01. Cont Adores Automatizacion de Celulas Sanguine As

Laboratorio de Anlisis Biolgico

Dr. Pedro Mercado Martnez

CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CLULAS SANGUNEAS

I.

INTRODUCCIN

A mediados del siglo XX se empezaron a disear los primeros contadores automatizados, ahora estos mtodos semiautomticos o manuales tradicionales (que siguen siendo los de referencia) han sido sustituidos por otros ms ventajosos, los instrumentos automticos, tanto del punto de vista de la rentabilidad, fiabilidad y condiciones de trabajo, como son los contadores electrnicos, que permiten realizar el hemograma a partir de sangre total anticoagulada con EDTA tripotsico y que son capaces de analizar miles de clulas en pocos segundos .

El desarrollo y adaptacin de diversas tecnologas ha generado una gran variedad de parmetros celulares, desde aquellos que contaban nicamente glbulos rojos y blancos hasta el utilizado hoy en da, capaz de medir 22 parmetros hematolgicos diferentes, incluyendo el recuento diferencial de las clulas blancas y reticulocitos. Algunos son muy tiles; otros tienen que demostrar aun su valor; sin embargo, existen varias aplicaciones interesantes de las nuevas tecnologas. La mayora de los contadores diferenciales automatizados actualmente disponibles utilizan la Citometra de Flujo incorporada en un contador de sangre total en vez de ser nicamente contadores diferenciales. Cada vez ms, los contadores automatizados de clulas sanguneas tienen la capacidad de realizar un recuento diferencial, proporcionando ya sea un recuento diferencial de tres componentes o de cinco a siete componentes.

Los recuentos de leucocitos se realizan en sangre completa diluida en la que los eritrocitos se han lisado o se han vuelto transparentes. Un recuento diferencial de tres componentes asigna las clulas a las categoras denominadas habitualmente: a) granulocitos o clulas grandes; b) linfocitos o clulas pequeas y c) monocitos, clulas mononucleares o clulas intermedias.

Las tecnologas utilizadas para estudiar las caractersticas de la clula incluyen la dispersin lumnica, las mediciones de la absorbancia y de la impedancia con corrientes de radiofrecuencia. Las clulas pueden haber estado expuestas a agentes lisantes o a reacciones citoqu micas que hayan ocurrido antes del estado de las caractersticas de la clula.1



Los recuentos automatizados son por consiguiente, mucho ms precisos que los recuentos manuales. En todos los tipos de contadores, las caractersticas celulares inusuales o el envejecimiento de una muestra sangunea pueden producir una mala clasificacin de las clulas.

En general, los recuentos automatizados resultan favorecidos al compararlos con los recuentos manuales de rutina, especialmente si a los instrumentos se les asignan solamente dos funciones: la realizacin de recuentos diferenciales en muestras normales y la sealizacin marcada de muestras anmalas. Si se sealan anomalas morfolgicas, se debe realizar siempre el examen microscpico de la extensin sangunea teida. La medida de la concentracin de las clulas sanguneas circulantes (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) suele realizarse simultneamente con la del tamao (volumen celular).

Para ello, los analizadores hematolgicos automatizados utilizan las variaciones que ejercen las clulas cuando atraviesan un campo electromagntico. Estas variaciones son captadas por detectores colocados estratgicamente y son procesadas para obtener los correspondientes datos tanto cuantitativos (recuento) y que comprende el recuento de glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas, cuantificacin de la hemoglobina, medicin del hematocrito y el clculo de las ndices eritrocitarios y otro cualitativo (frmula) que es la identificacin microscpica o automatizada de los diferentes tipos de leucocitos y su expresin en valores porcentuales y en nmeros absolutos que luego se expresan en tablas, histogramas y citogramas.

Todo equipo automatizado, suministra dos tipos de resultados: un informe numrico y un informe grafico (histogramas), y ambos poseen un software que contiene toda la informacin utilizando abreviaturas en ingles de utilidad en el informe numrico (es recomendable encontrar valores de referencia propios para cada poblacin en estudio).

2



II.

