biolixiviacion cuantificacion bacterias

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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACIÓN MEDIANTE NMP-PCR MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA KATHLEEN INGRID HOLZER SCHAA PROFESOR GUÍA: Sra. BLANCA ESCOBAR MIGUEL MIEMBROS DE LA COMISIÓN: Sra. ORIANA SALAZAR AGUIRRE Sr. TOMÁS VARGAS VALERO Santiago de Chile Abril, 2007

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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA

CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN PROCESOS DE

BIOLIXIVIACIÓN MEDIANTE NMP-PCR

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN

BIOTECNOLOGÍA

KATHLEEN INGRID HOLZER SCHAA

PROFESOR GUÍA:

Sra. BLANCA ESCOBAR MIGUEL

MIEMBROS DE LA COMISIÓN:

Sra. ORIANA SALAZAR AGUIRRE

Sr. TOMÁS VARGAS VALERO

Santiago de Chile

Abril, 2007

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RESUMEN DE LA MEMORIA

PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍAPOR: KATHLEEN HOLZER SCHAA FECHA: MARZO 2006 PROF.GUÍA: SRA. BLANCA ESCOBAR

“CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN PROCESOS DE BIOLIXIVIACIÓN

MEDIANTE NMP-PCR”

El siguiente trabajo de memoria tiene como objetivo cuantificar mediante la técnica de

NMP-PCR (Número más probable y PCR), poblaciones de las bacterias más importantes en

procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de Cobre: Acidithiobacillus ferrooxidans,

Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

La metodología empleada comprendió dos etapas: una de diseño computacional de

partidores específicos para el reconocimiento de la región 16S rDNA de las especies

Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans y una etapa de trabajo

experimental. Esta se dividió en calibración de la técnica de NMP-PCR, extracción de DNA

genómico de especies provenientes de soluciones de refino e identificación y cuantificación de

las especies de interés mediante la técnica de NMP-PCR. Además, se registró la composición

química de cada muestra de solución de refino: pH, Eh y concentración de Fiero total, Fe+3, Fe+2,

sulfato y Cu.

Se logró implementar cada una de las etapas antes mencionadas. Se determinaron los

partidores específicos. Con esto, se logró identificar y cuantificar Acidithiobacillus ferrooxidans

en el 100% las muestras; y Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans

sólo en el 70%; en tanto que Leptospirillum ferrooxidans no fue detectado en las muestras

analizadas. La etapa de calibración de la técnica mostró una diferencia de 6 órdenes de magnitud

entre las técnicas de recuento directo y de NMP-PCR, lo que puede atribuirse a la pérdida celular

en las etapas previas a la cuantificación. Por último, no fue posible establecer una relación entre

la concentración bacteriana y la composición de las soluciones, debido principalmente a la falta

de estudios de población microbiana de procesos reales de biolixiviación.

En resumen, se trata de una técnica cuya implementación aún se está trabajando, cuya

mayor importancia es permitir identificar y cuantificar especies directamente desde muestras de

soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Sin embargo, debe ser

validada mediante el uso de otras técnicas de cuantificación sobre muestras del mismo origen.

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A mi familia, juntos vamos a hacer cosas grandes,

son únicos, los quiero.

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AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer a cada uno de los que me apoyaron, acompañaron, escucharon,

soportaron y entendieron en todos estos años de estudio.

Los más importantes, mi familia. Mis papás, por aguantarse todas mis crisis, mis dudas y

mis cambios de humor (especialmente cuando tenía una prueba para la cual estudiar o un trabajo

que entregar), gracias por su paciencia y amor. Mis hermanos, Heilkki (mi “mellizo”) y Karen

(mi “hermanita chica”) nuestras peleas no tienen comparación, sin ellas no seríamos los mismos,

gracias por hacerme reír. Y mi “cuarta hermana” Angélica, te quiero mucho. Ustedes son lo más

importante para mí.

A mi profesora guía, Blanquita, gracias por todo el tiempo, por ser tan preocupada de mi

trabajo, por sus consejos y nuestras conversaciones. Aprendí mucho con usted.

A mis amigos y compañeros. Los más antiguos, los que entraron a la Escuela conmigo,

gracias por todo Ha Nui y Magaly, ustedes sí que me entienden. Mis compañeros BT, gracias por

hacer de las clases un momento agradable, me reí mucho con ustedes, hicieron que fuera más

fácil y más entretenido terminar la carrera. Y mis amigas químicas, Gabriela, Carmina y Perla, lo

hemos pasado bien, no? Sobre todo en nuestros paseos en Buin.

Gracias a todos.

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ÍNDICE

1 CAPÍTULO I: Introducción ..............................................................4

1.1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................4

1.2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ......................................................................7

1.2.1 Proceso de biolixiviación......................................................................................7

1.2.2 Microorganismos presentes en procesos de biolixiviación...................................10

1.2.3 Técnicas de detección y cuantificación de microorganismos ...............................12

1.2.4 Amplificación y cuantificación del gen 16s rDNA mediante PCR-NMP .............17

1.3 DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO............................................................................21

1.3.1 Presentación y justificación del proyecto ............................................................21

1.3.2 Objetivos ............................................................................................................22

1.3.3 Alcances .............................................................................................................23

2 CAPÍTULO II: Materiales y Métodos ............................................24

2.1 ESTRATEGIA DE TRABAJO...................................................................................24

2.2 MATERIALES ..........................................................................................................24

2.2.1 Muestras.............................................................................................................24

2.2.2 Reactivos............................................................................................................25

2.2.3 Microorganismos................................................................................................25

2.2.4 Equipamiento .....................................................................................................25

2.3 MÉTODOS ................................................................................................................26

2.3.1 Diseño de partidores específicos .........................................................................26

2.3.2 Extracción de DNA ............................................................................................28

2.3.3 Amplificación del 16s rDNA mediante PCR.......................................................32

2.3.4 Técnica de determinación del número más probable NMP. .................................34

3 CAPÍTULO III: Resultados y Discusión.........................................35

3.1 PARTE COMPUTACIONAL ....................................................................................35

3.1.1 Diseño de partidores ...........................................................................................35

3.2 PARTE EXPERIMENTAL ........................................................................................39

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3

3.2.1 Extracción de DNA ............................................................................................39

3.2.2 Extracción de DNA desde cultivos puros ............................................................39

3.2.3 Extracción de DNA desde soluciones de refino...................................................42

3.2.4 Extracción de DNA desde muestras de mineral...................................................43

3.2.5 Determinación de temperatura de alineamiento de partidores específicos para

Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans ...................................44

3.2.6 Temperatura de alineamiento de partidores específicos para Acidithiobacillus

thiooxidans ........................................................................................................................46

3.2.7 Temperatura de alineamiento de Sulfobacillus thermosulfidooxidans ..................49

3.2.8 Detección y cuantificación de DNA....................................................................51

4 CAPÍTULO IV: Conclusiones .........................................................63

5 ANEXOS...........................................................................................65

5.1 ANEXO I. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO...............65

5.2 ANEXO II. MÉTODOS .............................................................................................68

5.2.1 Electroforesis en gel de agarosa ..........................................................................68

5.2.2 Protocolo determinación de fierro .......................................................................68

5.3 ANEXO IV. CEPAS UTILIZADAS EN EL DISEÑO DE PRIMERS ........................69

5.3.1 Acidithiobacillus thiooxidans..............................................................................69

5.3.2 Sulfobacillus thermosulfidooxidans.....................................................................71

5.4 ANEXO V. TABLA DE NMP ...................................................................................72

5.5 ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS..........................................73

6 BIBLIOGRAFÍA..............................................................................74

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1 CAPÍTULO I: Introducción

1.1 INTRODUCCIÓN

Durante los últimos 50 años la vida útil de las reservas mundiales conocidas de cobre se

han mantenido constantes. La discusión planteada hoy en día no es el agotamiento de las

reservas, si no la capacidad de innovación en tecnologías que permitan satisfacer la demanda del

mineral. La demanda de cobre total para el siglo XXI se estima en 5 mil millones de toneladas,

unas 10 veces la producción del siglo XX. En este escenario Chile juega un rol fundamental con

un 35% de la producción mundial. Preservar el liderazgo obtenido dentro de la producción

minera significaría aumentar la producción a 11.5 millones de toneladas para el año 2050, lo que

pasaría por incentivar la creación de nuevas tecnologías de producción competitivas,

involucrando a toda la producción privada. Una de estas tecnologías es el proceso de

Biolixiviación, la cual tiene un rol cada vez más importante dentro de la industria minera.

Las reservas minerales disminuyen en ley y contenido de óxidos a través del tiempo,

aumentando la cantidad de sulfuros, lo que hace más difícil la extracción con tecnologías

convencionales. Todo este material sulfurado cuyo contenido de cobre no es posible recuperar,

ha sido considerado de descarte por décadas. La biolixiviación, practicada industrialmente desde

1960 para el tratamiento de minerales de baja ley en botaderos (dump leaching), permite el

tratamiento de este material y ha permitido incorporar como reservas los millones de toneladas de

minerales de descarte acumulados en diversas minas de cobre del mundo [1]. La contribución de

la biolixiviación es estimada en un 15% a la producción mundial total de cobre [2].

La lixiviación es definida como un proceso hidrometalúrgico de disolución para la

recuperación de metales desde minerales. En particular un mineral sulfurado es solubilizado (o

lixiviado) en ambiente ácido y en presencia de un agente oxidante, el cual al reducirse capta

electrones desde el sulfuro y posibilita así el rompimiento de su estructura. La disolución de

sulfuros en condiciones ambientales es termodinámicamente posible en presencia de oxígeno,

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pero muy lenta. Sin embargo el proceso es fuertemente catalizado ante la presencia de ciertos

microorganismos que están presentes en la microflora natural del mineral, esto es lo que se

denomina biolixiviación [1].

La Biolixiviación se ha transformado en una alternativa atractiva debido a una serie de

ventajas respecto de los procesos convencionales para la recuperación de minerales. Entre ellas se

puede nombrar la baja necesidad energética, reduciéndose las temperaturas de operación desde

los 1500ºC hasta menos de 100ºC. No produce emisiones de gases sulfurados y se reduce el

consumo de ácido gracias a la capacidad de las bacterias de producirlo. Permite el tratamiento de

minerales y productos residuales pobres, los que son imposibles de tratar con los procesos hidro y

pirometalúrgicos convencionales. Todo esto junto con reducidos costos de operación lo hacen un

proceso económico y ambientalmente más seguro.

El cobre constituye el principal recurso minero de Chile y el producto más importante de

exportación. Representa, en promedio, la tercera parte de los ingresos de exportaciones del país y

durante el 2005 alcanzó a un 42%. Chile tiene las mayores reservas explotables de cobre del

mundo, las que alcanzan a más de 250 millones de toneladas de cobre fino, lo que representa un

35% del total de cobre explotable a nivel mundial [3].

Evidentemente la minería representa una actividad de gran importancia para el

crecimiento económico del país, y en particular la extracción de cobre. Esto junto con el

escenario de la actividad para el siglo XXI hace necesario sustentarla mediante la utilización de

nuevas tecnologías de producción como la Biolixiviación. Para hacer de ésta una tecnología más

eficiente es necesaria una mayor comprensión y caracterización de los procesos y

microorganismos involucrados, y de este modo aprovechar al máximo sus capacidades.

La microflora natural del mineral es variada, desde bacterias mesófilas y termófilas que

oxidan hierro y azufre, sólo hierro o sólo azufre, hasta arqueas. Las bacterias involucradas son

microorganismos acidófilos, autótrofos y quimiolitrótofos, es decir viven a pH bajo, ocupan

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como fuente de carbono CO2 y obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos

(como el Fe y el S). El más común (encontrado en mayor cantidad, el más estudiado y utilizado)

en procesos industriales de biolixiviación es la especie Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin

embargo existen muchas otras que de acuerdo a las condiciones del medio del proceso

predominarán sobre la anterior [4].

Para detectar y cuantificar bacterias es de suma utilidad el uso de técnicas moleculares,

dada la dificultad que presenta el cultivarlas. Por otro lado las técnicas de cultivo impiden

determinar o detectar la población bacteriana real de un proceso de Biolixiviación, discriminando

sólo entre hierrooxidantes y azufreoxidantes, o privilegiando el crecimiento de una especie por

sobre otra. Pero además, se hace necesario el poder cuantificar las bacterias de una manera

rápida, con el fin de poder determinar bajo ciertas condiciones cuál población de bacteria es la

que mejor se desarrolla, haciendo más eficiente el proceso.

Esto último es lo que se pretende abordar en el siguiente trabajo, estudiando la microflora

natural de una solución de proceso de Biolixiviación mediante técnicas de biología molecular de

análisis de DNA. Y de este modo, cuantificar cada una de las especies en estudio,

Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y

Sulfobacillus thermosulfidooxidans, y relacionar su abundancia con los parámetros de la solución

de proceso.

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1.2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS

1.2.1 Proceso de biolixiviación

La Biolixiviación se ubica dentro de la clasificación de proceso comercial de Biominería,

que es el término usado para describir el uso de microorganismos en la extracción de metales

desde minerales o concentrados sulfurados y/o con contenido de hierro. Cuando el metal es

extraído desde soluciones, el proceso recibe el nombre de biooxidación o biolixiviación.

