PRÁCTICA # 10

“STREPTOCOCCUS”OBJETIVOS

Identificar al genero Streptococcus

META: Aislar, identificar, cuantificación UFC de streptococcus

INTRODUCCIÓN

GENERO STREPTOCOCCUSEl género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono. Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar hidratos de carbono, proceso que produce ácido láctico, y son catalasa-negativos, a diferencia de las especies del género Staphylococcus.

Un gran número de especies estreptocócicas destacan pos su papel como patógenos humanos. Lamentablemente, la diferenciación de las especies que componen este género es complicada debido a que se utilizan los tres sistemas diferentes parcialmente coincidentes enumerados a continuación para clasificar a estos microorganismos: 1) propiedades serológicas: grupo de Lancefield; 2) patrones hemolíticos: hemólisis completa (beta), hemólisis incompleta (alfa) y ausencia de hemólisis, y 3) propiedades bioquímicas (fisiológicas).

Rebeca Lancefield desarrolló en 1933 el sistema de clasificación serológica para diferenciar las cepas beta-hemolíticas. La mayoría de estas cepas y algunas de las alfa-hemolíticas y no hemolíticas poseen antígenos específicos de grupo, la mayoría de los cuales son hidratos de carbono de la pared celular. Estos antígenos se pueden detectar fácilmente con pruebas inmunológicas, y han sido útiles para identificación rápida de algunos patógenos estreptocócicos. Por ejemplo, ´ Streptococcus pyogenes (clasificado como Streptococcus de grupo A) causa faringitis estreptocócica. El antígeno de grupo de este microorganismo se puede detectar en los exudados faríngeos mediante inmunoanálisis rápido.

La mayoría (pero no todos) de los estreptococos alfa-hemolíticos y no hemolíticos carecen de los antígenos de la pared celular específicos de grupo. Estos microorganismos se deben identificar a través de pruebas bioquímicas. No obstante, estos sistemas de clasificación no son mutuamente excluyentes.

ESPECIES DE STREPTOCOCCUS

Streptococcus pyogenes.

La especie más importante de los estreptococos del grupo A es S. pyogenes originan diversas enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque este microorganismo constituye la causa más frecuente de faringitis bacteriana, la fama de estos microorganismos se debe a las llamativas enfermedades potencialmente mortales provocadas por bacterias necrosantes, como evidencia las publicaciones que han inundado tanto la literatura científica como la prensa sensacionalista.

Fisiología y Estructura.- Las cepas de S. pyogenes son cocos esféricos de diámetro comprendido entre 1 y 2 μm que forman cadenas cortas en las muestras clínicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivos. Su crecimiento es óptimo en el medio agar sangre enriquecido, pero se inhibe cuando contiene una concentración elevada de glucosa. Después de 24 horas de incubación se observan colonias blancas de 1 a 2 mm con grandes zonas de β-hemólisis.

Se ha estudiado detalladamente la estructura antígenica de S. pyogenes. El marco estructural básico de la pared celular, es la capa de peptidoglucano, la cual tiene una composición parecida a la de otras bacterias grampositivas. En el interior de la pared celular se encuentran los antígenos específicos de grupo y de tipo.

Hidratos de carbono específicos de grupo.- El hidrato de carbono específico de grupo, el cual constituye aproximadamente el 10% del peso seco de la célula (antígeno del grupo A), es un dímero de N-acetilglucosamina y de ramosa. Este antígeno se usa para clasificar a los streptococcos del grupo A y distinguirlos de otros grupos de estreptococos.

Proteínas específicas de tipo.- La proteína M es la principal específica de tipo que se asocia a los streptococos virulentos. Se compone de dos cadenas polipetídicas que forman una hélice alfa. La proteína se ancla a la membrana citoplásmica, se extiende a través de la pared celular y sobresale por encima de la superficie celular. El

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extremo carboxilo está anclado en la membrana citoplásmica y la porción de la molécula incluida en la pared celular, origina la variedad antigénica observada entre los más de cien serotipos de proteína M. Las proteínas M se subdividen en moléculas de clase I y de clase II. Las proteínas de clase I comparten los antígenos expuestos, mientras que las proteínas M de clase II carecen de antígenos expuestos comunes. A pesar de que las cepas portadoras de ambas clases de antígenos pueden provocar infecciones supurativas y glomerulonefritis, tan sólo las bacterias que contienen proteínas M de clase I producen fiebre reumática.Una proteína secundaria específica de tipo que constituye un marcador epidemiológico útil en las cepas bacterianas que no expresan la proteína M es la proteína T (resistente a la tripsina). Se ignora cuál es la función estructural de esta proteína. Aunque la clasificación epidemiológica de S. pyogenes se ha basado tradicionalmente en la identificación de los tipos específicos M o T mediante la aglutinación con anticuerpos específicos frente M o T, es posible que este procedimiento se sustituya por la secuenciación del gen emm que codifica la proteína M.

Otros componentes de la superficie celular.- Otros componentes importantes de la pared de S. pyogenes son las proteínas tipo M, el ácido teicoico y la proteína F. Las proteínas de tipo M están codificadas por un complejo de más de 20 genes que componen la superfamilia de genes emm. Estos genes codifican las proteínas M, las proteínas de tipo M y otras proteínas que se unen a las inmunoglobulinas (Ig). El ácido teicoico y la proteína F facilitan la unión a las células del organismo anfitrión, al formar un complejo con la fibronectina que se encuentra presente en la superficie de las células del organismo anfitrión.

Cápsula.- Algunas cepas de S. pyogenes forman una cápsula externa de ácido hialurónico que contiene moléculas repetidas de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina. La cápsula no se diferencia a nivel antigénico del ácido hialurónico presente en los tejidos conjuntivos de mamífero, de modo que permite evitar la fagocitosis bacteriana. Es probable que las cepas encapsuladas de esta especie originen infecciones sistemáticas graves.

Patogenia e inmunidad.- La virulencia de los estreptococos del grupo A está determinada por la capacidad de las bacterias de adherirse a la superficie de las células del organismo anfitrión, invadir las células epiteliales, evitar la opsonización y la fagocitosis y producir una variedad de toxinas y de enzimas. Se ha demostrado que en la adherencia a las células del organismo anfitrión, median más de 10 antígenos bacterianos distintos, siendo los más importantes el ácido teicoico, las proteínas M y la proteína F. La adherencia inicial es una interacción débil entre el ácido teicoico y los sitios de unión de los ácidos grasos en la fibronectina y las células epiteliales. La adherencia posterior implica a la proteína M, la proteína F y otras adhesinas que interaccionan con los receptores específicos de las células del organismo anfitrión.S. pyogenes puede invadir las células epiteliales, un proceso mediado por la proteína M y la proteína F, así como por otros antígenos bacterianos. Se considera que esta internalización es importante tanto para el mantenimiento de las infecciones persistentes (por ejemplo: la faringitis estreptococica recurrente) como para la invasión de los tejidos profundos.S. pyogenes dispone además, de otros mecanismos para evitar la opsonización y la fagocitosis. La región conservada de la proteína M se puede unir a una betaglobulina sérica, el factor H, la cual constituye una proteína reguladora de la ruta alternativa del complemento. El componente C3b del complemento, un importante mediador de la fagocitosis, se ve desestabilizado por el factor H. Por ello, cuando C3b se une a la superficie celular en la región de la proteína M es degradado por el factor H, con lo que se evita la fagocitosis. El efecto sólo se ve superado cuando el paciente produce anticuerpos opsónicos específicos de tipo frente a la proteína M específica. La unión de fibrinógeno a la superficie de la proteína M inhibe también la activación del complemento por la ruta alternativa y reduce la cantidad de C3b unido. Las proteínas M interfieren en el proceso de fagocitosis. Por último, todas las cepas de S. pyogenes son capaces de producir una peptidasa de C5a, una serina proteasa que inactiva este componente. C5a es una molécula quimioatrayente de neutrófilos y fagocitos mononucleares; de este modo se inhibe la formación de abscesos hasta que el paciente logra neutralizar la peptidasa por medio de anticuerpos específicos.Además, diversas enzimas y toxinas pueden intervenir en la patología observada por S. pyogenes.

