda; carriles 6, 7 y 8:insectos completos sin disecar expuestos al alimentoinfectivo, almacenados respectivamente en TE, etanol al70% y etanol 100% con visualización de la banda.

vectores de leishmaniasis, se recomienda utilizaretanol al 70% a temperatura ambiente.

No obstante, se necesitan futuros estudios parallegar a la caracterización e identificaciónetiológica de los parásitos y vectorescomprometidos en los ciclos de transmisión enáreas endémicas de leishmaniasis en el país,especialmente de leishmaniasis cutánea, ya queparásitos y vectores varían con la distribucióngeográfica de la enfermedad (32).

En conclusión, para estudios de incriminaciónvectorial, el etanol al 70% a temperatura ambientees la forma de almacenamiento adecuada parainsectos del género Lutzomyia. Además, estosresultados muestran la ventaja de incorporar laPCR para detectar flebótomos infectados enzonas endémicas de leishmaniasis visceral, comotécnica de rutina.

Agradecimientos

A Magaly Sandoval del CINTROP-UIS, por suasesoría y colaboración; a Martha Ayala delLaboratorio de Parasitología del INS por elsuministro del cultivo de Leishmania chagasi; aVíctor A. Olano del Laboratorio de Entomologíapor la lectura del documento. El estudio fuefinanciado por el Instituto Nacional de Salud de

Figura 2. Resultados de las muestras en diferentes mediosy temperaturas. Carril 1: MPM; carril 2: control positivo,cultivo L. chagasi; carril 3: control negativo, insecto decolonia en TE; carril 4: muestra de un insecto expuesto alalimento infectivo, almacenado en TE a -70 °C, convisualización de la banda; carriles 5 y 7: insectos completossin disecar expuestos al alimento infectivo, almacenadosen etanol al 70% a temperatura ambiente, con visualizaciónde la banda; carriles 6 y 8: intestino con flagelados en etanolal 100% a -20 °C con visualización de la banda.

300


Colombia y los National Institutes of Health deEstados Unidos, a través de Yale University.

Referencias

1. De Azebedo A, Monteiro F, Cabello PH, De SouzaNA, Rosa-Freitas MG, Rangel EF. Studies onpopulations of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva,1912) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) in Brazil.Mem Inst Oswaldo Cruz 2000;95:305-22.

2. Arrivillaga JC, Rangel YN, Oviedo M, Feliciangeli MD.Correlated morphologic and genetic diversity amongLutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae) collectionsin Venezuela. J Am Mos Control Assoc 2000; 16:171-4.

3. Arrivillaga JC, Rangel YN, Oviedo M, Feliciangeli MD.Genetic divergence among Venezuelan populations ofLutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae:Phlebotominae). J Med Entomol 2000;37:325-30.

4. Young DG, Duncan M. Guide to the identification andgeographic distribution of Lutzomyia sand flies in Mexico,the West Indies, Central and South America (Diptera:Psychodidae). Mem Am Entomol Inst 1994;54: 1-881.

5. Travi BL, Vélez ID, Brutus L, Segura I, Jaramillo C,Montoya J. Lutzomyia evansi an alternate vector ofLeishmania chagasi in a Colombian focus of visceralleishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg 1990;84:676-7.

6. Zeledón R, Murrillo J, Gutiérrez H. Observacionessobre la ecología de Lutzomyia longipalpis (Lutz &Neiva, 1912) y posibilidades de existencia deleishmaniasis visceral en Costa Rica. Mem Inst OswaldoCruz 1984;79:455-9.

7. Feliciangeli MD, Rodriguez N, De Guglielmo Z,Rodriguez A. The re-emergence of American visceralleishmaniasis in an old focus in Venezuela. II. Vectorsand parasites. Parasite 1999;6:113-20.

8. Killick-Kendrick R. Phlebotomine vectors of theleishmaniasis: a review. Med and Vet Entomol 1990;4:1-24.

9. Young DG, Morales A, Kreutzer RD, Alexander JB,Corredor A, Tesh RB. Isolations of Leishmaniabraziliensis from cryopreserved Colombian sand flies(Diptera: Psychodidae). J Med Entomol 1987;24:587-9.

10. Ferro C, Morrison AC, Torres M, Pardo R, WilsonML, Tesh RB. Age structure, blood-feeding behavior,and Leishmania chagasi infection in Lutzomyialongipalpis (Diptera: Psychodidae) at an endemic focusof visceral leishmaniasis in Colombia. J Med Entomol1995;32:618-29.

11. Uribe S, Porter C, Velez ID. Amplificación y obtenciónde secuencias de rRNA mitocondrial en Lutzomyia spp.(Diptera: Psychodidae) vectores de leishmaniasis. RevColombiana Entomol 1998;24:109-15.

12. Aransay AM, Scoulica E, Tselentis Y. Detection andidentification of Leishmania DNA within naturally infectedsand flies by seminested PCR on minicircle kinetoplasticDNA. Appl Environ Microbiol 2000;66:1933-8.

13. Uezato H, Hagiwara K, Hosokawa A, Maruno M,Nonaka S, Oshiro M, et al . Comparative studies of thedetection rates of Leishmania parasites from formalin,ethanol-fixed, frozen human skin specimens bypolymerase chain reaction and Southern blotting. JDermatol 1998;25:623-31.

14. Rodríguez N, Guzmán B, Rodas A, Takiff H, BloomBR, Convit J. Diagnosis of cutaneous leishmaniasis andspecies discrimination of parasites by PCR andhibridization. J Clin Microbiol 1994;32:2246-52.

15. Pirmez C, Trajano V, Paes-Oliveira M, Da-Cruz AM,Goncalves DA, Costa SC, et al . Use of PCR indiagnosis of human American tegumentaryleishmaniasis in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol1999;37:1819-23.

16. Romero GAS, Guerra MVF, Paes MG, Cupolillo E,Toaldo CB, Macêdo VO, et al . Sensitivity of thepolymerase chain reaction for the diagnosis of cutaneousleishmaniasis due to Leishmania (Viannia) guyanensis.Acta Trop 2001;79:225-9.

17. Barrios MA, Rodríguez N, Feliciangeli MD, Ulrich M,Telles S, Pinardi ME, et al . Coexistence of two speciesof Leishmania in the digestive tract of the vectorLutzomyia ovallesi. Am J Trop Med Hyg 1994;51:669-75.

18. Rodríguez N, De Lima H, Rodríguez A, Brewster S,Barker DC. Genomic DNA repeat from Leishmania(Viannia) braziliensis (Venezuelan strain) containingsimple repeats and mocrosatelites. Parasitology 1997;115:349-58.

19. Mukherjee S, Hassan MQ, Ghosh A, Ghosh KN,Bhattacharya A, Adhya S. Short report: LeishmaniaDNA in Phlebotomus and Sergentomyia species duringa kala-azar epidemic. Am J Trop Med Hyg 1997;57:423-5.

20. Schriefer ME, Sacci JB, Wirtz RA, Azad AF. Detectionof polymerase chain reaction-amplified malarial DNA ininfected blood and individual mosquitoes. Exp Parasitol1991;73:311-6.

21. Sandoval M, Gutiérrez R, Cárdenas R, Cabrera OL,Ferro C. Estandarización de la técnica de reacción encadena de la polimerasa para estudios de infecciónnatural de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae). Biomédica1999;19:122.

22. Killick-Kendrick R, Leaney AJ, Ready PD. Theestablishment, maintenance and productivity of alaboratory colony of Lutzomyia longipalpis (Diptera:Psychodidae). J Med Entomol 1977;13:429-40.

301

Biomédica 2002;22:296-302CABRERA O.L., MUNSTERMANN L.E., CÁRDENAS R., GUTIÉRREZ R., FERRO C.

23. Morrison AC, Ferro C, Morales A, Tesh R, WilsonML. Dispersal of the sand fly Lutzomyia longipalpis(Diptera: Psychodidae) at an endemic focus of visceralleishmaniasis in Colombia. J Med Entomol1993;30:427-35.

24. Oliveira-Neto MP, Pirmez MC, Fernandes O,Gonçalves-Costa SC, Silva de Souza SF, GrimaldiG Jr. Mucosal leishmaniasis ("espundia") responsiveto low dose of n-methyl glucamine (Glucantime ®) inRio de Janeiro, Brazil. Rev Inst Med trop S Paulo 2000;42:321-5.

25. Miranda JC, Reis E, Gonçalves M, Reis M, FernadesO, Barral-Netto M, et al . Combination of pinpointedphlebotomine capture and PCR for Leishmania improvesdetection of naturally infected Lutzomyia. Mem InstOswaldo Cruz 1997;92:504.

26. Rogers WO, Burnheim PF, Wirth DF. Detection ofLeishmania within sand flies by kinetoplast DNAhibridization. Am J Trop Med Hyg 1988;39:434-9.