El verdadero papel que desempeñan los microorganismos en la biooxidación de minerales

es un debate de largo tiempo, en cuanto a si el mecanismo usado por los mismos sería directo o

indirecto. El ataque directo es visto como un proceso en el cual componentes presentes en la

membrana bacteriana interactúan directamente con el metal y sus compuestos sulfurados usando

un tipo de mecanismo enzimático. Por otro lado, el mecanismo indirecto tiene que ver con al

ataque químico del ión férrico o del ácido sobre el mineral sulfurado, lo que resulta en la

disolución del mineral y la formación de ión ferroso y varias formas de sulfuro [5].

A pesar de una serie de mecanismos nuevos que se han propuesto, aún continua

estudiándose ambos mecanismos para una mejor comprensión del proceso. A continuación se

describe cada uno de los mecanismos.

1.2.1.1 Mecanismos directo

En este caso, la bacteria ataca al sulfuro metálico de forma directa, adhiriéndose a la

superficie del mineral y posteriormente lo oxida enzimáticamente por transporte de electrones

desde la parte reducida del mineral al oxígeno. La reacción general es:

422 MSOOMS bacterias →+

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La adherencia de las bacterias al mineral es una condición necesaria para la lixiviación.

Sin embargo, no es una condición suficiente en sí misma debido a la existencia de un mecanismo

alternativo: el indirecto. Las bacterias libres en solución pueden secretar un oxidante al medio

que lixivia al mineral en forma alternativa al propio mecanismo directo.

1.2.1.2 Mecanismo indirecto

A diferencia del mecanismo directo, el indirecto considera principalmente la acción de

iones férricos sobre el mineral sulfurado, disolviéndolo. A partir de esta reacción química se

producen ión ferroso y azufre elemental, los que posteriormente son oxidados biológicamente a

ión férrico y ión sulfato, respectivamente. Este mecanismo no necesita la adherencia de las

células al mineral. Las ecuaciones de este mecanismo son las siguientes:

+++ ++→+ 223 22 FeSMFeMS

En el caso de la pirita, la reacción es:

−+++ ++→++ 2

42

23

2 21615814 SOHFeOHFeFeS

Por otro lado, la oxidación del ión ferroso y del azufre elemental catalizada por la acción de

bacterias se lleva a cabo según las siguientes reacciones:

OHFeHOFe bacterias2

32

2 22212 + →++ +++

4222 223 SOHOHOS bacterias →++

Para la explicación de este mecanismo, en los últimos años distintos investigadores han

tratado de proponer modelos que aclaren su funcionamiento. Así los trabajos del grupo de W.

Sand en la Universidad de Hamburg [6] son muy interesantes. Según este modelo los iones

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férricos y/o los protones son los únicos agentes que disuelven el sulfuro, por lo tanto, el

mecanismo es estrictamente indirecto. Por otro lado, el modelo afirma que las funciones de las

bacterias son: regenerar los iones férrico y/o los protones; y concentrar estos iones en la interfase

mineral/agua o mineral/célula bacteriana para favorecer la degradación del mineral. También

proponen la formación de una capa fina de exopolímeros (EPS) que rodea las células, en la cual

se llevan a cabo los procesos químicos que producen la degradación del sulfuro (Figura 1).

Basándose en los compuestos intermediarios, diferencian dos tipos de mecanismo indirecto: vía

tiosulfato y vía polisulfuro.

Figura 1. Diagrama esquemático de las reacciones involucradas en el proceso de lixiviación a través de la superficie

que rodea al mineral, llamada exopolisacárido (EPS).

Mecanismo del tiosulfato

Aquí la solubilización del metal se produce gracias al ataque del ión férrico sobre el

mineral sulfurado, donde el tiosulfato es el principal compuesto intermedio y el sulfato el

principal producto final. La reacción sobre calcopirita procede de la siguiente manera:

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Mecanismo del polisulfuro

En este caso la solubilización del metal sulfurado es una combinación del ataque de

protones y del ión férrico, donde el azufre elemental es el principal compuesto intermedio. Este

azufre elemental es relativamente estable, pero puede ser oxidado a sulfato por la acción de

microorganismos azufre-oxidantes. Así la reacción procede de la siguiente manera:

Esto explica por qué algunas bacterias como Acidithiobacillus thiooxidans son capaces de

oxidar sólo algunos minerales sulfurados. Por otro lado, el ión ferroso producido durante el

proceso puede ser reoxidado por la acción de microorganismos hierro-oxidantes a ión férrico.

Por lo tanto, la acción de los microorganismos es la de proveer ácido sulfúrico para el

ataque proteónico y mantener el hierro en su estado oxidado.

1.2.2 Microorganismos presentes en procesos de biolixiviación

Los microorganismos que participan en procesos de lixiviación de minerales se

caracterizan por su capacidad de desarrollarse en ambientes extremos. Los ambientes acuosos

asociados a los vertidos de las minas se caracterizan por su bajo pH, altas concentraciones de

metales pesados y en algunos casos por elevadas temperaturas. A pesar de estas condiciones,

existen estos microorganismos, que además son capaces de desarrollarse y reproducirse. En estos

ambientes los microorganismos utilizan como fuente primaria de energía las especies reducidas

del azufre y ciertos metales en disolución [7].

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Una gran variedad de microorganismos participan en la oxidación de minerales

sulfurados, los que constituyen la microflora natural de estos minerales. Es decir, coexisten

distintos microorganismos cuyo metabolismo aporta los elementos necesarios para el desarrollo

de cada uno de ellos. Estos tienen varias características en común: son quimiolitótrofos (ocupan

compuestos inorgánicos como fuente de energía (azufre reducido o Fe+2), son autótrofos (CO2

como fuente de carbono), son acidófilos (pH óptimo está en un rango de 1.6 a 2) y de acuerdo a

la temperatura a la que pueden desarrollarse se dividen en mesófilos, termófilos moderados y

termófilos [4, 7].

Dentro de los microorganismos que coexisten en los minerales de lixiviación se

encuentran arqueas y bacterias, aunque se han encontrado algunos hongos y levaduras también.

Aunque está claro que existe una gran variedad de microorganismos involucrados, los más

importantes en el proceso de biolixiviación, y de los que se tiene mayor conocimiento son

principalmente bacterias, entre ellas: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans,

Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus termosulfidooxidans. Y también algunas arqueas:

Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus metallicus, etc. [4]. Se describen a continuación las

principales características de las especies lixiviantes que involucra este estudio:

Acidithiobacillus ferrooxidans: durante años se pensó que era el único organismo

importante en biolixiviación, y hoy en día es considerado como uno de los más importantes. Es

una bacteria Gram-negativa, acidófila, autótrofa y mesófila, cuya temperatura óptima de

crecimiento es entre 30 y 35ºC. Obtiene su energía de la oxidación de ion ferroso y especies

reducidas de azufre y su pH óptimo de crecimiento está entre 1.8 y 2.5 [4, 7]

Leptospirillum ferrooxidans: microorganismo aislado por primera vez en 1972, es una

bacteria Gram-negativa, acidófila, mesófila, aytótrofa y quimiolitótrofa [10]. A diferencia de A.

ferooxidans es capaz de oxidar sólo hierro ferroso, es más resistente al ácido (crece a pH 1.2),

más tolerante a temperaturas más elevadas y menos sensible a la inhibición por Fe+3 [4, 8].

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Acidithiobacillus thiooxidans: en procesos de biolixiviación aparece siempre junto con A.

ferooxidans y son indistinguibles morfológicamente. Es una bacteria Gram-negativa, acidófila,

autótrofa y mesófila, cuya temperatura óptima de crecimiento es entre 30 y 35ºC. Obtiene su

energía de la oxidación de especies reducidas de azufre y tolera mayores concentraciones de

ácido que A. ferooxidans.

Sulfobacillus termosulfidooxidans: se trata de una bacteria termófila moderada

soportando temperaturas de hasta 50ºC. Es un microorganismo mixotrófico, pudiendo asimilar

carbono tanto desde CO2 (autótrofo) como de azúcares (heterótrofo). Es una bacteria Gram-

positiva, capaz de oxidar hierro ferroso y azufre

1.2.3 Técnicas de detección y cuantificación de microorganismos

El conocimiento de la microbiología de un proceso de biolixiviación es clave en el

avance comercial de la operación de este proceso. Hasta hoy la ecología microbiana de los

procesos a gran escala de biolixiviación de minerales de cobre secundarios, columnas y pilas, han

sido escasamente estudiados y no se han hecho grandes esfuerzos para conocer, entender y

manejar los componentes microbiológicos del proceso. Es fundamental contar con técnicas de

identificación y cuantificación que permitan obtener información real de la dinámica poblacional

de la solución de proceso.

Durante años se ha utilizado como único método de detección la técnica de cultivo, el que

es eficiente en detectar el microorganismo más estudiado en procesos de biolixiviación:

Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin embargo, hay estudios que sugieren que existen otras especies

que jugarían un papel importante en el proceso como Leptospirillum ferrooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans, especies que requieren mucho tiempo para crecer en medio sólido o que

son incapaces de formar colonias [9]. Por otro lado, la dificultad de aislar las cepas desde un

conjunto de microorganismos con requerimientos metabólicos semejantes, hace que los métodos

tradicionales sean insuficientes en describir la población microbiana de un sistema complejo. Las

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técnicas moleculares e inmunológicas han sido desarrolladas para poder detectar y cuantificar

grupos filogenéticos específicos de microorganismos, lo que es importante para entender la

dinámica poblacional del sistema.

En la actualidad las técnicas utilizadas en el estudio de la diversidad microbiana de

procesos de biolixiviación, para la detección y cuantificación de las especies se dividen en:

técnicas convencionales de cultivo, técnicas inmunológicas y técnicas moleculares basadas en el

DNA.

Métodos convencionales

Corresponden a las técnicas de cultivo convencional y no convencional, análisis

microscópico y Número Más Probable (NMP). Para llegar a la detección y posterior

cuantificación de los microorganismos es necesario primero aislarlos del medio y luego

cultivarlos para obtener una concentración suficiente que permita estudiarlos. Las técnicas de

cultivo utilizadas y descritas se pueden dividir de acuerdo al medio de cultivo utilizado: agarosa,

sílica gel o filtros de membrana [10]. En la literatura se han reportado otras metodologías de

cultivo no convencional para el crecimiento de especies autótrofas acidófilas, las cuales son

sensibles a la presencia de orgánicos derivados principalmente de la hidrólisis del medio de

cultivo sólido (agarosa, agar, etc.). Estas técnicas impiden la inhibición del crecimiento por esta

materia orgánica proveniente de la hidrólisis de la agarosa. Una de ellas es la técnica de placa de

doble capa.

Para la cuantificación es comúnmente utilizado el recuento directo al microscopio directo,

y la metodología NMP. Esta última consiste en el cultivo de bacterias en medio líquido

específico, el que posteriormente es analizado para determinar la presencia de los

microorganismos deseados y su cuantificación mediante la tabla de NMP.

Page 17: biolixiviacion cuantificacion bacterias

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Estas técnicas presentan una serie de desventajas y dificultades, que acarrean

principalmente mayores tiempos de trabajo. En primer lugar, las técnicas de cultivo requieren

largos tiempos de espera y monitoreo de las muestras, además de la dificultad de cultivar

microorganismos que no crecen en medio sólido [8]. En segundo lugar, el cultivo de

microorganismos no permite la identificación de una especie filogenética específica, si no que

aisla microorganismos de acuerdo a sus necesidades nutricionales: hierrooxidantes o

azufreooxidantes. Por último, esta técnica no entrega una visión acabada de la población nativa

de la solución de proceso al utilizar medios con composición diferente a la de origen. Esto

privilegia el crecimiento de un microorganismo por sobre otro o simplemente algunas especies no

son capaces de crecer. Todas estas dificultades son obstáculos para la posterior cuantificación,

siendo la etapa de cultivo la etapa previa necesaria.

Métodos inmunológicos

En el intento por detectar e identificar variedades de bacterias acidofílicas, se han

desarrollado técnicas inmunológicas de identificación y cuantificación basadas en el uso de

anticuerpos marcados fluorescentemente. Estos métodos son de alta sensibilidad e incluso pueden

identificar serotipos específicos. En la literatura se ha encontrado el uso de estas técnicas para la

detección de Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferrooxidans, Sulfolobus

acidocaldarius y Acidithiobacillus caldus [11, 12, 13]. Sin embargo, estos métodos sólo permiten

detectar células en suspensión y son ineficientes en el caso de células adheridas. Así se ha

desarrollado la técnica de enzyme-linked immunofiltration assay (ELIFA) [13], una técnica

derivada del método ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) que permite la detección de

bacterias adheridas al mineral.

Sin embargo presentan una serie de desventajas como son el alto costo asociado y los

múltiples serotipos que existen por especies, de los cuales hay una gran cantidad para los que no

existen anticuerpos asociados.

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Métodos moleculares basados en el DNA.

Los métodos moleculares de identificación de microorganismos se basan en el estudio de

las moléculas de DNA y RNA, los que en su mayoría, a excepción de los métodos de hibridación

(DNA-RNA, DNA-DNA, RNA-RNA), están basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR). La PCR permite obtener un elevado número de copias del fragmento a amplificar a partir

de una pequeña concentración de DNA, prescindiendo del cultivo de los microorganismos. Con

ella es posible el análisis de ciertas regiones de los genes 16S, 23S y 5S del rDNA, usando

partidores específicos que reconocen la secuencia nucleotídica de estas regiones. En el caso del

gen 16S, es una herramienta comúnmente utilizada en la identificación de bacterias, esto pues es

una unidad evolutivamente conservada y contiene zonas que son comunes para microorganismos

filogenéticamente semejantes. Por otro lado, se trata de un gen relativamente corto, de

aproximadamente 1500pb.

