ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN GÉNICA:

‐ SILENCIAMIENTO Y SOBREEXPRESIÓN

‐PROTEÓMICA

DISRUPCIÓN GÉNICA

- Disrupción génica.

Reemplazamiento génico por doble entrecruzamiento

genA

T14 T14

NorthernSouthern

DISRUPCIÓN GÉNICA

Small silencing RNAs

En las células existen mecanismos de silenciamiento de la expresión génica mediados por dsRNA, este proceso se denomina RNAi (RNA interference). Estos mecanismos actúan a diferentes niveles:  transcripcional, degradación del RNAm, traduccional. 

Se han descrito diferentes tipos de RNA silenciadores (siRNA, miRNA), que parecen tener una distribución bastante universal en los distintos tipos de organismos eucariotas. 

Los diferentes RNA silenciadores se diferencian por su origen: intrínseco (codificados en el propio genoma de la célula) o extrínseco (virus, introducidos artificialmente a través de un vector), pero su mecanismo de acción es frecuentemente similar: se unen por complementariedad a su RNAm diana y provocan su degradación y/o inhibición del proceso de traducción.

Los RNAs de silenciamiento más importantes son:

‐ siRNA: small interfering RNA

‐miRNA: micro RNA

ATENUACIÓN DE LA EXPRESIÓN

Small silencing RNAs‐ siRNA: Small interfering RNA. Son moléculas de RNA de doble cadena de unos 22 nucleótidos que tiene extremos protuberantes de 2 nucleótidos en 3’. Provienen de un RNA de doble cadena de longitud variable, el cual es procesado por la enzima Dicer(una ribonucleasa específica de dsRNA de la familia de la RNsas III). El siRNA se une a una proteína denominada  AGO (argonauta), que junto con otras proteínas forma el RISC (RNA‐Induced Silencing Complex), y sus dos hebras se separan formándose así su forma madura final: una molécula de RNA de cadena sencilla de unos 21‐23 nucleótidos.  

Los siRNA son 100% complementarios a una secuencia del RNAm al que regulan, y provocan su silenciamiento mediante la actividad endonucleasa de AGO, que corta el RNAm que finalmente es degradado.

El origen de los siRNA puede ser:

‐ Endógeno: son codificados por el propio genoma celular, mediante transcripción convergente de las dos hebras de una regióndel DNA, o por la transcripción de un gen y un pseudogen en orientación opuesta.

‐ Exógeno: el dsRNA puede ser de origen viral. También puede generarse por trasncripción convergente de un fragmento de un gen que hemos introducido en un vector.

RISC RNA‐induced silencing complex

RITS RNA‐induced transcriptional silencing complex 

Dicer

Generación de un siRNA artificial para realizar estudios de la función de un gen

SOBREEXPRESIÓN

‐ Se fusiona el gen que queremos expresar a un promotor fuerte, o inducible, que funcione bien en el tipo de célula donde queremos llevar a cabo la sobreexpresión. Esta fusión puede realizarse por PCR recombinante

‐ Se inserta la fusión en un vector adecuado para transformar las células

‐ Transformación de las células con el vector

‐ Análisis de la integración del vector en el genoma (en caso de que sea un vector integrativo) mediante PCR y/o Southern blot 

‐ Análisis de la expresión del gen mediante RT‐PCR, Northern, Western

Purificación de proteínas mediante la adición de un tag (etiqueta): epitope tagging

‐ Permite la purificación mediante técnicas de afinidad, en un solo paso, de grandes cantidades de proteína para su análisis. Se requiere haber clonado previamente el gen.

‐ La proteína de interés se expresa en E. coli como una proteína de fusión, con un tag, el cual permite purificarla eficientemente mediante afinidad.

Sobreexpresión de una proteína para su purificación en grandes cantidades

Epitope tagging

The expression vector pQE‐30 Xa encodes a Factor Xa Protease recognitionsite between the N‐terminal 6xHis‐tag sequence and the multiple cloning site.

Sobreexpresión de una proteína para su purificación en grandes cantidades

Epitope tagging. Purificación: Ni-NTA resin interacts with histidines

Sobreexpresión de una proteína para su purificación en grandes cantidades

- Análisis proteómico- Análisis proteómico

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Técnicas de ProteómicaTécnicas de Proteómica

Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Isoelectroenfoque: separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico: pH al cual la carga neta total de la proteína es 0 

SDS‐PAGE: separación de las proteínas en función de su tamaño

Técnicas de ProteómicaTécnicas de Proteómica

Huella peptídica

Técnicas de ProteómicaTécnicas de Proteómica

Huella peptídica

Técnicas de ProteómicaTécnicas de Proteómica

Huella peptídica