DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS

1.- INTRODUCCION

En el campo de la micología industrial, se estudia tanto la acción nociva de los hongos

microscópicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los

distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le

campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestras diferencias

considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se

pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y

vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio.

Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de

un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por

su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el limite entre

los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y reproductoras de

micelio de las levaduras.

Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células

independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilíndricas. En

algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un

micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de

verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha

comentado ya, no existe un límite de separación definido entre levaduras y otros hongos que

forman un micelio típico.

Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos forman colonias de aspectos característicos

que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de interés industrial, el modo

habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan reproducción

sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse

solamente por sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la

identificación específica.

2.- OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GENERAL

Determinar e identificar, mohos y levaduras en una muestra sólida de harina de trigo. Mediante

un análisis microbiológico.

2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Aplicar todos los conocimientos anteriormente aprendidos para la determinación de los

parámetros en estudio.

Determinar todos los requerimientos básicos necesarios para las determinaciones de los

parámetros en estudio.

Conocer el medio y el modo de trabajo adecuado, para la determinación de mohos y

levaduras en la muestra harina de trigo.

Conocer el medio de cultivo PDA para mohos y levaduras, también las

condiciones de temperatura y tiempo de incubacion.

Diferenciar y reconocer lo que es un moho y una levadura, observar sus características

físicas.

Realizar el recuento de colonias en el medio, PDA.

3.- FUNDAMENTO TEORICO

Mohos y Levaduras

En el campo de la micología industrial, se estudia tanto la acción nociva de los hongos

microscópicos, que pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los

distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en le

campo de la biotecnología. Se trata de organismos fúngicos que muestras diferencias

considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonómicos muy diversos y, si bien se

pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y

vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio.

Comúnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de

un micelio verdadero, microscopios, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fácilmente por

su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepción, es inseguro establecer el limite entre

los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporógenas y reproductoras de

micelio de las levaduras.

Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células

independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargados casi cilíndricas. En

algunos casos, forman cadenas de células alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un

micelio, por lo que se denominan seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de

verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y según se ha

comentado ya, no existe un límite de separación definido entre levaduras y otros hongos que

forman un micelio típico.

Las levaduras, cuando crecen sobre medios sólidos forman colonias de aspectos característicos

que recuerdan a las colonias bacterianas en casi todas las especies de interés industrial, el modo

habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Muchas de ellas presentan reproducción

sexual por medio de ascosporas y, a diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse

solamente por sus caracteres morfológicos; se precisa la ayuda de pruebas bioquímicas para la

identificación específica.

Las levaduras y los mohos crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que

conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin

embargo, en los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que

las bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por la alteración de frutas frescas y

jugos, vegetales, quesos, productos cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos, así como en

los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones

inadecuadas. Además, existe el peliro potencial de producción de micotoxinas por parte de los

mohos.

Ni el hombre ni los animales deben consumir alimentos visiblemente enmohecidos, excepto, por

supuesto, los quesos tales como Roquefort ó Camembert y ciertos salamis que deben sus sabores

especiales a algunos mohos.

Las levaduras crecen más rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mientras

que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras generalmente crecen tanto en

presencia como en ausencia de oxígeno, aunque con mayor rapidez y hasta poblaciones más

elevadas en presencia de este gas. La fermentación es completamente un proceso anaeróbico. Las

bebidas fermentadas están fuera del marco de esta publicación.

En los alimentos frescos y en los congelados, pueden encontrarse números reducidos de esporas y

células vegetativas de levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado.

Solo cuando el alimento contiene cifras elevadas de levaduras o mohos visibles, el consumidor se

dará cuenta de la alteración. La alteración por levaduras no constituye un peligro para la salud.

Factores de crecimiento de los mohos:

Nutrimentos:

Los mohos, por sus paredes celulares quitinosas duras, obtienen nutrimentos solo por difusión o

por transporte de sustancias solubles y en consecuencia, su nutrición se limita a alimentos

bastantes sencillos. Muchos mohos obtienen carbono y energía de los carbohidratos;

especialmente de la glucosa, pero algunos utilizan alcoholes o ácidos orgánicos. Pueden obtener

también el carbono de las proteínas, y si falta alguna fuente de fácil obtención, lo obtienen de

productos de la digestión de las proteínas. Algunas especies utilizan exclusivamente grasas.

