Post on 02-Mar-2018
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
1/191
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS
Biolixiviacin de minerales sulfuro-ferroso en jales:aislamiento y caracterizacin de cultivos puros y mixtos
de microorganismos involucrados
TESIS
Que para obtener el grado deDoctor en Ciencias: rea Biotecnologa
Presenta
Argelia Jurez AlcarazArgelia Jurez Alcaraz
Asesores: Dr. Jos Gerardo Lpez Aguirre
Dr. Marcos Gustavo Monroy Fernndez
agosto de 2004
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
2/191
I
INDICE
Pgina
ndice de figuras Vndice de cuadros IXndice de plantillas XI
Abstract XVII
Resumen XVIII
I INTRODUCCIN 1
I.1 El problema 3
I.2 Hiptesis 4
I.3 Objetivo general 4
II. ANTECEDENTES 52.1 Microorganismos quimiolitotrficos presentes en los procesos de
biolixiviacin 5
2.2 Microorganismos heterotrficos presentes en los procesos de biolixiviacin 9
2.3 Sinergismo en bacterias acidoflcas 12
2.4 Lixiviacin microbiana 132.5 Mecanismos de accin bacteriana 15
2.6 Sustratos de energa 162.6.1 Pirita (FeS2) 16
2.6.2 Hierro 172.6.3 Azufre 18
III. MATERIALES Y MTODOS 21
3.1 Localizacin de las determinaciones analticas 213.2 Sitio de muestreo 21
3.3 Procesamiento de las muestras de suelo 22
3.4 Procesamiento de las muestras de agua 24
3.5 Proceso de muestras de jales 24
3.5.1 Medicin del contenido de humedad 253.6 Determinacin del pH de las muestras 25
3.7 Medios de cultivo para aislamiento de microorganismos en
condiciones de medio mnimo de crecimiento 27
3.7.1 Condiciones y adaptacin de los microorganismos en los sustratos 28
3.7.2 Aislamientos en medios slidos selectivos 303.8 Medicin del crecimiento celular 32
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
3/191
II
3.8.1 Cuantificacin de los microorganismos 32
3.9 Caracterizacin de cepas 343.10 Bioensayos 35
3.10.1 Determinacin de la actividad de los microorganismos en substratoestril y no estril 35
3.10.2 Crecimiento de los microorganismos aislados en el substrato con jal ydos diluyentes en diferentes condiciones 35
3.10.3 Oxidacin del ion Fe (II) a Fe (III) presentes en los jales a travs de loscultivos puros y mixtos 36
3.10.4 Oxidacin de los minerales sulfurosos presentes en los jales con cultivomixto de microorganismos 37
3.10.5 Capacidad oxidativa de la mezcla de microorganismos 383.11 Mediciones usadas para determinar la oxidacin de los minerales
sulfurosos 38
3.11.1 Determinacin de la acidez 383.11.2 Determinacin del in sulfato 40
3.11.3 Determinacin de Fe (II) y Total 413.11.3.1 Medicin del Fe(II) por titulacin 42
3.11.3.2 Medicin del Fe(II) con orto-fenantrolina 43
3.11.3.3 Determinacin del Fe total 45
3.11.4 Determinacin de protenas totales solubles 46
3.12 Observacin microscpica del crecimiento celular de las cepas aisladas 483.13 Determinacin de la concentracin de azufre durante la biolixiviacin 48
3.14 Biolixiviacin de los minerales sulfurosos de los jales 493.14.1 Condiciones experimentales 493.14.2 Diseo experimental 50
lV. RESULTADOS 534.1 Sitio de muestreo 53
4.2 Caracterizacin qumica de muestras de suelo 53
4.3 Caracterizacin fsico-qumica de muestras de agua 58
4.4. Determinacin de la humedad de muestras de jales 59
4.5 Caracterizacin qumica de jales 60
4.6 Determinacin del pH de jales y suelo 614.7 Aislamiento de microorganismos en condiciones de medio mnimo decrecimiento 62
4.8 Condiciones y adaptacin de microorganismos al substrato 64
4.8.1 Microorganismos quimiolitotrficos 644.8.2 Microorganismos heterotrficos 66
4.9 Caracterizacin fenotpica de cepas aisladas 69
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
4/191
III
4.10 Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de mineralessulfurosos 934.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril 93
4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados en elsubstrato con jales y diluyente distinto 97
4.10.3 Oxidacin de Fe (II) por cultivos mixtos y puros en presencia de jales 1024.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros y
mixtos 104
4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianas seleccionadas 108
4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores 108
4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias deTukey) 113
V. DISCUSION 119
VI CONCLUSIONES 127
VII. LITERATURA CITADA 129
VIII ANEXOS 151
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
5/191
V
ndice de figuras
Pgina
Figura 1. Diagrama de flujo de metodologas y experimentosutilizados en el proyecto.
23
Figura 2. Punto de equilibrio (P. E.) de las soluciones de hidrxido de
Fe y sulfato ferroso para determinar su acidez por el mtodo
de titulacin.
39
Figura 3. Curva de calibracin del in sulfato concentracin de 0
hasta 6 mg/L.
41
Figura 4. Formacin del complejo por la reaccin del in ferroso con
orto-fenantrolina.
43
Figura 5. Curva de calibracin del in Fe(II) realizada para medir la
concentracin por medio del espectrofotmetro con luz
visible.
44
Figura 6. Curva de calibracin realizada para medir la concentracin
de las protenas totales (Bradford, 1976).
47
Figura 7. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los
cultivos realizados en presencia de jales y sulfato ferroso.
66
Figura 8. Crecimiento de microorganismos quimiolitotrficos en los
cultivos realizados en presencia de jales y sulfato ferroso
(los valores son el resultados del promedio de tres
muestras).
67
Figura 9. Crecimiento de bacterias heterotrficas en medios de cultivo
orgnico e inorgnico FeSO4, S, y complementado con
extracto de levadura (los valores son el promedio de tres
muestras)
68
Figura 10. Crecimiento de hongos en medio de cultivo que contiene
Czapek y Sabouraud, flor de azufre y complementado con
extracto de levadura (los valores son el resultados del
promedio de tres muestras).
68
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
6/191
VI
Figura 11 Crecimiento de levaduras en medio de cultivo que contiene
Czapek y Sabouraud, flor de azufre ycomplementado con
extracto de levadura (los valores son el resultados del
promedio de tres muestras).
69
Figura 12 Evolucin de la concentracin de Fe (II) en el control en
condiciones estriles y no estriles.
95
Figura 13 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo puro
(Thiobacillus sp) en medio mnimo de sales (MMS).
95
Figura 14 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo mixto
en medio mnimo de sales.
96
Figura 15 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo puro
(Thiobacillus sp) en medio mnimo de sales, extracto delevadura y sulfato ferroso.
96
Figura 16 Evolucin de la concentracin de Fe (II) con el cultivo mixto,
en medio mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato
ferroso.
97
Figura 17 Evolucin de la concentracin de Fe (II) muestra de jales
con cultivo mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada
como diluyente: (1) control para el cultivo mixto; (2) con
extracto de levadura y cultivo mixto; (3) con extracto de
levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con
extracto de levadura y cultivo puro.
98
Figura 18 Evolucin de la concentracin de Fe (II), muestra de jales
con cultivo mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como
diluyente: (1) control para el cultivo mixto; (2) con extracto
de levadura y cultivo mixto; (3) con extracto de levadura y
consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) con extracto de
levadura y cultivo puro.
99
Figura 19 Evolucin de la concentracin de Fe (II), muestra de jales
con cultivo mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada
como diluyente: (4) cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo
100
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
7/191
VII
mixto, sulfato ferroso y extracto de levadura; (8) cultivo puro
y sulfato ferroso; (9) cultivo puro, extracto de levadura y
sulfato ferroso.
Figura 20 Evolucin de la concentracin de Fe (II), muestra de jales
con cultivo mixto y cultivo puro, empleando medio 9K como
diluyente: (4) cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto,
sulfato ferroso y extracto de levadura; (8) cultivo puro y
sulfato ferroso; (9) Cultivo puro, extracto de levadura y
sulfato ferroso.
100
Figura 21 Oxidacin de Fe(II) a Fe(III) y evolucin del crecimiento de
los microorganismos en cultivo puro (Thiobacillus sp.) y
cultivo mixto.
102
Figura 22 Cintica de la oxidacin de Fe (II) en presencia de jales con
cultivo mixto.
103
Figura 23 Cintica de crecimiento de microorganismos en el cultivo
mixto con sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente
de energa.
104
Figura 24 Crecimiento del cultivo puro de Thiobacillus sp en presencia
de sulfato ferroso y extracto de levadura, as como evolucin
en la concentracin de Fe (II) disuelto.
105
Figura 25 Crecimiento del cultivo puro de Penicillium sp en presencia
de sulfato ferroso y extracto de levadura, as como evolucin
en la concentracin de Fe(II) disuelto.
105
Figura 26 Crecimiento del cultivo puro de Rhodotorula sp en presencia
de sulfato ferroso y extracto de levadura, as como evolucin
en la concentracin de Fe (II) disuelto.
106
Figura 27 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de
Fe (II) para la mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp,
Penicillium sp y Rhodotorula sp.), utilizando sulfato ferroso
con extracto de levadura como fuente de energa.
106
Figura 28 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de 107
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
8/191
VIII
Fe (II) para la mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp,
Penicillium p y Rhodotorula sp.), utilizando sulfato ferroso
sin extracto de levadura como fuente de energa.
Figura 29 Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de
Fe (II) para la mezcla de microorganismos (Thiobacillus sp,
Penicillium sp y Rhodotorula sp.), sin fuente de energa
adicional, slo sulfuros presentes en jales.
108
Figura 30 Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad
microbiana durante la biolixiviacin de los jales en presencia
de sulfato ferroso como fuente de energa: (a) concentracin
de clulas en suspensin, (b) protenas totales; (c) pH; (d)
potencial rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfatodisuelto; (g) concentracin total de Fe disuelto; y (h)
concentracin total de ferroso disuelto.
