Procedimientos experimentales

Técnicas para medir niveles estacionarios de RNA

Caracterización del patrón de expresión

Northern blot

A un cultivo bacteriano, se le extrae el RNA en las diferentes condiciones a ensayar. Extraer el RNA es muy complicado, debido a

que las RNasas son muy estables y degradan rápidamente el RNA; por ello, se debe utilizar siempre dietilpirocarbonato ( DEPC ) que inhibe la función de estas enzimas por unión a los residuos de Histidina de sus sitios activos.

Al RNA obtenido se le debe realizar una electroforesis en gel , observando el patrón logrado, y luego pasando a una membrana para

realizar un Northern Blot . Ya en la membrana se realiza la identificación del RNA buscado utilizando una sonda por hibridación .

Surge la pregunta de cómo nos aseguramos que los resultados obtenidos se puedan relacionar con la expresión celular y que no hay ningún problema técnico. Para ello, junto con la hibridación del gen buscado, se realiza la hibridación de un gen de expresión

constitutiva , denominado: ESTÁNDAR INTERNO. Utilizando un contador de pixeles, se puede comparar la cantidad de gen constitutivo y obtener así un resultado en cuanto a la cantidad de RNA buscado que tenemos. El gen de control interno debe expresarse en iguales o similares cantidades en la mayoría de los tipos celulares y su expresión no debe ser estimulada o modificada por factores ambientales o por las condiciones en las que se realiza el ensayo.

Ejemplos de genes estándar son: actina, GAPDH (gliceraldehido 3fosfato deshidrogenasa), MHC I (complejo de histocompatibilidad mayor I), RPLPO, housekeeping genes, rRNA del 28 S o del 18S etc.

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Canti dadrelativa de RNA expresado= Cantidad de RNAtargetCantidad de RNA estándar

La contra que tiene este método es que solo permite analizar un gen por vez, aunque se lo pueda ver a este gen en diferentes condiciones. Métodos que incluyen el análisis de muchos genes a la vez son los utilizados hoy en día.

Hibridación y protección de nucleasas

Este puede darse entre DNA molde y cDNAs obtenidos a partir del mRNA por retrotranscripción, tal como lo indica la siguiente figura, o puede realizarse una hibridación entre RNA “blanco” y sondas de RNA o DNA; es decir, los componentes a hibridar pueden variar, pero solo se unirán si son complementarios entre sí.

El experimento de hibridación en solución se basa en la utilización de endonucleasas que degradan el DNA simple cadena, sin degradar el DNA de doble cadena, por eso también se lo conocemos como ensayo de protección a endonucleasas.

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Filter binding

Otro tipo de hibridación para reconocimiento de mRNA es el filter binding

en donde los híbridos quedan unidos a un filtro y pueden ser reconocidos.

PCR real time

Se realiza la retrotranscripción del mRNA extraído previamente, obteniendo un conjunto de cDNAs. Esta se realiza en una PCR cuantitativa o real time. Esto permite detectar la cantidad de molde original de mRNA a partir del cual surge el cDNA. Hay que controlar específicamente que no haya DNA en la mezcla de reacción, dado que esto afectaría a todo el ensayo. Utilizando sondas marcadas con fluoruros que se van uniendo al DNA formado por hibridación y marcando la aparición de producto (cDNA). A mayor cantidad de DNA vamos a observar mayor fluorescencia y ambas dependen de la cantidad de RNA inicial (molde). Graficando:

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FISH

Se realiza un FISH, hibridación in situ, en las células expuestas a las diferentes condiciones a ensayar, en las cuales se quiere ver la variación en la expresión de un gen en particular. Permite obtener resultados “in vivo”.

Estudio de promotores

Se puede clonar el gen al cual le quiero estudiar la expresión en diferentes condiciones. A este gen se lo puede mutar o modificar, adicionando un gen reportero (este gen codifica para una proteína de fácil cuantificación, cuya expresión no está regulada a nivel traduccional). Ese DNA modificado es transfectado a la bacteria de la cual se extrajo el gen y allí se observa la expresión del gen reportero. Esto permite dar una idea general en cuanto a que tipo de promotor contiene dicho gen que factores modifican su expresión.

Cuando se usa el gen reportero lac Z, se expresa la -galactosidasa, pero no se utiliza el compuesto Xgal que la reconoce y tiñe las colonias, sino que se utiliza el ortonitrogalactosidasa, que actúa como sustrato de la enzima, y luego se mide la depleción de dicho sustrato.

El gen reportero utilizado puede no dar lugar a una enzima, sino a una proteína fluorescente como la GFP. Esto permite monitorear in vivo cómo se expresa el gen y cuánto tarda en expresarse en diferentes condiciones. La contra del mecanismo es que no permite ver la desaparición del mRNA porque la proteína tiene una vida media más larga que él. Además hay sistemas de proteólisis dirigida por ubiquitina que llevan la desaparición en el tiempo del GFP. Para suprimir este defecto se pueden utilizar plásmidos que reducen la posibilidad de proteólisis.

