0macro Part Miquel

Estructura de Macromolècules (Part Miquel Pons) 2on de Bioquímica

1. Macromolècules a l’entorn cel·lular

Les principals macromolècules de l’entorn cel·lular són les proteïnes, els àcids nucleics i

els polisacàrids. Aquest curs té per objectiu aprendre a “llegir-les”, és a dir, identificar-

les (per exemple, una proteïna = tres lletres) i entendre quina funció fan. Si ho assolim,

en Miquel Pons considera que hem triomfat.

L’interior de la cèl·lula es pot considerar compacte i, per tant, sense forats. Del 30 al

50% del seu volum total està ocupat per macromolècules i la resta aigua (també una

molècula, però més petita). Per exemple, E. coli té de 3000 a 6000 espècies químiques

diferents, que resulta en una concentració total de 300 a 400 g de macromolècules per

L ‘entorn cel·lular. Per tant, del 30 al 40% del pes total d’E. coli es deu a les

macromolècules. Una esfera d’E.coli fa aproximadament 1 μm de diàmetre, la qual cosa

resulta en 5,32·10-16L per organisme. Per una longitud força gran tenim un volum molt

petit. Per tenir una concentració 1 μM (μmols/L) ens caldrien 317 molècules.

Les macromolècules estan formades sempre per uns components freqüents units d’una

manera determinada. Hi ha diverses maneres d’unir-se i estructurar-se:

Estructura covalent (primària): Consisteix en els diferents monòmers units per

enllaços covalents. Determina un alfabet limitat.

o Àcids nucleics (4 bases nitrogenades)

o Proteïnes (20 aminoàcids)

o Polisacàrids (gran diversitat de monosacàrids)

Estructures tridimensionals: Són necessàries per tal que la macromolècula pugui

dur a terme la seva funció. S’estableix una jerarquia estructural.

o Regularitats locals (estructura secundària)

o Plegament global (estructura terciària)

o Contactes intermoleculars (estructura quaternària)

Dinàmica i heterogeneïtat estructural:

o “Cicle vital” de les bio-macromolècules: Neixen, es modifiquen, fan la

seva funció i es degraden en la mesura requerida (ni massa ni massa

poc). Si no es regula correctament apareixen problemes: o bé no fa la

seva funció, o bé no és al lloc que i toca o bé s’acumula i no es degrada

(amiloïdosis). Hi són on i quan toca, i moren on i quan els toca.

o Moviments a diferents escales de temps: La funcionalitat es basa en el

moviment i la forma. No serveix de res fer una “fotografia” de la

molècula, perquè amb el temps es mou i canvia.

o Col·lectius estructurals (ensembles): les macromolècules s’agrupen per

formar col·lectius que duen a terme funcions determinades.

La informació per a l’estructura i plegament de la macromolècula està continguda a

l’estructura primària. Per exemple, en el cas dels monosacàrids, que tenen llocs d’unió


determinats per formar polisacàrids, observem que el nombre de possibles

combinacions d’entre 4 sucres diferents augmenta de manera exponencial si

augmentem el nombre de residus (mono, di, tri, tetra, penta, hexa) amb possibilitat de

repetició. En canvi, en proteïnes, les possibles combinacions són més limitades, perquè

la possibilitat d’enllaços és més limitada. Si afegim possibilitat de ramificació de la

molècula (no lineal) el nombre combinacions encara és més gran.

Les macromolècules de l’entorn cel·lular es comuniquen entre elles i desenvolupen la

seva informació en contacte i dependència de l’entorn. Entre unes i les altres,

transfereixen informació (per exemple: transcripció, traducció).

D’ara en endavant, parlarem de les proteïnes. La idea que tenim en ment d’una

proteïnes és la d’una macromolècula perfectament ordenades. Tanmateix, les proteïnes

eucariotes també poden trobar-se desordenades. En general, tenim tres formes d’ordre

de les proteïnes que, en llevat, correspon aproximadament a una tercera part de les

proteïnes totals en cada cas.

Proteïnes altament estructurades (S)

Proteïnes moderadament desdestructurades (M)

Proteïnes altament desestructurades (U)

Aquest curs estudiarem les proteïnes S, però cal tenir en compte que no són les

úniques. Els enzims, per exemple, han de ser proteïnes altament estructurades per tal

de dur a terme una funció específica en relació a altres macromolècules.

Les proteïnes són polímers formats per la unió d’aminoàcids mitjançant enllaços amida

(COOH + NH2 -CONH-). En aquest enllaç tots els àtoms es troben al mateix pla i,

respecte a aquest, surten els H i les cadenes laterals, R). Ho veurem amb més detall a

temes posteriors). En general, els biopolímers consten de parts comunes (cadena

principal de la proteïna o sucre i fosfat en els àcids nucleics) i parts variables (cadena

lateral o base nitrogenada). Això ens genera la necessitat de classificar els diferents

monòmers en funció de criteris determinats.

Els aminoàcids, per exemple, són 20 diferents. Hi ha molts criteris que ens permetrien

agrupar-los, per exemple: polaritat, basicitat, aromaticitat, pes molecular, formació de

ponts disulfur, quiralitat, abundància relativa, essencial o no, càrrega, grups funcionals,

etc.). Però serien criteris massa específics de cada cas, i cada aminoàcids pertanyeria a

grups diferents. Cal definir, doncs, uns paràmetres de classificació inequívoca.

POLARITAT: Observant l’estructura d’una molècula no podem determinar que

sigui polar o no. Per exemple, el dietil èter, aparentment sembla que doni dos

moments polars que s’anul·lin, però en realitat la polaritat global no és del tot

zero. Des del punt de vista pràctic, per determinar si una molècula és polar o

apolar podem veure si és o no dissolvent orgànics de components polars o


apolars, respectivament. Que una molècula es dissolgui en aigua no vol dir que

sigui polar, sinó que per tal que ho sigui s’ha de dissoldre més en aigua que no

en un component apolar. Cal tenir també en compte que no hi ha cap aminoàcid

que es dissolgui en èter, per la qual cosa no l’escollirem com a dissolvent apolar.

Si volem veure quin aminoàcid és més polar d’entre la leucina o la isoleucina,

per exemple, els dissolem en aigua i octanol i observem quina repartició

presenta cadascun. Això ens determinarà un coeficient, que és logP (coeficient

de repartiment), que és una mesura experimental que ens determina la relació

entre la concentració en octanol i en aigua que s’hi dissol de la molècula en

qüestió.

ÀREA D’EXPOSICIÓ AL DISSOLVENT: Volem determinar quins aminoàcids es

tronen a la superfície i quins a l’interior de la proteïna. Però , què vol dir estar

dins o fora? Cal establir un criteri de l’accessibilitat del dissolvent al nostre

aminoàcid. A grans trets, si acostem molècules d’aigua i poden accedir al nostre

residu, serà que es troben a la

superfície i viceversa. Una part

de la molècula serà accessible

al dissolvent i l’altra, no. Això

ho puc quantificar i establir un

criteri, que és el SEA (Solvent

Exposed Area), que es basa en

valors estadístics de

probabilitat a tal exposició. Per

exemple, observant la taula de

la dreta, veiem que la serina

(S) té una probabilitat del 70%

de tenir una superfície de 30 Å

exposada al dissolvent, un 20%

que aquesta sigui de menys de

10 Å i un 10% que estigui entre

ambdues superfícies.

Els aminoàcids polars (ho hem determinat

amb logP) coincideixen amb aquells que es

troben més exposats a la superfície. Per

exemple, el s aminoàcids més polars són

l’àcid glutàmic i la lisina (93% per 30 Å),

mentre que els menys polars o exposats

són la cisteïna, la isoleucina i la valina (32%,

39% i 40% respectivament). La cisteïna és

un cas especial, perquè tendeix a formar


ponts disulfur amb altres cisteïnes (té un grup tiol a l’extrem de la cadena lateral), que

ajuden al plegament global de la proteïna i, per tant, es troba dins de l’estructura

proteica.

A partir d’aquí podem establir escales d’hidrofobicitat, que segueixen els criteris

establerts. També es poden establir mapes del país dels aminoàcids (cito textualment),

que depenen de les similituds entre dues proteïnes. És a dir, imaginem que tenim dues

proteïnes que s’assemblen molt i conec quin aminoàcid hi ha a una posició determinada

de les proteïnes, però no l’aminoàcid a la mateixa posició de l’altre. Si s’assemblen tant,

puc afirmar que serà el mateix o un altre? Amb quina probabilitat puc dir-ho? Aquests

mapes m’informen en una taula de dues entrades de fins a quin punt puc substituir un

aminoàcid per un altre. Com més gran sigui el número, més probabilitat de substitució.

Evidentment, la substitució d’un aminoàcid per ell mateix és sempre del 100%.

Tot plegat ens porta a establir mapes de coordenades on se situen els aminoàcids en

funció de la mida i la polaritat. Sempre serà més fàcil establir la mida que la polaritat.

També disposem de mapes de substitució d’aminoàcids, ja sigui poc exposats a la

superfície (<10Å) o molt exposats (>30Å). Cal remarcar que la substitució dels

hidrofòbics (es troben dins la proteïna) ha de ser molt específica respecte la mida,

perquè si substitueixo un aminoàcid per un altre de més petit, deixaré buits i això pot

dur a un canvi de conformació de la proteïna, o viceversa, si fos més gran. Els polars, en

canvi, no tenen una substitució tan específica, perquè si es troben a la superfície, més o

menys mida no tindrà importància, però sí una substitució específica respecte la

polaritat, perquè determinarà les propietats de la proteïna.

Res en biologia no té sentit excepte sota la llum de l'evolució

(Theodosius Dobzhansky (1900–1975)

Aprèn els aminoàcids i les bases nitrogenades aquí:

http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/aa/aaid/id.html

http://www.sporcle.com/games/sproutcm/amino-acids-from-structures

http://www.sporcle.com/games/ariana24/dnanucleotides

http://quizlet.com/23112797/test

http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/aa/aaid/id.html

http://www.sporcle.com/games/sproutcm/amino-acids-from-structures

http://www.sporcle.com/games/ariana24/dnanucleotides

http://quizlet.com/23112797/test


2. Modificacions post-traduccionals

Les proteïnes són sintetitzades (traducció de l’mRNA) als ribosomes i un cop abandonat

aquest, una sèrie de mecanisme de modificació actuen sobre elles, en funció del que

se’n pretengui:

Modificacions que porten a la funcionalitat:

Modificació de les cadenes laterals: poden ser reversibles (R) o irreversibles

(IR).