110
Figura 31 Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad
microbiana durante la biolixiviacin de los jales en presencia
de sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente de
energa: (a) concentracin de clulas en suspensin; (b)
protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f)
concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de
Fe disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.
111
Figura 32 Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad
microbiana durante la biolixiviacin de los jales como nica
fuente de energa: (a) concentracin de clulas en
suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox;
(e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g)
concentracin total de Fe disuelto; y (h) concentracin total
de ferroso disuelto.
112
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
9/191
IX
ndice de cuadros
Pgina
Cuadro 1. Reacciones involucradas en el camino bioqumico de la
oxidacin de compuestos de azufre inorgnico por
Thiobacillus (Kelly,1988 b)
19
Cuadro 2. Donadores de electrones en la oxidacin de compuestos de
azufre inorgnico (Kelly,1988 b).
20
Cuadro 3. Caractersticas aparentes de las muestras obtenidas de la
presa de jales (Minatitln, Colima).
25
Cuadro 4. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo,
obtenidas de la presa de jales (Minatitln, Colima.).
26
Cuadro 5. Caractersticas aparentes de las muestras de agua y suelo,
obtenidas de la presa de jales (Minatitln, Colima.).
26
Cuadro 6. Medio de cultivo 9K para microorganismos quimiolitotrficos
(Silverman y Lundgren, 1959).
27
Cuadro 7. Medio de cultivo 9K para microorganismos heterotrficos
(Johnson, 1995).
28
Cuadro 8. Diseo experimental realizado con jales de la Presa(9x3x3=54 matraces).
51
Cuadro 9. Composicin qumica de las muestras de suelo cercano a
presas de jales (Minatitln, Colima).
53
Cuadro 10. Composicin qumica de las aguas de las orillas de la presa
de jales.
58
Cuadro 11. Contenido de humedad de las muestras de jales. 59
Cuadro 12. Concentracin de los elementos y xidos mayores presentes en
los jales.
60
Cuadro 13. Concentracin de metales potencialmente txicos al ambiente y
xidos mayores, presentes en una muestra compsito de jales.
61
Cuadro 14. Resultado de la apariencia y el pH de las muestras en tres
fechas diferentes tomadas de la presa de jales, Minatitln,
61
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
10/191
X
Colima.
Cuadro 15. Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con
muestras de suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa
de microorganismos quimiolitotrficos.
63
Cuadro 16. Evolucin de la concentracin de ion ferroso en pruebas con
muestras de suelo y agua para determinar la capacidad oxidativa
de microorganismos heterotrficos.
64
Cuadro 17. Caractersticas descriptivas de microorganismos
quimiolitotrficos desarrollados en medio lquido y slido de
muestras de suelo y agua de la presa de jales (Ramsay et al.,
1988; Kelly y Wood, 2000).
78
Cuadro 18. Caractersticas descriptivas de las colonias de microorganismoshetertrofos obligados, identificados en este trabajo.
90
Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para
las comparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes
de energa.
94
Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h-1) en
presencia de jales, para microorganismos, en funcin de la
presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura y dos
diluyentes distintos.
101
Cuadro 21. Valor de F calculada por anlisis de varianza de las
interacciones, aplicando los resultados de pruebas de
biolixiviacin con distintos microorganismos seleccionados.
114
Cuadro 22. Efecto de los microorganismos sobre las variables medidas
durante la biolixiviacin de los jales.
115
Cuadro 23. Efecto de la biolixiviacin de los minerales de sulfuro de los jales
con las tres diferentes fuentes de energa.
116
Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales con
las tres diferentes fuentes de energa (se consideran los
resultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes de
energa y distintos cultivos).
117
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
11/191
XI
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
12/191
XI
ndice de plantillas
Pgina
Plantilla 1. Panormicas de los sitios de muestreo de jales, suelo y agua:
(a) presa de jales; (b) perfil de suelo muestreado y (c) espejo
de agua en presa de jales
54
Plantilla 2. Sitios de muestreo de suelos para aislamiento de
microorganismos acidoflicos; (a) escurrimiento con
evidencias de produccin de drenajes cidos con ion frrico y
(b) detalle de suelo impactados por la actividad de
microorganismos
55
Plantilla 3. Sitios de muestreo de jales, suelo y agua: (a) presa de jales
donde se muestre agua y jales y (b) muestreo de suelo con
evidencia de escasa vegetacin por impacto de la oxidacin
de sulfuros.
56
Plantilla 4. Detalle de sitios de muestreo de jales y suelo: (a) alteracin
de los minerales sulfurosos en jales y (b) Evidencias de la
oxidacin de los minerales sulfurosos y precipitacin de
compuestos de fierro en suelos impactados.
57
Plantilla 5. Pruebas en matraces agitados para evaluar la oxidacin delion ferroso para muestras de suelo: (a) pruebas en medios de
cultivo para adaptacin y crecimiento de microorganismos
nativos; (b) pruebas para crecimiento de microorganismos
heterotrficos y (c) pruebas para crecimiento de
microorganismos quimiolitotrficos.
65
Plantilla 6. Colonias y clulas de bacterias quimiolitotrficas creciendo en
medios inorgnicos con azufre como fuente de energa: (a)
Colonia de Thiobacillus sp a 600 X; crecidas sobre agar (b)
Thiobacillus sp, crecidas sobre tiosulfato de sodio (600 X) y
(c) colonia bacteriana a 600X, crecida sobre tiosulfato de
sodio.
71
Plantilla 7. Colonias de bacterias quimiolitotrficas creciendo en medios 72
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
13/191
XII
slidos inorgnicos en presencia de tiosulfato de sodio: (a)
bacterias aisladas de presas de jales a pH
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
14/191
XIII
Plantilla 13. Crecimiento del consorcio de microorganismos heterotrficos
creciendo en un medio con sulfato ferroso y extracto de
levadura, proveniente de la presa de jales. (a) y (b) consorcio
original, a 600 X y (c) microorganismos aislados del
consorcio, a 600 X.
79
Plantilla 14. (a,b,c) Microorganismos heterotrficos aislados a partir del
consorcio creciendo en un medio con sulfato ferroso y
extracto de levadura, proveniente de la presa de jales a pH
1mm
En medio contiosulfato, bordes
lobulados, redondosverdes con centro rojo
> 1mm.
MEDIO LQUIDO
En medio con Fe(II),cambia el color
ambar, por oxidacin
del Fe. Con piritacambia a turbio verde
amarillo
En medio con Fe(II),cambia al color
ambar. Por oxidacin
del Fe, con piritacambia a turbio verde
amarillo
En medio con S se
volvi turbio ypolvoriento
TINCIN Gram negativo Gram negativo Gram negativo
NUTRICIN Auttrofa Auttrofa Auttrofa
RELACIN C/OXIGENO Aerobia Aerobia Aerobia
FUENTE DE ENERGA Fe(II), S, Tiosulfatopirita
Fe(II), S, Tiosulfato,pirita
Fe(II), S, Tiosulfatopirita
FUENTE DE CARBONO CO2 CO 2 CO 2
TEMPERATURA, 0C 29 20C 29 20C 29 20C
pH 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5 2.0 a 2.5FUENTE
AISLAMIENTOAgua Agua Suelo
OLOR MEDIOSLIDO
H2SO4 H 2SO4 H 2S y H2SO4
OLOR MEDIOLIQUIDO
H2SO4 H 2SO4 H 2SO4
Adems de estas bacterias quimiolitotrficas estrictas, se realiz el aislamiento de
bacterias creciendo en presencia de un medio de cultivo con sulfato ferroso y extracto de
levadura, por lo que deben tratarse de bacterias hetertrofas facultativas, entre las que se
distinguen algunas del gneroAcidophillium y algunas especies del gnero Thiobacillus,
por ejemplo T. acidophilus y T. cuprinus(Rawlings, 1997). La evidencia de que estas
bacterias emplean el sulfato ferroso como fuente de energa es la aparicin de
precipitados frricos (Plantillas 13 a 15), por lo que el extracto de levadura, debe ser
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
98/191
79
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
99/191
80
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
100/191
81
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
101/191
82
utilizado slo como el materia de construccin para la biosntesis de estructuras
celulares.
Adems de las bacterias quimiolitotrficas y heterotrficas facultativas que recin
se mencionaron, tambin se aislaron algunos hongos y levaduras, esto esmicroorganismos heterotrficas que crecieron inicialmente en medios de cultivo con
sulfato ferroso y extracto de levadura. Enseguida, su aislamiento y confirmacin fueron
realizados en presencia de medios de cultivo especficos: agar sabouraud y czapek para
crecimiento de hongos; y agar sabouraud con extracto de levadura para crecimiento de
levaduras. En el Cuadro 18 se describen las caractersticas ms sobresalientes de los
que se eligieron para el experimento. Lo anterior correspondi a la caracterizacin
basada nicamente en propiedades fenotpicas, basndose en los aspectos
mencionados en el captulo de materiales y mtodos.
En las plantillas 16 a 18 se presentan las colonias de hongos que se manifestaron
originalmente en el medio con sulfato ferroso y extracto de levadura, mientras que en la
plantilla 19 se observan colonias tipo fngico que crecieron en presencia de tiosulfato de
sodio. Todas estas colonias fueron aisladas a partir del consorcio recuperado de la presa
de jales, tanto de los jales como del agua ah depositada. Como se present en el
Cuadro 18, se reconocieron al menos 5 posibles especies fngicas diferentes(Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Penicillium y Rhizopus), distinguindose sus colonias
caractersticas en los medios slidos especficos (Plantillas 16 a 19).
A partir de estas colonias, se realizaron subcultivos repetidos para tener la certeza
de su pureza con el fin de mantenerlos como cepas puras para su posterior identificacin
y empleo en pruebas. Las imgenes de la plantilla 20 presentan la conservacin de las
cepas fngicas purificadas.
