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CAPÍTULO II Sistema genético mitocondrial humano

Manuel J. López Pérez y Julio Montoya

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza. Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza., España. lopezper@posta.unizar.es

RESUMEN

Las mitocondrias son los orgánulos subcelulares encargados de la producción de energía en forma de ATP. Contienen su propio sistema genético con ADN mitocondrial que codifica un número

pequeño de polipéptidos que forman parte de la cadena respiratoria junto con proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo. Para la biogénesis de la mitocondria se requiere la

expresión coordinada de los dos sistemas genéticos, el nuclear y el mitocondrial. Los genes están dispuestos en el ADN mitocondrial de manera muy compacta con los tARNs intercalados entre los

genes de los rARNs y los codificantes de proteínas. Esta organización génica se ve también reflejada en su modo de expresión y en las características singulares de los ARNs. Las dos cadenas

del ADN mitocondrial se transcriben completamente en forma de tres moléculas policistrónicas que se procesan posteriormente por enzimas específicos que cortan en los extremos 5' y 3' de los tARNs

para originar los rARNs, mARNs y tARNs maduros. La mitocondria posee asimismo su propia maquinaria para la síntesis de las proteínas codificadas en su genoma. El ADN mitocondrial difiere

del nuclear en una serie de características. En especial, el genoma mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre que lo transmite a todos sus hijos. Este ADN tiene tendencia a mutar y

a fijar estas mutaciones en variantes genéticas poblacionales por lo que se está utilizando para estudiar la filogenia y estructura de poblaciones.

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INTRODUCCIÓN

Las mitocondrias son orgánulos subcelulares con doble membrana que se encuentran prácticamente en todas las células eucariotas y cuya función principal es la de llevar a cabo el metabolismo oxidativo con la consiguiente producción de energía en forma de ATP. En este proceso, conocido como fosforilación oxidativa (sistema OXPHOS), participan una serie de complejos enzimáticos (complejos I al V) que proporcionan la mayor parte del ATP celular. Además, estos orgánulos participan también en la biosíntesis de otros componentes celulares: pirimidinas, aminoácidos, fosfolípidos, nucleótidos, ácido fólico, hemo, urea y una gran variedad de metabolitos (1).

La característica mas singular de las mitocondrias es la de poseer un sistema genético propio con toda la maquinaria necesaria para su expresión, es decir, para la síntesis de ADN, ARN y de todas las proteínas que codifica. Este segundo sistema genético celular, a pesar de contener un número muy pequeño de genes, es indispensable para la vida celular porque codifica 13 proteínas integrantes de los complejos respiratorios mitocondriales. Sin embargo, las mitocondrias no son autónomas ya que tanto la formación del orgánulo como la expresión de su genoma dependen de un gran número de proteínas codificadas en el núcleo, que son sintetizadas en los ribosomas citoplásmicos e importadas a la mitocondria. La biogénesis de las mitocondrias representa pues un caso único en la célula ya que su formación está bajo el control de los dos sistemas genético celulares: el nuclear y el mitocondrial.

La existencia de un sistema genético en el citoplasma empezó a intuirse a finales de los años 40 al descubrirse unos mutantes de levadura con deficiencias en las funciones respiratorias que eran debidas a un factor citoplásmico, no nuclear, y que era hereditario (2). El ADN mitocondrial se descubrió en los años 60 (3), y desde entonces se ha ido obteniendo una imagen muy detallada de su estructura así como de su relación con determinadas patologías. Se conoce la secuencia nucleotídica completa de muchas especies de animales vertebrados e invertebrados, aunque el sistema genético mejor estudiado es el humano.

El sistema genético mitocondrial presenta una serie de caracteres particulares como son la utilización de un código genético propio con algunas desviaciones con respecto al universal, la existencia de una alta velocidad de mutación, su transmisión por herencia materna, no-mendeliana, y la organización y expresión de sus genes (4-9). Asimismo, desde que en 1988 se describió por primera vez mutaciones en el ADN mitocondrial que podían causar enfermedades degenerativas humanas con deficiencias en la producción de ATP (10-

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12), el estudio de la bioenergética y genética mitocondrial ha adquirido nuevas dimensiones (13-15).