ESTEPTOCOCOS IMPORTANTES.Microorganismo Origen históricoStreptococcus streptus, flexible; coccus, grano o baya (un grano o baya flexible; en referencia al aspecto de

las largas y flexibles cadenas de cocos)S. agalactie agalactia, necesidad de leche (la cepa inicial [bautizada como S. mastitidis] originaba

mastitis bovina)S. anginosus anginosus, relativo a la anginaS. bovis bovis, bovino (asociado inicialmente a enfermedad en ganado bovino)S. constellatus constellatus, tachonado de estrellas (la cepa aislada inicialmente se encontraba inmersa en

agar y la colonia de mayor tamaño estaba rodeada de otras colonias más pequeñas; la formación en satélite no tiene lugar alrededor de las colonias situadas sobre la superpie de una placa de agar)

S. dysgalactiae dis, enfermo, duro; galactia, relativo de la leche (pérdida de la secreción de leche; las cepas causaban mastitis bovina)

S. intermedius intermedius, intermedio (confusión inicial acerca de si se trataba de una bacteria aerobia o anaerobia)

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S. mitis mitis, leve (se pensó, erróneamente, que producia infecciones leves)S. mutans mutans, cambiante (cocos que pueden adoptar un aspecto bacilar, en especial cuando se

aíslan inicialmente de un cultivo)S. pneunomiae pneumon, los pulmones (causa neumonía)S. pyogenes pyus, pus; gennaio, engendrar o producir (productos de pus; se asocia habitualmente a la

formación de pus en heridas)S. salivarius salivarius, salivar (se detecta en la saliva de la boca)

CLASIFICACIÓN DE LOS PATÓGENOS ESTREPTOCÓCICOS MÁS FRECUENTES.Clasificación bioquímica Clasificación serológica Patrón de hemólisisS. pyogenes A βS. agalactiae B β; ocasionalmente no hemolíticoS. dysgalactiae C, G βGrupo S. anginosus A, C, F, G, no agrupables β; ocasionalmente α o no hemolíticoS. bovis D α; no hemolítico; ocasionalmente β Grupo viridans No agrupable α o no hemolíticoS. pneumoniae No agrupable α

ENFERMEDADES POR ESTREPTOCOCOS: RESUMENES CLÍNICOS.

Steptococcus pyogenes (grupo A)

Infecciones supurativas Faringitis: faringe enrojecida con presencia frecuente de exudados; la linfadenopatía cervical puede ser

prominente. Escarlatina: exantema eritematoso difuso que comienza en el tórax y se extiende posteriormente a las

extremidades; complicación de faringitis estreptocócica. Pioderma: infección cutánea localizada con vesículas que avanzan a pústulas; sin indicios de enfermedad

sistémica. Erisipela: infección cutánea localizada con dolor, inflamación, adenopatía y síntomas sistemáticos. Celulitis: infección cutánea que afecta a los tejidos subcutáneos. Fascitis necrosante: infección profunda de la piel que provoca la destrucción de capas musculares y de

tejido adiposo. Síndrome del shock tóxico: infección multiorgánica que remeda el síndrome del shock tóxico estafilocócico;

no obstante, la mayor parte de los pacientes presentan bacteremia e indicios de fascitis. Otras enfermedades supurativas: se han reconocido otras infecciones, como la septicemia puerperal, la

linfangitis y la neumonía.

Infecciones no supurativas Fiebre reumática: caracterizada por alteraciones inflamatorias del corazón, articulaciones, vasos sanguíneos

y tejidos subcutáneos. Glomerulonefritis aguda: inflamación aguda de los glomérulos renales con edema, hipertensión, hematuria y

proteinuria.

Streptococcus agalactiae (grupo B)

Enfermedad neonatal de comienzo precoz: en el transcurso de los 7 días siguientes al nacimiento, los neonatos infectados desarrollan signos y síntomas de neumonía, meningitis y septicemia.

Enfermedad neonatal de comienzo tardío: más de 1 semana después del nacimiento, los neonatos presentan signos y síntomas de bacteriemia con meningitis.

Infecciones en mujeres gestantes: más a menudo, se manifiestan con infecciones del aparato urinario; pueden provocar bacteriemia y complicaciones diseminadas.

Infecciones en otros pacientes adultos: las enfermedades más frecuentes son la bacteriemia, la neumonía, las infecciones óseas y articulares y las infecciones cutáneas y de partes blandas.

Otros estreptococos β-hemolíticos. Formación de abscesos en tejidos profundos: asociada al grupo de S. anginosus. Faringitis: asociada a S. dysgalactiae; la enfermedad remeda la causada por S. pyogenes; pueden

complicarse con glomerulonefritis aguda.

Estreptococos del grupo viridans

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Formación de abscesos en tejidos profundos: asociada al grupo S. anginosus.

Steptococcus pneumoniae Neumonía: inicio agudo con escalofríos intensos y fiebre mantenida, tos productiva con esputo teñido de

sangre; consolidación lobular. Meningitis: infección grave que afecta a las meniges y cursa con cefalea, fiebre y septicemia; elevada

mortalidad y graves deficiencias neurológicas en los supervivientes. Bacteriemia: más frecuente en pacientes aquejados de meningitis que en aquellos con neumonía, otitis

media o sinusitis; septicemia fulminante en pacientes asplénicos. 1

Streptococcus agalactiae

CARACTERÍSTICAS GENERALESStreptococcus agalactiae, o estreptococo ß-hemolítico del grupo B (EGB), es un coco grampositivo, catalasa y oxidasa negativo, anaerobio facultativo, que se presenta formando cadenas de longitud variable. El EGB puede crecer en medios simples, aunque los medios suplementados con sangre o suero favorecen su crecimiento. Tras 18-24 h de incubación en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de diámetro, lisas y rodeadas por un halo de ß-hemólisis, aunque existen algunas cepas no hemolíticas. El empleo de medios selectivos favorece la recuperación del EGB. Como agentes selectivos se emplean, gentamicina, ácido nalidíxico, colistina o cristal violeta.

El EGB presenta, además del antígeno polisacárido común que le caracteriza como perteneciente al grupo B de Lancefield, antígenos polisacáridos específicos y antígenos proteicos, que permiten su clasificación en serotipos.

IDENTIFICACIÓNLas pruebas bioquímicas más utilizadas son el CAMP-test, la hidrólisis del hipurato y la resistencia a discos de bacitracina y cotrimoxazol, aunque ninguna de ellas es específica. En medios de cultivo especiales, el EGB produce un pigmento de color rojo naranja, que es característico, y que permite su identificación directa, sin necesidad de otras pruebas. Las cepas no hemolíticas no producen pigmento. La identificación definitiva de EGB requiere la demostración del antígeno específico de grupo, por ejemplo mediante la aglutinación con partículas de látex.

EPIDEMIOLOGÍA Y TRANSMISIÓNEl EGB forma parte de la flora normal del tracto gastrointestinal desde donde coloniza la vagina y, a veces, el tracto urinario. La colonización del tracto genital puede ser intermitente y es un hecho importante en las gestantes, por la posibilidad de transmisión del EGB al recién nacido. Las tasas de colonización en las gestantes oscilan entre el 5 y el 35 %, dependiendo de la población en estudio, de los medios y técnicas de cultivo y de las áreas anatómicas de las que se toma la muestra. En nuestro medio, del 11 al 13% de las gestantes son portadoras vaginales o rectales del EGB.

La colonización por el EGB en los recién nacidos se produce durante el parto, a partir del tracto genital materno colonizado, o en el útero, por vía ascendente, siendo la tasa de transmisión vertical del 50%. Hay varios factores obstétricos que se asocian con un mayor riesgo de infección del recién nacido, fundamentalmente: prematuridad (<37 semanas), la rotura prolongada de las membranas (>18 horas), la existencia de fiebre intraparto (>38 ºC), haber tenido un hijo anterior con infección por el EGB y la presencia de bacteriuria durante el embarazo causada por este microorganismo. También las tasas de colonización por EGB son mayores en los recién nacidos de madres que presentan una alta densidad de colonización vaginal, y en los nacidos de gestantes que presentan un bajo título de anticuerpos frente a la cepa colonizante de EGB.

En los últimos años se ha producido un notable incremento de las infecciones por EGB en adultos, fuera del periodo postparto, pero las causas que determinan esta mayor incidencia no están claras.

MANIFESTACIONES CLÍNICASActualmente, el EGB es la principal causa de sepsis neonatal; sin medidas de prevención, su incidencia es de, aproximadamente, 3 casos por mil nacidos vivos (entre el 1 y el 2% de los recién nacidos colonizados por el EGB). En éste, la infección suele manifestarse, en las primeras horas de vida, bajo la forma de neumonía, sepsis o meningitis, con una mortalidad próxima al 10% (0,2-0,5 casos por mil nacidos vivos).Aunque la existencia de factores obstétricos de riesgo aumenta la probabilidad de infección en el recién nacido, sólo en la mitad aproximada de los que presentan una sepsis neonatal se identifica algún factor de riesgo.El EGB es, también, una causa importante de infecciones en gestantes y puérperas: corioamnionitis, endometritis postparto, infección de la herida quirúrgica tras cesárea e infección del tracto urinario. La bacteriuria por el EGB durante el embarazo se asocia con un mayor riesgo de parto pretérmino y rotura prematura de membranas, probablemente reflejo de un mayor inóculo vaginal.