En la literatura se ha reportado el uso de técnicas basadas en PCR tanto para identificación

como para cuantificación de microorganismos, siendo en su mayoría técnicas semi-cuantitativas

es decir, revelan solo abundancia relativa dentro de una población. Dentro de esta clasificación se

encuentran los métodos basados en polimorfismos, con los que es posible detectar pequeñas

diferencias en secuencias específicas de DNA usando por ejemplo, enzimas de restricción. Luego

es posible diferenciar fragmentos de la secuencia ya sea por el tamaño del fragmento de

restricción o por diferencia de nucleótidos. Para ambientes biolixiviantes se ha aplicado distintos

métodos basados en poliformismos: RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism analysis),

para diferenciar fragmentos de restricción desde un producto de amplificación del gen 16S rDNA

[14, 15]; DGGE (Denaturing Gel Electrophoresis), para separar especies de acuerdo a la

migración del 5S rRNA a través de un medio denaturante [16, 17]; RADP (Randomly amplified

polymorphic DNA) y REP-PCR (PCR amplification of repetitive genomic sequences) que usa

partidores no específicos en la amplificación de fragmentos para la creación de patrones

genómicos, entregando resultados taxonómicos discriminatorios [18] y ARDREA (Amplified

ribosomal DNA restriction enzyme analysis). Por otro lado, se ha aplicado otras técnicas

asociadas a PCR como el análisis del espacio intergénico 16S-23S (ISR) [19], amplificación del

16sS rDNA [9] y real-time PCR [20].

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Los métodos de amplificación presentan una sensibilidad superior a las técnicas de

hibridación. Por esto su uso se ha hecho común en la detección de diversos microorganismos de

distintos ambientes microbianos. Sin embargo, existe una técnica de hibridación cuantitativa,

FISH (Fluorescente in situ hybridization), mediante la cual no es necesario extraer el material

genético y que detecta DNA o RNA que se encuentra en la célula de la especie a identificar. La

secuencia de prueba es marcada con un compuesto fluorescente por lo tanto, las células con

secuencias complementarias al DNA de prueba pueden ser visualizadas en microscopios de

epifluorescencia. Se trata de una técnica que entrega información acerca de la diversidad

bacteriana de la muestra además del aporte de cada especie, que no depende de extracción de

DNA; sin embargo, es una técnica laboriosa y de gran consumo de tiempo.

Las técnicas nombradas anteriormente son en su mayoría de detección e identificación de

especies, y entregan información importante acerca de la composición de una comunidad y de su

diversidad microbiana; no dependen de etapas de cultivo, siendo más rápidos que los métodos

tradicionales. En el caso de las técnicas basadas en polimorfismos, tienen la desventaja que el

análisis de los resultados depende de la resolución visual de los distintos fragmentos de

restricción, como ocurre con ARDREA, lo que limita el análisis a una reducida fracción de

fragmentos [21]. Otro inconveniente de técnicas como DGGE es el requerimiento de gran

cantidad de muestras, siendo todavía técnicas lentas y laboriosas [17]. Por último, generan

perfiles complejos que son difíciles de analizar para comunidades diversas, complicando su

traducción en información taxonómica. T-RFLP es otra técnica basada en polimorfismos que a

diferencia de ARDREA, DGGE o RDP trabaja sobre los fragmentos terminales de restricción,

limitando su número y generando un juego de datos manejable que son analizados de manera

automática por equipos de secuenciación, permitiendo procesar una gran cantidad de muestras

[21]. Sin embargo, todos estos métodos tienen en común que no son técnicas cuantitativas.

Por último, las técnicas asociadas a PCR para la identificación del gen 16S rDNA son

ampliamente usadas en el estudio de la ecología de procesos de biolixiviación, siendo un método

rápido en la detección e identificación de especies desde una comunidad diversa. La

identificación del gen 16S rDNA se utiliza en diversas técnicas asociadas a PCR como etapa

previa, sin embargo en el caso de este trabajo se implementará como técnica individual, que se

Page 20: biolixiviacion cuantificacion bacterias

17

combinará con el método microbiológico de NMP. De este modo, se convierte en una técnica de

detección cuantitativa.

1.2.4 Amplificación y cuantificación del gen 16s rDNA mediante PCR-NMP

Amplificación del gen 16S rDNA mediante PCR

La amplificación directa del gen 16S rDNA desde muestras de poblaciones microbianas

naturales, usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa, ha concentrado gran interés,

convirtiéndose en una técnica atractiva para la caracterización de los miembros de una

comunidad compleja, principalmente porque evita los métodos tradicionales de cultivo. Existen

diversas modalidades de amplificación del 16S rDNA, principalmente referidas al objetivo de

amplificación, realizando la identificación de un microorganismo específico o del conjunto de la

población.

La técnica de PCR constituye una vía de amplificación para la obtención de secuencias

nucleotídicas a partir de una muestra con baja concentración de células y, en consecuencia con

baja concentración de DNA, el que no puede ser detectado por métodos tradicionales de

hibridación. En la PCR la enzima termoestable DNA polimerasa Taq (Thermus aquaticus) es

usada para amplificar la secuencia de DNA de interés. Con este objetivo se diseñan partidores de

oligonucleótidos cuya función es reconocer una secuencia específica de aprox 20pb en una zona

del gen 16s rDNA.

Por medio de ciclos térmicos se lleva a cabo las etapas que comprende un programa de

PCR: denaturación del DNA de doble hebra, alineamiento y extensión. Estas tres etapas

constituyen un ciclo de amplificación y cada una se realiza a una temperatura específica. Para la

denaturación se utiliza una temperatura entre 92 y 95ºC que rompe los enlaces que unen ambas

hebras para separarlas y dejarlas disponibles para el alineamiento con los partidores. La

Page 21: biolixiviacion cuantificacion bacterias

18

temperatura de alineamiento depende de los partidores utilizados ya que en esta etapa los

partidores se unen a cada hebra de DNA en su secuencia complementaria. La última etapa se

realiza a 72ºC, en que la enzima DNA polimerasa Taq realiza la extensión de la hebra de DNA

incorporando los nucleótidos. Por cada ciclo de amplificación se obtiene el doble de DNA de la

etapa previa, por lo tanto luego de n ciclos se tendrá un 2n números de copias.

La técnica de amplificación por si sola es una técnica cualitativa, que permite identificar

un microorganismo específico dentro de una población compleja de microorganismos. Esto es

posible gracias a que el gen 16S rDNA varía filogenéticamente, y posee zonas altamente

conservadas para organismos del mismo género, que sirven como blanco para ser reconocidas por

partidores específicamente diseñados. En bacterias de lixiviación el número de copias de 16S

rDNA por genoma es de 1 a 2, lo que da una relación proporcional entre el número de bacterias y

el número de copias de 16S rDNA por muestra [20].

Aunque la técnica de amplificación mediada por PCR presenta importantes ventajas, tales

como rapidez, sensibilidad, necesidad de baja concentración de templado, independencia de

cultivo y especificidad, trae consigo una serie de desventajas intrínsecas de la técnica. Uno de

estos problemas es la aparición de falsos positivos por efecto de contaminación con ácidos

nucleicos; en este caso la extrema sensibilidad de la técnica pasa a ser un problema, basta una

minúscula concentración de estas secuencias para que sirvan de templado y generen

amplificación indeseada [21]. También hay que considerar la inhibición de la reacción, que puede

ser por degradación de reactivos (como la hidrólisis de dNTPs por efecto de ciclos de

congelamiento/descongelamiento) o por contaminantes como metales y proteínas que inhiben la

acción de la enzima DNA polimerasa Taq. Otro problema es la formación de productos

quiméricos o distorsiones (mutaciones puntuales, deleciones, etc.). Por último, se tiene la

amplificación de productos inespecíficos, problema que está relacionado principalmente con el

tiempo y la temperatura de alineamiento.

La técnica por sí sola es de gran utilidad para la identificación y clasificación taxonómica

de diferentes tipos de bacterias, sin embargo no permite obtener una estimación numérica de la

Page 22: biolixiviacion cuantificacion bacterias

19

diversidad bacteriana en una muestra compleja. Para resolver este problema se usa en conjunto

con una técnica microbiológica de cuantificación como es el método de NMP.

Método de NMP

Este método consiste en el cultivo de bacterias en medio líquido específico a distintas

concentraciones. Por medio de diluciones desde el cultivo inicial se construye un juego de

distintas concentraciones de células que son analizadas para detectar la presencia de bacterias.

Cada dilución representa una concentración de células 10 veces menor que la de la dilución

anterior, y por cada dilución se tiene de tres a cinco tubos iguales. Luego se analiza cada juego de

tubos buscando la presencia de bacterias asociada a alguna característica, definiendo la presencia

como una señal positiva (1) y la no presencia como señal negativa (0). Así se llega hasta la

dilución en que todos los tubos del juego dan señales negativas, desde este se busca hacia atrás el

juego de tubos que tenga sólo señales positivas y desde éste se utilizan las dos diluciones

siguientes. Es decir se tendrá una combinación de tres números, cada uno entre 0 y 5, la cual se

busca en una tabla de Número más Probable. La tabla de NMP está construida como la

probabilidad de encontrar determinada concentración de células para la combinación obtenida.

Figura 2. Esquema gráfico del método de Número Más Probable. En este caso la característica asociada a la

presencia de bacterias es la turbidez del medio luego de su desarrollo.

Page 23: biolixiviacion cuantificacion bacterias

20

La implementación PCR-NMP consiste en ocupar la metodología de NMP pero en la

etapa de amplificación, es decir, las diluciones antes mencionadas se realizan en el templado de la

reacción. Así se obtienen amplificaciones a distintas concentraciones de DNA. Esta técnica ha

sido utilizada con relativo éxito en la detección de poblaciones de Nitrobacter en suelo [22],

subestimando en algunos casos la población; sin embargo, resultó ser un procedimiento rápido

eficiente y directo que, con este trabajo, se pretende utilizar en bacterias de biolixiviación.

Page 24: biolixiviacion cuantificacion bacterias

21

1.3 DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO

1.3.1 Presentación y justificación del proyecto

Dada la importancia de la actividad minera en Chile y la inevitable utilización de nuevas

tecnologías que permitan optimizar el proceso de extracción desde minerales cuya ley es cada día

menor, es muy importante la aplicación de la biolixiviación de minerales.

Para la implementación de un proceso de Biolixiviación es necesario conocer y manejar

muy bien todos los parámetros involucrados. Debido a que son microorganismos los que llevan a

cabo el proceso, es vital otorgarles las condiciones óptimas para su desarrollo. Lo anterior lleva a

la necesidad de identificar los microorganismos que conviven en un determinado mineral de

interés, de una forma rápida y confiable. Las técnicas de cultivo más usadas no son eficientes

para todos los microorganismos de ambientes biolixiviantes, requieren de mucho tiempo, no

permiten diferenciar microorganismos con necesidades nutricionales similares y no puede

reproducir las mismas condiciones ambientales del proceso real.

Por otro lado, además de saber qué microorganismo está presente en el mineral, también

interesa conocer su concentración. De este modo, se puede variar parámetros con el fin de

mejorar su rendimiento o favorecer el crecimiento de algún microorganismo específico. No es

objetivo de esta memoria la variación de parámetros de la solución de proceso, pero la

cuantificación permitirá tener una visión general del comportamiento de la población microbiana

que entregue pautas para una eventual optimización del proceso en estudio.

Este proyecto pretende implementar una metodología rápida y confiable para la

cuantificación de bacterias en procesos de biolixiviación de minerales, en el marco del estudio de

la dinámica poblacional de soluciones de bolixiviación. Por esto, es fundamental contar con

muestras de procesos industriales reales, sin la utilización de etapas previas de cultivo. En primer

lugar se extraerá el DNA desde las muestras de solución de salida de una columna de

biolixiviavión, para luego realizar la detección de los microorganismos y su posterior

cuantificación con las técnicas de PCR y NMP acopladas. Para la implementación de la técnica

de PCR es necesario contar con los partidores específicos para cada bacteria, en este caso se

utilizarán partidores previamente diseñados para Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum

ferrooxidans, y se diseñarán los partidores correspondientes para Acidithiobacillus thiooxidans y

Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

Page 25: biolixiviacion cuantificacion bacterias

22

1.3.2 Objetivos

1.3.2.1 Objetivo general

Poder cuantificar mediante Técnicas Moleculares las variaciones de las poblaciones de las

bacterias más importantes en procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de Cobre.

.

1.3.2.2 Objetivos específicos

n Diseñar primers específicos para amplificar la región 16S rDNA de Acidithiobacillus

thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

n Utilizar la técnica de PCR para la detección de poblaciones de A. ferrooxidans, L.

ferrooxidans, A. thiooxidans y S. thermosulfidooxidans en soluciones de proceso.

n Utilizar la técnica de NMP- PCR para la cuantificación de poblaciones de A. ferrooxidans,

L. ferrooxidans, A. thiooxidans y S. thermosulfidooxidans en soluciones de proceso.

n Estudiar la relación entre las poblaciones bacterianas cuantificadas y la composición de

las soluciones y condiciones ambientales del proceso.