SISTEMA GENÉTICO MITOCONDRIAL HUMANO

Estructura y organización del ADN mitocondrial humano

Las células humanas contienen de 1.000 a 10.000 copias de ADN mitocondrial dependiendo de los tejidos; las plaquetas tienen unas cuatro y los oocitos unas 10.000. El ADN mitocondrial humano es una molécula duplohelicoidal circular cerrada que consta de 16.569 pares de bases (pb) cuya secuencia se conoce en su totalidad (16,17). Este ADN codifica 37 genes que corresponden a dos ARN ribosómicos (rARN) componentes de los ribosomas mitocondriales (rARNs 12S y 16S), 22 ARNs de transferencia (tARNs), y 13 polipéptidos componentes de los complejos respiratorios de la membrana interna mitocondrial (sistema OXPHOS). De estos polipéptidos, siete forman parte del complejo I (subunidades ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 y ND6) ; uno corresponde al apocitocromo b del complejo III; tres subunidades, COI; COII y COIII al complejo IV; y dos son las subunidades 6 y 8 de la ATPasa (complejo V) (18-20). El resto de las subunidades polipeptídicas de estos complejos están codificadas por el ADN nuclear.

Una de las características mas sorprendentes del ADN mitocondrial es que presenta una organización genética extremadamente compacta. Como se puede observar en la Figura 1 donde se muestra el mapa genético y de transcripción del ADN mitocondrial humano, éste se encuentra prácticamente saturado por genes. La cadena pesada (H) del ADN codifica los 2 rARNs, 14 tARNs y 12 polipéptidos, mientras que la cadena ligera (L) contiene solamente información para 8 tARNs y un polipéptido (ND6). La única zona del ADN que no codifica ningún gen es un pequeño fragmento que corresponde al 7% del ADN, localizado alrededor del origen de replicación de una de las cadenas y que incluye el bucle de desplazamiento (bucle D). Todos estos genes carecen de intrones. Los genes, en la cadena pesada, se disponen uno a continuación del otro, sin tramos no codificantes intermedios (16). Además, la mayor parte de genes codificantes de proteínas carecen de un codon de terminación. Estos presentan una T o TA después del último codon con sentido y preceden al extremo 5' del gen adyacente. El codon de terminación UAA del mARN se

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forma postranscripcionalmente por poliadenilación del extremo 3' como veremos mas adelante.

Otra de las peculiaridades de la organización genética del ADN mitocondrial es la distribución de los genes de los tARNs a lo largo de la secuencia del ADN. En la cadena pesada, estos separan casi con absoluta regularidad los genes de los rARNs y los codificantes de proteínas. Esta disposición tendrá consecuencias muy importantes para el procesamiento del ARN(16).

Replicación del ADN mitocondrial

El mecanismo exacto de replicación de ADN mitocondrial en animales es una materia controvertida desde hace unos años. Durante décadas se consideraba que la replicación sucedía por un modelo de desplazamiento de las cadenas con dos orígenes de replicación, una para la cadena pesada y otra para la ligera. Más recientemente en lo últimos años se ha propuesto un modelo alternativo con un solo origen de replicación, a su vez con dos variantes que lo explican; una conocida como replicación acoplada y otra conocida como RITOLS, que luego explicaremos.