Humedad y presión osmótica:

El medio húmedo facilita el crecimiento de los mohos, pero dichos organismos no necesitan el

mismo grado de humedad que bacterias y levaduras, que requieren un medio prácticamente

hídrico. El crecimiento en materiales secos; pulpas secas, granos, tejidos, cuero curtidos y muebles

ocurre solamente en una atmósfera húmeda. Al añublo o moho aparece en libros o zapatos; por

ejemplo: durante periodos duraderos, húmedos y calurosos en climas en que hay poco sol.

Temperatura:

Algunas especies de hongos crecen a temperaturas menores de 42 ºC o mayores de 42 ºC.

Oxígeno:

Prácticamente todos los mohos son aerobios y necesitan bastante oxígeno. Solamente algunas

especies; la que se emplea en la manufactura del queso Roquefort, crecen satisfactoriamente en

medios con menor tensión de oxígeno. Incluso en este caso, no obstante, se facilita el crecimiento

al picar el queso con alambres para obtener agujeros por el cuajo en maduración.

Cultivo de los Mohos:

Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos generales de cultivo que para las bacterias.

Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriológicos

usuales, a temperaturas que varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen más lentamente que

las bacterias, y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los

mohos.

Si se quiere aislar los mohos, resulta muy práctico usar un medio de cultivo que favorezca su

desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias. Medios ácidos (PH = 5,6) con

concentraciones relativamente elevadas de azúcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben

muchas bacterias.

Morfología de los Mohos:

Puesto que la identificación de los hongos depende en gran parte de características morfológicas

como el tipo y la agrupación de las esporas se deben tomar muchas precauciones al hacer

preparaciones para el examen microscópico. En general, el cultivo en medios líquidos no es

satisfactorio para este propósito. Los cultivos en medios sólidos, sobre todo en placas se pueden

ver con una lupa o con el objetivo seco débil del microscopio, empezando desde el fondo hasta la

parte superior de la placa lo cual nos proporcionará suficiente información para identificar o

precisar el género del moho examinado. Se deben hacer observaciones posteriores tomando con

una aguja o asa una pequeña muestra de micelio en desarrollo, la que se coloca en una gota de

azul algodón lactofenol que esté sobre un portaobjeto y se cubre luego con el cubreobjeto. En una

preparación hecha de esta manera, la hifas deben ser examinadas para ver si hay tabiques,

estructuras de las esporas y otras partes del hongo que son determinantes, sin embargo, una

manipulación de este tipo rompe y desorganiza las estructuras del organismo pues la disposición

característica de la que depende la identificación se pierde y no es posible clasificarlo.

Un método mejor para examinar los hongos es la técnica de cultivos en portaobjeto (microcultivo),

ya que permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo, y el arreglo y acomodo

de sus partes permanecen intactos.

Factores de crecimiento de las levaduras:

Agua:

Las levaduras necesitan un poco más de agua que los mohos, pero menos que las bacterias.

Conviene insistir no obstante, que entre las levaduras hay gran variación; algunas especies crecen

en medio que contienen incluso 40 por 100 de agua, por ejemplo en miel y jaleas o compotas. Los

microorganismos que crecen en soluciones de gran presión osmótica se denominan osmófilos.