27. Lopez M, Inga R, Cangalaya M, Echevarría J, Llano-Cuentas A, Orrego C, et al. Diagnosis of Leishmaniausing the polymerase chain reaction: a simplifiedprocedure for field work. Am J Trop Med Hyg1993;49:348-56.

28. Feliciangeli MD, Rodríguez N, Bravo A, Arias F,Guzmán B. Vectors of cutaneous leishmaniasis innorth-central Venezuela. Med Vet Entomol 1994;8:317-24.

29. Noyes HA, Reyburn H, Bailey W, Smith D. A nested-PCR-based schizodeme method for identifyingLeishmania kinetoplast minicircle classes directly fromclinical samples and its application to the study of theepidemiology of Leishmania tropica in Pakistan. J clinMicrobiol 1998;36:2877-81.

30. Rodríguez N, Aguilar CM, Barrios MA, Barker DC.Detection of Leishmania braziliensis in naturally infectedindividual sand flies by the polymerase chain reaction.Trans R Soc Trop Med Hyg 1999;93:47-9.

31. Isaza DM, Arboleda M, Restrepo M, McCann SHE,Barker DC. Validation of the polymerase chain reactionfor the diagnosis of human cutaneous leishmaniasis innorth-west Colombia. Trans R Soc Trop Med Hyg 2002;96:165-8.

32. Ferro C, Morales A. Flebótomos de ColXXombia:estudios realizados por el Laboratorio de Entomología,1965-1997. En: Toro G, Hernández CA, Raad J, editores.Instituto Nacional de Salud, 1917-1997: una historia,un compromiso. Bogotá, D.C.: Instituto Nacional deSalud; 1998. p.77-94.

302

SELECCIONES DEL IQEN

Inf Quinc Epidemiol Nac 2002;7:113-33

Biomédica 2002;22:303-16

La mortalidad por sida y su impacto económico enCartagena de Indias, Colombia, 1995-2000

Nelson Alvis 1, Juan Correa Reyes 1, Alvaro Carcamo 2

1 Universidad de Cartagena, Cartagena, Colombia.2 Departamento Administrativo Distrital de Salud, DADIS, Cartagena, Colombia

De todos los problemas que enfrentan los paísespobres, indudablemente la pandemia del sida esel más dramático. La pandemia ha llegado a todoslos países y en muchos la situación haempeorado rápidamente. A pesar de que lapandemia del sida es un problema global,presenta diferentes facetas en distintos lugares(1).

Para 1999, en los países en desarrollo, el 35%de las muertes fueron por causas infecciosas,frente al 7% de los países desarrollados. El sida,para el mismo año, ocasionó el 5,5% de lasmuertes por enfermedades infecciosas en paísesen desarrollo, superado sólo por las neumoníasy muy por encima de las diarreas (2). La OMS haestablecido los métodos para calcular latendencia de la epidemia de sida en las distintaspartes del mundo, así como la carga de laenfermedad (3). El impacto socioeconómico delVIH/SIDA no sólo es importante para el individuoy su familia, frente a los altos costos querepresenta el tratamiento, sino que generapérdidas en la productividad individual pordisminución de capacidades en el trabajo ypérdidas del capital humano por muertes en lapoblación económicamente activa (4,5).

Desde el inicio de la epidemia en una comunidad,ciertas consecuencias son inevitables, aunqueinicialmente sean inadvertibles. La extensión yvelocidad de tales consecuencias depende de laefectividad de los programas de prevención y dela voluntad y capacidad de la sociedad paraencarar el impacto.

Se pueden distinguir varias fases en la epidemiade sida:

• Fase 1: existen personas infectadas con VIHy los casos de sida no son detectados por losservicios de salud.

• Fase 2: existen más personas infectadas conVIH y algunos casos de sida son detectadospor los servicios de salud.

• Fase 3: los casos de sida son importantes paralos servicios de salud y existe algún grado deconciencia entre los planificadores yformuladores de políticas acerca de laepidemia de VIH/SIDA. Se informa unincremento en los casos de tuberculosis.

• Fase 4: el número de casos de sida puedecolocar en riesgo la sostenibilidad de losservicios de salud. Existe amplia concienciaen la población general sobre la epidemia deVIH/SIDA.

• Fase 5: se presentan inusitados niveles deenfermedad grave y muerte en el grupo de 15a 50 años de edad, lo cual genera problemascomo un significativo número de huérfanos,pérdida de los jefes de hogar y de personasen edad productiva de la comunidad. Latuberculosis es uno de las mayores causas demuerte.

• Fase 6: se presenta pérdida de recursoshumanos, en especial entre la poblacióneconómicamente activa. Se genera un impactodemográfico que afecta la capacidad de lacomunidad, las empresas y el gobierno. Estasituación genera respuestas innovadoras paraafrontar el impacto socioeconómico. Talestipos de respuestas se observan en algunospaíses, regiones, empresas e, incluso, en loshogares (6).

En Colombia, desde el inicio de la epidemia deVIH/SIDA hasta noviembre de 2001, seregistraron a través de la ficha de notificación

303

SELECCIONES DEL IQEN Biomédica 2002;22:303-16

obligatoria, 13.166 casos de infección por VIH,6.437 casos de sida y 3.722 muertes (7).

En Cartagena de Indias, Colombia, luego de 19años de haberse identificado el primer caso desida, la epidemia presenta un marcadocrecimiento que se refleja en el incremento delas tasas de incidencia, sobre todo de hombresen edad productiva.

La mortalidad por sida es una de las formas demedir el impacto ocasionado por este evento. Ental sentido, el presente estudio pretende describirlos niveles y las tendencias de la mortalidad porsida en Cartagena entre 1995 y 2000 y determinarlos años perdidos de vida potencial (APVP) y losaños perdidos de vida potencial productiva(APVPP) por esta enfermedad, así como valorarel impacto económico que la mortalidad por sidagenera para la sociedad.

El diseño metodológico del indicador APVPpermite evaluar la importancia de una causa demuerte, combinando simultáneamente loscriterios de magnitud y temporalidad, al suponerque una defunción que ocurre 'antes de loesperado' provoca una pérdida de vida potencialcuya magnitud en años es mayor cuanto másjoven es la persona que fallece, dandoimportancia no sólo a la frecuencia de una causade muerte en la población, sino también a la edaden que dicha causa produce esas defunciones.Además, en el estudio se hace una comparacióncon otras causas principales de muerte para elmismo periodo. Por último, la valoracióneconómica de la mortalidad por sida permiteestimar el impacto de esta entidad sobre el capitalhumano de la ciudad.

El estudio se llevó a cabo en Cartagena, situadaa orillas del mar Caribe colombiano; contaba con834.449 habitantes en el 2000 y es la quintaciudad más poblada de Colombia (9). Tambiénes el primer puerto marítimo en movimiento decarga de comercio exterior y el principal poloturístico del país. La ciudad, por su importanciahistórica, ha sido un atractivo polo receptor demigrantes que ha llevado su población total a unvalor cercano al millón de habitantes en laactualidad (2001).

Según el Dane, existen 81.487 familias residiendoen Cartagena, de las cuales 6.423 corresponden

a familias unipersonales y 75.064 a familiasmultipersonales (64% familias completas y 28%familias incompletas). Se describen, en promedio,11 personas por familia (hacinamiento), lo queincide sobre la salud pública en general alconsiderar la característica de ciudadconcentrada en un núcleo urbano. Con referenciaa la participación laboral, la población deCartagena es económicamente inactiva en sugran mayoría, pues de 834.449 personas,solamente 374.281 (45%) están económicamenteactivas. Esta situación se torna más grave cuandose discrimina esta cifra, pues de tal valor se debenrestar los desocupados, que en el 2000ascendían a 78.593, lo cual hace descender laparticipación laboral a un 35,5%. Igualmente,debe destacarse que, entre los inactivos, lamayoría se encuentra en edad de trabajar(262.222), lo cual ocasiona que la tasa dedependencia económica por cada personaocupada en la ciudad ascienda a 3 personas enpromedio.

La ciudad presenta altos niveles de pobreza (51%de los residentes de la ciudad son pobres,SISBEN 1 y 2). Finalmente, es importante resaltarque la población ocupada en el sector formal dela economía representa el 47,8%; si se aplica altotal de la población, se encuentra que el sectorformal sólo representa el 17% de la poblacióntotal, el 22% de la población en edad de trabajary el 37,7% de la población económicamenteactiva. Lo anterior significa que el perfilocupacional es de una ciudad dedicada a losservicios y al comercio, con recursos deinformática y donde los ingresos de las personasocupadas están muy referidos al salario mínimomensual y sólo una tercera parte tiene ingresossuperiores aunque limitados, en promedio, a 3salarios mínimos.

En síntesis, como tendencia general se puededescribir a la ciudad como un importante puertoy polo de atracción económica, pero con unadeuda social con sus residentes que se expresaen deficitarias condiciones de vida para lamayoría de la población.