Page 26: biolixiviacion cuantificacion bacterias

23

1.3.3 Alcances

De acuerdo a los objetivos de este trabajo lo que se quiere lograr es la cuantificación de

variaciones de poblaciones de bacterias en procesos de biolixiviación de minerales sulfurados de

cobre desde soluciones de proceso, para tener una visión más acabada de las características del

proceso. Con este fin, se implementará la técnica cuantitativa de PCR-NMP, basada en la

identificación del gen 16S rDNA mediante partidores específicos para cada tipo de bacteria:

Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum ferroxidans, Acidithiobaciluus thiooxidans y

Sulfobaciluus thermosulfidooxidans. La implementación de la técnica tiene como pasos previos

en primer lugar el diseño de partidores específicos para los microorganismos Acidithibacillus

thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans. En segundo lugar la detección de cada

microorganismo en cada una de las muestras, y su cuantificación.

Con estos datos, se hará un análisis que relacione los parámetros de la solución de proceso: pH,

Eh, porcentaje de sulfato y cobre, con la cantidad de cada microorganismo en cada muestra.

Page 27: biolixiviacion cuantificacion bacterias

24

2 CAPÍTULO II: Materiales y Métodos

2.1 ESTRATEGIA DE TRABAJO

La primera actividad para avanzar en el desarrollo del trabajo es el diseño de partidores

para Sulfobacillus thermosulfidooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans. Se necesita partidores

que reconozcan la mayor cantidad de secuencias de 16s rDNA disponibles en las bases de dato,

para cada bacteria y además que sean específicos.

Luego se trabaja con muestras de solución de una columna de biolixiviación de las cuales

se extrae el DNA, y con cada una se realiza la detección de cada microorganismo para después

proceder con la cuantificación.

Para la calibración de la técnica se hace la cuantificación de Acidithiobacillus

ferrooxidans, cultivado con sulfato ferroso en medio de cultivo MC pH 1.6.

2.2 MATERIALES

2.2.1 Muestras

Para el desarrollo de este trabajo se analizaron muestras de solución y de mineral

provenientes de la columna de biolixiviación MC-11 de la Compañía Minera El Abra. Se tiene a

continuación la descripción del mineral y de la solución de percolado:

• Mineral Bornita-Calcopirita dominante (Bn-Cpy, DOE2).

• Percolado: soluciones acuosas levemente ácidas de CuSO4, gravedad específica 1.11-1.10

Page 28: biolixiviacion cuantificacion bacterias

25

2.2.2 Reactivos

En cada etapa del proceso, cultivo, extracción de DNA y amplificación del 16s rDNA se

utilizan una serie de reactivos que corresponden a los protocolos correspondientes. Para ver la

composición y elaboración de cada uno ver la sección de Anexos.

2.2.3 Microorganismos

Se utilizaron cultivos de: Acidithiobacillus ferrooxidans, cepa ATCC 19859;

Leptospirillum ferrooxidans, cepa ATCC 29407 y Acidithiobacillus thiooxidans, cepa ATCC

8085. Para Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizó un cultivo de células en azufre que de

acuerdo a un estudio anterior (T-RFLP), mostraba la presencia de este microorganismo.

2.2.4 Equipamiento

• Balanza semianalítica, Precisa 1620C

• Baño térmico, Memmert

• Cámara de electroforesis, Bio JSP

• Cámara de electroforesis

• Fuente de poder, Bio Rad

• Microcentrífuga, Biofuge A

• Termociclador Mastercycler, Eppendorf

• Transiluminador UV, Vilber Loumart

• Centrífuga refrigerada, Sorvall

• Espectrofotómetro

Page 29: biolixiviacion cuantificacion bacterias

26

• Vórtex

• Micropipetas de 2, 10, 20, 100 y 200 µl, Gilbert y Capp

2.3 MÉTODOS

En esta sección se describen cada uno de las metodologías empleadas para cada etapa del

proceso:

- Diseño de partidores específicos para Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans.

- Extracción de DNA desde cultivos puros, soluciones de refino y mineral.

- Detección y cuantificación de cada uno de los microorganismos por medio de

PCR-NMP.

2.3.1 Diseño de partidores específicos

Para poder llevar a cabo la amplificación del gen 16S rDNA de los microorganismos

Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans primero se debe contar con

los partidores para cada uno de ellos. Así, estos deben ser diseñados de manera específica a partir

de secuencias nucleotídicas del gen de distintas cepas disponibles en bases de datos de Internet, y

con la ayuda de herramientas computacionales.

Existen distintas bases de datos disponibles en Internet que almacenan secuencias

nucleotídicas del gen 16S rDNA de diversos microorganismos para los cuales ha sido posible

secuenciar el gen. Para cada uno de los microorganismos hay en la base de datos gran cantidad de

cepas con el gen secuenciado, tanto cultivadas como no cultivadas. Una de estas bases de datos es

Page 30: biolixiviacion cuantificacion bacterias

27

la Ribosomal Database Project II1, RDP, herramienta creada por investigadores de la University

of Illinois at Urbana-Champaign (UIUC) y apoyada por la Michigan State University (MSU),

que además de almacenar secuencias del gen 16S rDNA ofrece análisis de datos en línea,

creación de árboles filogenéticos a partir de rRNA, y alineamiento de secuencias de rRNA. Las

secuencias utilizadas para el diseño de los partidores de las bacterias antes nombradas se

obtuvieron desde esta base de datos. En el caso de Acidithiobacillus thiooxidans se utilizó 17

cepas de las 27 disponibles en la base de datos, con largos que variaron entre 1301 y 1499 pb.

Para Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizó las 5 cepas disponibles en la base de datos, con

largos que variaron entre 1334 y 1519 pb.

Luego se trabaja con el software Primer Premier versión 5.0, una herramienta

computacional que ayuda en el diseño de partidores. El programa realiza alineamientos de las

secuencias obtenidas desde las bases de datos, buscando un patrón común a todas, es decir, la

posición de los nucleótidos en la secuencia ribosomal. Luego el programa entrega una lista de

todos los posibles partidores para cada alineamiento.

Para el diseño, es necesario además definir los parámetros de búsqueda, es decir de todos

los posibles partidores el programa desplegará aquellos que se ajusten a las necesidades del

usuario. Los parámetros de búsqueda son:

Destino de la secuencia: se define que la secuencia será utilizada para amplificación mediada

por PCR, en el programa se elige la opción PCR Primers.

Tipo de búsqueda: en esta sección se define qué tipos de partidores se está buscando, en este

caso se busca un par de partidores complementarios a ambas hebras. Un partidor sense

complementario a la hebra 3`-5`, y un partidor antisense complementario a la hebra 5`-3` del

DNA. En el programa se elige la opción Pairs.

1 RDP II, http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp

Page 31: biolixiviacion cuantificacion bacterias

28

Rango de búsqueda: aquí se le indica al programa que busque un par de partidores entre el

nucleótido número 1 y el último nucleótido del alineamiento. En el caso de Acidithiobacillus

thiooxidans la búsqueda se hace hasta el nucleótido número 1377, y para Sulfobacillus

thermosulfidooxidans se realiza hasta el nucleótido número 1369. Por último se define el tamaño

mínimo del producto de PCR en 900 pb y el tamaño máximo como el largo del alineamiento.

Largo de los partidores: se define el largo de los partidores en 20 ± 2 pb.

Por otro lado, cada par de partidores va acompañado por una tabla de información que

entrega los parámetros fisicoquímicos de la reacción: temperatura de meeting (Tm) de los

partidores, el porcentaje GC de cada partidor y la energía libre de Gibbs (ΔG) de la reacción de

hibridación del partidor a la hebra de DNA. También entrega otra tabla con las posibles

estructuras secundarias indeseadas que podrían formarse, como dímeros entre partidores,

autoplegamiento de un partidor y falso partidor (un partidor se pega en una región distinta de la

secuencia blanco), con su respectivo ΔG.

Basado en los parámetros anteriores se elige un par de partidores que además sea

específico. La especificidad de cada partidor se analiza nuevamente en el sitio de RDP, el cual

ofrece una herramienta para realizar match entre los partidores y todas las secuencias

almacenadas en su base de datos. Este análisis entrega una lista de organismos que podrían ser

amplificados con los partidores ingresados. Este proceso se realiza para cada par de partidor que

entrega el programa computacional, hasta encontrar un par de partidores que reconozcan sólo

secuencias de cepas de los organismos deseados.

2.3.2 Extracción de DNA

Los siguientes son los protocolos diseñados previamente [15, 23] para la extracción de

DNA de bacterias de biolixiviación provenientes desde cultivos, soluciones de refino y mineral.

Page 32: biolixiviacion cuantificacion bacterias

29

Protocolo de extracción de DNA desde cultivos

• Tomar 80-100 ml de muestra y centrifugar en tubos para centrífuga de 40 ml a 13.000

rpm por 15 min. Descartar sobrenadante.

• Lavar el pellet con 20 ml de PBS 1X pH 1.2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm

por 15 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.

• Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm por 15

min. Descartar sobrenadante.

• Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3

mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.

• Agregar SDS a una concentración final de 5% p/v. Realizar 3ciclos de congelamiento-

descongelamiento, de 3 min cada uno, a -20 ºC y 70 ºC, respectivamente.

• Centrifugar a 1.000 rpm por 2 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos Eppendorf

de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.

• Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%

v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase

superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.

• Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio

3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.

• Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.

• Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10

min. Repetir el lavado.

• Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 2 0min.

• Resuspender en 100 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.

Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.

Page 33: biolixiviacion cuantificacion bacterias

30

Protocolo de extracción de DNA desde soluciones de procesos de biolixiviación

• Filtrar el volumen de solución a tratar (entre 1 y 1.5 litros) con membrana de 0.2 um. Una

vez concluido recuperar la membrana y depositarla en el interior de un tubo para

centrífuga de 40 ml.

• Lavar el pellet con 20 ml de PBS 1X pH 1.2 agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm

por 15 min. Descartar sobrenadante.

• Lavar con 10 ml de buffer de lavado agitando en vortex. Centrifugar a 13.000 rpm por 15

min. Descartar sobrenadante.

• Resuspender en 3 ml de buffer A2X. Adicionar lisozima a una concentración final de 3

mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.

• Agregar SDS a una concentración final de 4% p/v.

• Agregar NaCl 5M hasta llegar a una concentración final de 0.7M y luego CTAB (CTAB

10% en 0.7M NaCl) para tener una concentración final de 1% CTAB. Incubar a 65 ºC por

1 hr.

• Realizar 3ciclos de congelamiento-descongelamiento, de 3 min cada uno, a -20 ºC y 70

ºC, respectivamente.

• Centrifugar a 1.000 rpm por 2 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos Eppendorf

de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.

• Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%

v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase

superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.

• Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio

3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.

• Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.

• Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10

min. Repetir el lavado.

• Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 20 min.

• Resuspender en 50 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.

Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.

Page 34: biolixiviacion cuantificacion bacterias

31

Protocolo de extracción de DNA desde minerales

• Tomar 10 g de mineral molido en mortero y lavar con 20 ml de H2SO4 0.04N. Centrifugar

a 10.000 rpm por 15 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado.

• Lavar el pellet con 20 ml de buffer de lavado de mineral, agitando en vortex. Centrifugar

a 6.000 rpm por 10 min. Descartar sobrenadante. Repetir el lavado (es recomendable

repetir de dos a tres veces esta etapa, para eliminar la mayor cantidad de contaminantes)

• Resuspender en 2 ml de buffer de lavado de mineral. Adicionar lisozima a una

concentración final de 15 mg/ml e incubar por 1 hora a 37 ºC.

• Adicionar 250 ul de proteinasa K (10 mg/ml) e incubar por 1 hora a 37 ºC.

• Agregar SDS a una concentración final de 5% p/v.

• Agregar NaCl 5M hasta llegar a una concentración final de 0.7M y luego CTAB (CTAB

10% en 0.7M NaCl) para tener una concentración final de 1% CTAB. Incubar a 65 ºC por

1 hora.

• Realizar 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento, de 3 min cada uno a -20 ºC y 70

ºC, respectivamente.

• Centrifugar a 4.000 rpm por 10 min. Recuperar sobrenadante y repartir en tubos

Eppendorf de 1.5 ml, aproximadamente 0.7 ml en cada tubo.

• Agregar fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) hasta una concentración de 50%

v/v. Vortex hasta homogenizar. Centrifugar a 12.000 rpm por 5 min. Recuperar fase

superior y traspasar a tubos Eppendorf de 1.5 ml limpios.

• Agregar isopropanol absoluto frío hasta una concentración de 50% v/v y acetato de sodio

3M pH 5.2 a una concentración final de 10% v/v. Incubar a -20 ºC toda la noche.

• Centrifugar a 14.000 rpm por 25 min. Descartar sobrenadante.

• Lavar con 500 ul de etanol al 70%, agitar suavemente. Centrifugar a 14.000 rpm por 10

min. Repetir el lavado.

• Descartar sobrenadante y secar el pellet al mechero por 20 min.

• Resuspender en 100 ul de buffer TE (sólo en un tubo). Almacenar a -20 ºC.

Para visualizar los resultados obtenidos se realiza electroforesis en gel de agarosa al 0.7%.