PH:

Las levaduras crecen en límites amplios de pH, aunque sus requerimientos son más limitados que

los de los mohos. Muchas especies se multiplican en soluciones con acidez de pH 3 y alcalinidad de

pH 7.5. La reacción óptima suele localizarse entre pH 7.5 y 5.0

Temperatura:

No hay crecimiento a temperaturas superiores a la del congelamiento, ni tampoco a temperaturas

superiores a 47 ºC; las temperaturas máximas para algunas especies son algo menores. La

temperatura más adecuada suele situarse entre 20 y 30 ºC. La incubación a 30 ºC suele ser

satisfactoria

Oxígeno:

Las levaduras fueron los primeros microorganismos en que se encontró crecimiento en un medio

sin oxígeno atmosférico. Pasteur se admiró notablemente de este hecho, y observó que la

utilización anaerobia de azúcar generaba principalmente alcohol y bióxido de carbono, en tanto

que los productos aerobios eran bióxido de carbono y agua. La multiplicación de las levaduras es

más rápida y la cosecha de células es mayor en condiciones aerobias que en anaerobias, en

consecuencia, se necesita abundancia de oxígeno en la elaboración de levadura comercial, pero el

oxígeno se excluye cuando se desea producir alcohol (en la fermentación de cerveza o en la

producción de vino).

Recuentos de Mohos y Levaduras:

Todos los mohos y levaduras crecen bien a valores de pH de 5,0 y aún inferiores, por lo que

generalmente sustituyen a las bacterias en los alimentos ácidos.

Para inhibir el crecimiento de las bacterias en los medios diseñados para el recuento de mohos y

levaduras, en los últimos 20 años se han utilizado con eficacia los antibióticos. Entre ellos puede

citarse la penicilina + estreptomicina, el cloranfenicol, la clorotetracilina, la oxitetracilina y la

gentamicina. Para fines generales, han sido muy utilizadas la oxitetracilina, que se refiere al a

clorotetracilina debido a su mayor estabilidad. La gentamicina suprime el crecimiento de las

bacterias Gran negativas y es efectiva por ellos en alimentos tales como la carne refrigerada. El

rosa de bengala retarda el crecimiento de aquellos mohos que normalmente producen abundante

micelio aéreo, como Neurospora y Rhizopus. Sin embargo, también inhibe algunas levaduras. La

mejor temperatura de incubación de los cultivos se sitúa alrededor de 22 ºC, y el tiempo de

incubación es de 5 días.

Las colonias de mohos pueden formarse a partir de hifas o de esporas. Por ello el talo de un moho

que esté muy cargado de espora dará recuentos de placas muchos más altos que otro de tamaño

similar sin esporas

PDA.- El Agar Dextrosa y Papa es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir

de muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosméticos. El Agar Dextrosa y Papa

puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este

medio es recomendado para realizar el recuento colonial. También puede ser utilizado para

promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. La base del medio es

altamente nutritiva y permite la esporulación y la producción de pigmentos en algunos

dermatofitos.

Algunos procedimientos señalan bajar el pH del medio a 3.5 ± 0.1 con ácido tartárico al 10 %, para

inhibir el crecimiento bacteriano. La infusión de papa promueve un crecimiento abundante de los

hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante.

4.-MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

REACTIVOS MATERIALES Y EQUIPOS

Muestras: sólida (harina de trigo) Matraz Erlenmeyer de 500 ml

Agua Peptona Agitador bortex

Agar: PDA 3 tubos de ensayo con sus tapas

Alcohol 4 pipetas de 2 ml

Desinfectante 3 cajas petri

detergente Balanza mecánica

Mechero

Gradilla

Tijeras

Cuchara

Incubadora de 37 ºC

5.- METODOLOGIA

Primeramente se hizo una limpieza general de los mesones con detergente y desinfectante ya que

esto es muy importante además puede interferir en muestro análisis.

También es muy importante que los materiales que se van a utilizar deben estar previamente

esterilizados.

Señalar con un marcador las correspondientes concentraciones:

-2 B

-1 -2 B

Se procedió a pesar 25 gramos demuestra (harina de trigo) este para disolverla

en la solución madre.

Se tubo el cuidado de pesar exactamente los 25 gramos de muestra en la balanza

mecánica.

Agitar la mezcla muy bien para que la solución sea homogénea.

Todo trabajo debe realizarse siempre detrás de un mechero esto para prevenir contaminación a

la muestra a analizar.

Solo una persona debe realizar el trabajo sin la ayuda de nadie.