Modelo de desplazamiento de las cadenas

En este modelo, la síntesis del ADN mitocondrial es unidireccional, asimétrica (21) y requiere dos orígenes de replicación diferentes, uno para la cadena pesada (OH), que se

localiza en la región del bucle de desplazamiento (bucle-D), y otro para la cadena ligera

(OL), situado entre los genes de los tARNCys y tARNAsn a dos tercios de la longitud total

del genoma respecto a OH (22) (Figura 1). La región del blucle-D carece de secuencias

codificantes, se extiende entre los genes de los tARNs prolina y fenilalanina (1122 pb), y contiene, además del origen de replicación, los promotores de la transcripción de las dos cadenas y las secuencias de regulación (23). La replicación comienza con la síntesis de un pequeño ARN iniciador, formado por procesamiento de un ARN transcrito a partir del promotor de la cadena ligera, que se prolonga por la acción de la ADN polimerasa gamma específica de la mitocondria. La transición de síntesis de ARN a síntesis de ADN se produce previa acción de una endorribonucleasa específica que corta el ARN precursor originando el extremo 3' del ARN iniciador que actúa como sustrato para su extensión por la ADN polimerasa. La replicación comienza con la síntesis de un segmento corto de cadena H (ADN 7S de 680 nt) (24), que permanece unido al ADN molde, desplazando la cadena H y formando una triple hélice (bucle-D).

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La elongación de la cadena H hija lo hace de forma unidireccional a lo largo de la cadena L, al tiempo que desplaza la cadena H parental. La replicación de la cadena L requiere la acción de una primasa específica y solo comienza cuando el desplazamiento de la cadena H ha dejado la zona del origen de replicación OL como cadena sencilla. La

síntesis de la cadena ligera hija termina después que la de la cadena pesada (22,25,26)).

Modelo acoplado y RITOLS.

Estos modelos se deben al trabajo del grupo Holt mediante estudios con electroforesis bidireccional en agarosa. En ellos se observaba la presencia de intermediarios de replicación de doble cadena procedente de un único punto de replicación conocido como OriZ diferente en posición al OH y OL del modelo anterior. La replicación era bidireccional (27-31).

Más adelante se comprobó la existencia de ribonucleótidos en los dúplex intermediarios explicándose la existencia de éstos por la existencia de fragmentos de Okazaki en la replicación del ADN mitocondrial dando lugar al modelo RITOLS (incorporación de ribonucleótidos a lo largo de la cadena retrasada). En este modelo a partir del mismo punto de replicación existe una replicación unidireccional con una cadena conductora y otra retrasada.

Nucleoides

La replicación del ADN mitocondrial está producida por varios factores de transcripción y de replicación codificados en el núcleo. Éstos junto con moléculas de ADN se empaquetan en lo que se conoce como nucleoide que tiene unos 70 nm de diámetro. En estos nucleoides hay alrededor de treinta proteínas diferentes muy conservadas entre especies. Existe un modelo estructural propuesto para los nucleoides en el que un núcleo central estaría compuesto por proteínas que participan en la síntesis de ácidos nucléicos mientras que las proteínas de ensamblaje estarían en la periferia. Hay un debate sobre el número de moléculas de ADN que participan en un nucleoide, manejándose cifras que van desde 2 hasta 15 moléculas de ADN por estructura (32,33).

Transcripción del ADN mitocondrial y procesamiento del ARN

Las particularidades que presenta la estructura genética y organización del mtADN se reflejan también en su modo de expresión. Las dos cadenas del ADN se transcriben completa y simétricamente (Figura 1). Los productos de transcripción del ADN

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mitocondrial humano que han sido aislados incluyen los 2 rARNs (rARN 12S y 16S), un ARN precursor de los mismos, 22 tARNs y 18 ARNs poliadenilados en el extremo 3' (poli(A)-ARNs), la mayoría de los cuales corresponden a los ARN mensajeros (mARNs) (34,35). La mayor parte de los ARNs maduros corresponden a un único gen. Solamente dos de ellos, los mARNs de los genes para las subunidades 6 y 8 de la ATP sintasa y ND4 y 4L, contienen dos genes cada uno con el marco de lectura solapado. Los tres poli(A)-ARNs mayores (ARNs 1, 2 y 3), el menor (ARN 18) y 8 tARNs son productos de transcripción de la cadena ligera del ADN mitocondrial mientras que el resto de los ARNs lo son de la cadena pesada (Figura 1).