Page 35: biolixiviacion cuantificacion bacterias

32

2.3.3 Amplificación del 16s rDNA mediante PCR

Para la amplificación por PCR es necesario definir las condiciones de reacción, es decir

los reactivos usados con sus respectivas concentraciones y el programa de PCR con las

respectivas temperaturas y tiempos de reacción.

Para los microorganismos Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum ferrooxidans

las condiciones de amplificación se encuentran previamente definidas en una tesis anterior [23], y

son las mismas utilizadas para Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans. Se observa en la Tabla I las concentraciones de cada reactivo para un

volumen final de reacción de 25 ul.

Tabla I. Concentraciones y volúmenes de reactivos de una reacción de PCR.

Concentración inicial Concentración final Volumen [μl]

Partidor sense 10 μM 1 μM 2.5

Partidor antisense 10 μM 1 μM 2.5

Nucleótidos 10 mM 200 μM 0.5

Buffer 5 X 1 X 5

MgCl2 25 mM 1.5 mM 1.5

Taq polimerasa 5 U/μl 2.5 U 0.5

Para este volumen de reacción se usa un volumen de DNA genómico de 1 ul, utilizándose

sin diluir y en diluciones que van desde 1:10 a 1:1000000.

El programa de PCR utilizado para Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum

ferrooxidans, que difiere únicamente en la temperatura de alineamiento (Ta), es el siguiente:

Page 36: biolixiviacion cuantificacion bacterias

33

Denaturación inicial: 95 ºC por 2 min.

Denaturación: 95 ºC por 45 s

Alineamiento: Ta por 45 s se repite 20 veces

Extensión. 72 ºC por 45 s

Extensión final: 72 ºC por 2 min

La temperatura de alineamiento para Acidithiobacillus ferrooxidans es 58.5 ºC y para

Leptospirillum ferrooxidans es 53 ºC.

En el caso de Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans el

programa de PCR utilizado es:

Denaturación inicial: 95 ºC por 5 min.

Denaturación: 95 ºC por 1 min

Alineamiento: Ta por 30 s se repite 29 veces

Extensión. 72 ºC por 1 min

Extensión final: 72 ºC por 5 min

Para la visualización de los resultados se realizaron geles de agarosa al 1.2% (ver

protocolo en Anexos)

Page 37: biolixiviacion cuantificacion bacterias

34

2.3.4 Técnica de determinación del número más probable NMP.

Para la cuantificación con NMP y PCR se realizan distintas diluciones de la muestra que

van desde 1:10 hasta 1:1000000. Luego se realiza la amplificación en triplicado de cada una de

las diluciones, incluyendo la muestra sin diluir, según el protocolo antes descrito. En este caso la

señal positiva del método de NMP será la amplificación del templado, las que se obtienen luego

de realizar una electroforesis en gel de agarosa de las muestras amplificadas.

Luego se determina la dilución en la cual no hay amplificación, es decir cuando

desaparece la señal. En seguida se busca la última dilución en la cual se observan tres señales

positivas, a la cual se le otorga un número 3, desde ésta se analizan las dos diluciones siguientes.

Finalmente se tendrá una combinación de tres números XXX, el primero fijo en 3 y los dos

siguientes variando entre 3 y 0. Con esta combinación se va a una tabla de Número más Probable

(ver Anexos) que entrega la concentración de unidades genómicas por cada 100 ml para esa

muestra.

La combinación de señales positivas entrega un valor de NMP/100 ml según la tabla de

NMP. Este número permite calcular la concentración de unidades genómicas de acuerdo a la

siguiente fórmula:

Unidades genómicas/100 ml = (NMP/100 ml X 10)/ última concentración con 3 señales (+)

Page 38: biolixiviacion cuantificacion bacterias

35

3 CAPÍTULO III: Resultados y Discusión

En el siguiente capítulo se presentan y analizan los resultados obtenidos a partir de las

distintas actividades realizadas para cumplir los objetivos del trabajo. Estas actividades

comprenden una parte computacional con el diseño de partidores; y otra parte experimental dada

por los procedimientos para la extracción de DNA, identificación del gen 16S rDNA y

cuantificación mediante PCR-NMP de bacterias, desde soluciones y mineral provenientes de un

proceso de biolixiviaión de un mineral sulfurado en columnas.

3.1 PARTE COMPUTACIONAL

3.1.1 Diseño de partidores

Se realizó el diseño de partidores específicos para las bacterias Acidithiobacillus

thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, basados en la región 16S del DNA ribosomal

de estas especies. A continuación se presentan los resultados de este diseño.

Acidithiobacillus thiooxidans

A partir del alineamiento de las secuencias ribosomales de 17 cepas de Acidithiobacillus

thiooxidans encontradas en la base de datos RDP II (ver las cepas en Anexo) se identificó una

secuencia blanco apropiada de 1377 pb, para la cual se diseñaron los siguientes partidores

forward y reverse:

Partidor forward (AzufreI): 5`- AAGAGGAGCCTACGTCTGA – 3`

Partidor reverse (Azufre II): 5`- GTGTAGCCCTGGACATAAA- 3`

Page 39: biolixiviacion cuantificacion bacterias

36

Este par de partidores permite la amplificación de 23 cepas de Acidithiobacillus

thiooxidans de las 27 cepas cuyo gen 16S de DNA ribosomal se encuentra secuenciado y

almacenado en las bases datos. Mediante el programa Primer Premier v5.0 es posible predecir el

largo del producto de amplificación, este corresponde a 1021 pb el cual se extiende desde el

nucleótido 210 al 1230 de la secuencia blanco. De esta manera, el partidor AzufreI que se alinea a

la hebra 3`-5`, lo hace a partir del nucleótido 210. Por otro lado, el partidor AzufreII se alinea a la

hebra 5`-3`a partir del nucleótido 1230.

El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla II), así

como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones

indeseadas.

Tabla II. Propiedades de los partidores específicos de Acidithiobacillus thiooxidans

Partidor Tm (ºC) Largo (pb) ΔG[kcal/mol] GC%

Forward Azufre I

Reverse Azufre II

51.8

50.4

19

19

-34.7

-34.3

52.6

47.4

En este caso se predice la formación de estructuras secundarias en el partidor forward:

• Autoplegamiento con una energía de activación de 0.1 Kcal/mol

• Dímero con una energía de activación de -6.3 Kcal/mol

• Un dímero cruzado entre ambos partidores con una energía de activación de -3.9

Kcal/mol.

La energía de activación ΔG antes mencionada para cada una de las reacciones,

incluyendo la reacción de hibridación del partidor a la secuencia blanco, entrega una noción de

tendencia de formación de cada estructura. Esta energía libre corresponde a la energía necesaria

para llevar a cabo una reacción, así mientras menor sea la energía más se favorecerá que ocurra la

reacción. De este modo, se debe comparar las energías de cada reacción indeseada con la de la

Page 40: biolixiviacion cuantificacion bacterias

37

reacción de interés. En este caso la energía de activación de la reacción de hibridación para el

partidor forward y el partidor reverse es de -34.7 Kcal/mol y -34.3 Kcal/mol, respectivamente.

Lo que comparado con las energías de activación de las reacciones indeseadas: 0.1Kcal/mol para

el autoplegamiento, -6.3 Kcal/mol para el dímero y -3.9 Kcal/mol para el dímero cruzado, es un

valor muy inferior. Así se puede inferir que la probabilidad de que se formen estructuras

secundarias es mucho menor a la probabilidad de la reacción de la correcta amplificación para la

cuál se diseñaron los partidores.

Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizan en base a la

temperatura óptima de alineamiento entregada por el software, la que corresponde a 54.2 ºC. Esta

es la temperatura que se usa como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento

definitiva que se aplicará en la reacción de PCR.

Sulfobacillus thermosulfidooxidans

A partir del alineamiento de las secuencias ribosomales de 5 cepas de Sulfobacillus

thermosulfidooxidans encontradas en la base de datos RDP II (ver las cepas en Anexo) se obtiene

una secuencia blanco de 1369 pb para la cual se diseñaron los siguientes partidores forward y

reverse:

Partidor forward (Thermo f): 5`- GTGCGTAATACATGCAAGTCG – 3`

Partidor reverse (Thermo r): 5`- TGTCCAGTCCTGGTAAGGTTCT – 3`

Este par de partidores permite la amplificación de 4 cepas de Sulfobacillus

thermosulfidooxidans de las 5 cepas cuyo gen 16S de DNA ribosomal se encuentra secuenciado y

almacenado en las bases datos. Mediante el programa Primer Premier v5.0 es posible predecir el

largo del producto de amplificación, este corresponde a 927 pb el cual se extiende desde el

nucleótido 37 al 963 de la secuencia blanco. De esta manera el partidor Thermo f que se alinea a

Page 41: biolixiviacion cuantificacion bacterias

38

la hebra 3`-5`, lo hace a partir del nucleótido 37. Por otro lado el partidor Thermo r se alinea a la

hebra 5`-3`a partir del nucleótido 963.

El software además entrega las principales propiedades de los partidores (Tabla III), así

como también condiciones termodináminas bajo las cuales se pueden producir reacciones

indeseadas.

Tabla III. Propiedades de los partidores específicos de Sulfobacillus thermosulfidooxidans

Partidor Tm (ºC) Largo (pb) ΔG[kcal/mol] GC%

Forward Thermo f 56.9 21 -38.6 47.6

Reverse Thermo r 57.9 22 -39.5 50

En este caso se predice la formación de estructuras secundarias:

• Dímero en el partidor forward, con una energía de activación de -7.0 Kcal/mol

• Dímero en el partidor reverse, con una energía de activación de -6.6 Kcal/mol

Como se dijo anteriormente la energía de activación es el parámetro que define la

tendencia de que una reacción se realice. En este caso la energía de activación de la reacción de

hibridación para el partidor forward y el partidor reverse es de -38.6 Kcal/mol y -39.5 Kcal/mol,

respectivamente. Este valor es muuy inferior comparado con las energías de activación de las

reacciones indeseadas: -7.0 Kcal/mol para el dímero en el partidor forward y -6.6 Kcal/mol para

el dímero en el partidor reverse. Así se puede inferir que la probabilidad de que se formen

estructuras secundarias es mucho menor a la probabilidad de la reacción de la correcta

amplificación.

Por último, todos los valores y datos entregados anteriormente se realizaron en base a la

temperatura de melting entregada por el software, la que corresponde a 58.4 ºC. Esta es la

Page 42: biolixiviacion cuantificacion bacterias

39

temperatura que se usó como punto de partida para encontrar la temperatura de alineamiento

definitiva usada en la reacción de PCR.

3.2 PARTE EXPERIMENTAL

3.2.1 Extracción de DNA

Esta corresponde a la etapa previa a la identificación y cuantificación, con la que se

obtuvo el material genético tanto de cultivos puros de Acidithiobacillus ferrooxidans,

Leptospirillum ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans,

como de las bacterias en las soluciones de refino y mineral de una columna de biolixiviación.

3.2.2 Extracción de DNA desde cultivos puros

Con el fin de utilizar el material genético de microorganismos provenientes de cultivos

puros como controles positivos y negativos en el diseño de los partidores, y como una manera de

conocer y manejar los protocolos de extracción, se realizó la extracción de DNA desde estos

cultivos. Es necesario hacer notar que a pesar de tratarse de cultivos puros, es altísima la

probabilidad de contaminación entre ellos. Es así como en trabajos de tesis anteriores [15] se ha

detectado mediante la técnica de T-RFLP, la presencia de alguna de las bacterias de interés en los

cultivos supuestamente puros de las otras.

Para Acidithiobacillus ferrooxidans se preparó 100 ml de cultivo con una concentración

de 3 g/l de sulfato ferroso (FeSO4), 2 ml de inóculo y medio MC (pH 1.6); este cultivo se

conservó en un agitador a 30ºC por alrededor de 48 h. Para Leptospirillum ferrooxidans se

preparó también 100 ml de solución con FeSO4 a una concentración final de 3 g/l, 4 ml de

inóculo y medio 9K modificado; se mantuvieron en agitador a 30 ºC por alrededor de 72-96 h. En

el caso de Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans se utilizaron

cultivos en perlas de azufre a una concentración de 3 g/100 ml de medio, en medio MC (pH 2.3).

Page 43: biolixiviacion cuantificacion bacterias

40

Mediante recuento directo se midió una concentración de células en cada uno del orden de 108

cel/ml.

En la Figura 3, se presenta la foto de un gel de electroforesis en agarosa al 0.8%, con el

DNA extraído de algunos de estos cultivos. En él se logró distinguir una banda de alto tamaño

molecular, que coincide con el patrón esperado en una extracción de DNA genómico.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de extracción de DNA genómico. Carril 1: marcador de peso

molecular 1Kb, carril 2: Acidithiobacillus ferrooxidans, carril 3: Acidithiobacillus thiooxidans y carril 4:

Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

En el caso de las cuatro especies se utilizó el mismo protocolo de extracción, el cual fue

estudiado y probado en tesis anteriores [15, 23]. Sin embargo se le introdujo algunas

modificaciones con el fin de mejorar la recuperación de material genético y eliminar

contaminantes. Con este objetivo se estudiaron tres etapas del protocolo:

• Las etapas de lavado previa lisis celular

• La etapa de extracción con fenol-cloroformo

• La etapa de lavado del pellet con etanol al 70%.