PRINCIPIOS HEMATOLOGA

GENERALES

DEL

EQUIPAMIENTO

EN

Impedancia electrnica El principio de impedancia en el recuento de clulas se basa en la deteccin y la medicin de cambios en la resistencia elctrica producida por las clulas cuando atraviesan una apertura pequea. El nmero de pulsos es proporcional al nmero de clulas contadas. El tamao del pulso de voltaje es directamente proporcional al tamao (volumen) de la clula, lo que permite la discriminacin y el conteo de clulas de tamao especfico mediante el uso de circuitos umbrales.

Fig. 1 Principio para el recuento celular.

Los pulsos se renen y ordenan (canalizan) segn su amplitud mediante analizadores de la altura de los pulsos. Los datos se trazan en un grfico de distribucin de frecuencias, o histograma de distribucin del tamao, con el nmero relativo en el eje Y y el tamao en el eje X. el histograma producido representa la distribucin de frecuencias. Los umbrales de tamao separan las poblaciones celulares en el histograma, y el recuento corresponde a las clulas cuantificadas entre los umbrales fijos, inferior y superior, para cada poblacin.

3



Fig. 2. Histograma que muestra la construccin de un grfico de distribucin de frecuencia.

El uso de reactivos lticos para controlar la contraccin y la lisis de tipos celulares especficos, permite separar y cuantificar a los leucocitos en sangre en tres poblaciones (linfocitos, clulas mononucleares y granulocitos) para el recuento diferencial de tres componentes sobre un histograma de distribucin del tamao.

El tamao de la apertura es crtico; para los eritrocitos y las plaquetas (PL) es ms pequeo que para la apertura de los leucocitos para aumentar la sensibilidad del recuento plaquetario. La acumulacin de protenas en la apertura disminuye el tamao del orificio, lo que reduce el flujo de clulas y aumenta la resistencia elctrica a medida que las clulas pasan. Esto produce recuentos celulares ms bajos con volmenes celulares con elevaciones falsas. El pasaje coincidente de ms de una clula en un momento dado a travs del orificio causa pulsos artificiales grandes, lo que produce volmenes celulares aumentados falsos y recuentos celulares disminuidos falsos.

Otros factores que afectan la altura del pulso son la orientacin de la clula en el centro de la apertura y la capacidad de deformacin de los eritrocitos, que puede alterarse por la diminucin en el contenido de hemoglobina. La recirculacin de las clulas hacia atrs en la zona de sensores crea pulsos errneos y proporciona recuentos celulares con elevaciones falsas. Se agreg un mecanismo de retrolavado o flujo de barrido para

4



prevenir la circulacin retrgrada de las clulas en la zona sensora y se elimina en forma electrnica los pulsos anmalos.

La correccin de la coincidencia se completa por el analizador de la computadora antes del registro impreso final de los recuentos celulares del equipo. El uso del centrado hidrodinmico evita muchos de los problemas inherentes a un sistema de apertura rgido. La corriente de la muestra est rodeada por un lquido de cubierta a medida que atraviesa el eje central de la apertura. El flujo laminar permite que la corriente central de la muestra se estreche lo suficiente para separar y alinear las clulas en una sola hilera para el pasaje a travs de la zona de sensores.

Radiofrecuencia La impedancia de CC de bajo voltaje puede utilizarse junto con la resistencia de RF, o corriente electromagntica de alto voltaje que fluye entre ambos electrodos, al mismo tiempo. Por cuanto el volumen total de la clula es proporcional al cambio en la corriente continua, la densidad interna celular (volumen nuclear, etc) es proporcional al tamao del pulso o el cambio en la seal de RF. Los cambios de voltaje de la CC y la RF pueden detectarse en forma simultnea y separarse por accin de dos circuitos de procesamiento de pulsos diferentes.

Pueden graficarse en forma comparativa dos propiedades celulares diferentes, como la impedancia y la conductividad, para la formacin de un citograma de distribucin bidimensional o un trazado de dispersin. Estos trazados muestran las poblaciones celulares como cmulos con el nmero de puntos en cada uno que representa la concentracin de este tipo de clula. Luego el anlisis computarizado del cmulo puede determinar los recuentos absolutos para poblaciones celulares especficas. El uso de varios mtodos en un equipo dado para la determinacin de por lo menos dos propiedades celulares permite la separacin diferencial de los leucocitos en cinco componentes (neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos).