1 Microbiología Médica. Quinta Edición. Murray, Rosenthal, Pfaller. Pag:238-242.

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En adultos, fuera del período postparto, las infecciones por el EGB se presentan, generalmente, como formas que complican otras patologías; en particular, la diabetes, las hepatopatías, el cáncer, las alteraciones neurológicas y la insuficiencia cardíaca o renal. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son las infecciones de piel y tejidos blandos, la bacteriemia sin foco séptico evidente, la endocarditis, las infecciones del tracto urinario, la meningitis y las infecciones osteoarticulares.

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICOEl diagnóstico requiere la demostración del microorganismo en sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR) u otras muestras significativas, mediante cultivo. Las muestras de sangre pueden inocularse en cualquiera de los sistemas de hemocultivo habituales.En los recién nacidos, el aislamiento del EGB en las mucosas, aspirado gástrico, orina o superficies cutáneas, por sí solo, no tiene significado diagnóstico, ya que no permite distinguir entre colonización e infección. La detección de antígeno en la sangre, LCR u orina, se ha empleado en el diagnóstico precoz de la sepsis neonatal pero, en general, con poca especificidad, lo que no permite su empleo como única prueba para el diagnóstico etiológico de este cuadro clínico. Sin embargo, el valor predictivo negativo de estas pruebas, próximo al 100%, las hace útiles, en algunos casos, para excluir a este microorganismo.

Para el estudio de las gestantes portadoras del EGB, se recomienda la toma conjunta de muestra vaginal y anorrectal en la 35-37 semana de gestación. Como técnica de cultivo, tradicionalmente, se ha recomendado el empleo de caldos de enriquecimiento selectivos (por ejemplo, el caldo Todd-Hewitt con colistina y ácido nalidíxico, o gentamicina y ácido nalidíxico), con posterior subcultivo en agar sangre e identificación del EGB, a partir de las colonias aisladas, mediante la detección de antígeno o por la prueba CAMP.En el Documento de Consenso Español para la prevención de la infección neonatal por el EGB, como alternativa al cultivo tras enriquecimiento, se recomienda el empleo del medio Granada (Biomedics, Alcobendas, Madrid), que es un medio específico, selectivo y diferencial basado en la detección del pigmento. Este medio permite la identificación directa del EGB y presenta una sensibilidad igual a la del cultivo tras enriquecimiento. Se ha desaconsejado expresamente, para determinar la colonización por el EGB en las gestantes, el empleo de técnicas de detección de antígeno directamente sobre exudados vaginales o rectales, por la elevada frecuencia de resultados falsos negativos.

El diagnóstico de la bacteriuria causada por el EGB en las gestantes, tiene interés por las complicaciones perinatales que puede ocasionar. El cribado para detectarla debe realizarse por cultivo de la orina. Las pruebas rápidas, salvo la tinción de Gram, carecen de suficiente sensibilidad. En medios como el agar CLED (Cistina-Lactosa-Electrolito-Deficiente), el EGB se desarrolla, tras 18 horas de incubación, en la forma de colonias puntiformes, transparentes, que pueden pasar fácilmente desapercibidas, sobre todo cuando se encuentra formando parte de un cultivo polimicrobiano. Por esto, para mejorar la eficacia del diagnóstico de la bacteriuria del embarazo, se recomienda el empleo sistemático de un medio de cultivo adicional, agar sangre o medio Granada. Independientemente del número de colonias aisladas, el hallazgo del EGB en la orina de las embarazadas refleja un fuerte grado de colonización vaginal que obliga a hacer profilaxis intraparto para la prevención de la sepsis neonatal precoz.

PROFILAXISLa administración endovenosa de antibióticos intraparto a las gestantes portadoras de EGB, iniciada cuatro horas antes o más antes del nacimiento, es la única medida eficaz actualmente aceptada para interrumpir la transmisión vertical del EGB y evitar la sepsis neonatal. La administración de antibióticos durante la gestación resulta ineficaz para erradicar la colonización vaginal, ya que, al suprimir el tratamiento, la vagina vuelve a colonizarse a partir del recto.

Basado en los datos epidemiológicos existentes en España, en el documento de Consenso Español, para la prevención de la infección neonatal por el EGB, se recomienda la administración de profilaxis intraparto en las siguientes circunstancias: a) en todas las mujeres identificadas como portadoras vaginales o rectales de EGB durante la gestación, b) en todos los partos de menos de 37 semanas en los que se desconozca si la gestante es o no portadora del EGB, c) en todas las embarazadas que hayan presentado bacteriuria por el EGB en la gestación, d) en las mujeres que previamente hayan tenido un hijo con enfermedad perinatal por EGB demostrada, independientemente del resultado de los cultivos de seguimiento, y e) cuando no se disponga de los resultados del cultivo, pero existan factores de riesgo tales como la rotura prolongada de membranas (>18 h), o la presencia de fiebre intraparto (>38º C).

Se recomienda administrar, al comienzo del trabajo de parto, una de las dos pautas siguientes: a) 2 g de ampicilina i.v., seguidos de 1 g cada 4 h hasta su finalización, y b) 5 MU de penicilina G i.v., seguidos de 2.5 MU cada 4 h, hasta el fin del parto. En caso de alergia a los ß-lactámicos, puede utilizarse la clindamicina i.v. 900 mg/8 h, o la eritromicina i.v. 500 mg/6h hasta la conclusión del parto.

En los recién nacidos, la infección por el EGB se relaciona con un título bajo de anticuerpos frente al antígeno específico de tipo de la cepa colonizante. Actualmente, se encuentran en fase experimental el desarrollo de vacunas dirigidas a prevenir la infección neonatal causada por el EGB, mediante la inmunización activa de las gestantes.

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Aunque los resultados de alguna de estas vacunas han sido prometedores en estudios realizados en voluntarias, de momento no se encuentran disponibles, y su eficacia en la prevención de la infección en adultos no se conoce.

TRATAMIENTOLa penicilina G es el antibiótico de elección para el tratamiento de las infecciones por este microorganismo. También se utiliza habitualmente la combinación de penicilina más un aminoglucósido, generalmente la gentamicina, en el tratamiento de las infecciones graves, dada la sinergia que estos antibióticos presentan in vitro. La duración del tratamiento es variable, según la edad, gravedad, localización de la infección y respuesta clínica inicial.

Algunos estudios recientes ponen de manifiesto un aumento de la resistencia del EGB a la eritromicina y la clindamicina (16 y 15% respectivamente), lo que puede plantear problemas a la hora de elegir la profilaxis antibiótica más adecuada en las gestantes alérgicas a los ß-lactámicos. En el tratamiento de la bacteriuria del embarazo, también suelen emplearse antibióticos de este grupo, manteniendo el tratamiento durante tres a siete días.2

Streptococcus pneumoniae

Reino: EubacteriaFilo: FirmicutesClase: BacilliOrden: LactobacillalesFamilia: StreptococcaceaeGénero: StreptococcusEspecie: S. pneumoniae

El Steptococus pneumoniae fue identificado como causa de neumonía entre los años 1880-1890. En 1926 se le asigno el nombre de diplococus pneumoniae basándose en al tinción de Gram. Recién en 1974 se le dio el nombre de Streptococus pneumoniae debido a que crece en el medio liquido. Desde ahí en adelante también se han identificado 90 serotipos lo cual se da ya que cada uno se estos serotipos posee una capa de polisacárido especifico.

Streptococcus pneumoniae, es un microorganismo patógeno capaz de causar diversas infecciones y procesos invasivos severos. Se trata de una bacteria Gram. Positiva que presenta una forma oval y el extremo distal lanceolado. Es inmóvil, no forma endosporas, y es un miembro alfa hemolítico del género Streptococcus. Generalmente, se presenta en forma de diplococo, aunque existen algunos factores que pueden inducir la formación de cadenas. Neumococo es un patógeno casi exclusivamente humano causante de un gran número de infecciones como neumonía, endocarditis y de procesos invasivos severos como meningitis, septicemia, etc. particularmente en ancianos, niños y personas inmunodeprimidas. El hábitat natural de neumococo es la faringe.

Concepto y clasificación. Son cocos gram positivos, lanceolados o dispuestos en cadenas y con una capsula de polisacárido que permite su tipificación con antisueros específicos. Estos son característicos por ser solubles en las sales biliares, esto se debe a la acción de los agentes tensoactivos, los cuales probablemente retiran o inactivan los inhibidores de las autolisinas de la pared celular, dando paso a la lisis.

El estreptococo pneumoniae se puede diferenciar del estreptococo viridans en que solo el primero es soluble en bilis, el viridans no. Y la otra diferencia es que el estreptococo pneumoniae se inhibe en la presencia de optoquina. El estreptococo viridans no se inhibe con la optoquina.