Otra estrategia general aplicable a todos los sistemas incluye la clonación del promotor a estudiar y mediante técnicas de recombinación, la obtención de plásmidos con partes del promotor (siempre contienen el sitio +1 de inicio de la transcripción) y un gen reportero. Todos los plásmidos obtenidos se transfectan a las células y se observa la expresión del gen reportero a partir de cada promotor. Aquel promotor que este completo dará lugar a una mayor expresión que el promotor que no lo esté.

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¿Qué determina ese patrón de expresión?

Promotor o zona de regulación:

Se utiliza un fragmento de DNA que contenga la zona promotora de la transcripción del gen estudiado y se realiza un Gel Shift Assay (EMSA). En este ensayo se estudia la interacción proteína-DNA y se caracteriza el complejo para ver si la unión es fuerte y si es especifica. Se desplaza con DNA heterologo.

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Finger print

Con el mismo fragmento de DNA se puede realizar un Finger Print (Footprinting) en el cual se corta el DNA con DNasas y se ve que cambia el patrón de corte al ensayar DNA solo y DNA con la proteína de unión. También se lo conoce como técnica de la huella, y está basado en los principios de la secuenciación del DNA. Los pasos son:

1. Aislar y marcar radiactivamente en un extremo de una de las cadenas de un fragmento de DNA que supuestamente contiene las secuencias reconocidas por una proteína de unión al DNA.

2. Se usan DNasas para producir roturas al azar obteniendo diferentes fragmentos de DNA.3. Se separan los productos de corte radiactivos mediante la electroforesis de alta resolución y se pone en manifiesto una

“escalera” de bandas radiactivas.4. Los pasos 1, 2 y 3 se repiten o se realizan para dos muestras diferentes: una con el fragmento de DNA libre y otra con el

fragmento unido a proteínas. Estas proteínas impiden el corte del DNA en la región en la que están unidas y por lo tanto cambian el patrón de corte o la “escalera” de fragmentos.

5. Los dos productos de conjuntos de corte se analizan y comparan por electroforesis. En la “escalera” de bandas radiactivas de la muestra que contenía la proteína se observa un agujero o “huella”, debido a la protección del DNA por la proteína unida.

6. De esta forma se identifican las zonas reconocidas por las proteínas, secuencias de unión y de regulación.

Se puede determinar la localización precisa de este sitio de unión de la proteína por secuenciación directa del mismo fragmento de DNA. Como control se utiliza un fragmento de DNA marcado cortando con un reactivo que produce un patrón de bandas uniforme.

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Primer extensión

Permite saber donde se da el inicio de la transcripción, es decir el nucleótido +1. También se lo puede hallar observando el primer aminoácido de la proteína y sus posibles codones de traducción.

(a) Se transcribe la secuencia de DNA del gen en estudio obteniéndose un mRNA (b) Utilizando la proteína codificada por dicho mRNA se diseña un primer usando su Nt y se hibrida el mRNA con la sonda(c) Se realiza la retrotranscipción con NTP’s marcdos in vitro (d) Se obtiene el segmento de RNA con el primer + Nt marcado con un determinado PM.

Para conocer el PM de dicho fragmento se utiliza el método de Sanger. En este método se usan los 4 tipos de NTPs y dioxiNTPs para producir fragmentos de diferentes largos que terminan en el dioxiNTP adicionado, de tal manera que en una electroforesis de alta definición (poliacrilamida) se pueden diferenciar los fragmentos por su tamaño y conocer cuál es el nucleótido en cada posición.

Si la banda aparece a la misma altura que A, +1 = A

DOT BLOT

El DOT BLOT sólo puede confirmar la presencia o ausencia de una biomolécula o biomoléculas que pueden ser detectados por las sondas de ADN o el anticuerpo. Se utiliza porque sirve para analizar más de un gen por vez.

Una muestra radiactiva puede ser hibridada para permitir al investigador detectar la variación entre muestras.

Alternativas:

1. Depositar en cada posición una muestra de RNA de células sometidas a diferentes estímulos e hibridar con una única sonda de DNA correspondiente al gen de interés (análisis de múltiples situaciones para un único gen).

2. Depositar en cada posición un exceso de DNA clonado con la secuencia de los genes de interés (uno diferente en cada posición) e hibridar con una sonda (mezcla de sondas) extraída de células incubadas en presencia de precursores radiactivos, o de cDNA (RNA extraído de células y usado para generar una sonda por transcripción reversa en presencia de precursores radiactivos)

ARRAYS y MICROARRAYS

Es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicio. Se usan para analizar la expresión diferencial de genes, monitorizándose los niveles de miles de ellos de forma simultánea. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica y la molécula diana, indicándose generalmente mediante fluorescencia y analizándose por análisis de imagen, lo cual nos indicará el nivel de expresión del gen.