Page 44: biolixiviacion cuantificacion bacterias

41

En el caso del lavado previo, se hace necesario no generalizar el protocolo a cualquier

muestra, es decir dependiendo de la suciedad de la muestra es conveniente repetir una o dos veces

el lavado con buffer de lavado. Así mismo, se puede incorporar como una primera etapa la

centrifugación a 1000 rpm por 10 min, recuperando el sobrenadante y descartando el pellet con

los elementos contaminantes.

La etapa de extracción con fenol-cloroformo consistió en la separación en dos fases del

DNA de las proteínas contaminantes. Estas proteínas tienen un efecto inhibitorio de la reacción

de PCR, por lo tanto es muy importante su eliminación. Así, es conveniente realizar siempre dos

veces esta etapa, una con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y otra con fenol-

cloroformo (24:1). Sin embargo, hay que destacar que cada repetición de estas etapas trae

consigo la pérdida parcial de material genético, por lo tanto no es conveniente realizarlas más de

dos veces.

Finalmente, la etapa de lavado con etanol al 70% para la recuperación de DNA desde la

mezcla de Isopropanol y Acetato de Sodio, se realizó dos veces para eliminar contaminantes

como metales, que puedan interferir en la reacción de PCR. El procedimiento utilizado fue lavar

el pellet de DNA con 500 μl de etanol al 70%, agitarlo por inversión del tubo, suavemente, hasta

visualizarlo en la solución.

Sin embargo, los efectos de las modificaciones mencionadas anteriormente fueron apenas

visibles, manteniéndose la presencia de un barrido producto de suciedad en la muestra. Sin

embargo, permiten que se produzca la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) sin problemas

de inhibición.

Las modificaciones del protocolo de extracción son extensibles para soluciones de refino

y mineral, de acuerdo a las condiciones de la muestra.

Page 45: biolixiviacion cuantificacion bacterias

42

3.2.3 Extracción de DNA desde soluciones de refino

Se utilizaron diez muestras de soluciones de refino de una columna de biolixiviación de la

sociedad minera El Abra. De cada una se concentraron las células por medio de microfiltración y

se extrajo el DNA mediante protocolo de extracción descrito en métodos. Por otro lado, a todas

las muestras se les realizaron los siguientes análisis: recuento directo de células, pH, Eh,

concentración de Fe total, Fe+3 y Fe+2, concentración de sulfato y concentración de Cu.

La Figura 4 corresponde a la foto de un gel de electroforesis en agarosa al 0.8% con la

extracción de DNA desde soluciones de refino.

Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de DNA genómico extraído desde muestras de solución de

refino. Carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb, carril 2: DNA genómico muestra 5, carril 3: DNA genómico

muestra 6, carril 4: DNA genómico muestra 7, carril 5: DNA genómico muestra 8, carril 6: DNA genómico muestra

9.

Se aprecia una banda de alto tamaño molecular, sobre 10,000 pb, según el patrón esperado

en una extracción de DNA genómico. Se aprecia además una especie de barrido bajo la banda de

DNA, lo que corresponde a DNA genómico degradado y contaminación propia de las muestras.

Esta contaminación se intentó eliminar mediante modificaciones en el protocolo de extracción,

principalmente en la etapa de lavado con fenol-cloroformo y con etanol al 70%, tal como se

describió en la sección anterior. Sin embargo, dado que las soluciones contienen escasa presencia

de células, del orden de 106 cel/ml, la incorporación de mayor cantidad de etapas de lavado se

Page 46: biolixiviacion cuantificacion bacterias

43

traduciría en pérdida de DNA. Por otro lado, la alta concentración de contaminantes del tipo sales

y metales se hacía evidente en la etapa previa de filtración de la muestra, produciéndose la

saturación de los filtros. Todo lo anterior muestra la dificultad de obtener DNA limpio desde este

tipo de soluciones.

Además, para el estudio de la población bacteriana de las muestras se realizó la medición

de distintos parámetros relacionados de alguna forma con la presencia de un tipo de bacteria en la

solución, o de su predominancia por sobre las otras. Estos parámetros corresponden a pH, Eh

concentración de Fe total, ión férrico, ión ferroso, sulfato y Cu. Cada uno de éstos parámetros se

midió al momento de recibir la muestra (ver Tabla en la sección ANEXOS, con la fecha de

recepción de cada muestra).

Cabe destacar que la extracción de DNA genómico se realizó directamente desde las

soluciones de refino no enriquecidas, logrando un buen resultado. Esto es un importante aporte

para el estudio de la diversidad bacteriana real de una muestra.

3.2.4 Extracción de DNA desde muestras de mineral

A pesar de que el estudio se centra exclusivamente en el análisis de las soluciones de

refino, es de utilidad conocer la diversidad bacteriana presente en el mineral mismo. Esto debido

a que se da el caso que bacterias como Leptospirillum ferrooxidans tendrían una tendencia a

crecer fundamentalmente adheridas al mineral.

El protocolo usado para esta extracción también sufrió modificaciones para obtener un

DNA libre de impurezas. Así, se incluyó un lavado adicional con buffer de lavado de mineral y

un lavado adicional con etanol al 70%. En la Figura 5 se presenta la foto de un gel de

electroforesis con la extracción de la muestra de mineral, la que se ajusta al patrón esperado de

extracción de DNA genómico, con un tamaño sobre 10,000pb.

Page 47: biolixiviacion cuantificacion bacterias

44

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de muestra de DNA genómico proveniente de mineral

aglomerado. Carril 1: DNA genómico de muestra de mineral, carril 2: marcador de peso molecular 1 Kb.

La extracción de DNA desde las células presentes en el mineral se realizó sin ningún tipo

de enriquecimiento bacteriano, obteniéndose una concentración suficiente de DNA para realizar

una reacción de PCR, como se verá más adelante. Luego, al comparar el resultado de esta

extracción con el de las soluciones de refino, que son aquellas muestras cuyo material genético es

de una mezcla de microorganismos, no se aprecia una gran diferencia en la intensidad de las

bandas de los respectivos geles. Esto significa una eficiencia de recuperación semejante entre

ambas muestras, lo que da cuenta de la efectividad del protocolo de extracción usado para

muestras de biolixiviación.

3.2.5 Determinación de temperatura de alineamiento de partidores específicos para

Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans

Para realizar la amplificación del gen 16S rDNA de cada uno de estos microorganismos,

es necesario determinar la temperatura de alineamiento de ambos partidores. Con la ayuda del

programa Primer Premier v5.0 se obtuvo las secuencias de los partidores específicos así como

también los productos de amplificación esperados, sin embargo el programa predice una

temperatura de alineamiento óptima que en muchos casos no arroja los mejores rendimientos de

Page 48: biolixiviacion cuantificacion bacterias

45

amplificación. Por lo tanto, es necesario utilizar un método experimental para determinar esta

temperatura, que en este caso se trata de un PCR de gradiente de temperatura.

La reacción se realizó simultáneamente para doce temperaturas distintas, dentro de la cual

se incluye la temperatura de alineamiento entregada por el programa de diseño. Mediante una

función especial, el termociclador es capaz de utilizar temperaturas diferentes para distintos

pocillos del equipo. Así dependiendo de la bacteria se construye un gradiente diferente, en el caso

de Acidithiobacillus thiooxidans las temperaturas variaron entre 45 ºC y 65.6 ºC y para

Sulfobacillus thermosulfidooxidans el rango de temperaturas fue entre 48 ºC y 68.5 ºC (Tabla

IV).

Tabla IV. Temperaturas utilizadas en PCR con gradiente de temperatura para A. thiooxidans y S.

thermosulfidooxidans.

Pocillo A. thiooxidans [ºC] S. thermosulfidooxidans [ºC]

1 45 48

2 45.3 48.3

3 46.4 49.4

4 48.2 51.2

5 50.4 53.5

6 53 56.1

7 55.8 58.8

8 58.5 61.5

9 61 64

10 63.1 66.1

11 64.7 67.7

12 65.6 68.5

Page 49: biolixiviacion cuantificacion bacterias

46

3.2.6 Temperatura de alineamiento de partidores específicos para Acidithiobacillus

thiooxidans

En la Figura 6 se presenta la foto de un gel de electroforesis con el resultado del PCR de

gradiente de temperatura para Acidithiobacillus thiooxidans. Se aprecia, para cada temperatura,

una banda del tamaño molecular esperado, 1021 pb, alrededor de la banda de tamaño 1000 pb del

marcador molecular de 1 Kb. Se ve además, que para cada temperatura del gradiente se obtiene

una banda única, sin productos inespecíficos ni impurezas. De este modo, el siguiente paso es

escoger una temperatura de entre las doce, con la cual se obtenga el mejor rendimiento de

amplificación.

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR con gradiente de temperatura para

Acidithiobacillus thiooxidans. Parte A, carril 1: marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 45ºC; carril 3: 45.3ºC;

carril 4: 46.4ºC; carril 5: 48.2ºC; carril 6: 50.4ºC; carril 7: 53ºC; carril 8: 55.8ºC; carril 9: 58.5ºC. Parte B, carril 1:

marcador de peso molecular 1 Kb; carril 2: 61ºC, carril 3: 63.1ºC; carril 4: 64.7ºC, carril 5: 65.6ºC.

De todas las temperaturas se eligió aquella que diera como resultado una banda intensa,

pero que además fuera relativamente alta para evitar reacciones indeseadas o productos

inespecíficos. En este caso se escogió una temperatura de 63.1 ºC.

Page 50: biolixiviacion cuantificacion bacterias

47

Prueba de especificidad de partidores diseñados para Acidithiobacillus thiooxidans

Para probar la especificidad de los partidores y dado que todas las temperaturas entregan

una sola banda como resultado de amplificación se realiza un PCR cruzado. Es decir la

amplificación de la secuencia 16S rDNA con los partidores específicos para Acidithiobacillus

thiooxidans diseñados, de DNA genómico proveniente de cultivos puros de: Acidithiobacillus

thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum

ferrooxidans.

En la Figura 7 se observa que a la temperatura de 63.1 ºC se obtiene amplificación desde

DNA de cada uno de los cultivos puros, sin embargo para cada uno es una banda del mismo

tamaño y sin productos inespecíficos.

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con partidores de A.

thiooxidans para T=63.1 ºC. Carril 2-3: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100

y 10-1, respectivamente. Carril 4-5: amplificación DNA genómico cultivo puro L. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,

respectivamente. Carril 6-7: amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-

1, respectivamente. Carril 8-9: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1,

respectivamente. Carril 1: marcador peso molecular 1Kb.

La alternativa para hacer la amplificación más específica es elevar la temperatura de

alineamiento, esto elimina reacciones y productos inespecíficos. Por otro lado, se observa en la

figura que las bandas de mayor intensidad son aquellas de los cultivos puros de Acidithiobacillus

Page 51: biolixiviacion cuantificacion bacterias

48

thiooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans y Acidithiobacillus ferrooxidans, cultivos que

pueden presentar algún tipo de contaminación. En el caso de Sulfobacillus thermosulfidooxidans

no hay certeza de que efectivamente se trate de un cultivo puro, mientras que en trabajos de tesis

anteriores [15] se detectó, mediante la técnica de T-RFLP, la presencia de Acidithiobacillus

thiooxidans en cultivos puros de Acidithiobacillus ferrooxidans, en el laboratorio de

Biohidrometalurgia de la Universidad de Chile.

Para eliminar la amplificación inespecífica encontrada a la temperatura de 63.1 ºC, se

llevó a cabo otra amplificación mediante PCR, esta vez a una temperatura de 65.8 ºC. En la

Figura 8 se observa la foto del gel de electroforesis con el resultado de esta amplificación. En él

sólo se observa bandas para el cultivo puro de Acidithiobacillus thiooxidans, en diluciones 100,

10-1 y 10-2. Por otro lado se trata de bandas intensas y gruesas, lo que es un buen resultado de

amplificación. Así, la temperatura de alineamiento escogida para la amplificación del gen 16S

rDNA de Acidithiobacillus thiooxidans fue de 65.8 ºC, utilizando el programa de amplificación

descrito en métodos.

Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado partidores A. thiooxidans para

T=65.8 ºC. Carril 2, 3, 4: amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100, 10-1 y 10-2,

respectivamente. Carril 5-6: amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1,

respectivamente. Carril 7-8: amplificación DNA genómico muestra proveniente de lodos, en duplicado. Carril 1:

marcador peso molecular 1Kb.

Page 52: biolixiviacion cuantificacion bacterias

49

3.2.7 Temperatura de alineamiento de Sulfobacillus thermosulfidooxidans

En la Figura 9 se presenta la foto del gel de electroforesis del resultado del PCR con

gradiente de temperatura para Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR de gradiente de temperatura para

Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Parte superior del gel, carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: 48ºC,

carril 3: 48.3ºC, carril 4: 49.4ºC, carril 5: 51.2ºC, carril 6: 53.5ºC, carril 7: 56.1ºC, carril 8: 58.8ºC, carril 9: 61.5ºC.

Parte inferior del gel, carril 1: marcador de peso molecular 1Kb, carril 2: 64ºC, carril 3: 66.1ºC, carril 4: 67.7ºC y

carril 5: 68.5ºC.

Aquí se puede ver bandas inespecíficas para las siete primeras temperaturas, de este modo

la temperatura de alineamiento será de entre 61.5 ºC y 68.5 ºC. En la medida que se aumenta la

temperatura de alineamiento desaparecen bandas inespecíficas producto de reacciones

indeseadas. Por otro lado, las bandas observadas para cada una de las temperaturas corresponden

al tamaño molecular esperado de 927 pb, ubicándose por debajo de la banda de 1000 pb del

marcador de peso molecular 1 Kb.