(A)

(B)

2 http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/agalac.htm

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En la imagen (A) tenemos un estreptococo viridans resistente a la optoquina, en la imagen (B) hay estreptococo pneumonae sensible a la optoquina.Estos microorganismos son muy difíciles de cultivar ya que presentan una gran sensibilidad a agentes externos.

Tipos de neumococos En los adultos los tipos 1 a 8 causan casi el 75% de los casos de neumonía neumocócica y más de la mitad de todas las muertes por bacteriemia neumocócica; en los niños, los tipos 6, 14, 19 y 23 son la causa más frecuente.

Microbiología En el laboratorio se le identifica como cocos gram positivos que crecen en cadenas y ademas que son catalasa-negativos.

El Streptococus pneumoniae sintetiza la toxina neumolisina la cual degrada la hemoglobina a un producto verdoso de degeneracion y causa hemolis α en agar de sangre, por lo que se le clasifica como α-hemolitico.

Estas cepas de neumococos en su mayoria (98%) son sensibles a etilhidrocupeina (optoquina) y ademas casi todas se disuelven por accion de sales biliares.

Los principales componentes de su pared celular son el peptidoglican y el acido teicoico y la integridad de la pared esta dado por la prescencia de cadenas laterales peptidicas entrelazadas entre si por accion de enzimas como las transpeptidasas y carboxipeptidasas. Estas enzimas son inactivadas por los antibioticos β-lactamicos.

El S. pneumoniae contiene una sustancia especifica, la sustancia C y esta presente en todas las cepas.Su virulencia esta dada entre otros por proteinas de union a colina como la PspA que impide la fagocitosis, ademas que todas las cepas poseen una capsula polisacarida.

Respecto a las cepas que producen mayor incidencia son las primeras descubiertas por lo que estas tiene un numero mas bajo, esto según el sistema norteamericano.

Pero el sistema danes que es el mas aceptado lo agrupo basandose en sus similitudes antigenicas.

Epidemiología S. pneumoniae coloniza al nasofaringe y se aisla entre el 5-10% de los adultos sanos y del 20-40% de los niños. Luego de su colonización pueden persistir de 2-4 semanas y an algunos casos hasta 6 meses. El contagio se produce por contacto proximo prolongado y este aumenta si se da en espacios cerrados. Tambien las salas cuna son lugares de diseminación para los niños y para los adultos, las aglomeraciones como albergues, prisiones hogares de ancianos, entre otros.

El riesgo no aumenta en colegios, lugares de trabajo e incluso hospitales. La insidencia es elevada en lactantes de hasta 2 años y baja en adolescentes y adultos jóvenes y asi la tasa se eleva luego de los 55 años.La mayoria de los casos de neumonía se debe al S.pneumoniae. aproximadamente 20/1000000 de los casos en adultos jóvenes y 280/100000 en adultos mayores.Esta insidencia alcanza el maximo en invierno y desciende en verano

Mecanismos Patogénicos. S. pneumoniae se une a las células nasofaringeas humanas por la interacción específica de las adhesinas de la superficie bacteriana, como el antígeno A de la superficie neumococica o las proteínas de unión a colina, con los receptores de las células epiteliales.

Los posibles sitios de unión pueden ser: glucoconjugados de células epiteliales o el glucolipido aislado. A esta adherencia también contribuye la variación de la fase neumococica, los organismos pasan de ser transparentes a opacos.

En los cultivos se encuentran colonias transparentes y opacos. Los opacos tienen peptidoglicano y capsulas grandes

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y los transparentes mayor cantidad de fosforicolina, lo que le da adherencia a células de mamíferos y menos polisacárido capsular.

Luego de la colonización de la nasofaringe se produce una infeccion si los microorganismos pasan a zonas adyacentes como: senos paranasales, trompa de Eustaquio y su eliminación se dificulata por edema de la mucosa que se produce por el mismo microorganismo.

También aparece neumonía si los microorganismo se inhalan por los bronquiolos o los alvéolos y no son eliminados. Que no se eliminen puede ser por la presencia de infeccion vírica, humo de cigarrillo u otra sustancia toxica que incrementan la cantidad de mucus y la disminución de la acción ciliar.

Además se ha demostrado que los neumococos se unen a los neumocitos luego de la infeccion vírica, y los neumocitos activados por citoquinas expresan el receptor del factor activador de plaquetas. Así el receptor se une a residuo de fosforilcolina de la sustancia C y eso aumenta la adherencia de los neumococos.

Luego que estos alcanzan una zona no habitual activan el complemento por la vía clásica y alterna, así se producen citocinas y la atracción de neutrofilos y así de fagocitosis., pero la capsula es resistente a ella. Y como no puede ser fagocitada comienza la infeccion, la cual se puede diseminar a espacios articulares, meninges, cavidad peritoneal, etc.

La patogenicidad de este microorganismo esta dada por la evolución de la fagocitosis y el potencial de estimular inflamación y lesión de tejidos, todo dado por su encapsulacion, ya que los neumococos no encapsulados casi nunca causan enfermedad invasora.

Los síntomas de la enfermedad que causan se debe a la inflamación de los tejidos que producen, lo que aumenta la presión intracavitaria (otitis, meningitis y neumonía).

Cuando invade el SNC en la meningitis produce lesión neuronal.

También en la patogenicidad actúa la autolisina que al producir la lisis de la bacteria esta vierte sus contenidos y aumenta la reacción de inflamación. También en la meningitis se liberan aminoácidos excitadores por el tejido neuronal lo que contribuye a las lesiones de esta enfermedad.3

TIPOS DE HALOS DE INHIBICIÓN (EN DISCOS CON ANTIBIÓTICO)

Cuando el disco impregnado con el antibiotico toma contacto con la superficie humeda del agar, el agua se absorbe en el papel filtro y el antibiotico se difunde en el medio que lo rodea .La velocidad de extracción del antibiotico fuera del disco es mayor que su difusión modo que la concentración inmediatamente adyacente al disco puede exceder a la del disco mismo. No obstante a medida que aumenta la distancia , hay una reduccion logaritmica de la concentración del antibiotico .Cuando se alcanza una masa celular critica de bacterias, se sobrepása la actividad inhibitoria y aparece el crecimiento bacteriano .La concentración del antibiotico que se difundio en esta interfase de crecimiento y las bacterias inhibidas se conoce como concentración critica y se aproxima a la CIM obtenida en las pruebas .Esto coincide con el desarrollo de una prueba practicable de difucion de discos ,se ha intentado simplificar la prueba . En la placa se presenta el disco de antibiotico en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con el gérmen. Es una medida de la potencia del antibiotico frente al gérmen. Los diferentes tipos de inhibición son los siguientes:

1 . Pruebas de sensibilidad antimicrobiana por difusión en disco.2. Pruebas de concentración mínima inhibitoria (MIC) en caldo. Esta prueba cuantitativa es muy útil para microorganismos anaerobios, para determinar la actividad bactericida o evidenciar el sinergismo o antagonismo entre agentes antimicrobianos.3. Pruebas para producción de beta-lactamasa. Los procedimientos comúnmente utilizados para determinar la producción de beta-lactamasas en laboratorios clínicos incluyen el método cromogénico decefalosporina, el acidimétrico y el iodométrico. Todas estas pruebas están basadas en la detección delos productos finales de la hidrólisis de beta-lactamasas por colorimetría.4. Pruebas para la detectar la resistencia a oxacilina (metacilina) en Staphylococcus. Esta prueba es importante considerando que algunas cepas de Staphylococcus pueden dar falsos negativos para metacilina en pruebas de difusión debido a la rápida inactivación de este medicamento en refrigeración.Se utiliza una oxacilina más estable que permite detectar además de las oxacilina resistentes, la mayoría de las cepas metacilina resistentes.5. Pruebas de sensibilidad por microdilución en caldo para bacterias anaerobias. Para anaerobios se recomienda utilizar dilución en agar, microdilución en caldo y macrodilución en caldo. Se deben utilizar medios suplementados

3 http://s-pneumoniae.blogspot.com/

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que favorezcan el crecimiento de anaerobios, en particular la microdilución en caldo es útil para microorganismos como Clostridium.

ENZIMA ESTAFILOCOCIDA PARA PRUEBA DE CAMP• Proteinasas. Destruyen proteínas.• Coagulasa. Coagula el plasma, forma una mallafibrina = Antifagocitaria.• Nucleasas. Clivaje de ADN y ARN.• Estafiloquinasas (fibrinolisina). Fibrinolisis.• Hialuronidasa. Despolimeriza ácido hialurónico.• Catalasa. Convierte H2O2 en agua y oxígeno• B-lactamasas. Destruyen penicilinas y cefalosporinas (antibióticos B-lactámicos).• Gelatinasas. Licuan la gelatina.