El análisis estructural de los ARNs mitocondriales ha mostrado unas características muy particulares. Así, los rARNs se caracterizan por estar metilados, aunque el grado de metilación es mas bajo que el de los rARNs citoplásmicos, y por estar oligoadenilados en su extremo 3' con 1 a 10 adeninas no codificadas en el ADN (36,37). Los tARNs tienen un tamaño que varia entre 59 y 75 nt son, por tanto, mas pequeños en general que sus homólogos del citoplasma o de procariotas. La estructura de los tARNs mitocondriales presenta numerosas desviaciones con respecto al modelo considerado como invariable de los sistemas no mitocondriales. Así, la mayoría de los tARNs carecen de los nucleótidos constantes y el tamaño del bucle "DHU" varia considerablemente llegando incluso a

desaparecer en el tARNSerAGY (38,39). La única región que ha conservado las

características generales de los tARNs, aparte del extremo -CCA, no codificada en el ADN,

es la región del anticodón. Con la excepción del tARNSerAGY, todos los tARNs

mitocondriales pueden plegarse en la característica hoja de trébol. Los tARNs mitocondriales juegan además un papel muy importante en el procesamiento de los precursores de ARN.

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Figura 1.- Mapa genético y de transcripción del ADN mitocondrial humano

Los dos círculos interiores representan las dos cadenas del ADN mitocondrial con los genes que codifican: rARNs (rARNs 12 S y 16 S), tARNs, indicados con la abreviatura del aminoácido que les corresponde, y secuencias codificadoras de proteínas (ND: subunidades de NADH deshidrogenas; cyt b: apocitocromo b; CO: subunidades citocromo C oxidasa). La posición de los ARNs está indicada en los círculos exteriores con barras negras (transcritos de la cadena pesada) y con barras abiertas (transcritos de la cadena ligera). H1,

H2 y L indican los lugares de iniciación de la transcripción de la cadena pesada y ligera,

respectivamente. OH y OL simbolizan el origen de replicación de la cadena pesada y ligera.

Las flechas exteriores indican la dirección de la transcripción de la cadena pesada y ligera respectivamente. Las flechas al lado de OH y de OL muestran la dirección de síntesis de la

cadena pesada y ligera.

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El ADN mitocondrial humano contiene 13 genes que codifican polipéptidos con un tamaño que varía de 70 a 610 aminoácidos. En las mitocondrias de células HeLa se han aislado e identificado, entre los poli(A)-ARNs, 10 mARNs que corresponden a los 12 polipéptidos codificados en la cadena pesada (dos de ellos contienen 2 marcos de lectura solapados). Estos mARNs contienen exclusivamente la secuencia del patrón de traducción y una cola de unos 55 adenosinas en el extremo 3'. Los mARNs mitocondriales humanos comienzan directamente por el codon de iniciación AUG, AUA o AUU o tienen muy pocos nucleótidos (1 a 3) delante de los mismos. Carecen por tanto de uno de los caracteres típicos de los mARN de otros sistemas, como es la presencia de un tramo no codificante en el extremo 5' (40). Tampoco contienen la estructura "cap" en el extremo 5' (41). Asimismo, el extremo 3' de la mayor parte de los mARNs carecen de una región no codificante y finalizan con un codon de terminación incompleto U o UA (42). La poliadenilación juega un papel muy importante y, en particular, la adición postranscripcional de la cola de poli(A) genera en la mayor parte de los casos el codon de terminación UAA. No existe ninguna secuencia en común cerca del extremo 3' que pueda actuar como señal de la poliadenilación, como sucede en los mARN nucleares.

Figura 2.- Nucleoide de ADNmt.