Para la elaboración de los indicadores delpresente estudio, se tomaron como referencia lasbases de datos de los registros de mortalidad que

304

Biomédica 2002;22:303-16 SELECCIONES DEL IQEN

el Departamento Administrativo Distrital de Saludde la ciudad de Cartagena de Indias procesóentre 1995 y 2000, dado que sólo a partir de 1994esta oficina realiza la recolección yprocesamiento de los registros oficiales demortalidad que, posteriormente, son trasladadosal Departamento Nacional de Estadísticas deColombia (Dane) para su procesamientodefinitivo. Además, se tomó la notificación decasos de VIH/SIDA proporcionada por la Oficinade Epidemiología del DADIS y por el InstitutoNacional de Salud. Para los fines de este estudio,se entiende como sida la etapa terminal de lainfección por el virus de la inmunodeficienciahumana (VIH), durante la cual se presenta undeterioro inmunológico grave que da lugar a laaparición de patologías oportunistas.

Es importante indicar el alto nivel de subregistrode casos de sida como causa de muerte. Seestima que en Colombia, por cada caso registradoen el sistema de vigilancia epidemiológica delprograma de ETS/VIH, existen 7 casos que noestán diagnosticados ni registrados (1). Además,es de anotar que por la historia natural de lainfección, consistente en el deterioro del sistemainmunológico del individuo infectado, desarrollainfecciones oportunistas o neoplasias queinducen a generar certificados médicos queindican como causa de muerte este tipo depatologías y no al sida, específicamente.

A esta situación se suma un proceso desubregistro y subnotificación por la falta dediagnóstico del padecimiento a causa deineficiencia en la atención médica de lospacientes o, incluso, por el cambio de diagnósticoen forma intencionada, dada la estigmatizaciónsocial que representa el diagnóstico de sida,particularmente por el estereotipo de transmisiónsexual en algunos grupos marginados y por eldeseo del médico tratante o de los familiares deno ser estigmatizados, aún después de fallecidoel paciente. Es indudable que estos factores, aligual que los relativos a la subnotificación y elretraso en la notificación de casos de sida,propician - en caso de no ser corregidos pormétodos adecuados - que los estimadores demagnitud e impacto del sida constituyan unasubestimación del comportamiento real de estaenfermedad como epidemia. Sin embargo, dichasestadísticas proveen, al menos, un límite inferior

de la cuantificación del proceso de infección porel VIH/SIDA (10).

Para calcular las tasas, se utilizaron los datos depoblación estimados por el Dane. Laspoblaciones estimadas para Cartagena para elperíodo 1995-2000, se basan en las proyeccionesoficiales del censo nacional de población de 1993(11).

El impacto de la mortalidad se midió mediante lasuma de APVP. Los años de vida perdidos paracada defunción son la esperanza de vida a laedad de muerte, obtenida de una tabla de vidade baja mortalidad (West 26, modificada).Además, se establecen diferencias entre lasesperanzas de vida para hombres y mujeres dadoque para éstas es superior, por lo que en igualdadde edad, la muerte de una mujer supone másaños de vida perdidos. Para el ajuste de lapreferencia temporal, se aplica una tasa dedescuento del 3%, lo cual permite incrementar elpeso de las muertes de adultos y ancianos.Además, se ponderan los años vividos a cadaedad para incrementar el peso de las muertesde adultos jóvenes (3).

Para la medición de los APVP y APVPP, se utilizóel programa GESMOR; se analizaron los registrosde mortalidad que utilizan la 9a y 10a revisión (CIE-9 y CIE-10) para establecer las causas básicasde muerte. Para la estimación de los APVPP acausa del sida, se consideró el inicio de la vidaproductiva a los 15 años y el límite superior de60 años para ambos sexos.

En el momento de considerar la valoracióneconómica de la mortalidad por sida, se reconocela dificultad para valorar los impactos de lamorbilidad y la mortalidad sobre la vida humanay los beneficios que generan las intervencionesen los sistemas de salud en procura de suprevención o mitigación. Sin embargo, la teoría decapital humano, basada en el supuesto de quetodas las capacidades que el hombre posee parala producción de bienes o servicios se puedenmantener o mejorar con las intervenciones de salud,o deteriorarse e, incluso, desaparecer con laenfermedad y la muerte, se convierte en el marcoteórico que sustenta la metodología para explicar yanalizar el impacto de las enfermedades(morbilidad, discapacidad y mortalidad) (12).

305


En tal sentido, existen dos formas de aproximarsea valorar la vida humana para efecto demediciones económicas.

La primera consiste en colocar en valor presentelos años o la salud que obtiene un individuodurante su esperanza de vida. Esta se haaplicado para efectos legales con el fin de poderestimar los costos de indemnizaciones por dañosa la salud o muerte de los individuos. Tambiénse ha utilizado para medir la pérdida deproducción que genera la morbilidad o lamortalidad como proporción de la producción totalde la sociedad.

Por otra parte, la segunda forma consiste enmedir la disponibilidad a pagar, por parte de losindividuos, para mantener su nivel de salud oevitar la enfermedad, la discapacidad y la muerte.Esta segunda forma se usa más por parte de loseconomistas de la salud para medir la pérdida oganancia de bienestar como criterio de eficiencia.De igual modo, esto soporta los estudiosactuariales de riesgo de las compañíasaseguradoras para establecer el valor de lasprimas por las pólizas de seguros de vida o salud(13,14).

Para efectos del presente estudio, optamos porla primera forma para lo cual hemos estimadolos siguientes pasos:

1) Se asumió como supuesto básico que cadaindividuo gana o consume en promedio, porlo menos, un salario mínimo de ingreso.

2) El valor del salario mínimo mensual se tomóde los registros oficiales del Dane y en cadaaño se multiplica por los 12 meses (15).

3) Se tomó la base de precios del Dane ajustadaa diciembre de 1998 y se ajustó al año basedel estudio de los años de vida perdidos, quees el 2000.

4) Se procedió a proyectar todos los salariosmínimos anuales de 1995 a 2000 paradeterminar su valor en pesos constantes dediciembre de 2000.

5) Se multiplicó el total de años perdidos de cadaperiodo anual por el valor del salario mínimoanual correspondiente a pesos constantes.

6) Finalmente, se efectuó la sumatoria paraestablecer el valor total del costo de los años

de vida perdidos en el periodo en pesosconstantes del año 2000.

Por otro lado, la valoración económica en dólaresse realizó mediante los siguientes pasos:

1) Se tomó el salario mínimo anualizado aprecios corrientes.

2) Se procedió a dividir el salario mínimoanualizado por el valor promedio del dólar(tasa representativa) certificado por el Bancode la Republica.

3) Obtenido el ingreso en dólares anuales, seprocedió a corregir los ingresos en dólares porel demérito ocasionado por la inflación enColombia para obtener el poder de comprade tales dólares en el año 2000.

4) Se calculó el valor en dólares de los añosperdidos de vida potencial y productivos porcada año.

5) Se obtuvo el costo a valor presente de los añosde vida perdidos para el periodo en dólaresPPA del 2000.

Finalmente, se procedió a determinar el costoanual equivalente durante el periodo 1995-2000,para lo cual se tomó como tasa de descuento el3% anual, que fue el valor utilizado por elprograma GESMOR para calcular los años devida perdidos. Este procedimiento se aplica tantopara las estimaciones en pesos de 2000 comoen dólares PPA 2000.

Los datos se integraron en un formatoestandarizado, se procesaron, se analizaron y sepresentaron en una variedad de formas paraconstituir un conjunto completo de referencia.Para el procesamiento de los datos, se utilizó lahoja electrónica de Excel 7.0 y el programaGESMOR diseñado para estudios de carga de laenfermedad (Pereira y Cañón, Instituto Carlos III,Madrid, por encargo del BID y la RedIberoamericana José Luis Bobadilla de Políticasde Salud).

Resultados

Tendencias de la incidencia

Entre 1990 y 2000, se informaron 727 casos deVIH/SIDA en Cartagena con un predominio del

306


sexo masculino, 70%. La tasa de incidencia por100.000 hab pasa de 0,47 casos en 1990 a 14,2casos en el 2000, lo que marca el perfil epidémicode esta patología (tabla 1). La situación puedeser más crítica al ajustar los casos no reportadospor la subnotificación y el retraso en el reporte.

Es de resaltar que en ambos sexos entre 1995 y2000, se presentó el 84,5% de los casos (n=614);se estableció una tendencia creciente positiva detipo potencial en la tasa de incidencia (figura 1).

Durante el periodo de estudio, la razón deincidencia hombre:mujer de los casos de VIH/SIDA se incrementó con mayor impacto en loshombres (figura 2).