5



Fig. 3. Ilustracin de la medicin del tamao y volmen celular con cambio de voltaje de la CC en comparacin con la medida del volmen y complejidad del ncleo celular con cambio de seal de RF. Las dos mediciones pueden trazarse comparadas entre s para la formacin de un trazado de dispersin de la distribucin bidimensional.

Dispersin ptica La dispersin ptica puede utilizarse como la metodologa primaria o en combinacin con otros mtodos. En los sistemas de dispersin ptica, una suspensin de clulas diluidas fluye a travs de una abertura de forma que las clulas pasan en fila india delante de una fuente lumnica; la luz se dispersa debido a las clulas que atraviesan el rayo de luz. Por lo general la fuente de luz es una lmpara de tungsteno o un lser de helio o nen. La luz lser, denominada luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda), posibilita la cuantificacin y la diferenciacin de tipos celulares (leucocitos, eritrocitos y plaquetas).

Fig. 4. Sistema de dispersin ptica de luz lser. 6



A medida que las clulas atraviesan la zona sensora e interrumpen el haz, la luz se dispersa en todas las direcciones. La luz dispersa como resultado de la interaccin entre los procesos de absorcin, difraccin (es un fenmeno fsico caracterstico que consiste en el curvado y esparcido de las ondas cuando encuentran un obstculo al atravesar una clula), refraccin (es el cambio de direccin que experimenta la luz laser al pasar de un medio a otro) y reflexin (es el cambio de direccin de la luz que ocurre al chocar con una clula, el cual se regresa a causa de la obstruccin).

La deteccin y la conversin de los rayos dispersados en seales elctricas se logran mediante fotodetectores (fotodiodos y tubo fotomultiplicador TFM) en ngulos especficos. Para colectar la luz dispersa se utilizan lentes adaptadas con barras bloqueantes para evitar que la luz no dispersa ingrese en el detector. Una serie de filtros y espejos separa las longitudes de onda variables y las presenta a los fotodetectores.

Los fotodiodos convierten los fotones de la luz en seales electrnicas con una magnitud proporcional a la cantidad de luz captada. Se utilizan TFM para captar las seales ms dbiles producidas a un ngulo de 90 y se multiplican los fotoelectrones en seales tiles ms intensas. Los conversores analgicos y digitales cambian los pulsos electrnicos a seales digitales para el anlisis computarizado. La dispersin frontal de la luz (0) se correlaciona con el volumen celular o el tamao; debido sobre todo a la difraccin de la luz. La dispersin ortogonal de la luz (90), o dispersin lateral, es consecuencia de la reflexin de la luz proveniente de las estructuras ms grandes dentro de la clula y se correlaciona con el grado de complejidad. La dispersin total de la luz en ngulo bajo (2 a 3) y en ngulo alto (5 a 15) tambin se correlaciona con el volumen celular y el ndice de refraccin, o con la complejidad interna, respectivamente.

La dispersin ptica puede graficarse en comparacin con la absorcin, como en los sistemas Bayer o con respecto al volumen, como en los sistemas Coulter. El anlisis por computacin de los cmulos de los citogramas puede brindar informacin cuantitativa y cualitativa.

7



Fig. 5. Dispersin ptica celular, clasificacin celular multidimensional.

III.

INSTRUMENTOS PRINCIPALES PARA RECUENTO DE CLULAS

Equipamiento Sysmex Proporciona anlisis completos de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes. Para determinar el hemograma se utilizan tres subsistemas hidrulicos: el canal para eritrocitos, el canal para leucocitos y un canal separado para hemoglobina.

En las cmaras de leucocitos y eritrocitos, las muestras diluidas se aspiraren a travs de aperturas diferentes y se cuentan por medio del mtodo de la impedancia para el recuento y la determinacin del tamao celular. En los canales de eritrocitos y leucocitos se utilizan los umbrales flotantes para diferenciar cada poblacin celular.