Sangre de carnero desfibrinada

La sangre desfibrinada de carnero sangre es completamente procesada, sin uso alguno de aditivos o preservantes para remover la fibrina, factor que estimula la coagulación de la sangre que interfiere con la preparación y utilización en el medio de cultivo. Está libre de citratos u otros anticoagulantes y libre de agentes complejantes que puedan interferir con el desarrollo microbiano. Además, esta libre de factores inmunológicos que comúnmente se encuentran en la sangre humana interfiriendo con el diagnóstico. La sangre de carnero es la más adecuada para la preparación de Agar Sangre y Agar Chocolate. Comúnmente se utiliza la sangre de carnero entre 5 - 10% como un medio de enriquecimiento nutritivo en la preparación de medios de cultivo. Éste es utilizado principalmente para el crecimiento, identificación y observación de las reacciones hemolíticas causadas por algunas bacterias con importancia clínica.4

TINCIÓN DE GRAM

La técnica de la tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Christian Gram en 1884. Esta tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta, que tiñe de violeta.2. Se añade el mordiente, iodo.3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante.4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.

El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las células Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano delgada y una membrana ex-terna. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa.

La tinción de Gram es extraordinariamente útil en clínica. Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la identificación de un microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con sólo un microscopio y unos cuantos botes de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su morfología celular y su agrupación típica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qué tipo de bacteria estamos trabajando. Es más, el tratamiento de una infección depende de que el agente sea Gram positivo o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan Sólo sobre los primeros, y otros sobre los segundos. La penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram positivas; mientras que la estreptomicina v la tetraciclina actúa sobre ambas.5

4 Brock, biología de los Microorganismos, Madigan, Michael y Martinko, Pearson educación, Madrid España, 7ª edición p.p 160-1635 http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm

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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso.

Medios definidos: es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.

Medios complejos: Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denomina caldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína.Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos.El uso de estos medios es universal y está orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier tipo de bacteria, se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o de productos patológicos. Los medios de este tipo de uso más frecuente son: Agar tripticasa-sangre, caldo tripticasa, Agar chocolate, medio de Mueller-Hinton.

Medios selectivos: favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. Ejemplo: agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina). Otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun.Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies.Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+). Medios diferenciales Se utilizan para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Algunas bacterias se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.Se emplean para demostrar alguna propiedad bioquímica de la bacteria como  degradación de hidratos de carbono, proteínas, hidrólisis de la urea, etc., contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en

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el medio o en las características típicas de las colonias el estudio en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificación de bacilos Gram(-) ya que ellos no tienen características muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso más corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azúcar (TSI agar  Medio de SIM,  Caldo glucosado fosfatado, Voges-Proskauer o del rojo de metilo,  Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons- Medio caldo urea, etc.6

Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas.

Medios de enriquecimiento: Se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirán el tratamiento y podrán crecer. Las bacterias lijadoras de nitrógeno pueden seleccionarse cultivando el inóculo de suelo en un medio libre de nitrógeno, donde sólo ellas podrán crecer porque obtienen el nitrógeno de la atmósfera. Los ecólogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto químico tóxico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la única fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en él podrá ser utilizado en biorremediación7

PRUEBAS Y MEDIOS DE CULTIVO

PRUEBA DE HEMOLISIS POR PICADURAEn esta prueba se corrobora la hemólisis producida por los Streptococcus que pueden ser de tres tipos: la alfa, beta y gamma.

La hemólisis alfa es color verdoso café por que tiene estreptolisinas O, S que degrada el potasio dentro del eritrocitoHemólisis beta es un halo transparente por que se expresa una estreptolisinaHemólisis gamma es ninguna hemólisis, ni verde ni transparente

PRUEBA DE QUELLUNGLa prueba de Quellung consiste en mezclar un antisuero anticapsular con el esputo o cualquier otra muestra problema, lo que provoca la hinchazón de la cápsula bacteriana, puede verse al microscopio. Es una de las pruebas de identificación para los Streptococcus.

PRUEBA DE CAMP

Principio:

A.- Sirve para determinar la capacidad de un microorganismo para producir y elaborar el dfactor CAMP que actúa de manera sinérgica con la -hemolisina estafilocócica ( -lisina) sobre eritrocitos ovinos o bovinos para producir un fenómeno lítico en la unión de los 2 microorganismos.B.- Alternativas:

Determinar el fenómeno de hemólisis sinérgica con el factor CAMP y la -hemolisina ( -toxina) de Clostridium perfringens.

Determinar la producción de fosfolipasa D, la que inhibe la reacción de la prueba de CAMP.

El fenómeno lítico se denomina prueba o reacción de CAMP por las iniciales de los apellidos de los autores originales: Christie, Atkins y Munich-Petersen. Con posterioridad, el término se utilizó para otros procedimientos. Murphy y col. Denominaron fenómeno lítico a la reacción CAMP y definieron la prueba CAMP como manera de determinar la capacidad de los estreptococos de producir un agente lítico (Factor CAMP) que se manifiesta como una zona hemolítica con la -lisina estafilocócica; de ahí la sigla CAMP.

Objetivo:

A.- Prueba de CAMP1) Diferenciar e identificar de manera presuntiva cepas humanas o animales cepas de Streptococcus agalactiae del grupo B (+) de otras especies de Streptococcus (-) cuando se incuban en aerobiosis o condiciones reducidas de oxígeno (jarra para extinción de la vela).

6http://209.85.173.104/search?q=cache:sp3LvVkZIIMJ:www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/archivos/microbiologia.doc+gelosa+sangre&hl=es&ct=clnk&cd=11&gl=mx7 http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap310.htm

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2) Verificar o identificar especies patógenas hemolíticas de Listeria junto con la producción de ácido a partir de D-Xilosa, L- ramnósido y -metil-D-manósido.a) Con Staphylococcus aureus subes. Aureus

Determinar reacciones -hemolíticas dudosas o débiles (+d) de Listeria monocytogenes (+) y Listeria seeligeri (+d)Ayuda a distinguir Actinomyces neuii subes. Anitratus (+) y A. neuii subesp. Neuii (+) de otras especies

Actinomyces(-)Ayuda a distinguir Corynebacterium Boris, Corynebacterium coylae (fuertemente+) y Corynebacterium

glucoronolyticum de otras especies de Corynebacterium (-). Corynebacterium subesp. Afermentans y Corynebacterium striatum son variables en la prueba CAMP.

La positividad CAMP es una característica importante para Turicella otitidis.Mycobacterium arborescens es CAMP variable.

b) Con Rodhococcus equi para identificar Listeria inanovii (+)

B.- Prueba CAMP inversa1) Para distinguir de manera presuntiva C. perfirgens (+) de otras especies de Clostridium formadoras de esporas y reductoras de sulfitos (-): altamente específica para C. perfringens.2) Para ayudar a distinguir Arcanobacterium haemolyticum (+) de Arcanobacterium pyogenes (-) y Arcanobacterium bernardiae (-)

C.- Producción de fosfolipasa D (PLD): Para distinguir Corynebacterium pseudotuberculosis (+) y Corynebacterium ulcerans (+) de otras especies Corynebacterium (-).

Bioquímica:

La prueba (reacción) CAMP se basa en el hecho de que los estreptococos del grupo B producen un factor (CAMP) que actúa de manera sinérgica con la -hemolisina de S. aureus subesp. Aureus en un medio agar con sangre ovina o bovina. El sinergismo es una acción coordinada o correlacionada por 2 o más microorganismos; el sinergista, factor CAMP, es un adyuvante de la acción de otro microorganismo. (Macfaddin 33-34)

Los estreptococos producen una proteína termoestable difusible (factor CAMP) que aumenta la hemólisis de S. aureus produciendo esfingomielasa C que se une a las membranas del eritrocito por que el K+ que se extraiga (si se exponen al factor como el grupo B) sufra hemólisis en forma de flecha.

Se produce en el grupo B 8estimula la hemólisis) y también a veces en los grupos C, F y G.

PRUEBA DE CATALASA

Principio: Probar la presencia de la enzima Catalasa

Objetivo: (H2O2 al 3%)Principalmente para diferenciar entre los géneros

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) o de Staphylococcus (V+) o de ambos.Bacillus (+) de Clostridium (V-)Listeria monocytogenes (+) de Khurthia (+), Corynebacterium (+) de otros microorganismos que pueden ser

similares morfologicamente: Erysipelothrix (-) de Lactobacillus (V-), espécies de Enterococcus (-) y Streptococcus del grupo B(-)

Microorganismos grampositivos- Aerococcus urinae(+) de Aerococcus viridans (-)- Staphylococcus aureus subesp. Anaerobius (-); por lo general solo crece em anaerobiosis y S. saccharolytica (-) de otras espécies de Staphylococcus (+). (Macfaddin 74)

Prueba de - LACTAMASA

Principio: Establecer la sensibilidad de microorgansimos específicos a penicilinas sensibles a penicilinasa o a cefalosporinasa, determinada por su capacesidad de elaborar una enzima -lactamasa que hidroliza el anillo -lactámico para producir ácido penicilonico o ácido cefalosporoico.