Page 53: biolixiviacion cuantificacion bacterias

50

Prueba de especificidad de partidores diseñados para Sulfobacillus thermosulfidooxidans

Dada la situación de posible contaminación en los cultivos puros, se realizó un segundo

PCR con gradiente de temperatura, pero esta vez para la amplificación de DNA genómico de los

cultivos de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans. Este PCR se lleva a cabo en un rango de temperaturas de entre 62.1 ºC y

63.8 ºC, con diluciones de 100 y 10-1 para cada cultivo. En la Figura 10 se puede ver una foto del

gel de electroforesis de los productos del PCR cruzado con gradiente de temperatura realizado

con los partidores específicos diseñados para Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% de productos de PCR cruzado con gradiente de temperatura

para partidores de Sulfobacillus thermosulfidooxidans. T = 62.1 ºC, carriles 2-3 amplificación DNA genómico

cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 4-5 amplificación DNA

genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 6-7 amplificación DNA

genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=62.7 ºC, carriles 8-9 amplificación

DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 10-11

amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente; carriles 12-13

amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente. T=63.3, carriles

14-15 amplificación DNA genómico cultivo puro S. thermosulfidooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;

carriles 16-17 amplificación DNA genómico cultivo puro A. thiooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente;

carriles 18-19 amplificación DNA genómico cultivo puro A. ferrooxidans, diluciones 100 y 10-1, respectivamente.

Se observa que para la temperatura de 63.3 ºC desaparecen las bandas de amplificación

relativas a Acidithiobacillus ferrooxidans (carriles 18 y 19), sin embargo de todas maneras existe

amplificación para el caso del cultivo puro de Acidithiobacillus thiooxidans. Dado que, el diseño

Page 54: biolixiviacion cuantificacion bacterias

51

de los partidores dio resultados de amplificación específicos de acuerdo a las bases de datos de

secuencias de DNA ribosomal, y el PCR entrega productos de amplificación coherentes con los

tamaños esperados, es altamente probable la contaminación del cultivo de Acidithiobacillus

ferrooxidans con Sulfobacillus thermosulfidooxidans.

3.2.8 Detección y cuantificación de DNA

Este proceso se llevó a cabo para la detección y cuantificación de cuatro especies

presentes en procesos de biolixiviación: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum

ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, en las diez

muestras de solución de refino.

En primer lugar se realizó la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans, para cada

una de las muestras. Para calibrar la técnica de PCR-NMP se aplicó ésta a una muestra de cultivo

puro de Acidithiobacillus ferrooxidans. En la Figura 11 se puede ver la foto de un gel de

electroforesis con el resultado de esta cuantificación. Las diluciones del DNA extraído utilizadas

van desde 100 a 10-5, en triplicado.

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en cutltivo

puro. Carril 1: estándar peso molecular 1Kb. Carril 2-3-4: dilución 100; carril 5-6-7: dilución 10-1; carril 8-9-10:

dilución 10-2; carril 11-12-13: dilución 10-3.

En el gel anterior se aprecia la señal de amplificación positiva hasta la dilución 10-3, con

la visualización de tres bandas en cada dilución. Se aprecia también la ausencia de amplificación

Page 55: biolixiviacion cuantificacion bacterias

52

en la dilución 100. Esto es señal de una elevada concentración de DNA en la muestra, lo que se

traduce a su vez en una elevada concentración de los contaminantes que contiene esta muestra,

los cuales inhiben la amplificación.

De este modo la concentración de unidades genómicas para el cultivo puro de

Acidithiobacillus ferrooxidans es: 800 UG/ml. Lo que es mucho menor a la concentración de 108

cél/ml medida por recuento directo del cultivo. Esta diferencia puede atribuirse principalmente a

la pérdida de células que se produce en la etapa de extracción de DNA.

Con esta calibración se calculó la concentración real de células en cada muestra, mediante

una relación lineal entre la concentración celular de la calibración y la concentración medida por

técnicas moleculares.

Por otro lado, la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans presente en las muestras

de solución de refino reveló la presencia de esta bacteria en todas las muestras, incluso a niveles

de concentración de ión férrico elevados, del orden de 8.600 mg/l. En la Figura 12 se presenta la

foto de un gel de electroforesis con el resultado de la cuantificación mediante NMP-PCR para

una de las muestras. Se ve las señales en triplicado para cada dilución, hasta su extinción.

Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. ferrooxidans en muestra de

solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carril 2-4, inferior:

dilución 10-3; carril 1: marcador de peso molecular 1Kb.

Page 56: biolixiviacion cuantificacion bacterias

53

La tendencia en la cuantificación de esta bacteria fue la aparición de señal sólo hasta la

dilución 10-3, y al igual que para las otras bacterias en estudio lo habitual es que desaparezca la

señal por completo, en triplicado, en una dilución específica. Esta desaparición de las tres

muestras de una misma dilución da cuenta de la reproducibilidad de la técnica de PCR.

La Tabla V corresponde a los resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus

ferrooxidans para cada muestra del estudio. En ella se presenta, para cada dilución, los resultados

de la amplificación como señal positiva, y además la concentración de UG de la bacteria en

cuestión, para cada muestra.

Tabla V. Resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans presente en soluciones de refino,

expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.

Muestra 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 UG/100ml UG/ml

Calibración

UG/ml

P1 3 3 3 0 0 0 8000 8x101 1x108

P2 0 3 0 0 0 0 800 8x100 1x107

P3 3 3 3 3 0 0 80000 8x102 1x109

P4 3 3 3 0 0 0 8000 8x101 1x108

P5 0 3 3 3 0 0 80000 8x102 1x109

P6 0 3 3 3 0 0 80000 8x102 1x109

P7 3 3 3 0 0 0 8000 8x101 1x108

P8 3 3 3 0 0 0 8000 8x101 1x108

P9 3 3 3 0 0 0 8000 8x101 1x108

P10 3 3 0 0 0 0 800 8x100 1x107

Se puede observar que Acidithiobacillus ferrooxidans fue identificado en todas las

muestras, incluso para los niveles más bajos de ferroso detectados, de 39.23 mg/l. En el Gráfico 1

se presenta el análisis de Fe realizado para todas las muestras, en el cual la variable tiempo

corresponde al día de recepción de la muestra. Este consistió en medir la concentración de Fe

total, Fe+2 y Fe+3 para cada una de las muestras. En él se puede observar que la concentración de

Page 57: biolixiviacion cuantificacion bacterias

54

ferroso mencionada anteriormente, corresponde a la muestra 2 recibida el día 28 del período de

estudio Esta muestra a su vez, es aquella con la concentración más baja de UG del

microorganismo, de 8 UG/ml.

01.0002.0003.0004.0005.0006.0007.0008.0009.000

10.000

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96tiempo [días]

Con

cent

raci

ón [m

g/l] Fierro total

FerrosoFérrico

Gráfico 1. Análisis de Fe total (verde), Fe+2 (rojo) y Fe+3 (amarillo) para cada muestra de solución de refino

proveniente de columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada trío de columnas corresponde a una

muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.

Uno de los objetivos de este trabajo tiene que ver con el estudio de la relación que existe

entre la concentración de microorganismos y las condiciones del medio. En el caso de

Acidithiobacillus ferrooxidans, su capacidad oxidativa se ve afectada por diversos factores, entre

los cuales uno de los más importantes es la elevada concentración de ión férrico en la solución.

Este compuesto es capaz de inhibir el crecimiento de esta bacteria, sin embargo es posible que la

baja concentración de ión ferroso disponible sea aún más relevante para el crecimiento de

Acidithiobacillus ferrooxidans. Si se intenta relacionar la concentración de UG de

Acidithiobacillus ferrooxidans con algún parámetro de la solución, no es posible encontrar un

comportamiento coherente. La variación de hierro total no permite establecer una relación entre

el consumo de ión ferroso y la disminución de la concentración de Acidithiobacillus

ferrooxidans. Por otro lado, las concentraciones de ión férrico detectadas no son suficientemente

altas como para inhibir el crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans.

Page 58: biolixiviacion cuantificacion bacterias

55

Según estudios [8], la ausencia de Acidithiobacillus ferrooxidans relacionada con un

coeficiente Fe+3/Fe+2 elevado, se traduciría en el aumento de la concentración de Leptospirillum

ferrooxidans. Sin embargo, en este trabajo no se detectó Leptospirillum ferrooxidans en ninguna

de las diez muestras analizadas. Esto podría tener su explicación en el elevado pH de las

muestras, alrededor de 2.02, siendo el pH óptimo de crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans

de 1.3 [24, 8]. En el Gráfico 2 se presenta el análisis de pH realizado para cada una de las

muestras, observándose que ese parámetro no baja de 1.9. Por otro lado, como se trata de una

bacteria que sólo oxida hierro, su crecimiento es menos eficiente en minerales sulfurados del tipo

calcopirita [4] si no tiene disponible ión ferroso para sus requerimientos metabólicos.

1,75

1,81,85

1,91,95

22,05

2,1

2,15

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96

tiempo [días]

pH

Gráfico 2. Análisis de pH para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de

Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable tiempo corresponde al día de

recepción de la muestra.

Es posible también, que el diseño de estos partidores específicos para Leptospirillum

ferrooxidans no contemplara cepas de esta bacteria que están presentes en este mineral, producto

de la menor cantidad de cepas disponibles en las bases de datos hace dos años, fecha en la cual

los partidores fueron diseñados.

Por otro lado, se buscó también Leptospirillum ferrooxidans en muestras de mineral, dado

que se trata de una bacteria que crece mejor adherida al mineral que en solución. Sin embargo no

Page 59: biolixiviacion cuantificacion bacterias

56

se detectó, lo que se puede atribuir, como se dijo anteriormente, al tipo de mineral con el que se

está trabajando.

Finalmente, se descartó algún problema con los partidores de Leptospirillum ferrooxidans

llevando a cabo una reacción de PCR con un cultivo puro de esta especie, obteniendo una banda

del tamaño esperado para esta amplificación, 1088 pb.

En la Figura 13 se presenta la foto de un gel de electroforesis con el resultado de la

cuantificación de Acidithiobacillus thiooxidans para una muestra de solución de refino.

Figura 13. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de A. thiooxidans en muestra de

solución de refino. Carril 2-4: dilución 100; carril 5-7: dilución 10-1; carril 8-10: dilución 10-2; carri 11-13: dilución

10-3; carril 14-16: dilución 10-4; carril 1 y 20: marcador de peso molecular 1Kb.

En el caso de esta bacteria, se logró identificar su presencia en sólo 7 muestras, además de

la muestra de mineral. En la Tabla VI se entregan los resultados de la cuantificación de este

microorganismo. Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria capaz de producir ácido sulfúrico

rápidamente, lo que ayuda a bajar el pH y mejora las condiciones ambientales para

Acidithiobacillus ferrooxidans. A valores de pH más bajos el crecimiento de Acidithiobacillus

ferrooxidans es mayor lo que acelera las velocidades de oxidación del sustrato y la extracción de

metales es mayor [7, 26].

Page 60: biolixiviacion cuantificacion bacterias

57

Tabla VI. Resultados de la cuantificación de Acidithiobacillus thiooxidans presente en soluciones de

refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.

Muestra 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 UG/100ml UG/ml

Calibración

UG/ml

P1 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109

P2 3 3 3 3 3 3 0 8000000 8x104 1x1011

P3 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x108

P4 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108

P5 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109

P6 3 3 3 2 0 0 0 14000 1,4x102 1,75x10

P7 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109

P8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Por otro lado, estudios [26] muestran que poblaciones bacterianas mixtas compuestas

predominantemente por Acidithiobacillus thiooxidans y por Acidithiobacillus ferrooxidans

presentan los mayores niveles de recuperación de cobre, mejorando el proceso.

Para evidenciar una mejora en el proceso un parámetro importante a medir es la

concentración de cobre disuelto. En el Gráfico 3 se presenta la variación de concentración de Cu

disuelto, para cada una de las muestras estudiadas. La tendencia general es que los mayores

porcentajes de Cu disuelto se dan en los casos en que las concentraciones de UG de

Acidithiobacillus thiooxidans y de Acidithiobacillus ferrooxidans son más elevadas, esto es para

las muestras 3, 5 y 6. Por otro lado, en los casos en que una de las dos bacterias disminuye su

concentración considerablemente o desaparece, como se ve en la Tabla VI en el caso de

Acidithiobacillus thiooxidans en las muestras 8, 9 y10, la concentración de Cu disuelto

disminuye.

Page 61: biolixiviacion cuantificacion bacterias

58

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96

tiempo [días]C

once

ntra

ción

Cu

[g/l]

Gráfico 3. Análisis de Cu disuelto en solución de refino para cada muestra de solución de refino proveniente de

columna de biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra, cuya variable

tiempo corresponde al día de recepción de la muestra.