(Siembra en profundidad)

- Realizamos la primera dilución tomando una pipeta 2 ml de la solución (peptona y

muestra). Colocamos 1 ml al tubo -2, agitamos en el agitador bortex, y el otro 1ml a la

placa -1 de PDA.

- siempre se debe tomar en cuenta que se debe trabajar detrás del mechero y

cada material pasar por la llama del mechero.

- En la segunda dilución con otra pipeta esterilizada tomamos 1ml del tubo

-2. Colocamos, 1ml a la placa -2 de PDA.

Una vez concluidas estas se procedió al vaciado al agar, a este método se le

conoce como siembra en profundidad o en masa. Mezclar perfectamente el

medio e inóculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos circulares

con la placa, a favor y en contra del sentido de las agujas del reloj y en forma de cruz, evitando al

mismo tiempo que el medio impregne la tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una

superficie hirizontal.

- Cuando se ha solidificado perfectamente el agar, NO se invierten las placas y se intruducen

en la estufa, evitando que se apilen en exceso y que entren en contacto con sus paredes.

Incubar a 25 ºC durante un periodo de 5 a 7 dias.

- Transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias en aquellas placas que

muestren colonias aisladas.

6.- DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Agar: PDA (-1) Agar: PDA (-2) Agar: PDA (blanco)

Mohos 6 colonias Mohos 3 colonias Mohos 0 colonias

Levaduras 4 colonias Levaduras 0 colonias Levaduras 0 colonias

Mohos y levaduras

Para el recuento de MyL se dejo incubar el PDA a 25ºC se recomienda que el tiempo de incubación

sea de 7 días

Donde se obtuvieron los siguientes resultados:

Parámetro MyL

Medio de cultivo PDA

Tiempo: 7 dias

Dilución UFC

-1 6 mohos + 4 levad.

-2 3 mohos + 0 levad.

B 0 mohos + 0 levad.

El recuento total de mohos y levaduras es de:

No hubo desarrollo sobresaliente de mohos y de levaduras, lo que nos indica que se trata de un

alimento contaminante de M y L, hay bastante discrepancia en los limites máximos control de los

parámetros analizados para la muestra de harina de trigo.

7.- OBSERVACIONES

En la caja petri 10-1 se observo la presencia de 6 mohos que presentan un color verdusco con

negro son de un tamaño muy visible con pelusas a su alrededor, pero hay muchos que aun están

creciendo y 4 levaduras característicos presenta un color cremoso y son lisas.

En la caja petri con la dilución 10-2 donde no se pudo observar levaduras pero se conto la

presencia de 3 mohos concéntricos, circulares, uniformes se ve que presentan pelusas a su

alrededor pero si se los deja mas día para incubar crecerán más cantidad de colonias.

En la caja petri (blanco) se observo ausencia de mohos y levaduras, lo cual es correcto porque es

blanco.

Sin embargo no se hace el invertido de placas para mohos y levaduras porque las esporas saldrían,

contaminando así el medio ambiente.

8.- CONCLUSIONES

Las conclusiones de la práctica realizada son las siguientes:

Es de vital importancia tener conocimientos de preparación de medios de cultivo, técnicas

de asepsia, orden y cuidado en la manipulación de las muestras, los materiales y los

medios de cultivo con los que se trabajara, ya que se debe evitar ante todo el momento de

realizar tanto la preparación de la muestra y la siembra en el medio de cultivo que se de

una contaminación externa por manipulación, pero lo mas importante es saber que

medios y a que temperatura se deben de incubara las muestras.

De igual manera se debe saber que materiales son los que se van a utilizar en cada una de

las determinaciones, desde la dilución, hasta que medios de cultivo son los adecuados

para los parámetros que se tienen que estudiar. En todo caso lo que se debe realizar es

una planeación de cómo es que se va a realizar las determinaciones dado que en el caso

de no realizar un buen pedido o preparación de requerimiento se puede estar en apuros al

momento de realizar las determinaciones, y eso nos puede llevar a que se contamine la

muestra y que se tenga a que volver a empezara realizar la determinación, no cabe dudas

que la preparación previa a los análisis es importante para saber con exactitud que es lo

que se va a realizar.

