Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y cadena de la polimerasa en biopsias frescas y

parafinadas.parafinadas.

1: Laboratorio de Inmunología e Infecciosas1: Laboratorio de Inmunología e Infecciosashttp://orbita.starmedia.com/~diseasesEmail: Email: diseases@starmedia.com ó ó mldiaz@emtel.net.co 2: Laboratorio de Bioantropología2: Laboratorio de Bioantropologíahttp://200.21.83.171/antroposEmail: Email: antropos@ucauca.edu.coUniversidad del Cauca – Popayán, ColombiaUniversidad del Cauca – Popayán, Colombia

María Lilia Díaz BetancourtMaría Lilia Díaz Betancourt11, Liz Betty García, Liz Betty García11, Ernesto , Ernesto León Rodríguez FLeón Rodríguez F22, Julio César Klinger, Julio César Klinger11, Miryam Bravo de , Miryam Bravo de InsuastyInsuasty11

Palabras claves:Palabras claves: PCR, PCR, Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis,, tuberculosis, tuberculosis, biopsias frescas, biopsias parafinadas, biopsias frescas, biopsias parafinadas,

INTRODUCCIÓN...

La tuberculosis es la primera causa mundial de muerte por enfermedad infecciosa.

El 30% de las población mundial está infectada.

En el mundo se enferman 9.000.000 y se mueren 3.000.000 de personas cada año por causa de la tuberculosis.

Uno de los problemas que aún existe a pesar de más de 100 años de conocerse el bacilo causante de la tuberculosis, es la baja sensibilidad de los métodos de diagnóstico disponibles.

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parafinadas.parafinadas.

INTRODUCCIÓN...

Así la tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes (ZN) requiere de 10.000 micobacterias/ml de muestra para ser positivo y en nuestros tiempos con el creciente número de pacientes inmunodeficientes es inespecífico

El cultivo requiere 400 micobacterias/ml de muestra y es necesario esperar mínimo tres semanas y hasta 2 meses para obtener el aislamiento.

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parafinadasparafinadas..

INTRODUCCIÓN...

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una metodología de Biología molecular. Es una técnica que puede ser aplicada en la identificación de micobacterias, es rápida y más sensible que el cultivo. Consiste en replicar in vitro una secuencia conocida de ADN característica de una determinada célula en este caso solamente presente en micobacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis de tal manera que al final del procedimiento se obtienen millones de cadenas, visibles fácilmente por diversas metodologías, a partir de unas pocas cadenas que pudieran estar en una muestra clínica.

Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y cadena de la polimerasa en biopsias frescas y

parafinadas.parafinadas.

OBJETIVOS...

• Estandarizar y aplicar una prueba de PCR al diagnóstico de tuberculosis en biopsias frescas y parafinadas.

• Evaluar la sensibilidad y especificidad.

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parafinadas.parafinadas.

Taq polimerasa

Esquema del PCREsquema del PCR

• Cultivo de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv)• Biopsias frescas y parafinadas procedentes de pacientes con sospecha o con tuberculosis comprobada.• Iniciadores para amplificar un fragmento de 245 pb de la secuencia de inserción INS6110 presente en el Complejo Mycobacterium tuberculosis.

INS1: 5´CGT-GAG-GGC-ATC-GAG-GTG-GC INS2: 5´GCG-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AA

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parafinadas.parafinadas.

Materiales y métodosMateriales y métodos

AREA DE EXTRACCIÓNAREA DE EXTRACCIÓN

Materiales y métodosMateriales y métodos

Materiales y métodosMateriales y métodos

Extracción de ADN de Cultivo deExtracción de ADN de Cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) M. tuberculosis (H37Rv)

• TE 400 µl.

• Lisozima al 3.3 % 50 µl, 37 °C, 1h.

• SDS al 20% 30 µl, 65 °C, 1h.

• Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 °C x 18 horas.

• Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10`.

• Cloroformo - alcohol isoamilico 24:1, 500 µl, 30´.

• Centrifugación 14.000 r.p.m 15´.

• Sobrenadante + Etanol Absoluto 1.5 ml + Acetato de Sodio 30 µl.