Finalmente, en la tabla 2 se observa que el grupode edad con mayor incidencia de casos es el de15 a 44 años, que acumulan el 89,4% de loscasos. Igualmente, el grupo en más alto riesgoes el de 25 a 29 con un 24,3%, seguido por elgrupo de 30 a 34 años con el 20,2% de los casos.

La mortalidad por sida, según género y edad

Con referencia a la mortalidad, durante el períodode 1995 a 2000 se notificaron 310 muertes, delas cuales el 83% se registró en hombres(tabla 3).

La tasa de mortalidad por cien mil habitantes enambos sexos pasó de 4,1 a 7,0 entre 1995 y2000, es decir, sufrió un incremento del 70%. Enhombres, dicha tasa pasó de 8,1 a 9,5 y enmujeres, de 0,5 a 4,7 durante el mismo período;es decir, que mientras la mortalidad en hombressólo creció en 17%, en mujeres se multiplicó por9,4. Es de anotar que la tasa media del períodoen hombres fue de 10,5 y en mujeres de 1,9. Asímismo, las tasas más bajas del período seregistraron en 1996 con 5,2 en hombres y 0,2 enmujeres (por 100.000 hab). Las tasas demortalidad por sida más altas se produjeron paralos hombres en 1998 con 15,2 y para las mujeresen el 2000 con 4,7 (figura 3).

Tabla 1. Casos de VIH/SIDA reportados en ambos sexos, Cartagena, 1990-2000.

Años Hombres Mujeres Total Tasa por 100.000 hab

Hombres Mujeres Total

1990 3 0 3 0,98 - 0,471991 13 0 13 4,05 - 1,941992 13 3 16 3,88 0,83 2,291993 18 15 33 5,16 3,97 4,541994 43 5 48 11,81 1,27 6,331995 40 23 63 10,68 5,67 8,071996 38 30 68 9,85 7,18 8,461997 60 42 102 15,09 9,75 12,321998 100 38 138 24,44 8,57 16,191999 87 28 115 20,66 6,14 13,112000 96 32 128 22,17 6,82 14,19

Total 511 216 727

Fuente: cálculo de los autores a partir de cifras suministradas por la Oficina de Epidemiología, DADIS, Cartagena, 2001.

Tasa

s X 1

00

.00

0 h

abts

.

20

15

10

5

1990 1991 1992 1994 1995 1996 1997 1999 2000

0,47 1,94 2,29 6,33 8,07 8,45 12,35 13,11 14,19Ambos sexos

y= 0,5621xR = 0,976

1,4338

2

Figura 1. Incidencia de VIH/SIDA en ambos sexos,Cartagena, 1990-2000.

4

3

2

1

0

1,74

1,271,43

2,63

3,11 3

1995 1996 1997 1998 1999 2000

Figura 2. Razón de incidencia de VIH/SIDA hombre-mujer,Cartagena, 1995-2000.

307


En 1997, el sida apareció por primera vez dentrode las primeras 20 causas de mortalidad generalen ambos sexos con puesto decimosexto. Parael 2000, el sida como causa de mortalidad generalocupó el puesto 17. Sin embargo, para hombresentre 15 y 44 años es la segunda causa de muerteluego de las muertes por arma de fuego (16).Entre 1995 y 2000, el sida mantuvo en promediouna relación entre tres y cuatro casos en hombre

Tabla 2. Distribución por edades de los casos de VIH/SIDA,ambos sexos, Cartagena, 1990-2000.

Edad N % % acumulado

0 3 0,4 0,4 1-4 17 2,3 2,7 5-9 0 0,0 2,710-14 6 0,8 3,515-19 29 4,0 7,520-24 141 19,4 26,925-29 177 24,3 51,230-34 147 20,2 71,435-39 107 14,7 86,140-44 9 6,7 92,845-49 25 3,4 96,250-54 5 0,7 96,955-59 11 1,5 98,460-64 3 0,4 98,865-69 4 0,6 99,470 + 3 0,4 100,0

TOTAL 727 100,0%

Fuente: cálculo de los autores a partir de cifras suministradas por laOficina de Epidemiología, DADIS, Cartagena, 2001.

Tabla 3. Mortalidad por sida por grupos de edad en ambos sexos, Cartagena, 1995-2000.

Edad 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Total

H M H M H M H M H M H M H M

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 0 0 1 21-4 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 3 05-9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 010-14 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 015-19 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 3 0 5 120-24 2 0 0 0 1 1 6 2 7 2 9 3 25 825-29 4 0 3 0 14 0 5 3 8 2 15 9 49 1430-34 8 1 7 0 9 0 8 6 14 1 2 1 48 935-39 5 1 6 0 5 1 17 1 10 1 7 3 50 740-44 6 0 3 1 7 1 7 1 6 0 1 3 30 645-49 1 0 1 0 1 1 8 0 5 0 3 3 19 450-54 2 0 0 0 1 1 1 0 2 0 1 0 7 155-59 0 0 0 0 2 0 3 0 2 0 0 0 7 060-64 0 0 0 0 1 0 1 0 2 0 0 0 4 065-69 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 3 070 + 0 0 0 0 0 0 2 0 3 1 0 0 5 1

Total 30 2 20 1 43 5 62 14 61 9 41 22 257 53

Fuente: cálculo de los autores a partir de datos de la Oficina Asesora de Planeación, DADIS, 2001.

por cada caso en mujer. Sin embargo, la razónde tasas de mortalidad entre hombres y mujeresse mantuvo en promedio de diez a uno contendencia decreciente. Lo anterior implica unatendencia al crecimiento y no a la estabilizaciónde la epidemia.

La letalidad para los casos acumulados de sidadurante el periodo (figura 4) tiene uncomportamiento diferencial por sexo, contendencias distintas. Para los hombres, aunquela letalidad es abiertamente superior a la de lasmujeres, la tendencia es logarítmica negativapartiendo de un 75% en 1995 y llegando al 61%al final del período.

Por el contrario, la letalidad en las mujerespresenta una tendencia polinómica positivapartiendo de 8,7% y con un 27,5% durante el2000. Ello permite mantener una tendencia

80

60

40

20

0

%

1995 1996 1997 1998 1999 2000

Mujeres Hombres Ambos sexos

Figura 3. Letalidad por sida sobre acumulado de casos,Cartagena, 1995-2000.

308


Figura 4. Tasas de mortalidad por sida por 100.000habitantes, Cartagena de Indias 1995-2000.

relativamente estable para ambos sexos con unamedia de 47,3% la cual se superó a partir de1997.

La edad promedio observada en el momento defallecer por sida en el periodo analizado, semantuvo prácticamente constante con cifras muysemejantes en ambos sexos (33,6 años enmujeres y 34,4 en hombres). En lo referente a lamortalidad por sida, dentro de los diferentesgrupos de edad, se observó que sólo hasta 1997se registraron muertes en los menores de 15 yen los mayores de 70 años.

Sin embargo, el sida ocupa un sitio cada vez másimportante en la mortalidad de ciertos grupos deedad. El aumento observado en la mortalidad en

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

1995 1996

Hombres Mujeres Ambos sexos

1997 1998 1999 2000

Tasa

s X

10

0.0

00

hab

ts.

Tabla 4. Tasa específica de mortalidad por sida por grupos de edad y sexos por 100 mil habitantes, Cartagena de Indias1995-2000.

Edad 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Media del período

H M H M H M H M H M H M H M

0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8,9 20,8 0,0 0,0 1,5 3,501-04 0,0 0,0 0,0 0,0 4,6 0,0 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,1 0,005-09 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,010-14 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,4 0,015-19 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,1 1,7 2,0 0,0 6,0 0,0 1,7 0,320-24 4,6 0,0 0,0 0,0 2,2 1,8 12,7 3,6 14,4 3,9 18,0 5,1 8,6 2,425-29 11,2 0,0 8,2 0,0 37,0 0,0 12,8 6,5 19,9 4,7 36,4 18,4 20,9 4,930-34 29,9 3,0 25,4 0,0 31,7 0,0 27,3 16,6 46,5 3,0 6,5 2,6 27,9 4,235-39 25,1 4,8 29,3 0,0 23,7 4,5 78,3 4,4 44,7 4,8 30,5 12,4 38,6 5,140-44 37,3 0,0 18,1 7,5 41,0 7,3 39,8 7,1 33,2 0,0 5,4 20,1 29,1 7,045-49 8,5 0,0 8,3 0,0 8,0 7,0 62,4 0,0 37,9 0,0 22,1 19,3 24,5 4,450-54 19,6 0,0 0,0 0,0 9,2 7,9 9,0 0,0 17,4 0,0 8,5 0,0 10,6 1,355-59 0,0 0,0 0,0 0,0 23,7 0,0 34,6 0,0 22,4 0,0 0,0 0,0 13,5 0,060-64 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 0,0 16,2 0,0 31,4 0,0 0,0 0,0 10,7 0,065-69 46,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 21,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 11,3 0,070 + 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 66,0 0,0 32,0 20,9 0,0 0,0 16,3 3,5

Total 8,1 0,5 5,2 0,2 10,9 1,2 15,2 3,1 14,3 1,5 9,5 4,7 10,5 1,9

Fuente: cálculo de los autores a partir de datos de la Oficina Asesora de Planeación, DADIS, 2001.

la población general y masculina de 15 a 44 añosse ha multiplicado dos veces entre 1995 y 2000y en mujeres se incrementó diez veces pasandode 2 a 22 muertes para el mismo período.