Logramos determinar e identificar en una muestra solida de harina de trigo, mohos –

levaduras en el Agar de Patata y Dextrosa, para realizar el análisis microbiológico de M y L.

En la determinación de los mohos y levaduras (MyL) el medio que se utilizo es el PDA, se

debe tener cuidado en la temperatura y tiempo de incubación, pero además que se debe

tomar encuenta que la caja petri NO se debe invertir durante la incubación.

las diferencias entre mohos y levaduras son mínimas pero bastante apreciables, por lo que

no hubo mucho problema al distinguirlos, el recuento final nos indico la presencia de

pocos MyL que es muy bueno ya que se trata de un alimento inocuo.

Se hizo un recuento aproximado de mohos y levaduras en el medio PDA

9.- BIBLIOGRAFIA

1. Seeley H y Van Demark P, Microbios en acción, Ediciones Blume, 1ra ed., España 1973.

2. Larrañaga I et all, Control e higiene de los alimentos, McGraw Hill, España 1999.

3. Pascual Anderson R, Microbiología Alimentaria, Ediciones Diaz de Santos, 2da ed., España

2000

10.- CUESTIONARIO

1.- Cuales son las principales estructuras características de las levaduras y hongos?

2.- Cómo se clasifican los mohos y levaduras?

3.- Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causada por los hongos y

tres ejemplos de utilización benéfica.

4.- De que manera influye el pH, la temperatura y la actividad del agua en el crecimiento de

mohos y levaduras?

5.-De acuerdo a la norma boliviana vigente ¿Cuál es el limite máximo permisible para hongos y

levaduras, en la chicha, api morado, yogurt casero, apanado, harina de perro, dar el numero de

norma. ( en caso de no contar con ellos, especifique según su criterio).

6.- Que pruebas bioquímicas se realizara para la caracterización de levaduras?. Mencione las

características bioquímicas de principales levaduras de importancia de salud pública. (por lo

menos tres)

7.- Explicar brevemente como se realiza la prueba bioquímica del auxonograma en placa (las dos

formas)

8.- Como se realiza la identificación de hongos filamentosos (mencione por lo menos tres).

1. Crecimiento permitido según norma para el alimento analizado en su grupo para los

parámetros trabajados.

Al ser un alimento que es nuevo, se debe considerar que no se llego a un acurdo internacional de

cual es el adecuado límite la presencia de R.T.B.A.M. o MyL, pero sin embargo hay algunos países

que se pusieron límites que son los siguientes:

Parámetro Limite máximo

R.T.B.A.M. 5*103.

MyL 1*103.

Observando estos límites podemos afirmar que nuestra muestra analizada es inocua y libre de

riesgo para el consumo, ya que están por debajo estos límites máximos.

2. Medios que se emplean para el análisis de mohos y levaduras.

Existe una variedad grande medios de cultivo especiales para la determinación de mohos y

levaduras entre los más conocidos y comunes son:

PDA, Caldo Triptona Soja (TSB), Agua de Triptona (TW), Solución de Ringer, Solución de Tween,

Agar extracto levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE), agar extracto de levadura, agar extracto de

malta y otros que no son muy utilizados o que en todo caso son particulares para el tipo de

alimento a analizar.

3. Funciones que cumplen los suplementos adicionados al medio empleado para mohos y

levaduras.

El acido tartárico se usa en diversas recetas de cocina donde se conoce como crémor tártaro,

especialmente en repostería y confitería para aumentar la masa y consistencia ya que enriquece la

fermentación de levaduras y mohos, es por ese principio que el acido tartárico tiene la propiedad

de estabilizar el medio PDA que se utilizo para la determinación del recuento de MyL.

Mientras que la oxitetraciclina actúa como un agente selectivo, impidiendo el crecimiento

bacteriano, es decir es un antibiótico que impedirá que se desarrollen bacterias en este medio de

cultivo y así no se contamine tan fácilmente el medio.