En las primeras décadas de los 1900, los virus se cultivaban en animales. El ratón y los monos eran hospederos comunes.

Huevos embrionados inoculados con virus

1949 Enders, Weller & Robins : Premio Nobel 1954. Cultivaron virus en monocapas de células de tejido embrionario.

1951 Hopkins,J. : Cultiva línea celular inmortalizada de Henrietta Lacks que sufría de cáncer cervical. Creación de células HeLa.

En platos petri ó frascos:

Célula 1ria continua: tejido se segrega

Ej. Fibroblastos

Línea celular diploide W1-38 de pulmón

Línea de epitelio humano ( HeLa)Línea 1ria de prepucio humanoLínea de fibroblastos de ratón

!Una forma sería estudiando el efectocitopático! (ECP)Esto se refiere a los cambios que el

virusprovoca en las células. Puede ser en el

núcleo ó en el citoplasma.

Células redondeadasMás espacios entre ellasGrumos y comenzar a sufrir lisisFormación de un *Sincicio

* célula grande con muchos núcleos por la fusión de células

En Herpes: proliferación en membrana celular , vacuolas en el citoplasma y rompimiento de cromosomas en la célula que infecta

En Polio: Vacuolas en el citoplasmaEn Picornavirus, Rhabdovirus,

Adenovirus y Herpes: Redondeo y desprendimiento de las células

1930 Ensayo de placas: Permite estudiar la multiplicación de bacteriófagos

1975 Dulbecco,R. Premio Nobel: los virus /animales forman placas

de una manera similar.

Preguntas guías: ¿cuántos Virus? ¿cómo se miden?

PFU= unidades formadoras de placas

# de placas X factor de diluciónEj. 17 placas X 10^6PFU= 1.7 x 10^8

Cinética de 1 hit= 1 partícula viral es suficiente para formar 1 placa. # de placas es proporcional directamente a la concentración del virus.

Cinética de 2 hits= se necesitan 2 partículas para hacer una placa.

NO siempre los virus forman placas… entonces…

Se puede medir el TCID 50 : mide muerte de las células en placas de 96 pozos.

Se hacen 10 monocapas de cultivos celulares y se infectan con diluciones del virus para identificar el efecto citopático en la mitad de los cultivos. En las diluciones bajas, todos los cultivos son infectados.

http://www.virology.ws/2009/07/13/measurement-of-viruses-by-end-point-dilution-assay/

#de partículas virales muestra/ # de partículas infecciosas

Hemaaglutiinación: Se mezclan eritrocitos con ciertos virus como el de la Influenza y se unen causando aglutinación.

Inmunotinción: inmunofluorescencia Directa e Indirecta

Directa: Ag viral-Abs específicos-fluorocromo

Indirecta: Es más específica porque usa un 2do anticuerpo.

Ag viral-Abs 1rios-Abs2rios-fluorocromo

http://www.virology.ws/2010/09/30/detecting-viral-proteins-in-infected-cells-or-tissues-by-immunostaining/

Para detectar proteínas virales en el suero muestra clínica , se usan Abs contra laProteína viral . Se acoplan a placas de 96 pozos Se añade la muestra clínica y si laproteína

viral está presente, al añadir un Abs 2rio ésta se une al anticuerpo que a su vez esta conjugado a una enzima como la peroxidasa de rábano y a un sustrato.

http://www.virology.ws/2010/07/16/detection-of-antigens-or-antibodies-by-elisa/

Separa las proteínas en geles de poliacrilamida

http://www.youtube.com/watch?v=pnBZeL8nFEo

Si un virus infecta celulas, es posible separar las proteínas virales acopladas a

anticuerpos específicos para esas proteínas en una gel de poliacrilamida con

electroforesis. La gel es transferida a una membrana con

afinidad a las proteínas separadas. La gel y la membrana son colocadas entre

papel absorbente para transferir las proteínas a la membrana por acción capilar.

http://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs

Se puede incubar la membrana con anticuerpos específicos para la proteína viral conjugados a una enzima como la peroxidasa de rábano.

Luego se incuba con un sustrato. Las proteínas pueden luego visualizarse

con “x-rays film”

Podría usarse un anticuerpo primario para que se una a la proteína en la membrana y luego añadir un anticuerpo 2rio dirigido al 1er anticuerpo.

Pase a ver diagrama disponible en el blog del Dr. V. Racaniello

http://www.virology.ws/2010/07/07/virology-toolbox-the-western-blot/

http://www.youtube.com/watch?v=8RBs0Ghg_48

http://www.youtube.com/watch?v=LNVdOdNQyCM

Separa DNA basado en tamañoSe transfieren fragmemtos de DNA a

gel de agarosaFragmentos pequeños se mueven

más rápido

Técnica de Polimerasa en cadenaPermite amplificar DNA y hacer

millones de copias de la molécula Ciclos:▪ Se eleva la temperatura a 95 grados para

separar cadenas o desnaturalizarlas▪ Se baja la temperatura a 60 grados para

permitir la unión de los “primers” de DNA. ▪ Lo s “primers”sirven de molde para que la

Taq DNA polimerasa añada nuevas secuencias al terminal 3’.. Esto a 72 grados.

2 cadenas de DNA doble hélice

Se repiten los pasos del ciclo 1 Desnaturalización a 95 grados Unión de los primers a 65 grados Síntesis de la polimerasas a 72 grados

4 cadenas de DNA

Se vuelven a repetir los ciclos anteriores

6 cadenas de DNA dovle cadena con terminal 3’ siempre más largo y 2 cadenas “molde”.

Repetición de pasosContinúa el proceso de amplificación8 moléculas de DNA y 8 primers

Al final de 30 ciclos habrán millones de copias del DNA “target”

http://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU

Pirosecuenciación se basa en controlar el flujo secuencial y

cíclico de nucleótidos sobre una placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo CCD.