La tasa de mortalidad por cien mil habitantesrevela que la tendencia es al desplazamiento alos grupos de edad cada vez más jóvenes enhombres; se observa que mientras el grupo deedad de 20 a 24 años incrementó en más decuatro veces su tasa, el grupo entre 30 y 34 añosla redujo casi cinco veces y el grupo de 35 a 39apenas la incrementó en un 15% en el períodode 1995 a 2000 (tabla 4).

La mortalidad por sida en el grupo de 15 a 24años de edad fue sólo de 2 casos en 1995mientras que en el 2000 fue de 12 casos enhombres. En mujeres, para este mismo grupo deedad, sólo hasta 1997 se presentó el primer casode fallecimiento y en el 2000 se registraron 3muertes. En cuanto al papel del sida como causaprincipal de muerte en este grupo de edad, sepuede señalar que de una tasa de mortalidad de1,04 por 100.000 hab en 1995, pasó a una de6,81 en el 2000. En las mujeres, la situación esparecida y sus muertes por sida se concentranmás en las edades de 20 a 34 años para el 2000(tabla 4).

309


La proporción de muertes por sida en el grupode 25 a 44 años de edad representó el 69,1%del total de las muertes registradas por dichaenfermedad entre 1995 y 2000. Para las mujeres,67,9% de las muertes notificadas en el lapsoanalizado se dieron entre los 25 y los 44 años y,en el caso de los varones, el 68,9%. Ello significaque poco más de una de cada dos muertes acausa del sida ocurre en estos grupos de edad,lo cual destaca más en el subgrupo de 25 a 34años, ya que aquí se concentra el 44,6% del totalde los casos ocurridos en Cartagena en la décadade los noventa. En el grupo de 25 a 34 años, latasa de mortalidad ascendió entre 1995 y 2000de 9,4 a 16,9 por 100.000 hab. En hombres, enel mismo periodo, la tasa de mortalidad ascendióde 19,2 a 23,5 y en mujeres del 1,3 al 11,4 por100.000 hab.

La mortalidad por sida en el grupo de 35 a 44años mantiene una tasa constante de 17,2 por100.000 hab entre 1995 y el 2000. Para el grupode 45 a 69 años, la tasa pasó de 5,8 en 1995 a7,0 por 100.000 hab en el 2000.

En resumen, el grupo de 15 a 69 años pasó deuna tasa de 6,6 por 100.000 hab en 1995, a 11,2en 2000, apareciendo entre las 20 primerascausas de muerte para este último año. Por loque respecta a la población masculina, se puedeseñalar que el sida aparece como la causa 15 demuerte en el 2000, con un ascenso en las tasasde mortalidad al pasar de 8,06 por 100 000 haben 1995, a 9,53 en 2000; en mujeres, el sidaocupó el lugar 19 como principal causa de muerteen 2000.

En cuanto al desplazamiento que realiza el sidacomo causa de muerte en el momento de revisary establecer las primeras causas en hombres ymujeres, encontramos que en hombres el sidacomo causa de muerte pasa del 6º al 2º lugardurante el período de estudio en el grupo de 15 a44 años y, en las mujeres, para el 2000, el sidapasa a ser la séptima causa de muerte en estegrupo de edad (10).

Años perdidos de vida potencial

De 1995 a 2000, en Cartagena se presentaron343.193 APVP, de los cuales el 2,4%correspondieron a sida (8.080 APVP).

Es importante resaltar que, desde 1997, la cifraanual de APVP viene creciendo por encima delpromedio y sólo ha disminuido en el 2000 por lamigración de muertes a grupos de mayor edad.Esto lo explica el hecho que mientras laspersonas vivas agotan sus años individualmenteen un determinado año, las muertes losconsumen en lapsos cuya duración varía segúnla edad al fallecer y la esperanza de vida al nacer.La tendencia de crecimiento de la tasa de APVPpor 100.000 hab presenta un patrón polinomial ypasa de 101 a 201 en el período de 1995 a 2000,lo cual correspondería al periodo de 1993 a 1997presentado por Colombia según el estudio deMinsalud-INS (figuras 6 y 7). Para la poblaciónnacional se ha descrito una tasa media de 457APVP por 1.000 hab entre 15 y 44 años y explicanlas diferencias el hecho que mientras paraCartagena no es importante la mortalidad por sidaen los grupos de edad de menos de 15 años, sílo es en el agregado nacional (5).

De los 8.080 APVP, los hombres aportaron 6.603y 1.477 las mujeres. Esto significa que laspérdidas de productividad social en hombres

Tabla 5. Años perdidos de vida potencial total y por sida,Cartagena, 1995-2000.

Año APVP total AVP sida %

1995 52.920 789 1,5%1996 40.892 545 1,3%1997 45.781 1.254 2,7%1998 70.683 1.916 2,7%1999 60.849 1.763 2,9%2000 72.067 1.813 2,5%

Total 343.193 8.080 2,4%

250

Tasa d

e A

PV

P

X 1

00

.00

0 h

abs

y= -4,6899x + 60,609x + 16,828

R = 0,7321

2

2

200

150

100

50

0

1995 1996 1997 1998 1999 2000

201201224,7151,467,7101,1APVP

Figura 5. Tasa de APVP por sida por 100.000 hab,Cartagena, 1995-2000.

310

SELECCIONES DEL IQENBiomédica 2002;22:303-16

equivalen al 81,7% mientras que las mujeres sólorepresentaron el 18,3%; es decir, una relaciónde 4,47 APVP en hombres por 1 APVP enmujeres (tabla 6). Los grupos de edad mássignificativos son los hombres entre los 30 y los44 años, seguidos por los que tienen entre 15 y29 años los cuales alcanzan una participacióndel 71,6%.

Asimismo, es importante resaltar que la mayorpérdida se produce en el 2000 entre el grupo deedad de 15 a 29 en ambos sexos que alcanza el15,6% de todo el periodo (tabla 6).

Años perdidos de vida potencial productiva

El mayor impacto se da en hombres entre 15 y29 años (878 años) el cual se inicia con unapérdida de 191,9 años en 1995 y alcanza los521,1 años en el 2000. Este comportamientocontrasta con lo observado en hombres de 30 a44 años donde las pérdidas por fallecimientospasaron de 478,8 años en 1995 hasta 251,9 añosen el 2000, significa disminución de la proporción

Tabla 6. Años perdidos de vida potencial por sida, Cartagena, 1995-2000.

Edades 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Total

Hombres 0-4 0 0 70,4 38,5 33,2 0 142,05-14 0 0 0 37,3 0 0 37,315-29 191,9 93,3 469,1 394,0 521,1 878,1 2.547,530-44 478,8 410,7 528,5 798,9 771,6 251,9 3.240,445-59 49,6 18,5 59,5 202,0 149,2 71,1 550,060-69 15,5 0 10,1 17,8 20,2 0 63,770 + 0 0 0.0 11,3 10,9 0 22,2

Subtotal 735,8 522,5 1.137,7 1.499,8 1.506,2 1.201,1 6.603,1

Mujeres 0-4 0 0 0 0 66,5 0 66,55-14 0 0 0 0 0 0 015-29 0 0 34,0 198,3 130,8 384,2 747,330-44 53,6 22,1 47,3 217,5 53,6 170,3 564,445-59 0 0 35,2 0 0 57,2 92,460-69 0 0 0 0 0 0 070 + 0 0 0 0 6,4 0 6,4

Subtotal 53,6 22,1 116,6 415,7 257,2 611,7 1.476,9

Total 0-4 0 0 70,4 38,5 99,7 0 208,55-14 0 0 0 37,3 0 0 37,315-29 191,9 93,3 503,1 592,3 651,9 1.262,3 3.294,830-44 532,4 432,8 575,8 1016,4 825,2 422,2 3.804,845-59 49,6 18,5 94,7 202 149,2 128,3 642,460-69 15,5 0 10,1 17,8 20,2 0 63,770 + 0 0 0 11,3 17,3 0 28,6

Total 789,4 544,6 1.254.1 1.915,6 1.763,5 1.812,8 8.080,1

de 60,6% en 1995 a 13,9% en el 2000. Igualmentemerece destacarse el crecimiento de los APVPPpor mortalidad femenina pasando de 34 años en1997 a perder 384,2 en el 2000, lo cual representaun incremento de más de 10 veces en el periodo(tabla 7).