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Suelen utilizarse para identificar genes con una expresión diferencial bajo condiciones distintas. Por ejemplo, para detectar genes que producen ciertas enfermedades mediante la comparación de los niveles de expresión entre células sanas y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades. También se utilizan para identificar y estudiar el TRANSCRIPTOMA que son todos los RNAs transcriptos de un tipo celular. Esto se relaciona directamente con que aunque las células de un mismo organismo tengan el mismo genoma, la expresión génica se regula diferencialmente en ellas y por lo tanto tienen diferentes transcriptomas. La expresión diferencial está determinada por muchos factores, los cuales pueden incluir: acetilación, metilación, Fosforilación del DNA y de las histonas, grado de compactación del DNA, presencia de activadores y receptores, estímulos del medio, etc.

Algunas de sus aplicaciones más frecuentes son:

Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones (sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados).

Clasificación molecular en enfermedades complejas. Identificación de genes característicos de una patología. Predicción de respuesta a un tratamiento. Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP).

Para cargar la muestra se utilizan cabezales y técnicas de micro-inyección.

CHIPS DE AFIMETRIX

Las tecnologías para fabricar microarrays utilizan dos tipos de técnicas diferentes:

(1) Fabricar las sondas in vitro para sembrarlas después sobre el chip.(2) Fabricar las sondas in situ, sobre el chip.

Los primeros corresponden a los ya mencionados ARRAYS y MICROARRAYS, mientras que los segundos se corresponden los con chips de AFIMETRIX. Affymetrix es la compañía líder en este tipo de chips. Se denominan genéricamente "GeneChips" en donde cada gen es representado por un conjunto de secuencias cortas que lo caracterizan. Algunos chips contienen genomas completos con más de 50.000 grupos de sondas.

Permite estudiar la expresión global de todo un genoma y como se relacionan en función a su expresión. La fabricación in situ se realiza utilizando nucleótidos que requieren activación por luz a diferentes longitudes de onda, para exponer sus grupos reactivos y unirse al siguiente nucleótido de la secuencia. Esta polimerización da lugar a diferentes secuencias en cada spot porque se usan “mascaras” que dejan pasar la luz activante solo en el spot correspondiente, para excitar al nucleótido y permitir la polimerización.

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Síntesis de RNAEnsayo de transcripción Run-ON

(1) Célula eucariota en transcripción.(2) Aislado de núcleos.(3) Incubación de los mismos con nucleótidos marcados (32P-GTP).(4) Extracción de RNA transcripto “Run-On”.(5) Dot Blot para ver qué genes se estaban transcribiendo/ que RNA se estaba sintetizando.

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Técnicas para identificar interacciones DNA-proteínaFilter Binding

Se utiliza un filtro de nitrocelulosa, a través del cual se hacen pasar tres soluciones distintas:

1. La solución con DNA de doble cadena con la secuencia a ensayar, el cual pasa libremente por la membrana y es recolectado por debajo.

2. La solución de proteína, la cual queda retenida en la membrana.3. La solución con el complejo DNA-proteína. Solo aquellos segmentos de DNA que estén unidos a proteínas quedaran en la

membrana y los demás serán recolectados por debajo.

Métodos 2 y 3 explicados previamente en ¿Cómo se determina el patrón de expresión?

Técnicas para identificar interacciones DNA-proteína y otras interacciones entre macromoléculas

Yeast-one-hybrid system

Esta técnica permite estudiar la interacción proteína-DNA y requiere de dos componentes:

1. Biblioteca de expresión de cDNA: estos se obtienen por una reacción de transcripción reversa a partir del mRNA extraído de la célula a estudiar sus proteínas.

mRNA Retro−transcripción→

cDNA

Cada cDNA debe ser fusionado con el DNA que codifica para un dominio de activación conocido, por ejemplo Gal4, en un plásmido, el cual tiene las partes:

Promotor: de expresión regulada por el factor de activación del cual se utiliza el dominio de activación y reconocido por la DNA polimerasa del huésped (levadura).

AD: dominio de activación del DNA (Gal4) DBD: dominio de unión al DNA, que en este caso serán las cDNAs de la biblioteca genómica.

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Cuando cada plásmido se transcriba y traduzca dará lugar a un factor de transcripción distinto cada uno, porque los cDNAs son diferentes.

2. Un gen reportero: que contiene la secuencia target a estudiar su interacción con una proteína. Esta secuencia se localiza Upstream y adyacentemente al promotor activado por el AD del factor de transcripción previamente ideado (Gal4) y al gen reportero, el cual puede ser lacZ.

Si alguno de los plásmidos recombinantes contiene cDNA tal que codifica para una proteína de unión al DNA target, el factor de transcripción producido se unirá a dicha secuencia y reclutará dominios de activación Gal4 que promocionan la transcripción del gen reportero lacZ. Las colonias transfectadas con el plásmido en las cuales aparezca el producto de lacZ, se tiñen de azul al ser expuestas a X-gal y de esta manera son seleccionadas.

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