En las plantillas 21 y 22, se presentan imgenes de colonias de levaduras
Saccharomyces sp.y Rhodotorula sp., que fueron aisladas y purificadas a partir del
consorcio proveniente de los jales cidos (pH
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
102/191
83
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
103/191
84
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
104/191
85
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
105/191
86
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
106/191
87
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
107/191
88
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
108/191
89
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
109/191
90
importancia en este trabajo sea su sinergismo con el resto de microorganismos (bacterias
y hongos) que crecieron en estos medios.
Es importante tambin mencionar, que se identificaron algunos protozoarios, aun
cuando el experimento se mantuvo permanentemente en oscuridad. Solo se trabaj con
ellos cuando se utiliz el consorcio de origen. En la plantilla 23 se presentan algunas
fotomicrografas de estos eucariotas.
Cuadro 18. Caractersticas descriptivas de las colonias de microorganismoshetertrofos obligados, identificados en este trabajo.
Posible especie demicroorganismos
Caracterstica del hbitat
As perg illu s nger
pH 2.3 a 6.0 de 29 a 30 C. Se encontraron en agua cida y en elsuelo que present color verde. Colonias tpicamente negras. Losconidiforos largos y ramificados aproximadamente de 1.5 a 3.0
mm (Domsch et al., 1993).
Cryptococcus spSe encontr en el agua y suelo donde se registr el pH de 1.2 a 1.9.El color de las colonias fue verde. Se observaron hifas septadas,formaron esclerocios (Alexopoulos, 1996).
Mucor racemosus
El pH fue de 2.5 a 2.8. Se encontr en el suelo, present coloniasde color gris. El esporangiforo oscuro. Las clamidosporas seobservaron globosas y las zigosporas que se detectaron masgrandes. (Domsch et al.,1993).
Penici l l ium ita l icum
En pH 2.9, encontrado en aguas rojas y suelo verde en la orilla de lapresa. La colonia cuando joven se dio verde pero al envejecercambi al color gris verdoso. Muy ramificadas se observaron hifasaseptadas (Domsch et. al., 1993)
Rhizopus stoloniferSe encontr en el suelo con un pH de 3.0. Colonias de color negro ylas zigosporas tambin negras. Hifas ramificadas y formaronesclerocios.
Rhodoto rula sp
El pH registrado en el suelo de color verde donde se encontrfue de 2.0. Las colonias fueron de color anaranjado debido a lospigmentos carotenoides de que son caractersticas estaslevaduras. El color se mantuvo constante hasta los 25 dascambiando al gris cuando envejecieron.
No se hizo ningn tipo de caracterizacin para estos microorganismos. Sin
embargo, se observ con frecuencia durante los conteos, la presencia de protozoariosas como algunos tipos de Amoebas. Adems de todos los microorganismos arriba
citados, se observaron algunos microorganismos filamentosos que crecieron en
presencia de sulfato ferroso, tanto como fuente de energa nica, como en presencia de
extracto de levadura (Plantilla 24).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
110/191
91
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
111/191
92
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
112/191
93
Tanto en los protozoarios, como los microorganismos filamentosos, no existi una
evidencia de formar colonias en los medios slidos, identificados exclusivamente como
individuos en los medios lquidos. Para ambos tipos de microorganismos, no se realiz
alguna caracterizacin fisiolgica, aunque ya se han reportado evidencias de su
presencia en este tipo de ambientes cidos (Bacelar-Nicolau y Johnson, 1999).
4.10Bioensayos para determinar condiciones en la biolixiviacin de
minerales sulfurosos
4.10.1 Actividad de los microorganismos en substrato estril y no estril
Se realizaron pruebas con los cultivos puros (Thiobacillus sp.) y mixtos (mezcla de
Thiobacillus sp., Rhodotorula sp. y Penicillium sp.) en presencia de un medio mnimo desales (MMS), en ausencia y presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura, utilizando
los jales como sustrato mineral, donde se compar el efecto de la esterilizacin del
sustrato con el fin de diferenciar la capacidad oxidativa de ambos cultivos. Los resultados
de estas pruebas se reportan en el Cuadro 19, donde se observa para los cuatro distintos
bioensayos una mayor oxidacin del ion ferroso en los cultivos con el sustrato estril,
aunque el contenido inicial de sulfato ferroso es superior para las pruebas donde se
adicion extracto de levadura y sulfato ferroso.
Aun cuando se observa que el porcentaje de oxidacin del Fe (II) para casi todos
los cultivos en sustrato no estril es similar al reportado para la prueba control (~26%), lo
cual significara ningn efecto en la oxidacin del ion ferroso por la presencia de los
cultivos puros y mixto en los sustratos no estril, en realidad si existe un efecto positivo
de la presencia de los microorganismos presentes en ambos cultivos (puro y mixto). Se
observ que al comparar la velocidad de oxidacin del ion ferroso (expresada en mg.h-1),
se comprueba que en presencia del MMS la velocidad de oxidacin del Fe(II) se
incrementa de 3 a 20 veces en comparacin a la prueba control, mientras que en
presencia del medio con extracto de levadura y sulfato ferroso, la velocidad de oxidacin
se incrementa de 78 a 260 veces en comparacin a la prueba control (Cuadro 19).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
113/191
94
Cuadro 19. Valores iniciales y finales del in Fe (ll) en cada tratamiento para lascomparaciones con cultivo mixto y puro con distintas fuentes de energa.
CondicionesConcentracininicial (mg/L)
Concentracin final(mg/L)
Oxidacin de Fe(II)(%)
Velocidad deoxidacin deFe(II) (mg.h-1)
Controlstril 0.05 0.037 26 1.8*10-5
no estril 0.05 0.036 28 1.9*10-5
Cult ivo pu ro (Thiobacil lus sp.) en MMS
Estril 0.35 0.09 74 3.6*10-4
no estril 0.30 0.18 40 1.7*10-4
Cul t ivo mix to en MMS
Estril 0.20 0.07 65 1.8*10-4no estril 0.20 0.16 20 5.5*10-5
Cult ivo puro (Thiobacil lus s p.) en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
Estril 3.98 2.60 35 1.9*10-3
no estril 3.60 2.60 28 1.4*10
-3
Cult ivo mixto en MMS con extracto de levadura y sulfato ferroso
Estril 4.27 0.89 79 4.7*10-3No estril 4.21 3.10 27 1.5*10-3
Debe mencionarse que en las pruebas donde no se adicion sulfato ferroso (tanto
bioensayos control como cultivos con MMS), el Fe (II) inicial es aportado por los jales.
Adems, se observ que no existe un mayor aporte del ion ferroso por la esterilizacin
del sustrato. En todos los casos, fueron evidentes las tendencias de disminucin en laconcentracin de Fe (II) en solucin conforme se incrementa el tiempo de reaccin (Fig.
12 a 16), cuando se esteriliz el medio y adems se adicion sulfato ferroso y extracto de
levadura el consumo fue significativamente mayor (Fig. 16). Como tambin se demostr
en el Cuadro 19, se observ una oxidacin similar del ferroso, tanto con los cultivos puros
como con los mixtos (Fig. 13 y 14). Sin embargo, cuando se adicion el sulfato ferroso y
extracto de levadura fue notablemente ms oxidado en presencia d el cultivo mixto (Fig.15
y 16).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
114/191
95
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
Ferroso(mg/L)
no estril
estril
Fig. 12. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) en el control en condiciones
estril y no estril.
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
Ferroso(mg/L)
no estril
estril
Fig. 13. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacil lus sp.)
en medio mnimo de sales (MMS).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
115/191
96
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
Ferroso
mg/L
no estril
estril
Fig. 14. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo mixto en mediomnimo de sales.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
ferroso
(mg/L)
no estril
estril
Fig. 15. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) con el cultivo puro (Thiobacillussp.)en medio mnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
116/191
97
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 24 48 60 72
Tiempo (h)
ferroso(mg/L)
no estril
estril
Fig. 16. Evolucin de la concentracin de Fe (ll con el cultivo mixto en mediomnimo de sales, extracto de levadura y sulfato ferroso.
4.10.2 Condiciones de crecimiento de los microorganismos aislados enel substrato con jales y diluyente distinto
Esta serie de bioensayos fue realizado para demostrar el efecto de dos diluyentes
diferentes: agua acidulada y medio 9K, ambos a pH de 2, realizndose para los cultivos
puros y mixtos en presencia de jales. Adems del diluyente, se evalu su efecto en
presencia y ausencia de sulfato ferroso como fuente de energa, con y sin extracto de
levadura.
En la Fig. 17, se presentan los resultados cuando se utiliz agua como diluyente,
con los cultivos puros (Thiobacillus sp.),mixto (mezcla de Thiobacillus sp.,Rhodotorula
sp. y Penicillium sp.) y consorcio, sin sulfato ferroso adicionado como fuente de energa
inorgnica. Se observa que no existe una disolucin adicional de ion ferroso a partir de
los jales para las cinco pruebas reportadas. La concentracin inicial de Fe(II) disuelto al
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
117/191
98
poner en contacto los jales con el agua acidulada, disminuye de 2 a casi 1.3 mg/L,
obtenindose el mejor resultado para el consorcio en presencia de extracto de levadura.
00.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.82
0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
ferroso(mg/L)
1
2
3
6
7
Fig. 17. Evolucin de la concentracin de Fe (ll) muestra de jales con cultivo mixto
y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (1) control parael cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) conextracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) conextracto de levadura y cultivo puro.