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La síntesis de ARN se inicia en tres lugares diferentes, uno en la cadena ligera (L) y dos en la cadena pesada (H1 y H2), situados cerca del origen de replicación, dando lugar a

dando lugar a tres moléculas policistrónicas largas que se procesan posteriormente por cortes endonucleolíticos precisos delante y detrás de los tARNs, dando lugar a los rARNs, tARNs y mARNs maduros (23,34,40,42). De acuerdo con este modelo que se denomina de "puntuación por el tARN", las secuencias de los tARNs situadas entre los genes de los rARNs y mARNs, actúan como señales de reconocimiento para los enzimas de procesamiento al adquirir la configuración en hoja de trébol en las cadenas nacientes de ARN. Para la transcripción del mtADN se requiere una ARN polimerasa (43) y dos factores de iniciación de la transcripción (mtTFA y mtTFB) (44-46).

La cadena pesada se transcribe mediante dos unidades de transcripción solapadas en la región de los rARNs (34). La primera de ellas, que se transcribe muy frecuentemente, comienza en el lugar de iniciación H1, situado unos 19 nt por delante del gen para el

tARNPhe, termina en el extremo 3' del gen para el rARN 16S y es responsable de la síntesis

de los rARNs 12S y 16S, del tARNPhe y del tARNVal. Un factor de terminación mTERF actúa uniéndose en una secuencia inmediatamente posterior al gen del rARN 16S, situada

en el gen del tARNLeu (47-50). El segundo proceso de transcripción, mucho menos frecuente que el anterior, comienza en el punto de iniciación H2, cerca del extremo 5' del

gen rARN 12S, se extiende más allá del extremo 3' del gen rARN 16S y produce un ARN policistrónico que corresponde a casi la totalidad de la cadena pesada. Los mARNs de 12 péptidos y 12 tARNs se originan por procesamiento de este ARN policistrónico. Este modelo de transcripción muestra asimismo un mecanismo por el cual se puede producir una regulación en la transcripción diferencial de los rARNs y de los mARNs (34).

La cadena ligera se transcribe mediante una única unidad de transcripción que empieza en el lugar de iniciación L, cerca del extremo 5´ del ARN 7S (poli(A)-ARN 18), dando lugar a 8 tARNs y al único mARN (ND6) codificado en esa cadena. El inicio de la síntesis de ADN depende también de la actividad de esta unidad de transcripción, como se ha mencionado anteriormente.

Traducción del ADN mitocondrial

Los mARN mitocondriales traducen su mensaje en un sistema de traducción propio de la mitocondria con ribosomas específicos. Los componentes de los ribosomas mitocondriales están codificados por los dos sistemas genéticos de la célula. Así, mientras que los rARNs están codificados en el ADN mitocondrial, las proteínas ribosómicas lo

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están en el genoma nuclear. El coeficiente de sedimentación de los ribosomas mitocondriales es de 55S, con subunidades de 28S y 39S, que contienen 33 y 52 proteínas respectivamente (51,52). Se conocen factores de iniciación, elongación y de terminación de la síntesis de proteínas.

El código genético utilizado por la mitocondria para traducir sus genes presenta algunas diferencias muy significativas con respecto al código universal. Así, el codon UGA codifica triptófano en lugar de ser uno de los codones de terminación. Asimismo, la mitocondria humana, además de AUG, utiliza AUA y AUU como codones de iniciación, mientras que AGA y AGG, codones de arginina en el código universal, son señales de terminación. Reciente mente se ha propuesto que los codones AGA y AGG no actúan directamente como codones de terminación sino que producen un movimiento del ribosoma de un nucleótido hacia atrás encontrándose entonces con un codon de terminación característico del código universal (53).

Otra de las características particulares del sistema genético mitocondrial es su inusual reconocimiento de codones, que permite la lectura del código genético con solo los 22 tARNs codificados en el mtADN. Cada una de las 8 familias del código con 4 codones para un aminoácido son leídas por un solo tARN, mientras en las otras 6 familias se siguen utilizando 2 tARNs para leer los codones de cada familia (54,55). De esta forma 24 tARNs son suficientes para traducir el código genético mitocondrial.