Es pertinente señalar que no se observandiferencias significativas entre las pérdidas en lavida potencial y de vida potencial productiva porestar concentrada la epidemia en la poblaciónen edad de trabajar.

Valoración económica de los APVPP

Al aplicar la metodología referenciada se lograestablecer la valoración económica de losresultados anteriores (tabla 8) y entre los quemerecen destacarse los siguientes:

- El valor de los APVP por las 310 personasfallecidas en Cartagena asciende - en pesoscolombianos de 2000 - a $2.211,3 millones(1995) y $5.658,1 millones (2000). Ello implica

311


un incremento de 2,5 veces en la carga pormortalidad por sida en Cartagena durante elperiodo de estudio.

- Entre 1998 y 2000, el valor de los APVP seha mantenido constante en una suma anualequivalente a $5.000 millones de pesos delaño 2000.

- La tendencia anterior se mantuvo al analizarel comportamiento de los APVPP, pues elvalor comienza en $ 2.167 millones del 2000(1995) y termina en $5.658,1 millones depesos (2000).

- Igual sucede con el peso ponderado delperiodo 1998-2000 donde el valor de los

APVPP corresponde a una pérdida anualequivalente a $5.000 millones de pesos del año2000.

Para colocar los resultados en perspectivanacional y mundial se procedió a realizar suhomologación en valores internacionales con lossiguiente resultados (tabla 9):

- El valor de la pérdida de los APVP de laspersonas fallecidas en el periodo 1995-2000se incrementa desde $2,4 millones de dólaresPPA 2000 (1995) hasta $2,7 millones dedólares PPA 2000 (2000). Esto implica que auncon la variación del poder adquisitivo del dólar,se registra crecimiento en la pérdida de capitalhumano por esta causa de muerte.

Tabla 7. APVPP por sida, Cartagena, 1995-2000.

Edades 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Hombres 15-29 191,9 93,3 469,1 394,0 521,1 878,130-44 478,8 410,7 528,5 798,9 771,6 251,945-59 49,6 18,5 59,5 202,0 149,2 71,1

Subtotal 735,8 522,5 1.137,7 1.499,8 1,506,2 1.201,1

Mujeres 15-29 0,0 00 34.0 198,3 130,8 384,230-44 150,152 62,350 135,091 623,487 165,169 531,54045-59 0.0 0.0 35,2 0.0 0.0 57,2

Subtotal 53,6 22,1 116,6 415,7 257,2 611,7

15-29 191,9 93,3 503,1 592,3 651,9 1.262,3

Total 30-44 532,4 432,8 575,8 1.016,4 825,2 422,245-59 49,6 18,5 94,7 202 149,2 128,3

Total 789,4 544,6 1.254,1 1.915,6 1.763,5 1.812,8

Tabla 8. Valoración económica (miles de pesos) de los APVP Y APVPP por sida, Cartagena, 1995-2000.

Conceptos Años

1995 1996 1997 1998 1999 2000

Salario mínimo anual(pesos corrientes) 1.427 1.706 2.064 2.446 2.838 3.121Salario mínimo anual(pesos constantes del 2000) 2.801 2.821 2.856 2.867 3.082 3.121Valor total de los APVP 1.126.633 928.819 2.588.538 4.685.389 5.003.967 5.658.111(pesos corrientes)Valor total de los APVP 2.211.379 1.536.451 3.581.778 5.491.276 5.434.256 5.658.111(pesos constantes del 2000)Valor total de los APVP 1.104.512 928.819 2.422.381 4.428.813 4.614.659 5.658.111(pesos corrientes)Valor total de los APVPP 2.167.958 1.536.451 3.351.866 5.190.569 5.011.472 5.658.111(pesos constantes del 2000)

312


- A partir de 1997, los APVP de las personasfallecidas por sida se encuentra en una cifraanual cercana a los $3 millones de dólaresPPA 2000.

- Con respecto a los APVPP, el comportamientoes similar aunque un poco menos, dado queel valor inicial de $2,4 millones de dólares PPA2000 (1995) se mantiene por debajo de $3millones en 1997, llega hasta $3,6 millonesen 1998 y luego desciende hasta una cifraequivalente a $2,7 millones de dólares PPA2000 en el año 2000.

- Esta tendencia se mantiene a pesar de que elvalor previsto de la remuneración se reduceen términos reales de US$3.069 PPA 2000en 1995 a US$1.495 PPA 2000, lo querepresenta una pérdida por la inflación delpoder adquisitivo en el tiempo equivalente ala mitad de los ingresos estimados.

Es evidente que no existe mucha diferencia entreel valor equivalente de los APVP y los APVPP

Tabla 9. Valoración económica en dólares de los APVP y APVPP por mortalidad por sida, Cartagena, 1995-2000.

Conceptos Años

1995 1996 1997 1998 1999 2000

Salario mínimo anual 1.564 1.645 1.809 1.714 1.614 1.495

Salario mínimo anual 3.069 2.722 2.503 2.009 1.752 1.495

Valor total de los APVP 2.422.685 1.482.274 3.138.937 3.848.018 3.090.138 2.710.576

Valor total de los APVPP 2.375.115 1.482.274 2.937.450 3.637.297 2.849.726 2.710.576

por los grupos de edad donde se concentra lamortalidad; por tal razón, se procede a examinarmás en detalle este fenómeno en la tabla 10, conlos siguientes resultados:

- En el 2000, más de dos terceras partes delvalor de los APVPP (69,9%) son generadospor la población que murió entre los 15 y los29 años, mientras que en 1995 sólorepresentaban un 24,8%, es decir, menos deuna cuarta parte.

- Los hombres de ese grupo de edad (15-29años) en el 2000 son quienes aportaban casila mitad de todo el valor de los APVPP(48,4%), mientras que en 1995 el valoraportado ascendía al 24,8%, es decir, que estaparticipación se duplicó en el periodo.

Con respecto a las mujeres es importantedestacar:

- Las mujeres entre 15 y 29 años, que en 1995y 1996 no tuvieron participación dentro delvalor por APVPP, subieron desde 1997 de una

Tabla 10. Valoración económica en miles de pesos constantes de 2000 de las APVPP por sida, Cartagena, 1995-2000.

Edades 1995 1996 1997 1998 1999 2000

Hombres 15-29 537,577 263,222 1,339,775 1,129,444 1,605,779 2,740,72630-44 1,341,282 1,158,686 1,509,425 2,290,134 2,377,699 786,23045-59 138,947 52,193 169,935 579,055 459,762 221,917

Subtotal 2,017,806 1,474,101 3,019,135 3,998,633 4,443,240 3,748,873

Mujeres 15-29 0 0 97,106 568,449 403,062 1,199,16530-44 150,152 62,350 135,091 623,487 165,169 531,54045-59 0 0 100,533 0 0 178,533

Subtotal 150,152 62,350 332,730 1,191,936 568,232 1,909,238

Total 15-29 537,577 263,222 1,436,881 1,697,892 2,008,841 3,939,89130-44 1,491,434 1,221,035 1,644,516 2,913,621 2,542,868 1,317,77145-59 138,947 52,193 270,468 579,055 459,762 400,450

Total 2,167,958 1,536,451 3,351,866 5,190,569 5,011,472 5,658,111

313

Biomédica 2002;22:303-16SELECCIONES DEL IQEN

suma equivalente a $97 millones de pesosdel año 2000 a $1.199 millones de pesos delaño 2000 en ese mismo año.

- Lo anterior contrasta con la disminución delgrupo de edad de hombres entre los 30 y 44años que, de una pérdida equivalente a$1.341 millones de pesos del año 2000 a$786,2 millones de pesos del año 2000 en elmismo, pasó de representar el grupo de edadcon mayores pérdidas de APVPP a ser eltercer grupo después de los mencionadosanteriormente.

Valoración económica total y anualequivalente de los APVP y los APVPP porsida en Cartagena

Con el uso de la metodología prevista, se efectuóla sumatoria del valor total de los APVP y losAPVPP de las 310 personas fallecidas en todoel periodo y la estimación del valor por anualidadtanto en pesos constantes del 2000 como endólares PPA ajustado al 2000. Los resultadosfueron los siguientes (tabla 11):

- El valor total de los años perdidos en la vidapotencial de los fallecidos en el periodo 1995-2000, si hubieran consumido por lo menosun salario mínimo en promedio, asciende auna suma equivalente a $23.913 millones depesos del año 2000.

- El valor total de los años perdidos en la vidaproductiva de las personas fallecidas en edadde trabajar durante el periodo 1995-2000, sihubieran obtenido un ingreso de por lo menosun salario mínimo, asciende a una suma

Tabla 11. Valoración económica de los APVPP por sida, Cartagena, 1995-2000.