En la Fig. 18 se presenta el bioensayo equivalente, empleando al medio 9K comodiluyente. Los resultados fueron similares a los obtenidos para el agua con los cultivos
puro y mixto, mientras que para el consorcio con extracto de levadura, la disminucin en
la concentracin del ion ferroso fue aun mayor (de 2 a 0.2 mg/L). Entonces, comparando
los diez tratamientos, la mejor condicin fue con medio 9K como diluyente y consorcio
como grupo microbiano (90% de potencial oxidacin de ion ferroso), aunque a muy bajas
concentraciones de ion ferroso (< 2 mg/L), por lo que era necesario confirmar esto con
mayores concentraciones de sulfato ferroso (con y sin extracto de levadura).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
118/191
99
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
ferroso
(mg/L)
12
3
6
7
Fig. 18. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivomixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (1) controlpara el cultivo mixto; (2) con extracto de levadura y cultivo mixto; (3) conextracto de levadura y consorcio; (6) control para el cultivo puro; (7) conextracto de levadura y cultivo puro.
Cuando se adicion sulfato ferroso como sustrato energtico, la concentracin
inicial de este ion fue superior: 1500 mg/L para la prueba con agua acidulada y 15000
mg/L para el medio 9K. En las nuevas series de bioensayos con adicin del sulfato
ferroso, no se experiment la presencia del consorcio, puesto que este ya haba
demostrado su mayor capacidad para oxidar el ion ferroso, sobre todo en presencia del
medio 9K con extracto de levadura. En cambio, en estas nuevas series, se tratara de
comparar el efecto del ion ferroso para los cultivos mixto y puro. En las Figs. 19 y 20, se
presentan las tendencias de la disminucin del ion ferroso cuando se us,
respectivamente, agua y medio 9K como diluyentes. Cuando se emple agua como
diluyente, se obtuvo un comportamiento similar para las pruebas con cultivo puro +
extracto de levadura, as como para el cultivo mixto, con y sin extracto de levadura (40%de disminucin, segn Fig. 19).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
119/191
100
0
200
400
600
800
10001200
1400
1600
1800
0 2 5 8 12 36
Tiempo ( h )
ferroso
(mg/L
)
4
5
8
9
Fig. 19: Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivo
mixto y cultivo puro, empleando agua acidulada como diluyente: (4)cultivo mixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso yextracto de levadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro,extracto de levadura y sulfato ferroso.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0 2 5 8 12 36
Tiempo (h)
ferroso(mg/m
L)
45
8
9
Fig. 20. Evolucin de la concentracin de Fe (ll), muestra de jales con cultivomixto y cultivo puro, empleando medio 9K como diluyente: (4) cultivomixto y sulfato ferroso; (5) cultivo mixto, sulfato ferroso y extracto delevadura; (8) cultivo puro y sulfato ferroso; (9) Cultivo puro, extracto delevadura y sulfato ferroso.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
120/191
101
Por otro lado, en la Fig. 19 se observa que el substrato que contena cultivo mixto,
sulfato ferroso y extracto de levadura en medio 9K, la disminucin de la concentracin de
ion ferroso fue significativamente mayor que el resto de los tratamientos. La disminucin
del in ferroso se aceler rpidamente a partir del quinto da, obtenindose un consumo
del 87 % del total del ferroso al inicio presente.
Si se considera que en las condiciones del sistema en estudio, la disminucin del
ion ferroso es provocada por su oxidacin a ion frrico, el Cuadro 18 reporta las
velocidades de oxidacin para estos 9 tratamientos. Con ello se confirma que la mayor
velocidad de disminucin en la concentracin de Fe(II) disuelto se obtuvo con el cultivo
mixto en presencia del medio 9K (7.6X10+2mg.h -1), sulfato ferroso y extracto de levadura
(Cuadro 20). Debe sealarse que esta velocidad mxima se obtuvo en los perodos
iniciales de la cintica, mientras que en ausencia del medio 9K, la mxima velocidad dedisminucin de Fe(II) se obtuvo hacia el final de la cintica (6.5*10+1mg.h -1). Dado que
estos bioensayos demostraron que el cultivo mixto presenta los mejores resultados en la
disminucin de Fe(II), la cual se asocia a su oxidacin en ion frrico, enseguida slo se
realizaron experimentos con este cultivo, haciendo comparacin de eficiencia con el
cultivo puro. Adems, tambin de estas pruebas se propone slo el empleo de medio 9K
como diluyente y extracto de levadura y sulfato ferroso como sustratos energticos.
Cuadro 20. Velocidad mxima de oxidacin del ion ferroso (mg.h-1) en presencia dejales, para microorganismos, en funcin de la presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura y dos diluyentes distintos.
Agua acidulada como diluyente Medio 9K como diluyente
Sin FeSO4 Con FeSO4 Sin FeSO4 Con FeSO4Tipo deMicroorganismo Sin
extractoCon
extractoSin
extractoCon
extractoSin
extractoCon
extractoSin
extractoCon
extracto
Consorcio demicroorganismos
- 7.5E-2 - - - 1.9E-1 - -
Puro (Thiobacillussp.)
2.5E-2 2.0E-2 6.1E+1 4.6E+1 5.7E-2 6.2E-2 3.3E+2 3.7E+2
Mixto (Thiobacillussp. Penicillium sp. y
Rhodotorulla sp.)1.5E-2 6.3E-2 8.3E0 6.5E+1 9.7E-2 4E-2 3.0E+2 7.6E+2
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
121/191
102
4.10.3 Oxidacin de Fe(II) por cultivos mixtos y puros en presencia dejales
Fue evidente la adaptacin de los cultivos de microorganismos al substrato
preparado. En un primer experimento no se adicion extracto de levadura, por lo que no
hubo carbono orgnico como fuente de energa. Se compararon cultivos puros
(Thiobacillus sp.) y mixtos, en presencia de los minerales sulfurosos presentes en los
jales y del sulfato ferroso que se adicion como fuente de energa. Se puede observar en
la Fig. 21 que se increment de manera logartmica la biomasa en ambos tipos de cultivo.
Aunque el cultivo mixto super el nmero de microorganismos con respecto al puro. Sin
embargo, en ambos cultivos se observa el mayor incremento durante los 20 a 35 das de
incubacin.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (d)
Feensol
ucin(mg/L)
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
clu
las/mL
F e( II ) p ar a c ul ti vo mi xt o F e( II I) par a c ul ti vo m ixt o
Cul tivo M ixto (cel / ml ) Cul ti vo P ur o (cel / ml )
Fig. 21. Oxidacin de Fe(II) a Fe(III) y evolucin del crecimiento de losmicroorganismos en cultivo puro (Thiobacil lus sp.) y cultivo mixto.
Por otro lado, tambin se evidenci un incremento en la concentracin de Fe(lll),
mientras que la concentracin de Fe(ll) disminuy de manera proporcional conforme se
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
122/191
103
incrementa el tiempo de la prueba (Fig. 21). Aun cuando en esta grfica no se
presentan los resultados para la oxidacin del Fe(II) correspondiente al cultivo puro, se
obtuvo una muy lmitada oxidacin del ferroso por estos microorganismos.
En seguida se realiz una prueba adicionando extracto de levadura y el sulfatoferroso. Los resultados de este experimento, confirmaron que la actividad microbiana
favoreci la disminucin de la concentracin de Fe(ll), incrementndose al mismo tiempo
la concentracin de Fe(lll) (Fig. 22). Debe sealarse que el pH de la pulpa descendi de
2.0 hasta 0.9. Con respecto a la actividad de los microorganismos en este substrato, se
manifest un aumento importante de la biomasa. El inculo inicial fue de 1*103
clulas.mL-1, alcanzando una concentracin de 4X109 clulas.mL -1 en periodo
estacionario (a seis das de incubacin) (Fig. 23).
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (d)
Fe(II)yFe(III),g/L
Fe(II)g/l Fe(III)g/l
Fig. 22. Cintica de la oxidacin de Fe(II) en presencia de jales con cultivo mixto.
Los microorganismos que se desarrollaron en este substrato fueron
microorganismos hetertrofos y quimiolitotrficos (cultivo mixto), ya que el aporte de
sulfato ferroso y el extracto de levadura seguramente funcionaron como fuente deenerga para la proliferacin celular. Cabe sealar que el cultivo de microorganismos que
se us en este experimento, es el que ya se ha seleccionado y adaptado al substrato
empleado en los experimentos anteriores.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
123/191
104
En la Fig. 23 se observa tambin que despus de alcanzar su periodo estacionario
de crecimiento entre 5 y 10 das despus de inoculacin, la concentracin de
microorganismos en suspensin disminuy significativamente.
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
1000000000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (d)
Clulas/mL
Fig 23. Cintica de crecimiento de microorganismos en el cultivo mixto con
sulfato ferroso y extracto de levadura como fuente de energa
4.10.4 Estudio comparativo de la capacidad oxidativa de cultivos puros ymixtos
Dado que el cultivo mixto presentaba mejor capacidad oxidativa del Fe(II), y
considerando que este cultivo mixto est constituido por una mezcla de los cultivos puros
identificados como Thiobacillus sp., Penicillium sp. y Rhodotorula sp., se procedi a
realizar cinticas de oxidacin del ion ferroso en presencia de los cultivos puros bajo las
condiciones de crecimiento determinadas como ideales para el cultivo mixto, esto con el
fin de distinguir cual de los microorganismos tiene mayor capacidad de oxidacin en lamezcla.
Bajo las condiciones de las pruebas, el crecimiento de los microorganismos
(expresado en celulas.mL-1), fue mayor para el cultivo identificado como Thiobacillus sp.,
el cual creci de 1*103 a 1*10 5, mientras que el crecimiento de Penicillium sp. y
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
124/191
105
Rhodotorula sp., fue apenas menor de 5 veces la concentracin inicial de clulas (fFigs.
24 a 26). La oxidacin del ion ferroso fue mayor para los cultivos puros de Thiobacillus
sp. y Penicillium sp., quienes promovieron la disminucin de la concentracin de Fe(II) de
8000 mg.L-1 hasta menos de 3000 mg.L -1 en 45 das (Figs. 24 y 25). En cambio, el cultivo
de Rhodotorula sp.,present una menor capacidad de oxidacin de Fe (II), de 550 a 300
mg.L-1 (Fig. 26).