Objetivo: Las -lactamasas se encuentran em uma variedad de gram+ y gram-. La importancia de las enzimas producidas por muchas bacterias entéricas (Enterobacteriaceae) es menos clara y estas bacterias no deben probarse para la producción de - lactamasa; su escaso valor se debe a la diversidad de enzimas con especifidades de sustrato diferentes que pueden producirse dentro de las especies o incluso por una sola cepa. (Macfaddin 236)

Prueba del disco de OPTOQUINA

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Principio: Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina probando la fragilidad de la membrana celular bacteriana.

Objetivo: El disco de optoquina se utiliza de manera específica para diferenciar entre Streptococcus pneumoniae (sensible; S) y otras especies de Streptococcus -hemolíticos (viridans) (resistente; R); Método fenotípico.

Bioquímica: La optoquina es una sustancia química, clorhidrato de etilhidrocupreína. La etilhidrocupreína, base del disco de optoquina es completamente insoluble en agua. Sin embargo, el clorhidrato de etilhidrocupreína es completamente hidrosoluble. La optoquina es un derivado del alcaloide hidroquinina.

Cuando el disco está impregnado con alrededor de 0.2ml de una disolución acuosa 1:4.000 de la sustancia química, secada a 37ºC sirve para la diferenciación de S. pneumoniae (las células se lisan debido a los cambios en la tensión superficial y se produce una zona de inhibición por contacto con la optoquinona) y es bacteriostática a una concentración 1:500.000 a 1:100.000. Las otras especies de -Streptococcus requieren una concentración 1:500 (o mayor) para inhibir el crecimiento. (Macfaddin 339)

Prueba de la OXIDASA:

Principio: Determinar la presencia de las enzimas oxidasas. (Ej de Reactivo: Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina)

Objetivo:

A.- Diseñada originalmente para identificar Neisseria; posteriormente para distinguir la familia Pseudomonadaceae de la familia Enterobacteriaceae oxidasa negativos (Sólo Plesiomonas shigelloides es +).B.- La mayoría de las bacterias gram+ son oxidasa negativas.

Bioquímica: Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular que se debe a un sistema de citocromo oxidasa (transporte de electrones y fijación del N) que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como aceptor de electrones en la fase Terminal del sistema de transferencia de electrones. (Macfaddin 344-345)

Prueba de OXIDACIÓN – FERMENTACIÓN (HUGH Y LEIFSON) O/F

Principio: Determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización.

Objetivo:

A.- Ayuda a la identificación de bacterias anaerobias y aerobias facultativas.Para diferenciar bacilos gram- entéricos y no entéricos, aerobios a anaerobios facultativos de la familia

Enterobacteriaceae, cuyos miembros son todos los fermentadores (F).Ayudar a la diferenciación de los géneros Staphylococcus y Micrococcus.

- Especies de Staphylococcus: fermentadores de glucosa; excepto S. saprophyticus, fermentador débil o no reactivo.- Espécies de micrococcus; por lo común oxidadoras de glucosa.

Determinar movilidad y producción de gas (CO2 y H2) debido al medio semisólido.

Bioquímica: Las bacterias utilizan carbohidratos ya sea por fermentación u oxidación. Algunas pueden metabolizar un hidrato de carbono (como se muestra por la producción de ácido) sólo en condiciones aerobias; mientras que otras producen ácido en ambos casos. La mayoría de importancia médica son anaerobias facultativas. (Macfaddin 354-355)

El medio de HUGH Y LEIFSON es un medio diferencial: la glucosa lo vuelve enriquecido ya que esta se desdobla y produce ácido láctico acidificando el medio) que contiene azul de bromotimol (en medio ácido vira a amarillo).

AGAR MUELLER HINTON

Pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de Neisseria

En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. También se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas)

Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño María a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún momento.

IdentificaciónCon sello Sin sello Metabolismo

+ + Fermentativo- + Oxidativo (Ej. Pseudomona)- - Ni F ni O (Ej. Streptococos)

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Usos: Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35ºC, en atmósfera de CO2. El medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodón húmedo y una vela encendida, cerrando luego herméticamente.

Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse después de 12 a 18 horas de incubación. Después de este tiempo se tendrán que revisar periódicamente las zonas de inhibición ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentración del agente antimicrobiano comienza a disminuir.

Se obtiene mejores resultados para aislar Neisserias patógenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adicionándole a cada 100 ml del medio terminado y fluido 1.0 ml de la suspensión VCN, mas 1.0 ml del polienriquecimiento. (MANUAL BIOXON 28)

BASE DE AGAR GC

La Base de Agar Gelosa Chocolate es un medio utilizado con varios suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeae y otros microorganismos fastidiosos. Este medio también es conocido como Base de Agar GC. Diseñada especialmente para aislar Neisserias patógenas, gonococo y meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de crecimiento.

En 1945 Jhonston describió un medio adecuado para observar las colonias de Neisseria gonrrhoeae en 24 horas en lugar de las 48 horas generalmente requeridas. El crecimiento acelerado fue debido a una reducción en la concentración de agar. Investigando el crecimiento de algunas cepas de neumococcos se observó que el medio conteniendo los factores de crecimiento glutamina y cocarboxilasa permitió una mejor recuperación. A partir de esta observación se desarrollaron suplementos de enriquecimiento que junto con la hemoglobina hacen a la Base de Agar GC un medio superior.

La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando es suplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para el crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria, así como suplementos (disponibles comercialmente) que proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina, coenzimas, hemina, vitaminas, aminoácidos, dextrosa y otros factores de crecimiento, todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophilus y Neisseria.

Cuando a esta base se le adiciona además inhibidores selectivos como el VCN o VCNT se prepara el Agar Thayer Martín y Thayer Martín Modificado.

Tanto el polienriquecimiento como la mezcla VCN (Vancomicina, Colistin y Nistatina) son preparados liofilizadamente.

Usos: El espécimen se debe estriar en la superficie de la placa, de tal manera que una zona relativamente pequeña se inocule masivamente. A partir de esta, continuar estriando suavemente y ligera a fin de lograr colonias aisladas. Se pueden identificar colonias de N. gonorrhoeae (blanco-grisáceas opacas de 1-2mm) (BIOXON 38-39)

Composición:

Mezcla de Peptonas 15.0 Fosfato Dipotásico 4.0Almidón de Maíz 1.0 Fosfato Monopotásico 1.0Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriológico 10.0pH 7.2 ± 0.2

La morfología típica colonia se describe: Haemophilus influenzae Colonias pequeñas, húmedas, perladas con característico olor húmedo Neisseria gonorrhoeae Colonias pequeñas grisáceas o incoloras, mucoides Neisseria meningitidis Colonias medianas a grandes, de color azul grisáceo, mucoides. Streptococcus pneumoniae Colonias pequeñas, planas, pueden aparecer verdes por la decoloración del medio8

BASE DE AGAR SANGRE

Aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes difíciles

8 http://www.mcd.com.mx/pdfs/BASE%20DE%20AGAR%20GC.pdf

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La base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difícil crecimiento. Al añadir sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo.

Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen.

La base de agar Sangre también puede usarse para la preparación de antígenos.(BIOXON 39)

Para el aislamiento, cultivo y detección de actividad hemolítica de Staphylococcus, Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises, Grandes, convexas de consistencia butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que Presenta hemólisis.  Las colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, Estos crecen rápidamente a 37° C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20 ° C).

MEDIO CTA

El medio Cistina-Tripticaseína es empleado para conservar cepas, detección de movilidad y adicionado con carbohidratos para estudios de fermentación de microorganismos muy exigentes y desarrollo difícil, tanto aerobios como anaerobios. Ideal para estudios bioquímicos de Neisserias patógenas.

Usos:

Repicado y mantenimiento de cepas: Los microorganismos exigentes y de cultivo difícil como Neisserias patógenas, Neumococcos, Estreptococos, Brucillas, Pasteurella, Corynebacterium, Vibrios y algunos otros, se reproducen fácilmente en el medio TCA sin que sea necesario agregarles suero o cualquier otro factor de crecimiento, ni colocar los cultivos en atmósfera de CO2. Es preferible usar este medio para anaerobios esporulados. Las cepas repicadas sin azúcar duran bastante tiempo. La mayor parte de las veces se recomienda inocular el tercio superior de la columna del medio.

Determinación de la movilidad: Sembrar el medio semisólido por picadura central sin llegar al fondo del tubo. Los microorganismos móviles, crecen a lo largo de la punción y se difunden a todo lo largo de la masa del medio adquiriendo este un aspecto turbio. En cambio si el germen es móvil, el desarrollo sólo se observa a lo largo y en el sitio de picadura, permaneciendo el resto del medio claro y transparente.