Costos del período Costo total 1995 - 2000 Costo anual equivalente

Años Perdidos de Vida Potencial(miles de pesos constantes de 2000) 23’913.250 4’414.326

Años Perdidos de Vida Potencial Productiva(miles de pesos constantes de 2000) 22’916.425 4’230.314

Años Perdidos de Vida Potencial(dólares PPA 2000) 16’692.629 3’081.418

Años Perdidos de Vida Potencial productiva(dólares PPA 2000) 15’992.439 2’952.164

mínima de $22.916 millones de pesosconstantes del año 2000.

- La diferencia entre el nivel de pérdidas entrela vida potencial y la productiva representaen el periodo una suma equivalente a $997millones del año 2000, lo cual constituye unporcentaje diferencial del 4%.

- Cuando la estimación se realiza en dólares,el valor de los APVP representa un total de$16,6 millones de dólares del año 2000 parael mismo lapso, mientras que los APVPPrepresentan $15,9 millones de dólares del año2000.

- La diferencia entre estas estimacionesrepresentan una suma equivalente a US$700mil en el periodo 1995-2000, es decir, unporcentaje similar al valor en pesos, el 4,2%.

- Con referencia al costo anual equivalente delos APVP en pesos constantes del año 2000,representa una anualidad (un mismo pago enel tiempo) de $4.414 millones de pesos del2000, mientras que el valor anualizado de losAPVPP es de $4.230 millones de pesos delmismo año.

- Con respecto al valor anualizado en dólareslos APVP, representan US$3 millones dedólares PPA 2000 y los APVPP alcanzanUS$2,95 millones de dólares PPA 2000 enpérdidas para la sociedad por las menoresoportunidades de generar ingresos oconsumos por parte de los residentesfallecidos.

Conclusiones y recomendaciones de política

Aún considerando la subnotificación en lamortalidad y el informe de casos de sida, la

314

SELECCIONES DEL IQENBiomédica 2002;22:303-16

primera se ha incrementado rápidamente y ocupaposiciones cada vez más importantes dentro delas primeras causas de mortalidad general deCartagena en los últimos años. La tasa deincidencia de casos por 100.000 habitantesalcanzó para el 2000 un 14,19%, lo cual contrastacon lo registrado para la mima fecha para todo elpaís (2,49 casos por millón de habitantes), conuna tendencia de tipo potencial en la tasa deincidencia, lo que implica que de no corregirsetal tendencia, en el futuro (10 años), el sida seráel trazador con mayor evolución e impacto en lamorbilidad de Cartagena, con las implicacionessociales y económicas que ello representa y quepueden estimarse a partir de estudios como elpresente.

Con respecto a la mortalidad, la tasa por 100.000habitantes en ambos sexos pasó de 4,1 a 7,0entre 1995 y el 2000, es decir, sufrió unincremento del 70%; para el nivel nacional, elregistro de defunciones por 100.000 habitanteses de 0,20 para el 2000. Esto demuestra laconsistencia de la tendencia de la mortalidad porsida en Cartagena con la incidencia de casos.Además, se mantiene una letalidad cercana al50% de los casos acumulados registradosdurante el período. La situación en mujeres esmás dramática que en hombres, dado que enéstos la mortalidad creció en 17%, mientras queen mujeres se multiplicó por 9,4 veces. En 1998,se registró la incidencia más alta tanto de casoscomo de muertes, lo cual corresponde a unperíodo de mayor búsqueda activa y revela lacertidumbre del subregistro para el resto de añosdel estudio.

De acuerdo con las tendencias de mortalidad porcausas específicas en hombres en los grupos deedad analizados, se puede señalar que el sidaempieza a impactar gravemente el grupo de 15 a44 años en el que, para el año 2000, se consolidócomo la segunda causa de muerte con una tasapor 100.000 hab de 21,49, luego de las muertespor arma de fuego. Esto ha provocado, al menospotencialmente, a través del reemplazo de otrascausas de muerte importantes, cambios en elpatrón epidemiológico, sin contar los posiblesefectos negativos en la mortalidad general, víala asociación tuberculosis-sida (aumento de

epidemias secundarias de tuberculosis), la mayorincidencia de niños huérfanos con lasconsecuentes reducciones en sus probabilidadesde supervivencia.

La mortalidad femenina por sida es igualmenteimportante para el grupo de 15 a 44 años y ocupala séptima causa de muerte para dicho grupo conuna tasa de 2,44 por 100.000 hab. Es decir, larazón de tasas de mortalidad por sidahombre:mujer para este grupo de edad es de 10a 1. Aún se mantiene la mortalidad por sida enmujeres por debajo de la del cáncer de cuellouterino, el infarto agudo del miocardio y lasmuertes violentas.

El impacto económico que implica la mediciónde la carga de mortalidad por sida en Cartagena,dadas sus condiciones de ciudad portuaria yturística, ocasiona un costo de oportunidadimportante sobre sus posibilidades de futuro, alconvertirse en un trazador de mortalidad parahombres y mujeres en edad productiva, lo cualimplica un deterioro del capital humano. Es deconsiderar que la situación descrita, respecto ala epidemia de sida en Cartagena, permiteclasificarla entre las fases 3 y 4 descritaspreviamente, lo cual implica que el conocimientode las tendencias y la corrección de las mismaspermitirán evitar el avance a fases quecomprometen no sólo la sostenibilidad de losservicios de salud para afrontar la epidemia, sinoel capital humano, que es la reserva másimportante de cualquier sociedad. Por elcontrario, si se mantienen las tendencias, haciafinales de la presente década representaríaefectos de población y económicos comparablescon los que ha generado la violencia en Colombia.

En tal sentido, además de las recomendacionesdel Instituto Nacional de Salud, es prioritariointensificar los programas con estrategia integralde investigación acción participante. Ellopermitiría incrementar la efectividad y la eficienciade las actividades realizadas. Por tanto,recomendamos:

·avanzar en la implementación de programas querescaten, mediante tareas investigativas, elperfil de conocimientos, actitudes y prácticas

315


cual permitirá hacer más coherentes y efectivaslas acciones de prevención;

·mejorar la monitorización de la epidemia con elfin de controlar el subregistro y establecer suscaracterísticas;

·determinar la efectividad y medir los costoseconómicos asociados con las accionespreventivas, diagnósticas y de tratamiento quese llevan a cabo en los programas de luchacontra el sida;

·estimar los costos económicos que representapara la sociedad colombiana la epidemia desida en términos de pérdida de productividad;

·realizar nuevas investigaciones, no sólo en loreferente APVP, APVPP y su valoracióneconómica, sino a la determinación de loscostos económicos de las intervenciones quese vienen realizando en materia de prevencióny mitigación de la epidemia. Para ello, esimportante considerar no sólo los APVP sinola ganancia potencial en la expectativa de vida(GPLE) a partir de evitar muertes medianteintervenciones preventivas (18).

Agradecimientos

Los autores agradecen a Robinson Castro y RaúlQuejada por sus comentarios y aportes para ladefinición de la metodología de cálculo del valorajustado de los dólares con poder adquisitivo decompra.

Referencias

1. WHO. Macroeconomics and health: investing in healthfor economic development. Report of the Commissionon Macroeconomics and Health. Geneva: World HealthOrganization; 2001. p.47-8.

2. Pereira J. El peso de la enfermedad. Trujillo (Perú);2002.

3. Mertens TE, Low-Beer D. ¿Hacia dónde se encaminala epidemia de infección por VIH y SIDA? Rev PanamSalud Publica 1997;1:220-8.

4. Castilla J, Martínez de Aragón MV, Gutiérrez J, LlacerA, Belza MJ, Ruiz C, Pérez de la Paz J, Noguer I.Impact of human immunodeficiency virus infection onmortality among young men and women in Spain. Int JEpidemiol 1997;26:1346-51.

5. Gómez M, Fernández D, Otero J, Miranda S, HunterR. The shape of the HIV/AIDS epidemic in Puerto Rico.Rev Panam Salud Pública 2000;7:377-83.

6. Barnett T, Whiteside A. Guidelines for studies of thesocial and economic impact of HIV/AIDS. Geneva,Switzerland: UNAIDS; 2000. p.10-26.

7. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud.Situación de la enfermedades de transmisión sexual,Colombia, 1976-2000. Inf Quinc Epidemiol Nal 2001;6:329-47.

8. Cavazos Ortega N, del Río Zolezzi A, Izazola LiceaJA, Lezana Fernández MA, Valdespino Gómez JL.Años de vida potencial perdidos: su utilidad en el análisisde la mortalidad en México. Salud Pública Méx 1989;31:610-24.

9. Pereira J, Cañón C, Alvarez E, Génova R. La magnitudde los problemas de salud en el ámbito internacional:los estudios de carga de la enfermedad. Revista deAdministración Sanitaria 2001;5:441-66.