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
clulas/mL
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Fe(ll)mg/mL
microorganismos [Fe(II)]
Velocidad promediode oxidacin = 1.5 mg/h
Fig. 24. Crecimiento del cultivo puro de Thiobaci llus spen presencia de sulfato
ferroso y extracto de levadura, as como su evolucin en laconcentracin de Fe(II) disuelto.
1
10
100
1000
10000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
celulas/mL
0
2000
4000
6000
8000
10000
Fe(II),mg/L
microorganismos Fe(II)
Velocidad promediode oxidacin = 1.5 mg/h
Fig. 25. Crecimiento del cultivo puro de Penici l lium spen presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracinde Fe(II) disuelto.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
125/191
106
Enseguida se realizaron nuevamente bioensayos con la mezcla de cultivos puros
de los cultivos de Thiobacillus sp., Penicillium sp., y Rhodotorula sp., en los mismos
tiempos y condiciones que las tres pruebas anteriores, con fuentes de energa diferentes
y empleando a los jales como un sustrato comn.
1
10
100
1000
10000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
clulas/mL
0
100
200
300
400
500
600
Fe(II),mg/L
microorganismos Fe(II)
Velocidad promediode oxidacin = 1.5 mg/h
Fig. 26. Crecimiento del cultivo puro de Rhodotorula spen presencia de sulfatoferroso y extracto de levadura, as como evolucin en la concentracinde Fe (II) disuelto.
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
clulas/mL
0
1000
2000
3000
4000
5000
60007000
8000
9000
Fe(II),mg/L
Microorganismos Fe(ll)
Velocidadpromedio de
Fig. 27. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para lamezcla de microorganismos (Thiobacillu s sp, Penicill ium sp y Rhodotoru lasp.), utilizando sulfato ferroso con extracto de levadura como fuente deenerga.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
126/191
107
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
clulas/mL
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Fe(II),m
g/L
Microorganismos Fe(ll)Velocidad
romedio de
Fig. 28. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la mezcla demicroorganismos (Thiobaci llus sp, Penici ll ium sp y Rhod otorula s p.), utilizando
sulfato ferroso sin extracto de levadura como fuente de energa.
En la figura 29 se observa la cintica de microorganismos que result con los jales
como nica fuente de energa. Expresa resultados con diferencia significativa comparada
con las dos pruebas anteriores. La produccin mxima de clulas por mL que se obtuvo
fue de 1X105, es decir, 6 y 4 ordenes de magnitud menor que con sulfato ferroso +
extracto de levadura y sulfato ferroso sin extracto de levadura, respectivamente.
Seguramente consecuencia del limitado crecimiento microbiano, la concentracin inicial
de Fe(ll) disminuy slo de 540 a 350 mg.L-1
, al final del tiempo de incubacin (Fig. 29).
1.00E+00
1.00E+02
1.00E+04
1.00E+06
1.00E+08
1.00E+10
1.00E+12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
clulas/mL
0100020003000400050006000700080009000
FeII(ppm)
Microorganismos Fe(ll)
Fig. 29. Evolucin del crecimiento microbiano y de la oxidacin de Fe(II) para la
mezcla de microorganismos (Thiobaci l lus sp, Penici l l ium sp yRhodotorula sp.), sin fuente de energa adicional, slo sulfurospresentes en jales.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
127/191
108
A travs de estos bioensayos, se pudieron detectar las tendencias de la oxidacin
del ion ferroso y del crecimiento microbiano para tres diferentes combinaciones de
fuentes de energa: (i) medio 9K con jales, sulfato ferroso y extracto de levadura; (ii)
medio 9K con jales y sulfato ferroso; y (iii) medio 9K con jales. La mayor proliferacin de
microorganismos que se dio a travs del tiempo fue para el primer bioensayo, es decir,
cuando se utiliz jales, sulfato ferroso y extracto de levadura (Figs. 27 a 29). En este
caso, el crecimiento celular alcanz hasta 1X1011clulas.mL -1, a lo cual se asocia una
disminucin en la concentracin de Fe(II) de 8000 hasta 500 mg.L -1 (Fig. 27). Al utilizar
jales y sulfato ferroso, tambin se expres un importante crecimiento celular, aunque slo
alcanz una concentracin de 1X107 clulas.mL -1 a los 20 das de incubacin,
disminuyendo la concentracin de Fe (II) de 7762 a 2000 mg.L -1 (Fig. 28).
4.11 Biolixiviacin de jales por comunidades microbianasseleccionadas
4.11.1 Descripcin de la evolucin de parmetros indicadores
Se realizaron pruebas de biolixiviacin de los jales sulfurosos con los distintos
tipos de microorganismos y en presencia de distintas fuentes de energa (sulfato ferroso y
extracto de levadura). Los resultados de este estudio compararativo se reportan
grficamente en las Figs. 30 a 32, donde se presentan los principales indicadores de la
actividad microbiana tomando como base los productos de reaccin del sistema en
estudio.
En las tres comparaciones realizadas en funcin de la fuente de energa (jales,
jales+sulfato ferroso y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura), la evolucin de los
parmetros analizados en los bioensayos testigo (sin adicin de microorganismos),
demuestra que efectivamente en todos los casos existe una influencia de la actividad
microbiana, comparado con su respectivo testigo (Plantilla 29 del anexo).
En todos los bioensayos, se observ un incremento en la biomasa (expresadaaqu por el nmero de celulas en suspensin) entre el perodo 15 a 35 das (Figs. 30a,
31a y 32a). Despus de este perodo, en la mayora de los ensayos se observ una
disminucin en el nmero de clulas. Esto fue confirmado por el ensayo de la
concentracin de protenas totales (Figs. 30b, 31b y 32b).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
128/191
109
En cuanto al pH, tambin se observ una evolucin similar para todos los
bioensayos, esto es, una disminucin conforme se incrementa el tiempo de la cintica, de
los valores iniciales cercanos de 2 hasta valores de pH ligeramente inferiores de 1 a los
45 das (Figs. 30c, 31c y 32c). Slo en la serie de pruebas con sulfato ferroso como
fuente de energa, se observa una tendencia de la acidez asociada a la evolucin del pH,
esto es, incremento de la acidez con la disminucin del pH (Figs. 30e, 31e y 32e). En
cambio, para las pruebas con jales y jales+sulfato ferroso+extracto de levadura, no se
observa un comportamiento asociado entre el pH y la concentracin de la acidez en la
pulpa. De una manera similar, la evolucin de la concentracin de ion sulfato es irregular
en la mayora de los bioensayos, aunque para los ltimos tres muestreos se observ una
tendencia de incremento (Figs. 30f, 31f y 32f).
El potencial rdox de las pulpas durante las pruebas mostraron una tendencia
normal para los sistemas de oxidacin de minerales sulfurosos, esto es, un incremento
hasta potenciales cercanos de 600 mV/SCE (equivalente a 840 mV/SHE), aunque en los
tres casos, se observ un mayor incremento en el potencial rdox para las pruebas con
el consorcio (Figs. 30d, 31d y 32d).
En el caso del anlisis de Fe total, se observ para los bioensayos donde se
adicion ion ferroso una tendencia a la disminucin en la concentracin de Fe (Figs. 30gy 31g), en cambio donde no se adicion el Fe (II) y el nico sustrato energtico fueron los
sulfuros de los jales, si se observ una tendencia al incremento en la disolucin de este
metal (Figs. 32g). A diferencia de este comportamiento no esperado del Fe total para los
bioensayos con el Fe(II), la concentracin del ion ferroso si present una tendencia
normal a la esperada, esto es, una disminucin en su concentracin, atribuida a su
oxidacin a ion frrico (Figs. 30h, 31h y 32h).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
129/191
110
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+12
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo(das)
Clulas/mL
CMS M Th P R
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
pH
CMS M Th P R T
c
0
20
40
60
80
100
120
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
Acidez(%
CMS M Th P R T
e
0
2000
4000
6000
8000
10000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
FeTotalmg/L
CMS M Th P R T
g
0
2
4
6
8
10
12
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
ProtenasTotales(ug/mL)
CMS M Th P R T
b
0
200
400
600
800
1000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
ORP
(mV/SCE
CMS M Th P R T
d
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
ionsulfato(mg/L)
CMS M Th P R T
f
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
Fe(ll)mg/L
CMS M Th P R T
h
Fig. 30. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso como fuente de energa: (a)concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencialrdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe
disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de
Penicillium sp.; R = cultivo puro de Rhodotorula sp.; T = testigo.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
130/191
111
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
1,00E+10
1,00E+12
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
Clulas/mL
CMS M Th P R T
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
pH
CMS M Th P R T
c
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
5 10 15 20 25 30 35 40
tiempo (das)
Acidez(%
CMS M Th P R T e
0
2000
4000
6000
8000
10000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (d)
Fetotal(mg/L)
CMS M Th P R T
g
0
3
6
9
12
15
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
ProtenasTotales
(ug/mL)
CMS M Th P R T
b
0
200
400
600
800
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
ORP(mV/SCE
CMS M Th P R T
d
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
tiempo (das)
ionSulfato(mg/L)
CMS M Th P R T f
0
10000
20000
30000
40000
50000
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
Fe(ll)mg/L
CMS M Th P R T
h
Fig. 31. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales en presencia de sulfato ferroso y extracto de levadura comofuente de energa: (a) concentracin de clulas en suspensin; (b) protenas totales; (c)
pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f) concentracin de sulfato disuelto; (g)concentracin total de Fe disuelto; y (h) concentracin total de ferroso disuelto.
CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de
Penicillium sp.; R = cultivo puro de Rhodotorula sp.; T = testigo.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
131/191
112
1,00E+00
1,00E+02
1,00E+04
1,00E+06
1,00E+08
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
Clulas/mL
CMS M Th P R T
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (d)
pH
CMS M Th P R T
c
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
Acidez(%
CMS M Th P R T
e
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo(das)
FeTotal(mg/L)
CMS M Th P R T
0
3
6
9
12
15
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
ProtenasTotales
(ug/mL)
CMS M Th P R T
b
0
200
400
600
800
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
ORP(mV/SCE)
CMS M Th P R T
d
0
500
1000
1500
2000
5 10 15 20 25 30 35 40 45tiempo (das)
ionsulfato(mg/L)
CMS M Th P R T
f
0
50
100
150
200
250
5 10 15 20 25 30 35 40 45
tiempo (das)
Fe(ll)mg/L
CMS M Th P R T
h
Fig. 32. Evolucin de los parmetros indicadores de la actividad microbiana durante labiolixiviacin de los jales como nica fuente de energa: (a) concentracin de clulas en
suspensin; (b) protenas totales; (c) pH; (d) potencial rdox; (e) acidez; (f)concentracin de sulfato disuelto; (g) concentracin total de Fe disuelto; y (h)
concentracin total de ferroso disuelto.CMS = Consorcio de microorganismos seleccionados; M = cultivo mixto ( Thiobacillus sp.,Penicillium sp. y Rhodotorula sp.; Th = cultivo puro de Thiobacillus sp., P= cultivo puro de
Penicillium sp.; R = cultivo puro de Rhodotorula sp.; T = testigo.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
132/191
113
4.11.2 Anlisis estadstico (ANOVA y Prueba de medias de Tukey)
Se presenta el anlisis de la separacin de prueba de medias que se realiz
para conocer el efecto de las diferentes clases de microorganismos sobre las variables
medidas durante el proceso de biolixiviacin de los jales. Los resultados de los anlisis
de varianza se reportan en el Cuadro 21, mientras que aquellos de las pruebas demedias en los Cuadros 22 a 24.
En el Cuadro 22, se muestra que el valor del pH mas bajo (1.58) fue con el
consorcio de microorganismos seleccionados (CMS) y ms alto con el testigo (2.58).
Caso contrario sucedi con el potencial rdox (ORP), mientras la cifra ms alta se dio
en CMS la ms baja fue en el testigo. De la misma forma, las concentraciones del in
sulfato ms elevadas se dieron en el CMS y con Penicillium sp y la menor en el
testigo. Con respecto a la acidez, la mayor concentracin tambin se manifest en elCMS (84.19), enseguida con Thiobacillus, seguida de la mezcla de microorganismos
as como con Penicillium y Rhodotorula y la ms baja en el testigo. Sin embargo, la
concentracin de clulas ms destacada, se evidenci con la mezcla de
microorganismos; posteriormente en el CMS, le siguieron con cifras similares
estadsticamente los cultivos de Thiobaciilus, Penicillium y Rhodotorula, siendo la ms
baja con el testigo.
En Cuadro 22 se pone en evidencia, a travs de la separacin de medias, los
efectos de los microorganismos sobre el resto de las variables. En el caso de la
concentracin de proteinas totales, los valores ms elevados fueron para el CMS, la
mezcla de microorganismos y el cultivo puro de hongos, mientras que los valores ms
bajos fue para la muestra testigo.
En cuanto a los resultados de los iones Fe (ll), la mayor concentracin se
manifest en el testigo, le siguieron los cultivos puros de Rhodotorula sp, Penicillium
sp y Thiobacillus sp., mezcla de microorganismos, y finalmente la muestra con menor
concentracin de ferroso fue el CMS. Contrariamente, las concentraciones mas
elevadas del Fe (lll), estuvieron en CMS y le siguieron con cifras estadsticamente
iguales la mezcla de microorganismos, cultivos puros de Thiobacillus sp, Penicillium
sp, Rhodotorulla sp y finalmente el mas bajo estuvo en el testigo.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
133/191
114
Por lo que se refiere a las concentraciones de azufre, de acuerdo al anlisis, la
evidencia reflej que la concentracin mas elevada fue en el CMS, le siguieron los
cultivos de hongos,Thiobacillus sp y Rhodotorula sp, teniendo la lectura menor para el
testigo.
Cuadro 21. Valor de F calculada por anlisis de varianza de las interacciones,aplicando los resultados de pruebas de biolixiviacin condistintos microorganismos seleccionados.
Fuente devariacin
Grados delibertad
ORP(mV)
In Sulfato(mg/L)
Acidez(%) pH
Azufre(mg/L)
Tratamientos 163
Microorga-nismos (M)
5 90.23*** 10.20*** 88.50*** 249.94*** 31.43***
Fuente deenerga (C)
2 19.38*** 721.83*** 1469.42*** 560.62*** 737.42***
Tiempo (T) 8 254.18*** 170.53*** 485.14*** 90.84*** 83.08***Repeticin (R) 2 1.17 NS 0.13 NS 0.27 NS 4.73 NS 0.20 NS
M*C 10 8.93*** 41.10*** 14.81*** 76.66*** 4.74***
M*T 40 6.40*** 66.96*** 7.74*** 4.85*** 9.05***C*T 16 4.91*** 15.02*** 26.87*** 8.99*** 7.96***
M*C*T 80 1.98*** 16.53*** 3.93*** 2.36*** 2.18***
Error 322CME 2948.915 17099.8 0.01027700 0.0454436 521690
C.V. (%) 11.24407 13.13519 14.70812 11.65991 18.34778
Fuente de
variacin
Gradosde
libertad
Fe (ll)
(mg/L)
Fe(lll)
(mg/L)
Fe Total
(mg/L)
Microorganismos
(Clulas/mL)
Protenas
totales(g/L)Tratamientos 163
Microorganismos(M)
5 52.48*** 179.97*** 202.79*** 3515.71*** 11.05***
Fuente deenerga (C)
2 1652.16*** 5182.50*** 1307.48*** 455.76*** 23.83***
Tiempo (T) 8 114.71*** 17.58*** 85.88*** 1136.72*** 27.67***Repeticin (R) 2 1.10 NS 1.34 NS 0.03 NS 0.95 NS 1.96 NS
M*C 10 25.00*** 135.86*** 6.43*** 40.09*** 10.42***M*T 40 5.95*** 8.81*** 75.30*** 50.78*** 6.49***
C*T 16 30.82*** 49.51*** 11.90*** 17.61*** 2.61 NS
M*C*T 80 4.05*** 5.26*** 4.83*** 7.99*** 3.92***Error 322CME 0.0571378 0.0152755 0.0598543 0.062253 0.1438972
C.V. (%) 10.61148 3.878380 8.463365 3.487970 40.39052 CME = Cuadrado medio del error. CV =Coeficiente de variacin.NS = No significativo *** Significativo al 1%
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
134/191
115
Cuadro 22. Efecto de los microorganismos sobre las variables medidasdurante la biolixiviacin de los jales
Tipo demicroorganismos
pH ORP(mV)
In Sulfato(mg/L)
Acidez(%)
Microorganismos(clulas/mL)
C. M. S. 1.58 c1 565 a 1031.2 a 84.19 a 6.41E+07 bMezcla (B, H y L) 1.66 bc 485 b 982.8 b 66.58 c 3.05E+08 a
Bacterias(Thiobaci i l lusp)
1.72 b 493 b 928.3 c 75.10 b 3.64E+07 c
Hongos(Penici l l ium sp)
1.74 b 496 b 1031.0 a 67.75 c 3.98E+07 c
Levaduras(Rhodototuru l la)
1.66 bc 473 b 958.0 bc 67.80 c 3.92E+07 c
Testigo (CN) 2.58 a 386 c 645.0 d 52.13 d 7.49E+03 d
Tipo demicroorganismos
Protenastotales(g/L)
Fe (ll)(mg/L)
Fe (lll)(mg/L)
Fe (Total)(mg/L)
Azufre(mg/L)
C.M S. 8.0 a1 345.4 d 3278.8 a 3624.2 a 4631.1 aMezcla (B, H y L) 7.8 a 788.44 c 1902.2 b 2690.6 cd 3770.6 c
Bacterias(Thiobaci i l lusp)
5.0 b 987.0 bc 1839.4 b 2928.5 c 3963.0 bc
Hongos(Penici l l ium sp)
7.0a 1089.0 b 1837.8 b 3299.4 b 4134.8 b
Levaduras(Rhodototuru l la)
5.6 b 1467.0 b 1687.8 b 2674.8 d 3859.2 bc
Testigo (CN) 1.9 c 1573.0 a 959.0 c 2531.8 d 3261.0 d1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).C M S = Consorcio de Microorganismos SeleccionadosB H L = Bacterias Hongos LevadurasCN = Consorcio Natural
Asimismo, fue analizada la fuente de energa como factor de variacin sobre
las mismas variables (Cuadro 23). Es decir, que se analiz el efecto de los
tratamientos sin fuente adicional de energa (solo jales), con sulfato ferroso y sulfato
ferroso con extracto de levadura como fuentes de energa. El pH ms bajo fue donde
se utiliz el sulfato ferroso con extracto de levadura y ms alto en donde no se
adicion ninguna fuente de energa. El ORP ms elevado fue obtenido para el cultivo
sin fuente de energa, mientras que el ms alto para el cultivo con sulfato ferroso. Por
otro lado, tanto en las variables in sulfato y acidez, como en los microorganismos, los
comportamientos fueron similares, ya que las cantidades ms grandes se
manifestaron en el sulfato ferroso con extracto de levadura que en los otros factores.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
135/191
116
Cuadro 23. Efecto de la biolixiviacin de los minerales de sulfuro de los jalescon las tres diferentes fuentes de energa
Fuentes deenerga
pHORP(mV)
In Sulfato(mg/L)
Acidez(%)
Microorganismos(clulas/mL)
Sin fuente deenerga
2.271a 462 b 677.86 c 34.0 c 4.90E+06 c
Sulfato ferroso 1.68 b 498 a 1132 b 81.8 b 1.73E+07 bSulfato ferroso y
Extracto delevadura
1.52 c 488 a 1176 a 91.0 a 3.34E09 a
Fuentes deenerga
Protenas(g/L
Fe (ll)(mg/L)
Fe(lll)(mg/L)
Fe (Total)(mg/L)
Azufre(mg/L)
Sin fuente deenerga
5.01c 37.87 c 489.4 c 527.3 c 2163 c
Sulfato ferroso 6.1 b 2304.9 a 2359.5 b 4664.4 a 4950 aSulfato ferroso y
Extracto de
levadura
8.5 a 782.0 b 2902.0 a 3683.0 b 4780 b
1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
En el Cuadro 24, se observa la evolucin que manifestaron las variables
estudiadas en el experimento a travs del tiempo. A travs de estos resultados se
confirma de manera estadstica a las tendencias de la evolucin del proceso de
oxidacin microbiana de los minerales sulfurosos presentes en los jales: disminucin
del pH y de la concentracin de ion ferroso disuelto; mientras que el ORP, acidez,
concentracin de ion sulfato, frrico y nmero de clulas, incrementaron con el avance
de las cinticas. Con relacin al Fe total, los valores ms altos se dieron durante los
primeros veinte das y la concentracin fue disminuyendo con el tiempo hasta los
cuarenta y cinco das de incubacin. Esta disminucin en la concentracin de hierro
disuelto, debe estar asociada a la formacin de jarosita [ ]643 ))(( OHSOKFe , que fue
observada como producto de la fase slida, a partir de los treinta y cinco das de
incubacin, en los tratamientos donde se usaron los cultivos mixtos. Este compuesto
no fue detectado en ningn otro tratamiento (Plantilla 30 del anexo).