GENETICA MITOCONDRIAL

El sistema genético mitocondrial presenta unas características genéticas que lo diferencial del nuclear (7).

Herencia materna. El ADN mitocondrial se hereda con un patrón vertical, no mendeliano,

transmitido exclusivamente por vía materna. La madre trasmite el genoma mitocondrial a todos sus hijos; por tanto, solamente las hijas lo trasmitirán a todos los miembros de la siguiente generación y así sucesivamente.

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El ADN mitocondrial es poliploide y durante la división celular las mitocondrias se distribuyen al azar entre las células hijas (segregación mitótica). Todas las células de un individuo normal tienen el mismo ADN mitocondrial, es decir son homoplásmicas. Sin embargo, en la célula pueden aparecer moléculas de ADN mitocondrial mutadas que pueden afectar a todas las moléculas (homoplasmia para la mutación) o que pueden coexistir con el ADN normal (heteroplasmia). Con la división celular el fenotipo de una línea celular determinada puede variar dando lugar a tres posibles genotipos diferentes: homoplásmico para el ADN mitocondrial normal, heteroplásmico y homoplásmico para el ADN mutado. El fenotipo de una célula con heteroplasmia dependerá del porcentaje de ADN dañado que exista en la célula, es decir del grado de heteroplasmia. Si número de moléculas de ADN mutadas es pequeño se producirá una complementación de la función

Figura 3.- Modelos de replicación

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con las moléculas de ADN normal y no se manifestará el defecto genético. Sin embargo, al aumentar el porcentaje de ADN mutado se hará patente un fenotipo patogénico. Es decir, el fenotipo se manifiesta de acuerdo con un efecto umbral. Si la producción de ATP llega a estar por debajo de los mínimos de energía necesarios para el funcionamiento de los tejidos debido a la presencia de mitocondrias defectuosas se produce la aparición de la patogenicidad.

Otra de las características particulares de la genética mitocondrial es que tiene una gran tendencia a mutar siendo la tasa sustitución de nucleótidos unas 10 veces superior a la del ADN nuclear (56). Como consecuencia de esto, hay una gran variación de secuencias entre especies e incluso entre individuos de una misma especie. Se puede calcular que dos individuos tienen al menos unos 50-70 nt de diferencia en su secuencia. Además de estas diferencias, en un individuo determinado se esta produciendo continuamente, a lo largo de la vida, una heterogeneidad en el mtADN como consecuencia de las mutaciones que se están originando en sus células somáticas. Por tanto, es posible que una acumulación de este daño mitocondrial sea la causa de la disminución en la capacidad respiratoria de los tejidos que tiene lugar en el envejecimiento (57).

La gran variación existente en la secuencia del mtADN de diferentes individuos se está utilizando hoy en día para estudios acerca de la filogenia y estructura de las poblaciones. Los datos disponibles son coherentes con los siguientes puntos (58,59): 1) Las mutaciones se van acumulando de un modo secuencial en la radiación de de las diferentes lineas maternas; 2) La variación del mtADN correlaciona con el origen ético y la distribución geográfica de los individuos; 3) Existe un único árbol mitocondrial humano, cuyas ramas se dividen en los diferentes continentes, indicando que el origen del homo sapiens es único; 4) La variación actual es mayor en África, seguida de Asia, Europa y finalmente América. Ello implica que el homo sapiens se originó en África (hace unos 300.000 años de acuerdo con el ritmo de evolución y asumiendo un "reloj molecular"), luego emigró a Asia y Europa y finalmente llegó (recientemente, hace unos 30.000 años) a América. El origen africano de la rama actual de la especie humana se ha visto confirmado recientemente mediante estudios de locus altamente polimórficos del cromosoma Y.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido subvencionado por ISCIII – FIS PI 10/00662.

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