Modificació de l’esquelet

Modificacions que porten a la degradació:

Transport i degradació: poliubiqüitinització i degradació al proteosoma.

A. MODIFICACIONS DE LES CADENES LATERALS

1) Fosforilació (R): tyr, ser, thr, his (les tres primers, al grup -OH)

2) Metilació (R): lys (mono, di, tri). Metilació de les histones!!

3) Acetilació (R en lisina): Lys (N-t). Histones, també!

4) Carboxilació (IR): glu

5) Hidroxilació (IR): pro, lys (hidroxiprolina). Està relacionada amb els primers

descobriments del que són les proteïnes, que es deuen a l’escorbut que patien

els mariners, que s’alimentaven a base de productes càrnics i no obtenien

vitamina, fins que van descobrir que enduent-se llimones no experimentaven la

malaltia. En absència de Vitamina C el teixit conjuntiu no pot mantenir-se, per

manca d’una modificació post-traduccional a la prolina del col·lagen. Per tant, la

hidroxilació modifica la molècula en tant que les seves propietats són totalment

diferents i funcionals).

6) Miristilació (àcid mirístic) (IR): cys, his

7) Addició de sucres (IR): asn

8) Addició de glucofosfolípids (IR): C-t

9) Prenilació (IR): cys

10) ADP-Ribosa (R)

11) Diptamida (IR): his

12) Ubiqüitinització (IR): lys, Senyal de transport cap al proteosoma i degradació.

Cada modificació es dóna a un compartiment diferent de la cèl·lula eucariota:

Citoplasma:

o Eliminació Me inicial

o Acetilació de l’amino

o Miristilació de l’amino

o O-glicosilació amb GlcNAc

o Àcids palmitoílics


o Processament de la poliproteïna vírica

Mitocondris i cloroplasts:

o Tall de la seqüència senyal

RE

o Tall de la seqüència senyal

o N-Glicosilació dels residus Asn

o Palmitoil i glicosil-fosfatidilinositol

o Carboxilació de glu

o Hidroxilació de procol·làgena, pro i lys

o Ponts disulfur

Golgi

o Modificacions dels grups N-glicosil

o O-glicosilació de ser i thr

o Sulfatació de tyr

Vesícules secretores i grànuls

o Amidació

o Processament proteolític de precursors

Edmond H. Fisher i Edwin G. Krebs van ser premiats amb el Premi Nobel del 1992 pel

descobriment de la reversibilitat de la fosforilació de proteïnes com a un mecanisme de

regulació biològic. Una tercera part de

les proteïnes humanes estan

fosforilades. En llevat, el 3% de les

proteïnes tenen funció de treure o

posar fosfats:

Cinases: posen fosfats

Fosfatases: treuen fosfats

La presència d’un grup fosfat canvia

totalment l’entorn de l’aminoàcid. Es

tracta d’un grup carregat

negativament. Els residus fosforilats

tenen una càrrega negativa a pH < 5.5,

1.5 càrregues negatives a un pH

aproximadament de 6.5 i 2 càrregues negatives a pH>7.5. (més àcid, menys càrrega).

A la cèl·lula es donen processos de fosforilació en cascada en què una cinasa posa un

fosfat a una segona cinasa i aquesta fa el mateix amb una tercera... i es dóna una

cadena de fosforilacions que donen com a resultat una cascada de senyalització

reversible.

B. MODIFICACIONS DE L’ESQUELET


Es poden donar dues situacions:

Polipèptids precursors que contenen seqüències de múltiples proteïnes madures

o pèptids diferents. Per tant, d’una sola síntesi podem obtenir-ne diversos

productes (molta eficiència). Per exemple: el producte de traducció de la

propiomelanocortina és tallat i dóna lloc a diversos polipèptids madurs petits. Els

talls poden dur-se a terme de maneres diferents i donar així a productes

diferents.

Polipèptids precursors que contenen seqüències múltiples i idèntiques per petits

pèptids. Són exemples el precursor de l’enkephalina (6 còpies de Met-

enkephalina i 1 còpia de leu-enk) o el precursor del neuropèptid ELH.

El virus de la sida, per exemple (VIH), com ja hem vist extensament a genètica... fa un sol

transcrit que conté 3 gens: gag, pol i env. Gag es pot traduir directament, env també,

però després de gag hi ha un codó stop, de manera que cal un canvi de pauta de lectura

per a que es produeixi un producte gag-pol sencer. Aquest és després processat per una

proteasa. Cadascun dels productes són digerits per donar llocs a polipèptids petits

funcionals, que formaran proteïnes funcionals necessàries per al virus.

Un altre exemple és el cas de la insulina. Es tracta d’una proteïna que és producte de

diferents modificacions funcionals. Una d’elles és la formació de ponts disulfur entre

cisteïnes. Com saben quines

cisteïnes s’han d’emparellar? Al

principi, la insulina es plega

d’una manera determinada, en

tant que les cisteïnes quedin a

prop per formar els ponts

disulfur (recordem, al RE). El

pèptid precursor té un parell de

seqüències que seran eliminades

(en blanc) i un parell de

seqüències que formaran la

proteïna final (negre). Les

seqüències blanques són

tallades a N-t de la negra (talls

de l’esquerra) i a C-t (talls de la dreta). Aquestes seqüències eliminades són necessàries

per a la formació de l’estructura que permeti als ponts disulfur formar-se.

El procés de maduració de les proteïnes està relacionat amb el procés d’splicing de

l’mRNA (eliminació dels introns). En aquest cas parlem d’splicing de proteïnes. La

proteïna es traduïda, experimenta modificacions post-traduccionals i es processa

eliminant les inteïnes (=introns) i unint les exteïnes(=exons).


Parlem concretament de N-exteïna

i C-exteïna, a banda i banda de la

inteïna, respectivament (figura).

Quina és la reacció química que

s’esdevé?

En primer lloc, els elements que ho

fan possible són les cadenes laterals

de certs aminoàcids: serines i

cisteïnes que es troben a banda i banda de la inteïna a eliminar. Les serines tenen un

grup hidroxil i les cisteïnes, un grup tiol, que actuen igualment en aquest procés.

El procés és el següent:

1) El grup OH de la serina a N-t

de la inteïna ataca el C=O a C-t de la

N-exteïna. No hi ha trencament, sinó

canvi de posició dels àtoms.

2) L’hidroxil de la serina a C-t

ataca l’enllaç format mitjançant una

transesterificació. Exteïnes queden

unides. N-t de la inteïna queda liure.

3) NH2 de la inteïna ataca C=O

propi i exieïnes queden alliberades i

unides.

4) Exteïnes recuperen forma

original per reversió de la reacció

anterior. Obtenim el pèptid madur.

Un exemple real és el cas de

l’autoprocessament de la proteïna

Hedgehog. Aquesta s’uneix a una

molècula de colesterol i duu a terme

l’autocatàlisi. En resum, es trenquen

enllaços, es formen enllaços

“estranys”, es dóna transesterificació

i s’obté un producte final madur de la

proteïna Hedgehog.

Al laboratori, això succeeix de manera espontània en un interval de temps donat,

perquè les inteïnes no tenen una seqüència qualsevol, sinó que la seva estructura és

adequada per a la reacció que hem vist. I com ho podem aprofitar, nosaltres, al

laboratori?


Com puc fer una proteïna gran que tingui “coses rares”? (Per exemple, un

aminoàcid inventat amb una seria fosforilada).

Una síntesi química (versàtil) et permetrà fer productes no naturals. Em

permet fer coses rares.

Una síntesi biològica et permetrà fer productes naturals. Per exemple,

podrem fer que un bacteri ens expressi una proteïna determinada. Em

permet fer coses grans.

o Així, produïm per síntesi química la part “rara” i per síntesi biològica

la part “gran” i les unim aprofitant les reaccions que ho permetin

imposant les restriccions necessàries. Per exemple, a la imatge, per

síntesi química imposo que l’aminoàcid final tingui un grup tiol enlloc

d’un OH de la metionina (codó d’inici) per tal que es doni la reacció

entre tiols.

A continuació, ens deturarem a analitzar tres experiments que ens duen a l’establiment

d’hipòtesis empíriques per al transport de proteïnes i les seves modificacions. Cal

observar què passa i establir conclusions pertinents a les observacions:

TRANSPORT DE PROTEÏNES I (Albúmina i ferritina)


Plantejament inicial: les cèl·lules del fetge generen dues proteïnes diferents. Una d’elles

(ferritina) es reté a la cèl·lula, mentre que l’altra (albúmina) és secretada.

Pregunta: Com sap la cèl·lula que una proteïna ha de ser secretada i l’altra retinguda?

Primer fet experimental: Un poliribosoma és un conjunt de ribosomes que tradueixen

un mateix fragment de mRNA. Es poden trobar lliures al citoplasma o units a

membranes. Ambdós tipus de poliribosomes poden separar-se per centrifugació i ser

analitzats independentment. Així, veiem que els poliribosomes lliures produeixen la

ferritina, mentre que l’albúmina és traduïda pels que es troben units a la membrana.

Segon fet experimental: Hi ha vesícules rugoses que contenen poliribosomes adherits

(del RER). Aquests poliribosomes poden alliberar-se de les vesícules si són tractats amb

puromicina. La puromicina fa la mateixa funció que un tRNA, malgrat no ser natural de

l’organisme. La molècula de puromicina s’introdueix al mRNA i bloqueja la síntesi de

proteïnes en tant que queda adherit a la cadena peptídica i aquesta no pot continuar

sent traduïda pels ribosomes.

Resultats: El tractament amb puromicina té dos efectes. En primer lloc, s’atura la síntesi

proteica i la molècula resultant (tros peptídic + puromicina) es desenganxa i queda a

l’interior de les vesícules. Però, a més, els poliribosomes també es desprenen de la

membrana de les vesícules, que passen a ser llises (del SER), i queden lliures al

citoplasma. Si ara analitzem els dos tipus de poliribosomes (els originalment lliures i els

lliures).