10. Izazola-Licea J, Valde-García M, Sánchez-Pérez H,Del Río-Chiriboga C. La mortalidad por el sida enMéxico de 1983 a 1992: tendencias y años perdidos devida potencial. Salud Pública Méx 1995;37:140-8.

11. DANE. Proyecciones de población por edad y sexo,1990-2015. Series estudios censales Nº 2. Bogotá:Dane; 1998.

12. Arredondo A. Economía de la salud para AméricaLatina: un marco para el análisis y la acción de lossistemas de salud. Lima, Perú: Universidad Nacionalde San Marcos; p.59-62.

13. Follan S. The economics of health and health care.Second edition. Rio de Janeiro: Prentice Hall do BrasilLtda.; 1993. p.572-5.

14. Drummond M, Stoddart G, Torrance G. Métodos parala evaluación económica de los programas de salud.Madrid: Ed. Diaz de Santos; 1991. p.187-210.

15. Departamento Nacional de Estadísticas. SeriesEstadísticas 2001. Bogotá: Dane; 2001.

16. Alvis N. Análisis de la situación de salud desde lamortalidad: caso de Cartagena de Indias, 1995-2000.Cartagena: Departamento Administrativo Distrital deSalud; 2001.

17. Organización Panamericana de la Salud,Organización Mundial de la Salud. Vigilancia del sidaen las Américas. Informe bianual 2001. Washington,D.C.: OPS; 2001.

18. Lai D, Hardy R. Potential gains in life expectancy oryears of potential life lost: impact of competing risk ofdeath. Int J Epidemiol 1999;28:894-8.

316

COMENTARIO BIBLIOGRÁFICO

Obregón Torres, Diana. Batallas contra la lepra:estado, medicina y ciencia en Colombia. Medellín:Banco de la República, Fondo EditorialUniversidad EAFIT; 2002.ISBN 958-81-7308-6

422 páginas con 12 páginas de fotografías deinstituciones y personajes en blanco y negro.

Diana Obregón es profesora de historia de laUniversidad Nacional, doctorada en 1996 en elVirginia Polytechnic Institute & State Universityde Estados Unidos, con una tesis de grado que,actualizada y con adición de otros capítulosconstituye la base del presente libro, obraganadora del premio Alejandro Angel Escobar delaño 2001, en el área de ciencias sociales.

Estudiando el origen de las sociedades científicasen Colombia y la influencia de la bacteriologíaen la medicina colombiana, nos cuenta la doctoraDiana que la lepra aparecía por todas partes, porlo cual decidió estudiar en profundidad los"efectos sociales, culturales y políticos de la omni-presencia de la lepra en la historia de Colombia",cuyo resultado es este libro.

La obra se basa en la revisión de la literaturamundial y nacional pertinentes, profusamentecomentada, en documentos oficiales, en lasvoces de algunos pacientes y en entrevistas conpocos actores de la misma historia.

El libro analiza el concepto de lepra en elmedioevo, en buena parte derivado del Levítico,y cómo este concepto consideraba a la lepracomo enfermedad impura, degradante, quemerecía el aislamiento del enfermo en lazaretos,el primero de los cuales se estableció enCartagena en 1608. Los enfermos se aislabanpara que la gente no viera el espectáculodesagradable de su desfiguración y no comomedida preventiva de diseminación de laenfermedad o para su tratamiento. Los lazaretosno fueron lugares de atención médica para losenfermos sino sitios de reclusión y aislamiento,inclusive hasta su cierre en 1961. Fueron lugaresen los cuales charlatanes y médicos prosperaronofreciendo curaciones milagrosas o mágicas o

con base en el aceite de chalmugra. El conceptomedioeval de la lepra predominó en Colombiahasta 1880, cuando nacieron algunas sociedadescientíficas y se difundió más la idea del origenbacteriano de la enfermedad, descubierto porHansen en Noruega en 1874. Las influenciaseuropeas y de Hawai extremaron las necesidadesde aislamiento y lanzaron conceptos como losde la lepra como propia de razas inferiores, deborrachos, de negras que podrían pasarlas ablancos que tuvieran intimidades con ellas y comoenfermedad tropical (estando presente enEuropa), que representaba un peligro potencialpara el 'imperio británico', ideas aceptadas pornuestros dirigentes de entonces.

El análisis de los trabajos de Juan de DiosCarrasquilla sobre la seroterapia y la transmisiónde la lepra por pulgas, así como el cultivo delbacilo por Federico Lleras Acosta o la reacciónque diseñó para diagnosticar la enfermedad sonaspectos relevantes del libro, analizados con susentido cultural, político y en su trascendenciainternacional. Por ejemplo, la 'reacción Lleras' seusaba en 1949, cuando ya se sabía que no servíapara nada, pero el peso de la tradición y delpersonaje eran demasiado grandes como paradescartarla. Guillermo Muñoz Rivas recogió laidea de Carrasquilla sobre la transmisión de lalepra por las pulgas (1905), se hizo famoso consus hallazgos, fue premiado en Rio de Janeiropor ellos (1947), hecho que sirvió para que laprensa liberal criticara el gobierno de OspinaPérez, que no lo había apoyado para asistir alCongreso de Río; este trabajo y estas críticassirvieron para mejorar luego las condiciones devivienda, para combatir la lepra y otrasenfermedades; enfatizaron que no sólo el baciloera culpable, sino que las condiciones de miseriade los enfermos eran igual de importantes.

Muñoz Rivas es analizado como un científico'hipernormal', término usado para referirse alinvestigador minucioso que escudriña cada puntode su investigación hasta el mínimo detalle, peroque no contribuye substancialmente al problema

317

central que su investigación representa, unconcepto que merece ser tenido en cuenta pornuestros investigadores.

La influencia médica llegó a inventar la cifra de20.000 leprosos en Colombia, a finales del sigloXIX, para resaltar la importancia de la enfermedadque sólo los médicos debían enfrentar, cifras quelos religiosos llevaron a 50.000 para obtener máslimosnas y donaciones. Se pensó en adecuar laisla de Coiba en el océano Pacífico, al frente dePanamá, para aislar a los enfermos, siguiendo elejemplo de la isla Molokai en Hawai. Estosnúmeros trascendieron internacionalmente y,luego, la lucha fue para demostrar que Colombiaera un país sano, seguro, adecuado para lainversión extranjera, con menos de 4.000enfermos de lepra. Sin embargo, el confinamientode los enfermos en los lazaretos se hizoobligatorio y más riguroso. Los ciudadanosdebían denunciar a los enfermos de lepra antelas autoridades, para que fueran conducidos aAgua de Dios u otros lazaretos. El secretoprofesional de los médicos podía no cumplirsecon los leprosos, a quienes ellos también debíandenunciar ante la autoridad respectiva. Perodenunciaban a los pobres y no a los ricos quepodían sufragar sus consultas.

Con la reducción de su impacto social y político,los leprólogos desaparecieron, hecho aún masjustificado por la aparición de la quimioterapiaantileprosa desde 1941. De ser la lepra laenfermedad más importante del país, queconsumía el 75% del presupuesto nacional dehigiene, pasó al sexto lugar, luego de lasenfermedades de la infancia, tropicales,alcoholismo, sífilis y tuberculosis. Dice la autoraque se ha llegado al punto que "la mayoría de

los trabajadores de la salud son incapaces dediagnosticarla", lo cual es un tanto exagerado,pero no mucho.

El libro explora el papel que jugó la lepra en elorigen y desarrollo de la salud pública enColombia y el uso de la enfermedad paraconsolidar la profesión médica como grupoinfluyente y de poder en la sociedad colombianaa finales del siglo XIX. Nos hace pensar en todoel desarrollo social, administrativo, político,legislativo, racista y colonialista, así como en lanecesidad de poder cultural y económico,inclusive el de los médicos, que estuvo presenteal lado de la lepra. Intereses entre los cuales casinunca se pensó en el paciente, en su tratamientoy su bienestar, como sí se hizo en Noruega, cuyoejemplo no se entendió. El enfermo de lepra debíaestar aislado fundamentalmente para que noimpresionara a la sociedad con su presencia.

El libro presenta las estadísticas de lepra enColombia para 1991, que hubieran podidoactualizarse. Es una obra excelente que nos hacereflexionar sobre "una enfernedad religiosa", "uncastigo de Dios", que originó actividades de todaclase, con hondas repercusiones en la legislaciónsobre la salud pública en el país, sin tener encuenta al enfermo como el objetivo esencial deestos procedimientos. Para los médicos es unareflexión sobre la cantidad de circunstanciaspresentes más allá del acto médico deldiagnóstico, la baciloscopia y el tratamiento.

Gerzaín RodríguezLaboratorio de Patología, Instituto Nacional deSalud; Profesor titular, Departamento dePatología, Universidad Nacional de Colombia.

318

2002_biomedica_223[1]

Documents

Transcript of 2002_biomedica_223[1]