De acuerdo a los resultados del anlisis del experimento, se observ que, las
diferencias que se obtuvieron en las concentraciones de las distinas variables
medidas, desde el origen del experimento, hasta los cuarenta y cinco das de
incubacin, fueron positivos y altamente significativas.
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
136/191
117
Cuadro 24. Efecto del tiempo de reaccin en la biolixiviacin de los jales conlas tres diferentes fuentes de energa (se consideran losresultados de todas las pruebas, incluyendo distintas fuentes deenergia y distintos cultivos).
Tiempo deincubacin
pHORP(mV)
In Sulfato(mg/L)
Acidez(mg/L)
Microorganismos(clulas/mL)
5 2.251a 272 e 735.10 e 27.81 f 5.06E+07 bc
10 2.15 a 296 e 778.26 de 27.81 f 6.04E+07 b15 1.95 b 466 d 829.44 d 46.82 e 4.74E+07 c20 1.82 c 522 c 837.24 d 55.01 d 1.21E+09 a
25 1.81 c 530 c 959.14 c 77.26 c 1.15E+09 a30 1.79 cd 551 bc 1046.90 b 86.40 b 1.02E+09 a
35 1.67 de 586 a 1073.69 b 91.78 b 1.80E+06 d40 1.65 e 567 ab 1312.03 a 9834 a 5.24E+05 e
45 1.32 f 553 bc 1388.08 a 97.53 a 1.25E+04 f
Tiempo deincubacin
Protenas(g/L)
Fe (ll)(mg/L)
Fe (lll)(mg/L)
Fe (Total)(mg/L)
Azufre(mg/L)
5 2.8 c1
2.8954 a 2.3514 g 3.2864 a 3703.4 cd10 4.8 b 2.7144 b 2.4859 f 3.2731 a 3511.2 e
15 7.3 ab 2.4141 c 2.7252 e 3.2185 b 3134.2 f20 11.8 a 2.1524 d 2.8597 d 3.2129 bc 3050.1 f
25 11.0 a 2.1180 d 3.0211 c 3.2053 bc 3972.4 cd30 8.4 a 2.0994 de 3.0842 bc 3.1646 cd 5955.6 a
35 7.8 ab 2.0277def 3.1455ab 3.1253 cd 4584.9 b40 7.6 ab 1.9631 ef 3.1460 ab 3.1041 e 4070.9 b
45 1.9 c 1.8884 f 3.1974 a 3.0905 e 3446.9 e
1 Medias entre columnas seguidas con la misma letra son estadsticamente iguales (Tukey 0.05).
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
137/191
119
V DISCUSIN
En este trabajo se realiz el muestreo de residuos, agua y suelos en una
presa de jales donde se depositan residuos que contienen minerales sulfurosos,
adems de xidos de hierro y silito-aluminatos. En este sitio se identificaron
ambientes cidos, tanto en el agua como en suelo, alcanzando valores de pH hasta
de 1.20, favorecindose entonces las condiciones para el desarrollo de
microorganismos acidoflicos que catalizan la oxidacin de los sulfuros como fuente
de energa. El anlisis del cuadro 10 donde se reporta la composicin de las aguas,
denota la generacin de DAM, dados los valores de pH y potencial rdox reportados,
adems de la alta concentracin de Fe y SO4disueltos. Incluso, en el caso del Fe, la
mayor proporcin es ion ferroso (82% en promedio), lo que sugiere reacciones deltipo (Sand et al., 2001):
++ ++ ++ HSOFeOHOFeS ismosmicroorgan 2227 2
42
222 (1)
Mientras que la presencia de los elementos alcalinotrreos (Ca, Na, etc.),
debe ser precisamente resultado de la disolucin cida de los silito-aluminatos, por
reacciones del tipo (Blowes y Jambor, 1994):
Muscovita:
4522221032 )(23
23)]([ OHOSiAlKOHHOHOAlSiKAl +++ ++ (2)
Albita:
4522442
283 )(2122
9 OHOSiAlSiOHNaOHHONaAlSi ++++ ++ (3)
El pH de los suelos, jales y aguas reportados durante los tres muestreos, es
tambin indicativo de la generacin de DAM, lo cual se confirma por la coloracin
rojiza puesta en evidencia en la mayora de los escurrimientos que derivan de la
presa de jales. La coloracin rojiza, debe ser consecuencia de la hidrlisis del ionfrrico producido durante el DAM, de acuerdo a las reacciones (Sand et al., 2001):
OHFeHOFe ismosmicroorgan
23
22 2444 + ++ +++ (4)
+++ HOHFeOHFe 3)(3 323
(5)
Sin embargo, en algunos puntos de muestreo, se detectaron precipitados de
coloracin verde, acompaados de olores caractersticos de H2S. Esto, podra ser
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
138/191
120
consecuencia de la disolucin cida de la pirrotita (Fe1-XS), el segundo sulfuro de
hierro caracterstico de estas mineralizaciones:
SHFeHFeS 222 ++ ++ (6)
Por ms de cinco dcadas se han estudiado a los microorganismos
acidoflicos que participan en los procesos de oxidacin de sulfuros, enfocndose los
estudios la mayor parte del tiempo hacia los quimiolitotrficos, particularmente a
Thiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Sin embargo, en estudios
recientes, se han identificado una mayor variedad de microorganismos en estos
ambientes cidos, entre los que se incluyen varias especies de hetertrofos,
reconocindose incluso que algunos de estos juegan un papel importante en la
oxidacin de los sulfuros y la conservacin de los ambientes cidos (Baker et al.,
2003).
La caracterizacin de las muestras de suelo y agua, as como la composicin
de los jales, demuestra que se tienen las condiciones para la proliferacin de
microorganismos que emplean los componentes minerales como fuente de energa o
que propician el ambiente para su desarrollo. Por ello, se realiz un trabajo de
aislamiento y caracterizacin de microorganismos recuperados del sitio en estudio,
donde predominan ambientes cidos, esto con fin de evaluar su capacidad de oxidar
las especies reducidas de hierro o azufre.El aislamiento y cultivo de los microorganismos se realiz manteniendo
condiciones similares a las de su ambiente de procedencia con el fin de asegurar su
actividad metablica. Gracias a ello, se pudo obtener un consorcio de
microorganismos a partir del cual se aislaron y seleccionaron cultivos de bacterias,
hongos, levaduras y otros eucariotas, todos ellos con capacidad para crecer en el
medio cido. De estos cultivos, fue posible seleccionar y caracterizar fenotpicamente
aquellos que mostraron una mejor adaptacin a las condiciones de cultivo,
destacndose bacterias posibles Thiobacillus sp., hongos posibles Penicillium sp. y
levaduras posibles Rhodotorula sp.
Adems, se demostr la capacidad por disolver minerales que tienen los
microorganismos hetertrofos acidoflicos con los que se trabaj, de una manera
similar a lo reportado por varios autores (Rezende et al., 1999; Brandl et al., 2001;
Gross y Robbins, 2000; Miadokova et al.,.2000; Schneegurt et al., 2001), para la
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
139/191
121
biolixiviacin de minerales empleando microorganismos hetertrofos. Al parecer la
presencia de microorganismos hetertrofos, tienen inferencia metablica en el DAM,
aun cuando los niveles de carbono orgnico sean bajos. Este hecho coincide con los
resultados del trabajo que realizaron Bacelar-Nicolau y Johnson (1999).
Sin embargo, tambin se demuestra aqu que la diversidad de
microorganismos es muy amplia en este ambiente cido, contrario a lo esperado, de
que los microorganismos quimiolitotrficos tipo Thiobacillus sean los ms
abundantes.
Desde el inicio del trabajo, se demostr que los microorganismos hetertrofos
tienen tanta capacidad para aprovechar la oxidacin del ion ferroso, como los
quimiolitotrficos (fig. 6 y 7), de ah que se haya decidido encontrar las mejores
condiciones para mejorar el crecimiento y actividad oxidante por tipo demicroorganismo (bacterias, hongo o levadura) y para el cultivo mixto.
La oxidacin de especies reducidas de hierro y azufre realizada por bacterias,
ya fue demostrada por Blais et al, (1993). En este trabajo se mostr la correlacin
entre el incremento de biomasa y de la concentracin de iones sulfato y Fe(II), as
como un decremento en el pH en los tratamientos donde se adicion cultivo de
microorganismos. Esto se explica por las reacciones (1) y (4), caractersticas de
estos ambientes (Sand et al., 2001).