Conclusions: Els poliribosomes transcriuen proteïnes diferents en funció del lloc on es

troben de la cèl·lula en un moment determinat. No hi ha poliribosomes diferents que

produeixin proteïnes diferents.

TRANSPORT DE PROTEÏNES II (Ribosomes, RER i SER)

1)

Pregunta: Per què els ribosomes s’uneixen a les vesícules i en quin moment?

Fet experimental: Partim de cèl·lules plasmàtiques que segreguen immunoglobulines

(Ig). Si sotmetem aquestes cèl·lules a un xoc osmòtic (canvi sobtat de la força iònica, és

a dir, la concentració de sals), els polisomes (o poliribosomes) es disgreguen de l’mRNA

que transcrivien. En aquestes condicions, puc tenir ribosomes i mRNA sense que

estiguin junts fent la seva funció. Partint d’aquí, puc decidir començar la síntesi proteica

quan vulgui, mitjançant un canvi de la força iònica adequat. Per tant, la unió o no dels

dos components és un procés reversible.

Si canvio la força iònica i s’inicia la síntesi, el polisoma va produint una proteïna,

començant per l’N-terminal i anant-la fent créixer per unió d’aminoàcids. 30 segons


després d’això, quan uns 80 residus d’aminoàcids conformen el pèptid que s’està

formant, s’observa que els polisomes comencen a associar-se a vesícules. Les proteïnes,

aleshores, se sintetitzen cap a l’interior de les vesícules.

Conclusió: Els ribosomes adherits a vesícules (vesícules rugoses) s’hi han unit després

d’haver-se iniciat la síntesi proteica i, per tant, per algun motiu relacionat amb els

primers residus de la cadena.

3)

Pregunta: Què tenen els primers residus de la cadena peptídica que fan que el ribosoma

s’uneixi a les vesícules?

Plantejament inicial: Partim d’un sistema de translocació de cèl·lules lliures, és a dir, un

sistema que conté tots els components (els mínims) necessaris per a la síntesi de

proteïnes. Si en aquest sistema fem que els ribosomes sintetitzin una proteïna, aquesta

és més gran que quan el mateix ribosoma la sintetitza dins la cèl·lula. En concret,

l’extrem N-terminal conté una part addicional que la fa més llarga que la proteïna

nativa.

Fet experimental: Al sistema de translocació de cèl·lules lliures anterior hi afegim un nou

component, en aquest cas microsomes de cèl·lules de pàncrees de gos. Aquests

ribosomes produeixen la proteïna nativa (sense la part afegida a N-t).

4)

Pregunta: Depèn dels microsomes, que la proteïna sigui més o menys llarga?

Fet experimental: Afegim els microsomes en dos moments diferents: abans d’afegir

l’mRNA, just després. Veiem que, en el primer cas, la proteïna formada és directament

la proteïna nativa. En el segon cas, es produeix la proteïna més llarga.

Pregunta: Els microsomes tallen l’afegit proteic de la proteïna nativa?

Fet experimental: Afegim els microsomes un cop la proteïna ja ha estat sintetitzada

completament i observem que no hi passa res.

Conclusió: El que talla les proteïnes no són els microsomes.

Hi ha d’haver una partícula de reconeixement de senyal amb tendència a unir-se a

pèptids hidrofòbics (hidroxileucina). Si no hi poses aquesta partícula de reconeixement

(SRP), la proteïna s’avorta des del principi.

Explicació: Un ribosoma lliure conté unida a ell una SRP. Quan el ribosoma comença a

sintetitzar la proteïna, ho fa iniciant-se per un pèptid senyal (extrem N-t) que la proteïna

SRP reconeix. Aquest extrem queda enganxat al SRP mentre que la proteïna va essent


sintetitzada. El RE té receptors de membrana que s’uneixen a l’SRP del ribosoma i

aquest queda adherit a la membrana del RE. En aquest moment, el ribosoma es col·loca

sobre un canal de translocació (forat) i l’SRP s’allibera i es recicla al citosol. La proteïna

que està sent sintetitzada ho fa cap a l’interior del RE. Es tracta d’un cas de

TRANSLOCACIÓ COTRADUCCIONAL, perquè a mesura que va creixent la proteïna, és

empesa cap a l’interior del RE.

Així doncs, una sèrie d’estudis han conclòs que:

Les proteïnes estan distribuïdes desigualment dins les cèl·lules.

Les proteïnes que han de ser exportades són sintetitzades a ribosomes units al

reticle endoplasmàtic. El senyal de localització es troba en el pèptid naixent en

lloc de en la seqüència nucleotídica del mRNA.

La creació de fusions transcripcionals (quimeres polipeptídiques) ajuden a

determinar quina és la direcció i localització de cadascuna de les proteïnes.

Les proteïnes estan marcades per senyals complexos aminoacídics.

Una proteïna en absència del seu senyal és enviada a una destinació incorrecta.

Els senyals poden ser tallats abans d’assolir el compartiment diana.

Una gran varietat de molècules i estructures estan involucrades en la lectura de

les seqüències diana.

C. DEGRADACIÓ DE PROTEÏNES

La ubiqüitina és una proteïna de 76 residus que pot ser conjugada a proteïnes d’una

família d’enzims de sistemes en cascada. Les proteïnes que s’han de degradar són

poliubiqüitinitzades per ubiqüitines lligasa i això serveix de senyal per a dirigir-se i unir-

se a la subunitat 20 S del proteosoma. Aquest és un cilindre buit que té un centre actiu


responsable de la proteòlisi. Tanmateix, no és l’únic sistema de degradació. Les

proteïnes extracel·lulars es degraden, en canvi, als lisosomes.

Les accions són bones si es fan quan toquen

(Miquel Pons)

3. Caracterització de biomolècules

Imaginem que aïllem una proteïna desconeguda i volem saber de què es tracta. Per tal

de determinar-ho, disposem de diversos mètodes que la caracteritzaran via:

A) El pes molecular: Quant pesa? Quin volum té? Quina mida?

B) Mapes peptídics: Fem servir l’”empremta digital” de la molècula per identificar-

la.

C) Seqüenciació: Determinació de la seva seqüència.

A. CARACTERITZACIÓ DEL PES MOLECULAR

Les tècniques de determinació del pes molecular s’agrupen en dos grans grups:

1) Tècniques clàssiques:

a. Ultracentrifugació

b. Cromatografia d’exclusió molecular

c. Electroforesi SDS-PAGE

2) Tècniques avançades: Basades en l’espectrometria de masses (EM)


Si ja sé de quina proteïna es tracta, n’analitzo el pes molecular. Quin sentit té, si a en

conec la seqüència? Sí. La proteïna, a la cèl·lula o a les condicions experimentals, pot ser

que es trobi formant dímers o trímers. Experimentalment, doncs, determinarem un pes

molecular doble, triple... al que determinem mitjançant la seva seqüència. Així, aquests

mètodes ens aporten informació sobre les associacions i estat de les proteïnes en unes

condicions determinades.

a. Ultracentrifugació

Es basa en fer rotar una mostra, de manera que les partícules que es troben en solució

tendeixen a anar cap al costat exterior del tub en rotació (força centrípeta). Si no fes


servir centrifugació, la força de la gravetat causaria la sedimentació al fons del recipient,

però aquesta tècnica n’accelera el procés.

Tanmateix, no totes les coses se’n van al fons del tub, sinó que en funció de la seva

densitat, queden flotant (per exemple, el porexpan) o s’enfonsen (sorra). Aquestes

darreres sedimenten perquè pesen més que el volum del líquid que desplacen.

Si la densitat del líquid que hi ha al tub no és uniforme i es causa un gradient de densitat

(concentració), les partícules que hi dipositi se separaran en funció de la seva densitat,

tot situant-se a la fracció del tub que tingui la mateixa densitat que elles.

Si la proteïna té tendència a dimeritzar, on la concentració sigui més baixa, hi haurà

tendència a trobar la proteïna aïllada, perquè li costarà més trobar “parella” per a

dimeritzar. En canvi, allà on la concentració sigui més elevada, tindrem major nombre

de molècules dimèriques. Tot plegat ens determina dos fets claus:

Pes molecular de la proteïna

Constant d’equilibri del procés de

dimerització (pot ser determinada).

Es tracta doncs d’una centrifugació analítica

d’equilibri. Al gràfic s’observa que com més

t’acostes al fons del tub, més petita és

l’absorbància. Si l’absorbància és: A=Ɛ·c·ltub, vol

dir que l’absorbància és proporcional a la

concentració. Així, la concentració augmenta a

mesura que ho fa el radi. Com més t’apropes al

fons del tub (+ radi), major concentració i més dímers es formen.

b. Cromatografia d’exclusió molecular

Tant la cromatografia d’exclusió molecular com l’electroforesi en gel SDS són tècniques

semblants amb una base comuna. Es tracta de tècniques que separen partícules de

mides diferents i que requereixen algun tipus de filtre per a distingir molècules grans i

petites. La idea, però, s’aplica de maneres oposades.

En el cas de la cromatografia d’exclusió molecular s’omple una columna de boles d’un

polímer porós. Els pors consisteixen en espais buits plens d’aire, la mida dels quals és

coneguda i escollida per nosaltres. Els pors poden ser més grans o més petits.

Si fem passar una partícula gran, sortirà ràpid, perquè no s’introduirà als canals

del polímer i, per tant, tan sols travessarà la columna fins arribar al final.


Si fem passar una partícula petita, sortirà més tard, en funció de la seva mida,

perquè podrà entrar als pors del polímer i el seu “viatge”, doncs, serà més llarg.

La mida dels pors, doncs, determinarà en quin moment la partícula ens arriba al final de

la columna, on és recol·lectada. Això ens permet separar molècules en funció de la seva

mida, que serà proporcional a la massa molecular.

c. Electroforesis SDS-PAGE

Si en comptes de formar espais (polímer de la CEM), fem que el polímer formi una xarxa

contínua les que tenen més possibilitats de creuar són les petites, perquè les grans són

retingudes per la xarxa. I com puc “convèncer als peixos” perquè passin d’un costat a

l’altre de la xarxa? L’electroforesi aplica un camp elèctric per tal que les molècules

migrin cap al pol pel qual se senten atretes, és a dir, cap a la càrrega oposada. Però

també és cert que les proteïnes tenen càrregues molt dispars, i per tant, cal que

assegurem la càrrega d’alguna manera.