• Refrigeración a -20 °C, 2 h.

• Centrifugación 14.000 r.p.m 15´.

• Suspensión en agua destilada y desionizada.

• Cuantificación 260 nm.

AREA DE AMPLIFICACIÓNAREA DE AMPLIFICACIÓN

Materiales y métodosMateriales y métodos

IniciadoresIniciadores

INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´

INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´

• TE 10x Buffer 5 µl.

• ClMg 25 nM 4 µl.

• Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM.

• Formamida 0.5 µl.

• ADN.

• Agua destilada y desionizada. Volumen total 50 µl.

Materiales y métodosMateriales y métodos

Amplificación de ADN de cultivo deAmplificación de ADN de cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) M. tuberculosis (H37Rv)

Mezcla:Mezcla:

Desnaturalización 5´ 95°C

Taq Polimerasa 0.5 ud, 4°C

Desnaturalización 4´ 95°C

Desnaturalización 2´ 95°C

Hibridización 2´ 67°C

Extensión 2´ 72°C*

Extensión final 10´ 72°C

* 5” de aumento en cada ciclo.

35 Ciclos

Materiales y métodosMateriales y métodosAmplificación de ADN de cultivo deAmplificación de ADN de cultivo de M. tuberculosis (H37Rv) M. tuberculosis (H37Rv)

Condiciones:Condiciones:

Separación de los productos de PCR en gel de agarosa al 1.5%, y visualización mediante luz ultravioleta después de la tinción con bromuro de etidio a 0.5 µg/ml.

Materiales y métodosMateriales y métodos

Electroforesis del ADNElectroforesis del ADN

Electroforesis en gel de agarosa a 40 vol. durante 3 horas

Materiales y métodosMateriales y métodos

Extracción de ADN de biopsiasExtracción de ADN de biopsias

Desparafinación: 2 fragmentos de 10 µm

• Xilol 500 µl, 55 ºC, 15´ x 2 veces.

• Etanol 500 µl al 75% x 2 veces.

• Secado

• Suspensión de la biopsia desparafinada o fresca en 400 µl de TE.

• Lisozima al 3.3 % 50 µl, 37 °C, 1h.

• SDS al 20% 30 µl, 65 °C, 1h.

• Proteinasa K 2 mg/ml 150 µl, 55 °C x 2 horas.

• Perclorato de Sodio 3 mM 100 µl, 10`.

Materiales y métodosMateriales y métodos

Extracción de ADN de Biopsias Extracción de ADN de Biopsias

• Cloroformo - alcohol isoamílico 24:1, 500 µl, 30´.

• Centrifugación 14.000 r.p.m 15´.

• Sobrenadante + Etanol Absoluto 1.5 ml + Acetato de Sodio 3 mM 30 µl.

• Refrigeración a -20 °C, 2 h.

• Centrifugación 14.000 r.p.m 15´.

• Suspensión en agua destilada y desionizada.

• Cuantificación 260 nm.

Materiales y métodosMateriales y métodos

IniciadoresIniciadores

INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´INS1 - 5´ CGTGAGGGCATCGAGGTGGC - 3´

INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´INS2 - 5´ GCGTAGGCGTCGGTGACAAA - 3´

• TE 10x Buffer 5 µl.

• ClMg 25 nM 4 µl.

• Dionucleotidos trifosfatados 2.5 nM.

• Formamida 0.5 µl.

• ADN 1 µg.

• Agua destilada y desionizada. Volumen total 50 µl.

Materiales y métodosMateriales y métodos

Amplificación de ADN de biopsiasAmplificación de ADN de biopsias

Mezcla:Mezcla:

Desnaturalización 5´ 95°C

Taq Polimerasa 0.5 ud, 4°C

Desnaturalización 4´ 95°C

Desnaturalización 4´ 95°C

Hibridización 2´ 67°C

Extensión 2´ 72°C*

Extensión final 10´ 72°C* 5” de aumento en cada ciclo.