Empleo en las reacciones de fermentación y degradación: Este medio carece de azúcares y como es rico en nutrientes no es necesario agregarle suero sanguíneo, suprimiendo así una fuente de carbohidratos indeseables. Los azúcares pueden agregarse en polvo o impregnados en disco de papel.

El medio CTA no siempre da reacciones de fermentación bien definidas con las enterobacterias ni con los clostridios. Estos gérmenes tienden a reducir la Cistina presente en el mismo, dando a veces reacciones de interpretación dudosa. (BIOXON 54)

POLIENRIQUECIMIENTO

La acción de VCN se refuerza decididamente al agregar al medio polienriquecimiento que se prepara de forma liofilizada, por lo que su estabilidad es indefinida, sobretodo en refrigeración.

Se reconstruye agregando el contenido (10ml) de un vial de líquido diluyente a un vial de producto liofilizado. Agitar en seguida unos cuantos minutos hasta que el material sólido se disuelva.

Agregar 1.0ml en la solución de polienriquecimiento a 100ml de medio de cultivo, sólido o líquido, que se desee enriquecer. Si se trata de un medio sólido, por ejemplo Agar chocolate , base de agar Casman, este deberá aún estar fluido a una temperatura entre 45 y 50ºC.

En general se utiliza para enriquecer con sus 12 factores y cofactores de desarrollo, a determinados medios de cultivo especialmente a aquellos diseñados para aislar y multiplicar gérmenes exigentes y delicados. Es indispensable para aislamiento de gonococos y meningococos.(BIOXON 71)

Fórmula aproximada en g/L

Vitamina B-12………………………0.010L-Glutamina………………………...10.00Adenina……………………………..1.000Clorhidrato de Guanina……………0.030Ácido p-aminobenzóico……………0.013L-Cístina…………………………….1.100Glucosa……………………………..100.0

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Nucleótido de difosforitridina……..Oxidasa (Coenzima 1) ……………0.250Cocarboxilasa………………………0.100Nitrato férrico……………………….0.020Clorhidrato de tiamina……………..0.003Clorhidrato de cisteína…………….25.90

BASE DE AGAR CASMAN

Medio de enriquecimiento para el cultivo de Neisseria Gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus vaginalis y estreptococos patógenos; Microorganismos exigentes.

Casman describió un medio enriquecido con sangre para microorganismos exigentes incubados en un ambiente anaerobio. Casman ajustó el medio después de que varios experimentos revelaran que la nicotinamida interrumpía la acción de una enzima sangu’inea que inactivaba el factor V (NAD). Con posterioridad, la concentración de nicotinamida se rebajó para favorecer el crecimiento de Neisseria.

La proteosa peptona nº 3, triptona y extracto de carne proporcionan nitrógeno, vitaminas y aminoácidos. La nicotinamida favorece el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae impidiendo la liberación de la coenzima (factor V) por medio de nucleotidasas procendentes del enriquecimiento con sangre. La dextrosa se añade para favorecer el crecimiento de cocos patógenos. El Cloruro sódico mantiene el balance osmótico en el medio. El almidón tiene como función asegurar que cualquier metabolito tóxico producido sea absorbido, neutralizar la inhibición de beta-hemólisis por la glucosa y favorecer el crecimientode Neisseria. El agar bacteriológico es el agente gelificante.

Por su alto contenido en peptonas y otros factores nutritivos, da excelentes resultados para cultivar microorganismos exigentes; siendo especialmente empleado para aislar Haemophilus vaginalis del tracto urogenital.

El medio base de agar casman funciona perfectamente tanto como GS y GC. Los resultados mejoran notablemente si se incuban en atmósfera de CO2 (técnica de la vela). El almidón de maíz y el uso de agar muy purificado incrementa notablemente el crecimiento de N. gonorrhoeae.

La morfología colonial típica se describe así:Neisseria Gonorrhoeae: Crecimiento satisfactorio.Haemophilus influenzae: Crecimiento satisfactorio.Streptococcus pneumoniae: Crecimiento con alfa hemólisis.Streptococcus pyogenes: Crecimiento con beta hemólisis.9

¤ Peróxido de hidrógeno al 3%Uso de la sustancia o preparado: Para usos de laboratorio, análisis, investigación y química fina.Propiedades físicas y químicas Aspecto: Líquido transparente e incoloro.Olor: Característico.

¤ Discos de penicilinaLa actividad delos discos de la penicilina primaria incluye no productores de ß-lactamasa, grampositivos y algunos bacterias gramnegativas fastidiosas, y. Las acilamina penicilinas (ampicilina y amoxicilina) tienen actividad específica contra más especies de gramnegativos, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de ß-Lactamasa. Carboxi- penicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina) tienen un amplio y considerable espectro contra gramnegativos, incluyendo actividad contra Pseudomonas spp.y Burkholderia spp. Penicilinas penicilinasa resistentes (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) que tienen un espectropredominantemente grampositivo, incluyendo Staphylococcus spp. productor de penicilinasas.El método de difusión con un disco de penicilina no es un método fiable para la detección de la resistencia a dicho antibiótico, debido a la ausencia de correlación entre los halos de inhibición del disco de penicilina y la CMI correspondiente. Así, las cepas con resistencia intermedia o de bajo nivel a la penicilina (CIM entre 0,12 µg/ml y 1 µg/ml) pueden presentar halos de inhibición con el disco de penicilina relativamente grandes.

¤ Reactivo para oxidasa (Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina)El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

9 http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_casman.pdf

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¤ SacarosaSacarosa está regulada principalmente en tres pasos, los catalizados por la fructosa-1,6-bisfosfatasa, sacarosa-6-fosfato sintasa y sacarosa fosfato fosfatasa. Cuando la luz incide por primera vez sobre la hoja por la mañana, aumentan los niveles de triosa fosfato en el citosol (provenientes de la fijación de carbono en el cloroplasto). Las triosas fosfato inhiben la actividad de la fosfofructoquinasa-2 disminuyendo los niveles de fructosa-2,6-bisfosfato. Esto libera la inhibición de la fructosa-1,6-bisfosfatasa, lo que permite la síntesis de fructosa-6-fosfato y así de otras hexosas fosfato, incluida la glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato es un activador alostérico de la sacarosa-6-fosfato sintasa. La sacarosa fosfato fosfatasa cataliza el paso final en la síntesis de sacarosa a medida que dispone de sustrato.10

MATERIAL

40 cajas petri estériles2 mecheros fisher1 pizeta1 agitador magnético30 tubos de tapa de rosca chicos2 gradillas4 matraces Erlenmeyer 1L1 espátula4 asa y portasa1 probeta 500mlPapel craftPapel encerado2 pipetas estériles 5 y 10mlGasaAlgodón

REACTIVOS

Base de agar CasmanPeróxido de hidrógeno al 3%Discos de penicilinaDiscos de optoquinaReactivo para oxidasa (Clorhidrato de tetrametil fenilendiamina)Medio de Hugh y LeifsonAgar Mueller HintonBase de agar SangreBase de agar GCPolienriquecimiento liofilizado y su diluyenteSorbitol 70%sacarosa

EQUIPO

AutoclaveRefrigeradorParrillaBalanza semianalíticaEstufaMicroscopio

MATERIAL BIOLÓGICO

S. agalactiaeS. pyogenesSangre de carnero desfibrinada

PROCEDIMIENTO

Primera sesión

10 Microbiología de Prescott, L.M y Harley, J.P y Klein, D.A, Mac Graw Hill, Madrid España 4ª edición (2001) p.p 39, 198-201)

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1. Se procede a preparar los medios que se van a utilizar para la identificación de posibles microorganismos.Como son:

Base de Agar SangrePreparación:Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Después de esto enfriar a 4 –50ºC y añadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estériles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo.

También es posible inocular el fondo de una caja petri estéril con un pequeño inóculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50ºC; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra.

En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapón de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estériles

Base de agar chocolate

Suspender 7.2 g del medio en 100 mL de agua purificada para obtener una base de doble concentración, mezclar y dejar reposar durante 5 minutos, calentar con agitación frecuente hasta completar la disolución del polvo y hervir durante un minuto. Por otro lado, preparar 100 mL de una solución de hemoglobina al 2% adicionando gradualmente agua a 2 g de hemoglobina seca para obtener una solución uniforme.

Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Enfriar las soluciones a una temperatura de 45-50 °C, mezclar y agregar los demás ingredientes dependiendo del medio que se desee preparar. Homogenizar y vaciar en placas Petri estériles.

Procedimiento:

1. Procesar las muestras y sembrar las placas inicialmente en forma de Z y posteriormente estriando.2. Incubar en atmósfera aeróbica enriquecida con CO2 a 35 ± 2°C por 18 a 24 y hasta 48 horas y observar el crecimiento.

Agar Mueller HintonPreparación:Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121ºC por un tiempo no mayor de 15 minutos.