Per a homogeneïtzar la càrrega, fem servir SDS. SDS correspon a dodecildulfat sòdic, un

detergent (molècula de la imatge) amb una cua hidrofòbica i una càrrega negativa.

S’uneix no selectivament a proteïnes en proporció de 1 SDS cada 2 aminoàcids. Així

doncs, carrega negativament la proteïna fins al punt que les càrregues positives que hi

puguin haver deixen de tenir importància. Assegurem així que la proteïna migrarà cap al

pol positiu. SDS també desnaturalitza les proteïnes de manera que perden la seva

conformació. Així, s’obtindrà una gran correlació entre el pes molecular i la proteïna en

qüestió.

Ens podríem plantejar el dubte següent: com més gran sigui la proteïna, més càrregues

negatives tindrà. Aleshores, no serà més atreta pel camp elèctric i anirà més ràpid, tot i

ser més gran? Doncs NO. Farem un experiment per demostrar-ho.

Disposem 7 proteïnes diferents i les movem en SDS en camp elèctric en xarxes

de diferents porositats (com més xarxa, menys forats).

Observem el resultat següent:

Com major és la concentració del gel, major és la diferència entre les proteïnes

grans i les petites (menys mobilitat per les grans).


Com més redueixes la concentració del gel, menys diferències hi ha.

Arriba un moment en què, sense gel, totes les proteïnes es mourien igual

(extrapolació). Però... si tenen més càrrega unes que d’altres... com pot

ser!!?¿?¿ Doncs sí! Es tracta d’una raó hidrodinàmica; moure una cosa més gran

és més difícil que moure una cosa petita. Per tant, la mida va per damunt de la

càrrega.

Què passa si tinc una proteïna gran i una proteïna molt gran? O una petita i una de molt

petita? Les podré separar? En principi, cap de les tècniques mencionades ens permet

diferenciar amb tanta precisió. Per a això ens caldrà fer servir tècniques més avançades,

basades en espectrometria de masses.


Les tècniques per espectrometria de masses es basen en:

Una proteïna que conté un cert nombre càrregues positives o negatives, de la

qual en mesurem el paràmetre m/z. Aquest és la relació entre la massa i la

càrrega de la proteïna. Si sabem la càrrega i el valor de la relació, podrem

determinar el pes molecular.

La tècnica fa servir proteïnes ionitzades en fase gas.

Aquestes tècniques ens aporten una sèrie d’avantatges:

Sensibilitat: mesuren masses de quantitats ínfimes (de l’ordre de nm, pm,...)

Precisió: podem distingir proteïnes molt semblants però que es diferenciïn per

petits detalls, com és un sol àtom de fòsfor, o d’hidrogen!!!!

Presenten una sèrie d’utilitats:

Seguiment de reaccions

Modificacions post-traduccionals

Identificació de proteïnes

Seqüenciació de l’ordre dels aminoàcids

Com ja hem dit, un dels requeriments és que la proteïna es trobi en fase gas. Una

molècula com el benzè és fàcilment ionitzable mitjançant un canó d’electrons, però si

seguim aquest procediment amb les proteïnes, se’ns desnaturalitzen. D’aquest

problema han sorgit solucions. Hi ha una sèrie de tècniques que ens permeten obtenir

proteïnes en fase gas. Destaquem les tècniques:

MALDI

ELECTROSPRY (ES)


Aquestes corresponen a tècniques que permeten ionitzar i volatitzar la proteïna.

Tanmateix, també ens calen analitzadors d’ions:

TEMPS DE VOL (TOF, DE Time Of Flight)

QUADRUPOLS

1. MALDI + TOF

A la tècnica MALDI partim de la proteïna sòlida(purificada) i la mesclem amb una matriu.

Aquesta matriu està composta per molècules orgàniques petites que són capaces

d’absorbir una longitud d’ona que la proteïna no és capaç d’absorbir. A la matriu també

s’hi troben dispersos ions. Si aleshores donem energia a través d’un làser, les molècules

de la matriu absorbeixen l’energia a la longitud d’ona mencionada, des descomposen i

exploten. És tanta l’energia produïda en l’explosió que les proteïnes surten disparades i,

durant el vol, es troben amb ions que també han sortit disparats i se’ls enduen (Na+,

H+,...). Algunes proteïnes no hauran agafat cap càrrega, d’altres n’hauran agafat una,

dues... Aleshores, la massa molecular de la proteïna, en cas que els ions, per exemple,

siguin protons (m protó = 1), serà: Mo+n·1, on n és el nombre de càrregues que haurà

pres.

Fins aquí el fonament de MALDI. Per detectar les proteïnes ionitzades, em cal un

analitzador per temps de vol, TOF. Consisteix en tibar les proteïnes cap a un camp

elèctric i, per tant, només les espècies carregades “volaran” a través del camp.

L’analitzador funciona de la manera següent:

En una primera regió, sotmetem les proteïnes a una força constant i, per tant, la

seva acceleració anirà augmentant.

Deixem d’aplicar la força, de manera que al llarg d’una segona regió les

proteïnes seguiran una velocitat constant segons com s’havien accelerat.

Les proteïnes arriben al detector final en un moment determinat, segons la seva

velocitat

En funció del moment en què arribin al detector podem determinar la seva velocitat

perquè v=x/t. Coneixent la velocitat podem determinar la seva acceleració. I coneixent

l’acceleració podrem determinar la massa perquè F=m·a, i coneixem la força que hem

aplicat. Així doncs, haurem obtingut la massa de la molècula. De fet, el que determinem

realment mitjançant TOF és la relació m/z mitjançant l’equació següent:


Nosaltres el que rebrem serà una sèrie de pics corresponents als ions de què s’hagin

rebut senyal, relacionant la seva relació m/z i la intensitat de l’ió. Per exemple, per

l’espectre de masses de la seroalbúmina rebrem:

Dels pics rebuts deduïm que:

Un pic 1: m/z=33,22

Un pic 2: m/z=66,43

El pic té una relació m/z doble que

la del pic 2. Per tant, el pic 1 ha agafat un

protó més que el 2 (dividim entre z). Així:

Pic 1: M+2H+

Pic 2: M+H+

Intensitat pic 3 = 4 x intensitat pic

1. Per tant, només pot ser que sigui 2M+H+ (pic 2 x 2)

Pic 4 = pic 1 x 6 o bé pic 2 x 3. Per tant: 3M + H+.

L’espectre té una sèrie de pics de fons que no corresponen a res, sinó a soroll aleatori

que, estadísticament sempre és diferent. Si fos igual podríem sospitar que es tracta

d’un... FRAU!

2. ELECTROSPRY + QUADRUPOL

L’electrospry (ES) parteix d’una proteïna en solució aquosa tampó. Si aleshores insertem

aquest tampó dins el sistema (capil·lar metàl·lic) sotmès a:

Pressió baixa

Camp elèctric molt intens

Quan torna a sortir es forma un spry, és a dir, petites gotetes de líquid que conté les

proteïnes. Les gotetes aleshores s’evaporen i a mesura que ho fan es van fent petites

progressivament. Arriba un moment en què són tan petites que exploten perquè els

ions del seu interior es repel·leixen. Generen noves gotes que repeteixen el procés

diverses vegades fins que obtenim la proteïna sense aire que ha arrossegat un

determinat nombre d’ions.


El resultat és un espectre de m/z que

mostra l’abundància dels ions, tal

com en el cas de MALDI. En aquest

cas, però, la colla de pics tenen

números m/z molt més petits i les

espècies tenen moltes més

càrregues/pic. Obtenim, a més, tota

la sèrie (valors consecutius). Com

més gran és la proteïna, més

càrregues tindrà. Però, quina és la

massa? La massa l’obtindrem

mitjançant sistemes d’equacions. Per

exemple si sabem que:

(

)

(

)

ja podem resoldre tant el valor de la M com el de n. Automàticament, però, l’ordinador també

ho sap resoldre.

Quines aplicacions tenen ambdós mètodes?

Determinar la massa ens permet determinar el pes molecular. I, el PM, ens serveix per

diferenciar proteïnes diferents.

També, per exemple, podem predir quin seria el mecanisme d’una determinada proteasa en

una proteïna determinada. Incubo la proteïna amb la proteasa i després analitzo el pes dels

diferents fragments. Sabem que una proteasa és específica de seqüència i, per tant, em talla per

un lloc determinat, sempre igual. La màquina aleshores compara els fragments amb els que

s’esperaria d’una proteïna determinada coneguda. D’aquí podrem identificar seqüències de la

proteïna i, finalment, saber de què es tracta, en cas que aquesta es trobi a les bases de dades.

És difícil fer amics al mig del desert

(Miquel Pons)


4. Seqüenciació de proteïnes mitjançant espectrometria de masses.

Fins ara, mitjançant mètodes d’espectrometria de masses (MS) hem aconseguit

determinat el pes molecular de la proteïna en qüestió. Tanmateix, pot ser que es tracti

d’una proteïna desconeguda de la qual vulguem conèixer quins aminoàcids la formen i/o

en quin ordre es troben aquests residus al llarg del pèptid. És possible fer aquesta

seqüenciació proteòmica mitjançant espectrometria de masses.

Hi ha tres mètodes que ens permeten dur a terme una espectrometria de masses en

tàndem:

MS per quadrupol triple: El primer espectròmetre de masses selecciona els ions i

els traspassa a una cel·la de col·lisions. Els fragments obtinguts se separen a un

analitzador de masses.

MS per quadrupol amb trampa d’ions: Els ions són injectats a la trampa de

l’espectròmetre des d’una font externa d’ions. Un ió precursor és seleccionat

mitjançant el volum de la trampa. Un voltatge de ressonància és aplicat a la

trampa, resultant en diversos fragments de l’ió. Aquests fragments són

aleshores escanejats mitjançant el traspàs de la trampa a un detector.