En los equipos Sysmex podemos encontrar una diversa gama de series; el XS-1000i provee resultados rpidos y confiables de pruebas a partir de cantidades pequeas de muestra para la asistencia en el diagnstico y monitoreo teraputico de pacientes. Utiliza la misma tecnologa poderosa y exacta de los analizadores de alto volumen de la serie X (XE-2100, serie-XT).

8



El sistema XS-1000i incluye: XS-1000i: 32 cm de ancho x 40.39 cm alto x 41.40 cm profundidad; 23.95 kgms Computador y monitor integrados en uno Lector de cdigo de barras Impresora lser Auto muestreador (opcional) - 2.80 ancho x 40.0 cm alto x 35.5 profundidad; 10 Kg Especificaciones XS-1000i: Sistema operativo Windows XP Almacenamiento de muestras - 10,000 registros con dispersogramas Opcin de seleccin de perfiles - hemograma o hemograma + diferencial Reactivos y controles e-Check comunes con analizadores de la serie XT y XE.

Fig. 6. Imagen de un equipo Sysmex

Equipos Coulter Este equipo proporciona anlisis completo de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes. El equipo Coulter tiene dos canales de medicin en el sistema hidrulico para determinar los datos del hemograma. Se considera que los recuentos de eritrocitos y leucocitos, y la determinacin de hemoglobina se miden en forma directa. La muestra de sangre entera aspirada se divide en dos porciones y cada una se mezcla con un diluyente isotnico.

9



La primera dilucin se entrega a la cmara de eritrocito y el otro a la cmara de leucocitos. En el primer caso se cuentan los eritrocitos y plaquetas, y se diferencian por la impedancia elctrica a medida que las clulas pasan a travs de cada una de las tres aperturas con sensores. Las partculas entre 2-20 femtolitros (fL) se cuentan como plaquetas y las dems de 36 fL, como eritrocitos. En la cmara de leucocitos, se agrega un reactivo para lisar los eritrocitos y liberar la hemoglobina antes de contar los leucocitos en forma simultnea. Despus de que se completan los ciclos de recuento, la dilucin de leucocitos pasa a hemoglobina (lectura que se hace a 525 nm). Los pulsos elctricos generados en los ciclos de conteos se envan al analizador para la revisin.

Las partculas entre 35 y 90 fL se consideran como linfocitos, entre 90 y 160 fL mononucleares (monocitos, blastos, granulocitos inmaduros y linfocitos atpicos) y entre 160 y 450 fL, granulocitos, de esta forma es posible realizar el clculo de las cifras relativas absolutas de estas tres poblaciones.

Fig. 7. Imagen de un equipo Coulter

10



MTODOS PARA LA DETERMINACIN DEL HEMOGRAMA EN LOS CUATRO EQUIPOS DE HAMATOLOGA MS IMPORTANTESCompaa Modelo Cell-Dyn 3500 Abbot Cell-Dyn 4000 + Sapphire Tecnologa Dispersin de la luz. Dispersin de la luz y recuento de eritrocitos posterior a la unin con el colorante fluorescente. Advia 60 Bayer ADVIA 120, 2120 H1 H2 Y H3 AcT 5 diff Beckman Coulter GEN-S + LH750 Impedancia electrnica. Dispersin de la luz. Impedancia electrnica. Impedancia electrnica. Dispersin de la luz. Impedancia electrnica. Impedancia con radiofrecuencia. Impedancia electrnica. XE 2100 Impedancia con radiofrecuencia. Dispersin de la luz.

SE 9000 Sysmex

11



IV.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Rodack F. Hematologa: fundamento y aplicaciones clnicas. 2 ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 2004. 2. Crocker J, Burnett D. La ciencia del diagnstico de laboratorio. 2 ed. Espaa: Mc Gan Will, 2007. 3. Lewis S, Bain B, Bates L. Hematologa prctica. 10 ed. Espaa: Elsevier; 2008

12

01. Cont Adores Automatizacion de Celulas Sanguine As

Documents

Transcript of 01. Cont Adores Automatizacion de Celulas Sanguine As