Enfriar a 40-45ºC y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar “chocolote”, previa adicción de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en baño maria a 80ºC 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningun momento.

Segunda sesión

2. Se siembra los medios de GS y GC inoculando por estría cruzada las cepas de S. pyogenes y S. agalactiae3. En el medio de CASMAN se hace la prueba de CAMP haciendo una estría de S. aureus vertical e inocular perpendicular S. pyogenes y S. agalactiae.4. En el medio de Muller-Hinton se realiza la prueba de sensibilidad de Optoquina después de la estría masiva de la bacteria. 5. Incubación de las placas a 35ºC, durante 24 a 48 hrs.

Tercera sesión:6. Observación de las características macroscópicas en cada medio sembrado7. Realización de frotis al Gram de colonias. Observación a inmesrsión8. Medir el halo de inhibión (si se presentó) con un regla y determinar posible tratamiento.9. Realización y lectura de la prueba de coagulasa, oxidasa y catalasa.10. Identificación de microorganismo a partir de los resultados obtenidos.

RESULTADOS

MEDIO DE CULTIVO Y/O BACTERIA

CARACTERÍSTICAS IMAGEN

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O/F

Streptococcus agalactiae

Con sello: negativoSin sello: negativo

Por lo tanto: Ni oxidativoni fermentativoObservaciones:

Se observó crecimientoturbio en ambos tubospor lo que se deduce

que es anaerobio facultativo

MUELLER- HINTON(2 discos de penicilina

Y2 discos de optoquina)

Streptococcus agalactiae

No hubocrecimiento en el medio

MUELLER- HINTON(1 disco de penicilina

Y1 disco de optoquina)

Streptococcus pyogenes

Sólo hubo crecimientoen la optoquinaPor lo tanto es:

resistente a la optoquinaY sensible a la penicilinaHalo de inhibición: 1cm.

Prueba de CAMP

Streptococcus agalactiae

YStreptococcus

pyogenes

(en medio S. aureusATCC 25923)

Formación de hemólisis en formaDe flecha para: S. agalactiae

Hemólisis para: S. pyogenes

GELOSA SANGRE(Por picadura)

Streptococcus pyogenes

Hemólisis Colonias pequeñas, en puntillos

Entre blancas y grises

GELOSA SANGRE

Streptococcus agalactiae

Hemólisis Colonias muy pequeñas

Entre blancas y transparentes

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GELOSA CHOCOLATE

Streptococcus pyogenes

Hemólisis Colonias muy pequeñas

redondeadas y uniformestransparentes

GELOSA CHOCOLATE

Streptococcus agalactiae

Hemólisis Colonias muy grandes, convexas

y abundantes; de consistencia butirácea, con bordes regulares,

cremosas y blancas-grisáceas

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La primer prueba que se realizó fue en el medio O/F con S. agalactie en el cuál la prueba nos dio que su metabolismo no es ni oxidativo ni fermentativo ya que esta es una característica de este género en este medio. También se logró comprobar la forma de respiración de aporte de oxígeno de esta bacteria que es anaerobia facultativa ya que hubo crecimiento en ambos tubos.

La segunda prueba que se realizó fue en el medio Mueller Hinton ( con 2 discos de penicilina y 2 discos de optoquina) con Streptococcus agalactiae en el cuál no hubo crecimiento; para la penicilina este género es sensible debido a que no tiene la enzima -lactamasa; sin embargo debió de haber dado crecimiento para la optoquina ya que es resistente a este antibiótico, por lo cual se deduce que no se realizó adecuadamente la siembra del microorganismo en el medio.

La tercer prueba se realizó también en el medio Mueller Hinton ( con 1 disco de penicilina y 1 disco de optoquina) con Streptococcus pyogenes en el cuál no hubo crecimiento a un halo de 1cm de halo del disco de penicilina debido a que es sensible a este antibiótico debido a que no tiene la capacidad de elaborar la enzima -lactamasa que hidroliza el anillo -lactámico para producir ácido penicilonico, razón por la cuál la bacteria es inhibida; sin embargo si hubo crecimiento en la prueba del disco de optoquina demostrando así su resistencia a esta sustancia química ya que el único streptococo que da positivo es Streptococcus pneumoniae.

En la prueba de CAMP se observó que dio positivo para S. agalactiae dando una hemólisis en forma de flecha (ya que tiene la capacidad de producir y elaborar el factor CAMP que actúa de manera sinérgica con la -hemolisina estafilocócica ( -lisina o esfingomielinasa C de S. aureus ATCC 25923) sobre eritrocitos para producir un fenómeno lítico en la unión de los 2 microorganismos que se observa con la flecha amarilla que se produce; esta es una reacción común de los streptococos del grupo B, con lo que se puede deducir que si se trata de este microorganismo ya que por ejemplo para S. pyogenes nos dio la prueba negativa ya que no produce el factor de CAMP que es una proteína termoestable difusible que aumenta la hemólisis de S. aureus.

En la siembra de GS por picadura de S. pyogenes se puede observar la actividad hemolítica más clara de este microorganismo ya que se observó una hemólisis característica de este grupo ya que normalmente posee los 3 tipos de hemólisis.

Para S. agalactiae se observó una hemólisis también la cual siempre es su patrón hemolítico. En GC para S. pyogenes, se observó crecimiento y hemólisis ; hubo crecimiento de las colonias; para S. agalactiae

también se observó crecimiento pero más abundante y con hemólisis ; en este medio al agregar el polienriquecimiento se aseguró el crecimiento de los microorganismos ya que este contiene 12 factores y cofactores de desarrollo que sirven para aislar y multiplicar microorganismos exigentes como es el caso de estos 2 microorganismos.

CONCLUSIONESEn esta practica se realizaron diferentes prueba para poder identificarlos al genero Streptococcus. Pruebas como fueron la de CAMP, de Optoquina y hemólisis por picadura.

En la prueba de CAMP se coloco una estría de S. aureus vertical, inoculando perpendicularmente a S. agalactiae y S. pyogenes, dando positivo (formación de una hemólisis en forma de flecha) S. agalactiae esto demuestra la producción de la proteína termoestable (factor K) que aumento la hemólisis de S.aureus que produce la esfingomilasa que ayuda a la estreptolisina que ayuda a la estreptolisina a que sea di fusible a través del medio.

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En la prueba de Optoquina que se utiliza para poder descartar la presencia de S. pneumoniae y demostrar la presencia de los grupo A y B, ya que ambos grupos son resistentes a este. Sin embargo al hacer esta prueba también se utilizo Penicilina donde se demostró sensibilidad (de un halo de 1 cm) en S. pyogenes, lo que no ocurrió con S. agalactiae.

Se realizo también la hemólisis por picadura en esta prueba se inocularon S. pyogenes y S. agalactiae donde efectivamente se formaron hemólisis en las picaduras realizadas al medio. Donde S. pyogenes realiza su actividad hemolítica característica de ella ya que normalmente posee los 3 tipos de hemólisis ( , y ). Y en S. agalactiae la hemólisis presentada es su patrón hemolítico.

En las características culturales del desarrollo de las bacterias se observa que en S. agalactiae se efectuó una hemólisis dada por que se expresa una estreptolisina y crecimiento abundante. En S. pyogenes se observo un crecimiento muy abundante y hemólisis en agar GS y en GC se produjo una hemólisis lo cual se da por que no tiene estreptolisina O,S, degradando el potasio que se encuentra dentro de los eritrocitos.

Demostrando con esto las diferencias para identificarlos entre S. pyogenes y S. agalactiae que cada uno tiene. Aunque se relacionan mucho existen este tipo de pruebas las cuales nos ayudan mucho en la diferenciación y no son las únicas existen muchas mas.

REFERENCIAS http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm http://209.85.173.104/search?q=cache:sp3LvVkZIIMJ:www.ucol.mx/acerca/coordinaciones/cgd/DGEMS/archivos/

microbiologia.doc+gelosa+sangre&hl=es&ct=clnk&cd=11&gl=mx Mac Faddin J. F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. ED Panamericana

3ra edición 2003, Buenos Aíres Argentina. Pp. 33, 34, 74, 236, 339, 344, 345, 354 y 355 Manual BIOXON pp. 28, 38, 39, 54 y 71 http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_casman.pdf http://www.mcd.com.mx/pdfs/BASE%20DE%20AGAR%20GC.pdf Microbiología Médica. Quinta Edición. Murray, Rosenthal, Pfaller. Pag:238-242. http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/agalac.htm http://s-pneumoniae.blogspot.com/ Brock, Biología de los Microorganismos. Séptima edición. Madigan, et al. ED. Pearson educación. Madrid, España.

P.p. 160-163 Microbiologia. Cuarta edición. Prescott, L.M et al. ED. Mac Graw Hill. Madrid, España. P.p 39, 198-201.

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