MS per TOF: Els ions són accelerats mitjançant una força des de la font d’ions a

una regió de la cel·la. Quan deixa d’aplicar-se la força, continuen movent-se a

una velocitat constant gràcies a un camp elèctric fins a arribar al detector. Allà

es determina m/z en funció del moment d’arribada.


Com es duu a terme la seqüenciació per espectrometria de masses?

En primer lloc, cal trencar la nostra proteïna mitjançant col·lisions amb gasos inerts.

Això ens servirà per generar tota una sèrie de fragments útils per a la seqüenciació.

1) Disposo d’una mostra de proteïnes diferents amb càrregues diverses. Em cal

aïllar la proteïna d’estudi. Això ho duc a terme per electroforesi. Finalment em

quedo amb un sol tipus de molècula subjecte d’estudi.

2) Introdueixo la meva molècula (ió) a una cel·la de col·lisions amb un gas noble. Es

generen fragments de diverses mides (totes les mides possibles entre residus si

considerem que només es dóna una col·lisió per proteïna). *El trencament

considerem que només es dóna via l’enllaç peptídic (enllaç amida).

3) Un segon analitzador rep els productes de la col·lisió i n’analitza la relació m/z. A

partir d’aquí calculo la massa de cada fragment.

4) Obtindrem un mapa peptídic com el següent:

S’observen una sèrie de pics anomenats com a Ynº. Aquests pics corresponen a

fragments de massa creixent que difereixen en una certa massa. Aquesta diferència

entre pics consecutius correspondrà a la massa d’un dels 20 aminoàcids existents. Al

gràfic s’observa també l’abundància relativa de cadascun dels pics, i això ens indica que

un major nombre de molècules s’han fragmentat just en aquell residu. Els pics que no

estan marcats amb Y no corresponen a cap aminoàcid, perquè la diferència respecte

l’anterior no difereix en la massa de cap dels 20 aminoàcids existents.

És possible que la proteïna a analitzar es tracti d’una molècula molt gran, és a dir, d’un

gran nombre de residus. En aquest cas, el nombre de fragments obtinguts seria molt

Cys Ala


gran. L’analitzador, però, imposa un nombre de fragments límit. Per tant, ens cal una

solució.

Per a analitzar proteïnes grans ens cal escindir-les en fragments per acció d’una

proteasa. Aleshores, se’ns generen una sèrie de fragments que podrem analitzar

independentment i, dels resultats obtinguts per a cada cas, podrem destriar-ne la

seqüència completa. Però, en aquest punt, com sabem quin dels fragments anava

primer? La proteasa que hem fet servir per tallar els fragments és un enzim que

reconeix i talla unes seqüències determinades. Per tant, tots els fragments hauran de

començar i acabar per una mateixa seqüencia (tret dels extrem N i C terminals). Per

tant, podrem anar solapant els diversos fragments per a obtenir seqüències molt

llargues (aquesta tècnica, aplicada al DNA, ens serveix per a seqüenciar un genoma

complet).

Avui dia, la seqüència de totes les proteïnes es coneix o es pot conèixer, sobretot

gràcies al fet que coneixem la seqüència del DNA complet (genoma) i les seves

seqüències codificants per a les proteïnes existents. Què és el que diferencia les anàlisis

de la seqüència de proteïnes respecte a les de DNA?

Proteïnes: Les anàlisis sempre es basen en trencaments aleatoris i en la

comparació dels pesos moleculars dels fragments obtinguts.

DNA: Es basa en la propietat de construcció del DNA i en la síntesi de la cadena

complementària d’allò que volem seqüenciar.

Seqüenciació de DNA:

La seqüenciació del DNA pot dur-se a terme mitjançant dos mètodes: la seqüenciació de

Sanger i la piroseqüenciació.

A) La seqüenciació de Sanger:

El primer pas és la separació de la doble hèlix de DNA per a donar dues cadenes

simples. Aleshores, les cadenes senzilles es disposen en 4 solucions buffer que contenen

desoxiribonucleòtids (algun d’ells marcat radioactivament), DNA polimerasa i primers

per iniciar la polimerització. A més, cadascun dels buffers conté didesoxiribonucleòtids

(desoxiribonucleòtid sense –OH a 2’ i 3’) d’una base determinada a cada solució (A, G,

C, T). El resultat és una sèrie de fragments de DNA que han pogut créixer fins que un

didesoxiribonucleòtid s’ha afegit a la cadena, moment en què l’elongació s’ha aturat

perquè en absència del 3’OH no es pot formar l’enllaç fosfodièster. Aquest pas es duu a

terme mitjançant PCR, que amplificarà els fragments d’estudi. S’hauran format

fragments de totes les possibles longituds (diferint en un nucleòtid cadascun). Els

fragments de cada buffer són aleshores disposats a quatre carrils diferents

d’electroforesi amb gel de poliacrilamida, en els quals s’obtenen diverses bandes que


poden observar-se per autoradiograma. A partir d’aquestes bandes, podrem determinar

la seqüència del fragment de DNA objecte d’estudi.

http://www.youtube.com/watch?v=91294ZAG2hg

B) La piroseqüenciació:

És un dels mètodes més emprats i simples per a analitzar SNIPS.

Es basa en la seqüenciació per síntesis i en l’alliberament d’un pirofosfat quan un

nucleòtid és incorporat a un extrem 3’ lliure de la cadena. Cal, en primer lloc, disposar

en una placa la cadena motlle, l’encebador i la DNA polimerasa. En aquest cas, però, en

lloc d’oferir 4 bases (A, G, C, T), n’ofereixo només una (G o C o T o A). Per exemple,

imaginem que comencem oferint només GTP. Aleshores, poden passar dues coses:

No toqui incorporar G i, per tant, no s’hi pugui addicionar cap nucleòtid. No es

dóna reacció química.

Toqui incorporar una G perquè la seqüència motlle llegida té una C. Es dóna

reacció química. En aquest moment, s’allibera un grup pirofosfat. D’aquest

grup, gràcies a un enzim ATP sulfurilasa i adenosina 5’ fosfosulfat (APS), se’n

forma ATP. Aquest ATP és aleshores utilitzat per un enzim luciferasa per a

produir llum (rebem senyal = pic). Finalment, l’enzim apyrasa, degrada els

nucleòtids GTP que hi ha al medi.

Un cop s’ha degradat el GTP o bé no s’ha donat reacció perquè no tocava, el sistema

introdueix un nou tipus de nucleòtid (C o T o A) i el procediment es duu a terme de la

mateixa manera. En el cas de l’addició d’ATP, com que aquest és el responsable que la

http://www.youtube.com/watch?v=91294ZAG2hg


luciferasa emeti llum, cal afegir un nucleòtid modificat amb sofre, per tal que no l’utilitzi

però sí polimeritzi al DNA.

http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

5. Seqüenciació de proteïnes sense espectrometria de masses.

Es basa en aquelles reaccions químiques que poden dur-se a terme sobre el primer

residu de la cadena, però no sobre els altres: reaccions selectives. Hi ha dos mètodes de

seqüenciació sense MS: reacció del residu N terminal i degradació d’Edman.

A) Reacció del residu N terminal:

Es basa el grup amino lliure d’aquest extrem, que a diferència de la resta, no es troba

formant l’enllaç peptídic. La reacció es dóna amb clorur d’àcid sulfònic (sulfonamida),

que “marca amb fluorescència” aquest extrem. Aleshores, s’hidrolitzen els enllaços

peptídics per tal d’obtenir els aminoàcids. Només un d’ells estarà marcat i correspondrà

al primer aminoàcid de la cadena (a N-t). Tanmateix, cal tenir en compte que hi ha

aminoàcids que també tenen grups amino (lisina en té dos) i, per tant, també quedaran

marcats. De la lisina, però, n’obtindrem una marca doblement visible, perquè estarà

doblement marcada. D’aquesta manera la podrem descartar, si és que no és el primer

aminoàcid. Per tal de fer aquesta anàlisi de l’aminoàcid marcat es duu a terme una

cromatografia.

B) Degradació d’Edman:

El procediment d’aquesta seqüenciació es basa en marcar i eliminar només el residu N

terminal de la cadena, deixant intacta la resta.

1) Mantenim “enganxada” la proteïna a un suport sòlid per l’extrem C

terminal.

http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA


2) Es fa reaccionar la cadena a seqüenciar amb un reactiu PITC (fenil

isotiocianat). Aquest reacciona amb el grup amino terminal.

La reacció s’ha de dur a terme a pH bàsic (entre 9 i 9,5).

3) S’afegeix àcid (TTA, HCl,... pH= 1,2). Això facilita el trencament d’un

enllaç peptídic degut a l’adició anterior del PITC.

4) El residu N terminal s’analitza mitjançant HPLC (cromatografia líquida

d’alta resolució).

5) S’ha generat un nou residu N terminal, que pot ser analitzat de la

mateixa manera. I així consecutivament, anem repetint el procés.

Tanmateix, aquest sistema té limitacions. No podem analitzar una proteïna de número

indefinit de residus. Com que cada vegada tenim menys producte per analitzar, arriba

un moment (als 30-40 residus seqüenciats) en què no es pot continuar. Per tant, ens

caldrà generar un fragment que comenci més endavant per a continuar la seqüenciació

i unir els resultats de les diferents anàlisis (solapament).

Moltes vegades, la seqüenciació d’Edman s’utilitza per a saber per on s’ha degradat una

proteïna. Només cal seqüenciar uns 5 o 6 residus, perquè aleshores es compara amb la

proteïna, ja seqüenciada i coneguda, i es determina el lloc de trencament.

Per a què pot fer-se servir l’espectrometria de masses?

Molt sovint s’utilitza per determinar el pes molecular d’una proteïna.


També per determinar l’accessibilitat d’una proteïna de la càpsida viral a un

reactiu petit concret (acetilació, aigua deuterada...) amb què volem tractar

aquest virus. Si es modifiquen els grups amino terminals (a l’analitzar-la la

proteïna pesa més) d’aquestes proteïnes significa que el reactiu sí que és

accessible a la càpsida.