45 Ciclos

Materiales y métodosMateriales y métodosAmplificación de ADN de biopsiasAmplificación de ADN de biopsias

CondicionesCondiciones::

Las lineas muestran diferentes cantidades de ADN de cultivo de Mycobacterium tuberculosis amplificado.

1) 2 µg, 2) 1 µg, 3) 500 fg, 4) 10 fg, 5) 1 fg. 6) Sin ADN, 7) Marcador de peso

molecular 245 pb.

1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7

Sensibilidad en ADN del cultivo de Mycobacterium Sensibilidad en ADN del cultivo de Mycobacterium tuberculosistuberculosis

ResultadosResultados

1) Sin ADN 2) M. tb H37Rv 3) M. bovis 4) M. kansassi 5) M. avium-intracelular 6) Histoplasma sp 7) E coli 8) Linfocitos humanos 9) Sin ADN 10) Marcador de peso molecular ladder 123 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10

240pb

La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes células

Especificidad del PCR en ADN de diferentes célulasEspecificidad del PCR en ADN de diferentes células

ResultadosResultados

Grupos Frescas Parafinadas

Nº (% PCR+) Nº (% PCR+)

Establecida 4 (75) 10 (100)

Probable 5 (80) 14 (86)

No TBC 4 (25) 7 (0)

Resultados del PCR en biopsias frescas y Resultados del PCR en biopsias frescas y parafinadas.parafinadas.

1) Sin ADN 2) Endometrio, probable TB 3) Escroto TB 4) Ganglio linfático 5) Pleura probable TB 6) Biopsia control positívo 7) Biopsia control negatívo 8) ADN Mt.b 9) Control de contaminación de extracción 10) Sin ADN 11) Marcador de peso molecular 245 pb

La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes biopsias parafinadas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

245pb

Resultados del PCR en ADN de biopsias parafinadasResultados del PCR en ADN de biopsias parafinadas

Resultado del PCR en ADN de biopsias frescasResultado del PCR en ADN de biopsias frescas

1) Sin ADN 2) Peritoneo TB 3) Ganglio linfático, Linfoma 4) Piel, Esporotricosis 5) Pleura, probable TB 6) Exocervix, probable TB 7) Biopsia control positívo 8) Biopsia control negatívo 9) ADN Mt.b 10) Control de contaminación de extracción 11) Sin ADN 12) Marcador de peso molecular 245 pb

La lineas muestran 1µg de ADN amplificado procedente de diferentes biopsias frescas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

245pb

TB Prob. TB

Sensibilidad 93% 84%

Especificidad 91% 91%

VPP 93% 94%

VPN 92% 79%

Análisis estadístico para resultados del PCR en Análisis estadístico para resultados del PCR en biopsias frescas y parafinadasbiopsias frescas y parafinadas..

CONCLUSIONES...

• Con nuestra prueba es posible estudiar tejidos frescos y parafinados procedentes de sitios con sospecha de enfermedad tuberculosa, en busca de secuencias del ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis con una sensibilidad del 93% en tuberculosis establecida y del 84% en tuberculosis probable. Una biopsia de ganglio linfático cervical fresca se encontró ZN positiva y PCR negativa. El cultivo de esta biopsia fue negativo. Aunque podría este, ser un falso negativo del PCR por inhibición de la prueba lo cual no fue buscado, bien podría tratarse de infección por micobacterias no tuberculosas las cuales no son amplificadas por nuestra prueba que sólo detecta ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis, caso en el cual la sensibilidad sería del 100% en tuberculosis establecida.

Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en Diagnóstico de tuberculosis mediante reacción en cadena de la polimerasa en biopsias frescas y cadena de la polimerasa en biopsias frescas y

parafinadas.parafinadas.

CONCLUSIONES...

• De otro modo nuestra prueba adelanta el diagnóstico de la tuberculosis establecida por cultivo ya que el procedimiento se demora 2 días mientras el cultivo 3 a 8 semanas.

• El PCR permitió establecer el diagnóstico en lesiones granulomatosas con cultivo y tinción negativa con una especificidad del 91%, y en este grupo de pacientes se constituiría en una prueba de gran ayuda para el tratamiento de la gran mayoría de ellos con un valor predictivo positivo del 79%.

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