En este trabajo de tesis, se observ para casi todos los bioensayos realizados
una tendencia general similar de la evolucin de los parmetros indicadores de la
oxidacin del ion ferroso y la produccin de cido, que resultan de las tres reacciones
anteriores: disminucin de la concentracin de Fe(II), disminucin del pH, incremento
de acidez, proliferacin celular, incremento de potencial rdox e incremento de las
concentraciones en solucin de Fe(III) y SO42-.
El descenso del pH de 2.0 a 1.3 y la produccin de sulfato, ocurrieron
simultneamente a travs del tiempo. Al final de los experimentos, virtualmente todo
el Fe(II) ha sido oxidado a la forma Fe(IIl). Esto no se observ en los controles (no
inoculados), durante los 45 das de incubacin, lo que confirma el papel importante
que realizan los microorganismos. En un ambiente cido donde existe la presencia
de microorganismos, el ion ferroso formado durante la oxidacin de la pirita (FeS2)
presente en los jales sulfurosos, posiblemente sea una de las causas que incremente
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
140/191
122
la velocidad de oxidacin biolgica de estos minerales, al favorecerse la produccin
de Fe (III) y la consecuente oxidacin frrica del sulfuro:
+++ ++++ HSOFeOHFeFeS 16215814 242
23
2 (7)
La velocidad de oxidacin est sujeta en esencia a las condiciones del medio
ambiente, puesto que los microorganismos deben encontrar las condiciones de
sustrato (en este caso, ion ferroso o pirita), de temperatura y de humedad. Como se
observ en este trabajo, durante mayo y septiembre, fueron los meses donde se
obtuvo el pH mas bajo, esto es, donde hubo mayor produccin de H+, generados por
la actividad microbiana, puesto que en estos meses se tienen condiciones climticas
ms favorables para la proliferacin de los mismos (temperatura, humedad y aporte
de nutrientes). Un resultado similar tambin fue reportado por Haack y Warren
(2003).
En este caso, los microorganismos con los que se trabaj, fueron aquellos que
se manifestaron sobre un material slido y adems, los que se mantuvieron
presentes cada vez que se realiz el sub-cultivo a partir de la colonia en la resiembra
a material nutritivo fresco. Caso que no se repiti con numerosos microorganismos
que se visualizaron en medio lquido y microscopio.
Sin duda alguna, los micro-nutrientes sugeridos por Silverman y Ludgren
(1959) para microorganismos quimiolitotficos y por Johnson (1995) parahetertrofos fueron exitosos para el aislamiento de ellos en este trabajo. Es
importante sealar que la cuantificacin de los microorganismos de ambas
modalidades nutricionales se realiz con los que se encontraron en solucin y los
que crecieron en medios slidos. Debido a que se ha sugerido, que durante la
oxidacin de los compuestos reducidos de azufre en la biolixiviacin (sulfuros
minerales), es mediada por la reduccin de los iones Fe (lll) a Fe(II), lo cual es
importante en la participacin de polmeros extracelulares de microorganismos y la
proliferacin de biopelculas sobre el soporte mineral (Tributsch, 2001). La formacin
de estos biopolmeros permite a los microorganismos adherirse a los substratos
sulfurosos para realizar la oxidacin de los compuestos, generando fuentes de
energa para su metabolismo (Sand et al., 1995; Ingledew, 1982).
Cuando se realizaron los bioensayos para elegir a los microorganismos ms
eficientes en la oxidacin, los que aqu destacaron fueron los identificados como
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
141/191
123
posibles Thiobacillus, Penicillium sp y Rhodotorula sp. (figuras 24 a 26). Esta
actividad oxidativa de los microorganismos mencionados, ya ha sido citada por otros
trabajos, donde hacen referencia de su eficiencia no solo para oxidar al hierro, sino
tambin por su capacidad para tolerar concentraciones altas de metales, que para
muchas especies incluyendo al hombre, son txicas (Schneegurt et al., 2001; Gross
y Robbins, 2000; Rezende et al., 1999; Acharya et al., 2003). Adems, los cultivos
mixtos con hetertrofos acidoflicos, en la actualidad se estn considerando como el
futuro para los procesos de biolixiviacin (Ehrlich, 2001).
En las reacciones de oxidacin, tuvieron un papel importante, ya que estos
fueron integrantes del consorcio de microorganismos seleccionado (CMS), adems
de los protozoarios (Plantilla 23 en anexo), que ya se han reportado tener un papel
importante en estas reacciones (Johnson y Rang, 1993; Brake et al., 2001), tambinlas bacterias, hongos y levaduras, Aspergillus sp, Mucor sp y Saccharomyces sp,
ademas de Penicillium sp, Rhodotorula sp, Thiobacillus ferrooxidans yT. thiooxidans.
A lo que se le puede atribuir en su funcionalidad sinergtica destacada con respecto
al resto de microorganismos. Adems de estos, en el agua cida tambin se
encontraron microorganismos muy similares a los descritos por Bacelar-Nicolau y
Johnson (1999), los que denominaron serpentines cidos (Plantilla 24 en anexo).
Por otra parte, las concentraciones altas de acidez no solo son producto de la
concentracin de protones, por la oxidacin de la pirita o por la oxidacin del Fe (ll) a
Fe (lll) y posterior hidrlisis de este ltimo, sino tambin por la acumulacin de los
compuestos cidos formados como resultado metablico de los microorganismos
hetertrofos, tales como cido ctrico, cetoglutrico, frmico y lctico atribuido a
hongos y levaduras (Burgstaller y Schinner, 1993). Estos compuestos cidos, se
encuentran en la solucin en forma no disociada, no producen inhibicin para los
microorganismos quimiolitotrficos, reportndose que de esta forma son
transportados a travs de la membrana celular. Cuando estn internamente en el
citoplasma, se disocian para ser utilizados por la clula en sus procesos biosintticos
(Alexander et al., 1987).
La explicacin del porque se obtuvo mayor oxidacin en el medio esterilizado
y no en los no esterilizados, fue posiblemente porque los jales (usados como
substratos) estuvieron sometidos a un proceso de deshidratacin intensa a
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
142/191
124
temperatura menor de 40 C, para eliminar la mayor cantidad de microorganismos
mesoflicos nativos. Adems, al someter a los jales a mayores temperaturas en
medio acuoso, durante la esterilizacin, se produce una oxidacin qumica superficial
de los minerales sulfurosos produciendo iones ferrosos (Mustin et al., 1992), que al
adicionar el sulfato ferroso, incrementa la concentracin del Fe(ll) en solucin y por lo
tanto la disponibilidad para los microorganismos en la prueba (Tonniazo, 1998). Una
vez agotada la fuente de energa, los microorganismos pasaran a obtenerla de los
minerales sulfurosos, a los cuales tienen que adherirse para iniciar el proceso
oxidativo.
Fue evidente la adaptacin de los microorganismos aislados en estudio hacia
los substratos adicionados, puesto que la velocidad de oxidacin durante el
experimento de biolixiviacin final fue significativamente mas rpida (6.62 mg.h -1) quecuando se sometieron al proceso de adaptacin a las diferentes fuentes de energa
(1.5X10-3 mg.h -1).
La comprensin de las reacciones qumicas que se dieron en el sistema,
podran explicarse de la manera siguiente: la contaminacin del agua puede ser
provocada por la intemperizacin fsica y qumica de los sulfuros en los depsitos de
jales. El principal mineral proveedor de energa acumulado en los jales, es la pirita,
por lo que el nivel de acidez y la concentracin de metales contaminantes en el
drenaje de las minas pueden estar directamente correlacionados con la cantidad de
pirita que se encuentre en el rea de los depsitos y la actividad de los
microorganismos. Los procesos geoqumicos implicados en la oxidacin de la pirita,
producen iones ferrosos e hidrgeno, as como electrones disponibles para los
microorganismos como fuente de energa (reaccin 1). Enseguida, tanto el ferroso
como el hidrgeno son oxidados nuevamente para producir iones frricos (reaccin
4). Los iones frricos con el agua producen hidrxido frrico y nuevamente protones
(5). Al combinarse la pirita con el in frrico y el agua, producindose in ferroso,
sulfato y buena proporcin de protones y electrones para utilizarlos como fuente de
energa durante el transporte de electrones (7). Cuando se combina el hidrxido
frrico con el sulfato en solucin se obtienen hidroxi-sulfatos frricos, de acuerdo a la
reaccin (8).
OHSOOHFeSOHOHFe 242
43 2)(2)( ++++ (8)
7/26/2019 TESIS Biolixiviacion de Minerales Sulfuro-ferrosos(191pag)
143/191
125
Cuando el ion frrico formado como producto de la oxidacin del ferroso se
combina con el agua vuelve a producir hidrgenos que acumulados con las
reacciones anteriores, incrementando la concentracin de estos iones y ocasiona
que el pH del agua disminuya.
Una prueba de los resultados de estas reacciones que se puede mencionar en
este trabajo, fue la formacin de jarosita [ ]643 ))(( OHSOKFe , como producto de la fase
slida de los precipitados que se obtuvieron, donde se trabaj con los cultivos mixtos
(Plantilla 30 en anexo). El hidrxido frrico, precipitado cristalizado llamado tambin
hidroxi-sulfato, cuando lleg a su punto de saturacin, al incrementarse
sustancialmente la oxidacin del sulfato ferroso. Este precipitado, tambin se ha
encontrado en las aguas residuales de las minas por la oxidacin del Fe (ll) (Ivarson
y Sojak, 1978; Bigham, 1990).
La accin definitiva de los microorganismos en las reacciones de precipitacin
y solucin qumica, an no esta clara. Lo que si est claro, es que existe un amplio
espectro de microorganismos con requerimientos de energa tambin muy amplia. Lo
que se traduce, en un panorama importante y prometedor para continuar estudiando
sus procesos bio