* L’aigua deuterada és H2O modificada per D2O. La diferència es basa en el fet

que la massa de l’hidrogen és 1 i la del deuteri és 2. Aleshores, si la proteïna

abans pesava X, ara pesarà una unitat més per hidrogen que contenia. Però per

tal que això es doni, cal que aquest hidrogen sigui bescanviable i accessible. Si

coneixem l’increment de pes que s’ha donat respecte la proteïna inicial, sabem

quants hidrògens han estat bescanviats per deuteri i això significa que hi ha

tants hidrògens exposats a l’aigua deuterada.

5. Estructura de proteïnes

L’estructura secundària de les proteïnes implica regularitats locals. Aquestes regularitats

es deuen a les pròpies regularitats de la seva estructura primària.

L’enllaç peptídic és el resultat de la condensació del grup carboxil d’un aminoàcid amb

el grup amino d’un altre, amb l’alliberació d’aigua. Aquesta reacció no és espontània en

dissolució i, per tant, requereix un aportament d’energia (in vivo, gràcies a l’acoblament

a RNA de transferència). L’enllaç peptídic (amida) presenta ressonància entre dues

formes extremes. Aquest fet determina un híbrid de ressonància amb un enllaç que és

intermedi entre un de simple i un de doble. Això explica el fet que el C carbonílic amb el

seu hidrogen i carboni alfa, així com el nitrogen amb el seu hidrogen i carboni alfa,

siguin coplanars (respectivament). L’enllaç peptídic pot ser cis (els dos carbonis α es

troben al mateix semiplà definit pel l’eix de l’enllaç doble) o trans (es troben en

semiplans diferents, menor energia). La majoria dels enllaços peptídics de les

proteïnes són trans, tret del cas especial de la

prolina, perquè la seva cadena lateral es troba

unida al nitrogen de l’enllaç peptídic. En

aquest cas, trans és molt poc més estable

que cis, així que la podem trobar

indistintament d’una manera o altra.

L’enllaç peptídic, doncs, pel fet que té caràcter d’enllaç doble, no permet la rotació. Per

tant, l’angle de rotació al seu voltant pot ser o 0º (cis) o 180ª (trans). La resta

desestabilitzarien la molècula en gran mesura; es trencaria la ressonància i es

convertiria en un enllaç senzill ordinari.


Un pèptid és una successió de plans peptídics en què es troben els carbonis alfa. Cada

pla peptídic conté àtoms de dos residus consecutius. Cada carboni α forma part de dos

plans peptídics (anterior i posterior). L’orientació d’aquests dos plans respecte al pla

addicional format pel propi carboni alfa, el seu hidrogen i el primer àtom de R, està

determinada pels angles Φ (phi) i Ψ (psi).

Φ mesura el gir entorn de l’enllaç

que uneix el carboni α d’un residu i

el N del mateix residu i pertanyent

al pla peptídic anterior.

Ψ mesura el gir entorn de l’enllaç

que uneix el carboni α amb el

carboni del grup carbonil del mateix

residu i pla peptídic posterior.

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/ep_spt/index.html

La conformació global d’una proteïna queda perfectament

definida per aquests dos angles. Aquests dos angles

no estan fixats a priori, perquè són senzills.

Tanmateix, no poden adoptar valors qualsevols

perquè en alguns d’ells es produeixen xocs estèrics

entre els plans anteriors i posteriors o amb les cadenes

laterals del residu. Ramachandran i col·laboradors van

determinar els valors permesos dels angles Φ i Ψ. La representació es coneix amb el

nom de mapa de Ramachandran. En aquest diagrama, les coordenades de cada punt

representen una parella de valors de Φ i Ψ. Les zones on apareixen parelles de valors

permesos es presenten ombrejades. Els aminoàcids solen tenir mapes molt semblants

entre ells, tret del de la glicina, la prolina i els residus X-prolina. Cada mapa consisteix en

dues grans zones permeses amb valors negatius de Φ, i una petita regió positiva

d’aquest angle. La glicina té més zones permeses des d’un punt de vista energètic,

perquè la seva cadena lateral es compon d’un sol hidrogen. A les proteïnes, els residus

adopten valors de Φ i Ψ de dins de la zona permesa. La denominació permesa i no

permesa no és gaire encertada. No es produeix un salt brusc d’energia a la frontera

d’ambdues regions, sinó un augment progressiu. I a més, el cost energètic d’adoptar

valors no permesos pot ser compensat per l’establiment de noves interaccions

estabilitzants.

De les restriccions conformacionals derivades dels enllaços peptídics, les proteïnes

veuen delimitades les seves conformacions perquè els angles de rotació dels enllaços de

les cadenes laterals adopten valors que condueixen a les formes més estables (no

atzarosament). Aquests enllaços són denominats X1, X2, etc. L’angle preferit és aquell

que situa els substituents al més allunyats possible (conformació alternada). Per l’angle

http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/ep_spt/index.html


X1 hi ha tres conformacions alternades: gauche+, gauche- i trans. Les més estables són

la gauche+ i després la trans. Cadascuna de les conformacions rep el nom de rotàmer.

Com major la cadena lateral, major nombre de rotàmers. Malgrat el gran nombre de

restriccions, el número de possibles conformacions que pot adoptar una proteïna és

astronòmic.

Estructura secundària de proteïnes:

El mapa de Ramachandran mostra l’existència, a grosso modo, de dues zones d’angles

Φ i Ψ permesos, les dues amb valors negatius de Φ (phi) i que es diferencien pel valor

negatiu o positiu de Ψ (psi). Quan analitzem l’estructura tridimensional d’una proteïna

s’observa que hi ha regions en què els carbonis αconsecutius adopten angles de Φ i Ψ

molt similars, que cauen en una de les zones permeses del diagrama. Això determina

que la cadena peptídica adopti en aquestes regions, una disposició periòdica de les

seves unitats peptídiques. Les dues disposicions periòdiques tenen, forma d’hèlix (hèlix

alfa) o de cadena estesa (bri β). L’associació de bris β mitjançant ponts d’hidrogen dóna

lloc a les làmines β.

a) Les hèlixs α

Qualsevol estructura regular d’un polímer és una hèlix. Una hèlix és el resultat d’un gir i

una translació, lligats ambdós. Les hèlixs es caracteritzen per diversos paràmetres:

1) Radi/diàmetre

2) Pas de rosca: distància entre punts equivalents.


Pas

de

rosc

a

3) Avenç per residu: si l’hèlix està formada per

elements discontinus. (per exemple una

proteïna) cal que els residus vagin agafant els

mateixos valors de psi i phi, de manera que

anem generant “l’escala de cargol”.

A les proteïnes, les hèlix reben noms diversos en funció de

les seves propietats. Existeixen hèlixs alfa, làmines o fulls

beta (també són helicoïdals). Les hèlixs possibles estan

compostes per residus que es troben a regions permeses

del mapa de Ramachandran.

* Característiques de les hèlixs alfa:

Una hèlix alfa és qualsevol seqüència formada per

5 o més aminoàcids consecutius d’una proteïna

amb angles Φ d’aproximadament -57º i de Ψ d’aproximadament -47º. A

l’adoptar-los, el grup CO de l’aminoàcid i queda a la distància i orientació

adequades per formar un pont d’hidrogen amb el NH de l’aminoàcid i+4.

Els 4 grups CO de l’extrem C terminal de l’hèlix i els 4 grups NH de l’extrem

amino terminal no compleixen aquestes normes, perquè l’hèlix acaba amb ells.

Les hèlixs alfa donen una volta al voltant del seu eix cada 3,6 aminoàcids,

avançant 0,45 nm al llarg de l’eix.

Els plans peptídics queden disposats gairebé paral·lels a l’eix, de manera que els

seus dipols queden alineats.

Les cadenes laterals surten del cilindre apuntant cap a l’exterior de l’hèlix no

totalment perpendiculars, sinó inclinades lleugerament cap a l’extrem amino.

Les hèlix són objectes quirals no idèntics a les seves imatges especulars. Les hèlix

alfa de les proteïnes són de tipus R.

Els residus hidrofílics i hidrofòbics es

troben en costats oposats de l’hèlix

(amfipàtiques). Això els permet, per

exemple, empaquetar-se amagant les

parts hidrofòbiques en presència d’aigua.

El grau d’exposició a l’aigua es pot deduir

mitjançant la representació de “roda

helicoïdal”. Quan els residus polars

s’agrupen a una cara i els apolars a

l’altra, es tracta d’una hèlix amfipàtica. Si

la pràctica totalitat de l’hèlix consta de

residus apolars, es tracta d’una hèlix

enterrada a l’interior de l’estructura


proteica i si consta de residus polars, es tracta d’una hèlix totalment exposada.

L’estabilitat d’una hèlix depèn de:

o Els aminoàcids que la componen

o La posició que ocupen aquests aminoàcids

o Interaccions entre cadenes laterals disposades a i - i+4

o Interaccions d’empaquetament amb la resta de la proteïna

Com hem vist, els residus de les hèlixs alfa formen ponts d’hidrogen entre i – i+4 (per

exemple, entre els residus 1-5, 2-6 o 3-7, etc.). Això suposa un benefici. Si els enllaços

amida formen ponts d’hidrogen de manera regular es determina una estructura

estable. Tanmateix, hi ha tres hèlix de naturalesa diferent degut als ponts hidrogen que

formen:

Hèlixs 3-10: té un forat central. És molt més abundant que l’hèlix pi. 3 residus

per volta. i-i+3 (imatge: 1-4, 2-5, 3-6)

Hèlixs alfa: la més estable i abundant. Molt més compactada (interior total i

perfectament empaquetat). 3,6 residus per volta. Ponts d’hidrogen i-i+4.

(imatge: 1-5, 2-6, 3-7, 4-8, 5-9)

Hèlixs pi: té un radi molt més ample (genera un forat). 4,3 residus per volta. i-i+5

(imatge: 2-7, 3-8, 4-9)


Cercles: residus hidrofílics, quadrats: residus hidrofòbic, triangles: residus molt carregats

negativament i pentàgons: positivament. Verd: els més hidrofòbics, groc: hidrofobicitat

zero, vermell: els més hidrofílics, blau: potencialment carregats.

Les hèlixs es dobleguen formant estructures de superhèlixs, de manera que la part

situada a l’interior sigui la regió hidrofòbica. Aquestes hèlixs es pleguen formant un cert

angle, en tant que les cadenes laterals s’han d’encaixar d’una determinada manera.

Com es forma una hèlix?

L’hèlix es forma perquè energèticament és més favorable que no pas estant

desplegada. Per tal de formar-la, la força determinant és la que generen els ponts

d’hidrogen. La formació d’un pont d’hidrogen comporta una despesa entròpica; una

cadena sense hèlixs alfa té molta llibertat d’angles psi i phi i, per tant, estar en forma

desplegada comporta un guany entròpic. Quan es forma l’hèlix, per contra, només es

poden adoptar uns angles psi i phi determinats (mapa de Ramachandran) i aleshores es

perd entropia. Però el guany de ponts d’hidrogen és més rellevant perquè:

El primer pont d’hidrogen necessita de molta energia per formar-se.

El segon ens comporta molta més estabilitat que l’energia que “paguem”.

Per tant, el guany és cooperatiu, i el balanç global entre fets favorables i desfavorables

és positiu, perquè costa molt començar, però un cop fet, es dispara!


Hi ha fets claus que ajuden a iniciar el procés de formació de ponts d’hidrogen per a

l’establiment de l’hèlix. Les prolines són incompatibles amb l’hèlix alfa, per tant, poden

ser primeres en l’hèlix. Tanmateix, el problema es dóna quan formen part del seu

interior. Són els extrems N terminal i C terminal que ajuden a començar i acabar de

formar l’hèlix. L’extrem N terminal:

Ser-X-X-Glu es troba amb freqüència a l’extrem N-t. Aleshores aprofita la cadena

lateral de la serina per formar un pont d’hidrogen amb l’àcid glutàmic. A partir

d’aquí, el plegament s’esdevé amb facilitat i rapidesa.

* Característiques dels fulls beta:

També són hèlixs (polímer regular). Si ens fixem en un carboxil de referència, veiem que

una cadena plana, per cada 2 residus gira 360º. Aleshores, els carbonils miren amunt i

avall successivament. En aquest cas, els ponts d’hidrogen es formen entre fragments

distants de la cadena.

Hi ha dos tipus de cadenes:

Aquelles que corren en una mateixa direcció (full beta paral·lel)

Aquelles que corren en direccions oposades ( full beta antiparal·lel)

Els extrems del full beta representen un problema. D’aquesta manera, algunes

proteïnes ho solucionen formant un barril.


Una mateixa proteïna pot tenir regions en hèlix alfa i d’altres en làmina beta. Per

exemple, a la imatge següent s’observa com la làmina beta presenta una curvatura

perfecta per tal que s’hi posi una hèlix alfa al damunt. Les regions blanques són

segments de la proteïna que no es troben plegats.


Tècniques de determinació de l’estructura de proteïnes:

A continuació, parlarem de diverses tècniques que ens permeten determinar

l’estructura de proteïnes. Contestarem les següents qüestions:

a) Quina és la tècnica i quina informació ens dóna?

b) Com s’interpreta la informació?

c) Quines limitacions té?

d) Fins a quin punt aquest model és real?

És molt important tenir en compte que tota la informació que trobem a les bases de

dades fa referència a models basats en la interpretació d’un investigador determinat.

Per exemple, al PDB (Protein Data Bank) hi trobem gran quantitat de figures

estructurals que provenen d’anàlisis per difracció de raigs X i per ressonància magnètica

nuclear, i la posterior interpretació per part dels investigadors.

Des del 1993 fins a l’actualitat, l’augment de nombre d’estructures proteiques en bases

de dades ha augmentat exponencialment gràcies al desenvolupament de noves

tècniques com les que es tractaran a continuació.

1. DIFRACCIÓ DE RAIGS X

La difracció de raigs X té una sèrie de requeriments experimentals per poder-se dur a

terme:

Es necessita la proteïna en forma de cristalls (aproximadament de 0.2 mm3)

Es necessita una font de raigs X (actualment es fa servir la radiació de

sincrotrons).

Problema de la fase. Cal resoldre’l per experiments addicionals.

La tècnica de difracció de raigs X ens proporciona la informació següent:

Estructura de proteïnes globulars (només obtenim informació de proteïnes que

es puguin cristal·litzar (p. globulars); les proteïnes desordenades no es poden

cristal·litzar i caldrà analitzar-les per altres tècniques).

Permet estudiar estructures molt grans. El límit de mida per a RX és el més ampli

d’entre totes les tècniques.

La seqüència d’esdeveniments que segueix la cristal·lografia de raigs X és la següent:

1) Purificació de la proteïna d’estudi

2) Cristal·lització de la proteïna

3) Difracció de raigs X

4) Avaluació de les dades obtingudes

5) Resoldre el problema de les fases per càlculs de la densitat electrònica


6) Construcció i refinament

7) Validació

8) Construcció i obtenció del model final

El requeriment principal és disposar de cristalls únics, homogenis i de bona qualitat.

a. Com s’obtenen els cristalls?

Els cristalls de qualsevol substància s’obtenen a partir d’una solució sobresaturada,

mitjançant l’addició de molècules de solut a un nucli inicial de cristal·lització. Si la

solució no estigués saturada no es donaria canvi de fase.

La sobresaturació és una situació en la qual hem incorporat més solut del que admet la

solució. Per exemple, si disposem tant sucre com sigui possible en aigua, mesclem a alta

temperatura i deixem refredar, no succeirà cristal·lització. Però si hi afegim una

branqueta de canyella o anís, es formaran cristalls de sucre sobre la branca. Aquesta


intrusió ha aportat energia (energia d’activació de la formació de cristalls ordenats) i ha

proporcionar una superfície sobre la qual s’han generat nuclis inicials de cristal·lització.

L’objectiu, doncs, de la cristal·lització és disposar d’una dissolució sobresaturada que

generi nuclis de cristal·lització sobre els quals creixin uns pocs cristalls. Tanmateix, si la

concentració és massa elevada i es dona per un canvi brusc, es poden formar agregats

amorfs que no ens són útils per a les anàlisis. Per tant, la cristal·lització s’ha de dur a

terme molt a poc a poc per passar d’una situació metastable a una d’inestable.

L’estratègia consisteix en disposar d’una concentració inicial i anar-la augmentant per

eliminació d’aigua i per introducció de canvis que disminueixin la solubilitat de la

proteïna. D’entre aquests factors de canvi, els més habituals són:

1) Eliminació d’aigua

2) Ph (menor solubilitat a pH isoelèctric)

3) Temperatura (les proteïnes són més solubles a baixa temperatura. S’afegeix la

sal en fred i es deixa que s’assoleixi la T ambient per a la cristal·lització).

4) Baixa concentració salina (algunes proteïnes (globulines) requereixen la

presència de sal per a ser solubles; altres (albúmines), no).

5) Alta concentració salina

6) Solvents orgànics

7) Precipitants polimèrics

8) Lligands de proteïna

La tècnica més comuna es basa en l’assoliment de la sobresaturació mitjançant difusió

de vapor. Una petita gota preparada mesclant a parts iguals la solució de la proteïna i la

de cristal·lització es manté dins d’una cambra hermètica formada per un reservori que

conté un volum molt més gran de solució de cristal·lització, sense que la gota i la solució

entrin en contacte. La pressió de vapor de l’aigua és major en la gota que en el reservori

i, per tant, la gota per a poc a poc aigua fins que la concentració de precipitants a la

gota i la concentració del reservori són iguals. Hi ha dues modalitats principals per a

aquesta tècnica:

1) Gota penjant

2) Gota assentada

b. Com s’obtenen les condicions òptimes per a la cristal·lització?

Quan una proteïna no ha estat mai cristal·litzada, cal iniciar l’experiment amb una cerca

de les condicions òptimes per a la cristal·lització. El número de factors a controlar és

immens, de manera que s’han desenvolupat matrius que exploren l’espai de

cristal·lització. S’hauran de tenir en compte els següents fets:

Optimització de la construcció


– Eliminació de regions desordenades (que no cristal·litzen)

– Bon rendiment i solubilitat

Paràmetres de cristal·lització

– Combinació de dissolvent/precipitant

– Temperatura, etc.

– Robots de cristal·lització

Optimització i conservació dels cristalls

– Criopreservació

Obtenció del diagrama de difracció

– Grup de simetria, cel·la (mateixa proteïna pot cristal·litzar en diverses formes)

– Resolució

c. Com són els cristalls?

L’estructura cristal·lina està caracteritzada microscòpicament per l’agrupació de

components (ions, àtoms o molècules) segons un model de repetició periòdica,

tridimensional per translacions. La repetitivitat constitueix una xarxa cristal·lina. El

conjunt mínim de repetició ordenada en les tres dimensions de l’espai rep el nom de

cel·leta elemental o cel·leta unitat. Les tres translacions formen un prisma definit per

tres eixos i tres angles interaxials que serveixen de sistema de coordenades per definir

la posició dels àtoms.

També es donen elements de simetria que provoquen repeticions dins la cel·leta

elemental.

d. Què fem amb els cristalls?

La difracció de raigs X és la interacció dels raigs X amb els cristalls d’estudi. Quan hi

incideix, aquest raig interacciona amb els electrons dels àtoms del cristall, els fa vibrar

acobladament amb les variacions periòdiques del seu camp elèctric. Aleshores els

electrons donen lloc a un nova radiació, que pot ser per dispersió si s’interfereixen, o

per difracció si cooperen entre ells.

Sigui com sigui, els raigs X tenen una longitud d’ona molt petita per tal de poder

visualitzar unitats molt petites de l’ordre d’Å (veurem àtoms).

Els raigs X incidents a la nostra mostra i difractats, incideixen sobre un detector

electrònic que ens proporciona una imatge amb una sèrie de punts discrets que


reflecteixen la regularitat del cristall en funció de la intensitat dels punts. L’ordinador

ens preguntarà quina és l’amplitud de l’ona, que és coneguda, però també la fase.

Aquesta última no la podem conèixer experimentalment. Es tracta del problema de la

fase.

La informació experimental ve de la intensitat dels pics de difracció en diferents

posicions. Les posicions estan definides per les característiques del cristall i la seva

orientació. Els cristalls es fan girar per obtenir totes les orientacions possibles. La

intensitat del pic reflecteix l’amplitud de la ona de radiació que arriba a aquest punt

però no dóna informació sobre la seva fase. Calen experiments independents per a

determinar la fase (“el problema de la fase”).

Com que no tenim una lent que ens reconstrueixi la imatge (com ho faria un

microscopi) ens cal fer-ho mitjançant una transformació de Fourier. En ella intervenen

una sèrie de magnituds denominades factors d’estructura definits en cada punt de

l’espai i que contenen la resultant de la dispersió dels raigs X que cooperativament

emeten tots els àtoms de la cel·leta elemental.

La informació de la fase s’obté per:

* Cal fer experiments per desxifrar-la:

Per reemplaçament molecular: Depenent del

què sabem de la proteïna. Suposem que ja la

coneixem. Fem una aposta en funció de la

intensitat per obtenir la fase.

Per dispersió anòmala a diferents longituds

d’ona: no sabem l’estructura de la proteïna.

Comparem anomalies.

Per comparació amb derivats isomorfs amb

metalls pesants.

Per exemple. Imaginem que volem determinar

l’estructura d’un aneguet. Del diagrama de Fourier no

podem desxifrar-ne la forma, malgrat que conté tota la

informació necessària per tal que a l’aplicar la

transformada de Fourier obtinguem l’ànec.

Però com que els experiments mai són perfectes, a vegades podem obtenir un regió

molt més petita de la informació, de manera que ens donarà una transformada amb

molta menys resolució.

La resolució és en funció de la qualitat de les dades. Disminueix també amb la fiabilitat

de les dades.


Així doncs, els dos grans problemes a solucionar fins ara han estat la obtenció de cristalls

i la obtenció de la fase de les ones.

El resultat havent solucionat els dos problemes és un

mapa de densitat electrònica. Es tracta de regions on

hi ha molts electrons, indicador que hi ha molts

nuclis. Els elements de què podem estar rebent

senyal són el C, N i O, perquè tenen molts electrons.

L’H, per contra, es trobarà en regions clares. A partir

d’aquí és possible anar imaginat com es situen els

àtoms. Per tant, inferim una estructura a partir del

mapa de densitat electrònica. No vol dir que la

nostra estructura sigui correcta. Com més resolució

tinguin les nostres dades, més fiabilitat tindrà la nostra estructura. A partir de 2 Å cap a

menys tenim una resolució acceptable i cada vegada millor.

A partir de les imatges obtingudes podem anar imaginant com es troben situats els

àtoms en la molècula i, per tant, farem una inferència a partir del mapa de densitat

electrònica. Tanmateix, com ja hem dit, l’estructura final que s’obtingui serà en funció

del que l’experimentador infereixi. Per tant, cal passar una sèrie de controls.

Al principi teníem un diagrama amb punts i n’hem establert una estructura amb el 95%

dels punts que s’hi observen. Però, què passa amb el 5% dels punts restants? No es

tractarà de l’estructura sencera perquè cal tenir en compte que:

Hi ha regions invisibles: són regions desordenades. Al diagrama, ens semblarà

que la cadena desapareix a un punt i torna a aparèixer a un altre. Entremig hi ha

una seqüència desordenada.

Hi ha senyals duplicats: les cadenes laterals pot ser que es trobin mirant cap a

diferents orientacions en diferents molècules de la mateixa proteïna. Quan fas

l’anàlisi et surten les dues possibilitats perquè aproximadament el 50% es

troben en una posició i el 50% en l’altra.


Si el dissolvent és estàtic també hi observarem els seus àtoms. Si és mòbil, no els

observarem. En determinats punts haurem de dir que es troben coberts, per

exemple, per aigua. Malgrat això, ha de establir-se aquesta afirmació al mínim

de llocs possible.

Hi ha una sèrie de programes que ens determinen quina és la qualitat dels nostres

models estructurals. Per exemple: PROCHECK

http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html

Aquests programes ens permeten saber si una estructura és raonable o no. Si la nostra

estructura està d’acord amb el coneixement general. S’estableixen una sèrie de gràfics

de valors raonables a dins dels quals hauria de “caure” la nostra estructura. Un exemple

és el Mapa de Ramachandran, que ja hem vist anteriorment. En aquest tenim uns

angles Psi i Phi que determinen dues o tres grans regions raonables per a les proteïnes.

Els principals factors que determinen els programes com a raonables o no, són:

Geometria covalent: distàncies d’enllaç i angles

Planaritat

Angles diedres

Quiralitat

Interaccions de no enllaç

Ponts disulfur

Paràmetres estereoquímics

Anàlisis de residu per residu

A la presentació del tema es donen imatges per a diversos models de control.

2. RESSONÀNCIA MAGNÈTICA NUCLEAR (RMN)

Els resultants que s’obtenen fent servir RMN poden ser molt similars als resulatst

obtinguts per RX, malgrat que les tècniques són molt diferents.

L’objecte que ens dóna informació, aquí, és el nucli de l’àtom. Concretament, l’àtom

d’hidrogen és el que ens dóna més informació, perquè només té un protó. També

podem estudiar el 13C, el 15N o el 31P, però de tots, el 1H és el que ens dóna més

informació. L’àtom de 12C, que és el més freqüent, és invisible a RMN. No tots els àtoms

es poden estudiar. Aleshores, la tècnica consisteix en fer créixer les proteïnes en

bacteris que s’alimentin de clorur amoni amb 15N i glucosa 100% amb 13C, de manera

que les seves proteïnes només tindran aquests tipus d’elements.

http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.html


La tècnica es basa en l’spin nuclear, és a dir, les propietats magnètiques del nucli.

Aquestes només es manifesten si els posem amb un imant. Així doncs, la mostra

s’introdueix a un camp magnètic intens (imants immensos!).

Al metge, una ressonància es fa per RMN, però com que els pacients han

generat un cert tilín cap a la paraula Nuclear, perquè sembla que hagi d’induir

tumors, ara rep el nom de ressonància magnètica d’imatge, en medicina.

La diferència de la RMN de proteïnes respecte a la mèdica és que, a la primera,

volem determinar la posició dels àtoms d’hidrogen de la proteïna. En canvi, en el

segon cas, les imatges mostren en quines regions de l’objecte hi ha aigua (molts

protons). Això ens determina que la concentració d’aigua és diferent a regions

diferents i, per tant, determinarà propietats diferents.

Amb tot, el més important és que:

Cada nucli d’una macromolècula és potencialment distingible dels altres i proporciona

informació sobre el seu entorn.

Cada protó, doncs, ens dóna una informació en funció dels seus veïns. És a dir, d’alguna

manera, els protons faran “d’espies” que ens informaran sobre el seu entorn.

Els investigadors van trobar-se que cada àtom d’hidrogen no simètric o no equivalent

emetia una senyal diferent, perquè el seu entorn és diferent. Entenguem-ho amb un

exemple sobre la classe i els alumnes.

Imaginem que els alumnes, asseguts, som un conjunt de protons que formem

una estructura. Com a espies, hem de dir-li a en Miquel, cadascun de nosaltres,

quina és l’estructura en què ens trobem.

Si una proteïna té 50 residus, tindrà 270 àtoms d’Hidrogen. Si en té 200... en

tindrà 1080! Per tant, és difícilment distingible.

Cadascun de nosaltres té un número de telèfon diferent. En Miquel té una llista

que relaciona el nostre nom amb el telèfon que tenim.

Inicialment, l’únic que hem

de conèixer és l’estructura

primària. Un cop reculls els

espectres obtens un gràfic

com el següent:


Cadascun dels pics del gràfic significa el protó d’un residu determinat. Però normalment

obtenim un munt de pics que es troben sobreposats: problema de la dispersió. Com ho

solucionem?

Hem obtingut un gràfic en una dimensió en què dos senyals no poden sobreposar-se

per obtenir una estructura:

Per tant, ens cal fer un experiment en dues dimensions. Seguint amb l’exemple anterior:

És possible que els telèfons estiguin repetits. En Miquel trucarà a dos telèfons a

la vegada que segons l’experiment anterior, són de protons veïns. Només el

podrem agafar si sona el nostre i el del nostre veí! Així establirem el mateix en

dues dimensions:

O bé, fins i tot, podem fer l’experiment en tres dimensions (amb tres telèfons) i

obtindrem, encara amb més precisió, el següent:


I quina informació ens proporciona tot plegat?

La RMN ens informa sobre:

Distàncies entre protons en base a l’Efecte Nuclear Overhauser (NOE)

o Depèn de 1/r6 i ; només es detecten distàncies molt curtes (< 5 Å)

Angles diedres mesurant constants d’acoblament

o En cas de rotació ràpida es mesura un acoblament “promig”

Exposició al dissolvent dels protons làbils (NH) per bescanvi hidrogen - deuteri

o Al contrari dels experiments de masses, en aquest cas es coneix la

posició on es produeix el bescanvi.

Orientació relativa dels enllaços N-H encara que estiguin allunyats entre sí.

o Implica la orientació de la proteïna respecte al camp magnètic i la

mesura dels anomenats acoblaments dipolar residuals

Distància de un nucli determinat respecte a un centre paramagnètic natural

introduït per l’experimentador

A cada experiment trobo condicions en què a dos protons els passen les mateixes coses.

D’aquí, obtinc uns models:

Llocs on hi tinc molta informació:

models definits

Llocs on hi tinc poca informació: models

indefinits; tinc moltes possibilitats. Per

exemple, a les estructures reals, les

puntes o extrems estan esfilagarsats

(moltes possibilitats)... però totes són

possibles!

Com més gran és el conjunt de restriccions, més bona serà l’estructura resultant.

Finalment ens preguntem... què és millor, RX o RMN?

RX RMN

Proteïnes ordenades (globulars i cristal·litzades)

Proteïnes desordenades

Proteïnes molt grans Proteïnes més petites

Optimització de construccions per després fer raigs X

Disseny de fàrmacs amb unió forta a proteïnes.

Disseny de fàrmacs amb unió feble a proteïnes.

No es pot fer in vivo. Es pot fer in vivo a les cèl·lules.

Estudis funcionals en menys mesura. Estudis funcionals.

0macro Part Miquel

Documents

Transcript of 0macro Part Miquel