Lo anterior da cuenta de la importancia de Acidithiobacillus thiooxidans como agente

oxidante de azufre reducido, y por lo tanto como generador de ácido sulfúrico. Su capacidad de

generar ácido sulfúrico provoca una disminución en el pH de la solución, lo que podría explicar

la disminución de pH entre las muestras 2 y 5. En este caso según la Tabla VI, para la muestra 2

se obtuvo una concentración de 80.000 UG/ml de Acidithiobacillus thiooxidans, lo que se traduce

en un incremento en la concentración de ácido sulfúrico que tiene su efecto bajando el pH de la

columna, lo que se puede ver en el Gráfico 2 alrededor del día 35. Por otro lado, la concentración

de sulfato se eleva con el aumento de concentración de Acidithiobacillus thiooxidans, y luego

baja progresivamente hasta la muestra 5 con la disminución de concentración del

microorganismo. El Gráfico 4 presenta la variación de la concentración de sulfato entre las

distintas muestras analizadas.

Page 62: biolixiviacion cuantificacion bacterias

59

0

102030

40

506070

8090

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96

tiempo [días]C

once

ntra

ción

Sul

fato

[g/l]

Gráfico 5. Análisis de sulfato para cada muestra de solución de refino proveniente de columna de biolixiviación de

Sociedad minera El Abra. Cada columna corresponde a una muestra cuya variable tiempo corresponde al día de

recepción de la muestra.

En la Figura 14 se ve la foto de un gel de electroforesis con las resultados de la

cuantificación de Sulfobacillus thermosulfidooxidans para una de las muestras de solución de

refino.

Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa 1.2% resultado de cuantificación de S. thermosulfidooxidans en

muestra de solución de refino. Carril 2-4: dilución 10-1; carril 5-7: dilución 10-2; carril 8-10: dilución 10-3; carril:

marcador de peso molecular 1Kb.

Este microorganismo se logró detectar en sólo siete muestras de las diez totales, como se

aprecia en la Tabla VII.

Page 63: biolixiviacion cuantificacion bacterias

60

Tabla VII. Resultados de la cuantificación de Sulfobacillus thermosulfidooxidans presente en

soluciones de refino, expresado como concentración en Unidades genómicas (UG) por ml.

Muestra 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 UG/100ml UG/ml

Calibración

UG/ml

P1 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108

P2 3 3 2 0 0 0 0 1400 1,4x101 1,75x107

P3 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108

P4 3 3 0 0 0 0 0 800 8x100 1x107

P5 3 3 3 3 0 0 0 80000 8x102 1x109

P6 3 3 3 0 0 0 0 8000 8x101 1x108

P7 3 3 3 1 0 0 0 11000 1,1x102 1,38x108

P8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

En esta tabla se entregan los resultados de la cuantificación y las concentraciones de UG

del microorganismo encontradas para cada muestra. Las concentraciones de UG encontradas para

este microorganismo son inferiores a las correspondientes a Acidithibacillus ferooxidans y a

Acidithibacillus thiooxidans, en la mayoría de las muestras. Esto puede deberse a su condición de

bacteria termófila, por la cual su crecimiento óptimo ocurre a temperaturas entre 45ºC y 50ºC, por

lo tanto en ambientes de bacterias mesófilas su crecimiento se ve disminuido. Así mismo, las

elevaciones en la concentración de UG pueden atribuirse a elevaciones en la temperatura del

medio, como en el caso de las muestras 1, 3, 6 y 7. Por otro lado, su mayor concentración

coincide en número con las concentraciones de Acidithiobacillus ferooxidans y Acidithiobacillus

thiooxidans, que a su vez determina la mayor concentración de Cu soluble (ver Gráfico 3).

En el Gráficos 5, se presentan los resultados de la dinámica poblacional en el tiempo para

las tres bacterias identificadas.

Page 64: biolixiviacion cuantificacion bacterias

61

0100200300400500600700800900

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96

tiempo [días]C

oncn

etra

ción

[UG

/ml]

ST

AF

A

B

0100002000030000400005000060000700008000090000

0 28 35 40 47 56 78 88 92 96

tiempo [días]

Con

cent

raci

ón [U

G/m

l]

AT

Gráfico 6. Dinámica poblacional bacteriana de muestras de solución de refino provenientes de columna de

biolixiviación de Sociedad minera El Abra. Gráfico A: variación de Acidithiobacillus ferrooxidans (columnas

verdes) y Sulfobacillus thermodulfidooxidans (columnas amarillas). Gráfico B: variación de Acidithiobacillus

thiooxidans.

En el gráfico anterior se puede apreciar que el comportamiento de Acidithiobacillus

ferooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, presenta cierta semejanza, aún cuando la

concentración de éste último es menor a la de Acidithiobacillus ferooxidans. Ambos son

microorganismos que oxidan Fe y compuestos reducidos de azufre, por lo que sus variaciones

deberían ser semejantes. Sin embargo, como se dijo anteriormente, Sulfobacillus

thermosulfidooxidans es un microorganismo termófilo, lo que explica su menor crecimiento en

ambientes de microorganismos mesófilos.

Page 65: biolixiviacion cuantificacion bacterias

62

Finalmente, dado que no se trata de un ambiente controlado no es posible establecer

relaciones precisas y certeras entre la concentración de un determinado microorganismo y los

parámetros de la solución del proceso, como ocurre en la mayoría de los estudios realizados hasta

ahora. En el caso de Leptospirillum ferrooxidans, diversos trabajos [8, 25] avalan la tendencia de

esta especie de predominar por sobre Acidithiobacillus ferrooxidans a concentraciones elevadas

de Fe+3. Sin embargo, se trata de estudios llevados a cabo bajo ambientes diseñados

especialmente a escala de laboratorio, donde los nutrientes, pH, T, Eh, etc., de la solución fueron

controlados. Esto puede ser la causa de la imposibilidad de establecer la misma tendencia en el

presente trabajo. Esto hace que los resultados obtenidos no se correlacionen exactamente con la

información disponible.

Sin embargo, la mayor importancia de la técnica cuya implementación se presenta en este

trabajo, radica en que permite identificar y cuantificar especies directamente desde muestras de

soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Esto es un avance en el

estudio de poblaciones bacterianas de procesos reales de biolixiviación.

Page 66: biolixiviacion cuantificacion bacterias

63

4 CAPÍTULO IV: Conclusiones

Con los resultados obtenidos para cada una de las actividades realizadas y en base a los

objetivos planteados al inicio de este trabajo se puede concluir que:

Se diseñó, mediante el uso de herramientas computacionales y bases de datos disponibles

en internet, primers específicos para la amplificación del gen 16S rDNA de Acidithiobacillus

thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans. Sin embargo, problemas de contaminación de

cultivos hacen necesario un nuevo estudio sobre su especificidad.

Mediante la técnica de PCR, fue posible detectar en muestras de soluciones de proceso la

presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans. En el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans se detectó su presencia en

todas las muestras analizadas, mientras que Acidithiobacillus thiooxidans y Sulfobacillus

thermosulfidooxidans se detectaron sólo en el 70% de las muestras.

No se detectó la presencia de Leptospirillum ferrooxidans en ninguna de las muestras

analizadas, así como tampoco en muestras de mineral; o más bien no se encontraba en

concentraciones detectables. Sin embargo, fue probada con éxito la eficiencia de los partidores en

muestra de cultivo puro de esta especie.

Se llevó a cabo la cuantificación de Acidithiobacillus ferrooxidans, Acidithiobacillus

thiooxidans y Sulfobacillus thermosulfidooxidans, mediante NMP-PCR Con lo que se obtuvo una

medida de concentración de UG de cada especie, para cada muestra en estudio. Por no haberse

detectado Leptospirillum ferrooxidans, este no fue cuantificado.

Acidithiobacillus ferrooxidans es la única especie común en todas las muestras, aún para

los niveles detectados de Fe+3 más elevados, 8.700 mg/l. Así mismo, este nivel coincide con la

Page 67: biolixiviacion cuantificacion bacterias

64

concentración más baja de UG y con el Eh más elevado. Sin embargo, no se trata de una

concentración lo suficientemente elevada como para inhibir su crecimiento y favorecer el

crecimiento de Leptospirillum ferrooxidans.

La calibración de la técnica arroja una diferencia de hasta 6 órdenes de magnitud entre el

uso de la técnica de NMP-PCR y la técnica de recuento directo. Esta diferencia da cuenta de

problemas propios de la técnica de cuantificación utilizada, como la pérdida de células en la etapa

de extracción de DNA. Sin embargo, podría establecerse algún tipo de correlación entre la

cantidad obtenida por medio de NMP-PCR y el recuento directo de cultivos puros.

No fue posible establecer una relación entre las poblaciones bacterianas y la composición

de las soluciones, tal como se ha obtenido en trabajos anteriores. Esto principalmente debido a la

diferencia de las condiciones experimentales, es decir los registros que existen son en base a

procesos a escala de laboratorio y con parámetros controlados. Esto hace que los resultados

obtenidos no se correlacionen exactamente con la información disponible.

Se trató de establecer una relación entre el cobre disuelto (como una medida de la

recuperación de cobre) y la concentración de los microorganismos. Así, se estableció que la

mayor concentración de Cobre disuelto, o recuperación de Cu, se obtuvo cuando

Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, estaban presentes. Mientras que la

disminución de alguno de ellos se traduce en la disminución del metal en solución. Lo que

concuerda con las observaciones de que la presencia de ambos microorganismos significa

mayores niveles de recuperación de cobre.

En resumen, en este trabajo se presenta una técnica cuya implementación aún se está

trabajando, cuya mayor importancia es permitir identificar y cuantificar especies directamente

desde muestras de soluciones de refino de procesos industriales, sin previo enriquecimiento. Sin

embargo, debe ser validada mediante el uso de otras técnicas de cuantificación sobre muestras del

mismo origen. De cualquier forma, es un avance en el estudio de poblaciones bacterianas de

procesos reales de biolixiviación.

Page 68: biolixiviacion cuantificacion bacterias

65

5 ANEXOS

5.1 ANEXO I. COMPOSICIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

En las tablas VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV y XV se entregan las composiciones de cada

reactivo usado en la etapa de extracción de DNA genómico. Además de la composición de los

reactivos usados en electroforesis.

Tabla VIII. Composición Buffer A2X.

Compuesto Concentración [mM]

Tris HCL pH 8.0 200 EDTA 50

NaCl 200 Citrato de Na 2

CaCl2 10

Tabla IX. Composición Buffer de lavado.

Compuesto Concentración (v/v)

Buffer A2X 50%

Glicerol 25% Agua destilada 25%

Tabla X. Composición Buffer lavado de mineral.

Compuesto Concentración Tris HCL pH 7.6 50mM

EDTA 50mM Sacarosa 20% p/v

Page 69: biolixiviacion cuantificacion bacterias

66

Tabla XI. Composición Buffer TE.

Compuesto Concentración [mM]

Tris HCL 10 EDTA pH 8.0 1

Tabla XII. Composición Buffer de carga 6X.

Compuesto Concentración

Glicerol 30% v/v Azul de bromofenol 0.25% p/v

Tabla XIII. Composición Buffer TAE 50X.

Compuesto Concentración

Tris HCL 24.2% p/v Ácido acético glacial 5.71% v/v

EDTA 0.5M pH 8.0 10% v/v

Tabla XIV. Composición Buffer de almacenamiento.

Compuesto Concentración [mM]

Tris HCL pH 7.5 100

NaCl 200

Tabla XV. Composición de estándar de peso molecular, 1Kb.

Compuesto Concentración (v/v)

Buffer de almacenamiento 10%

Estándar de peso molecular 10% Buffer de carga 6X 16.5%

Page 70: biolixiviacion cuantificacion bacterias

67

Todas las soluciones son preparadas con agua destilada, a excepción de buffer TAE 50X

que fue preparado con agua desionizada. Los pH fueron ajustados con H2SO4 o NaOH

concentrado según lo requerido, excepto en el caso de Tris HCl cuyo pH fue ajustado con HCl.

Las tablas XVI y XVII contienen la composición de los medios de cultivo MC y 9K

modificado, usados para el cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans y Leptospirillum

ferrooxidans, respectivamente.

Tabla XVI. Composición medio MC.

Compuesto Concentración [g/l]

(NH4)2SO4 0.4

MgSO4x7H2O 0.4

K2HPO4x3H2O 0.056

Tabla XVII. Composición medio 9K Modificado.

Compuesto Concentración [g/l]

(NH4)2SO4 0.2

MgSO4x7H2O 0.4

K2HPO4x3H2O 0.1

Para la preparación de los medios de cultivo se disolvieron las sales en 1 litro de agua y el

pH se ajustó con H2SO4 concentrado a 1.6 para el medio MC y 1.7 para el medio 9K modificado.

Luego se esterilizan mediante calor húmedo por 15 minutos.

Page 71: biolixiviacion cuantificacion bacterias

68

5.2 ANEXO II. MÉTODOS

5.2.1 Electroforesis en gel de agarosa

• Pesar 0.8 o 1.2 gramos de agarosa, dependiendo del uso que se le dará al gel (para DNA

genómico o producto de PCR). Disolver en 100ml de Buffer TAE 1X en horno

microondas agitando cada 20 segundos hasta disolver completamente.

• Adicionar 10μl de Bromuro de Etidio a la mezcla tibia.

• Armar la cámara de electroforesis con las peinetas correspondientes. Luego agregar la

agarosa disuelta hasta que las peinetas queden levemente sumergidas y se forme el

pocillo.

• Una vez sólida la agarosa cubrir con Buffer TAE 1X y luego retirar las peinetas.

• Cargar las muestras en el gel. Para esto se mezcla 5μl de muestra de DNA y 3μl de Buffer

de carga 6X. Luego el volumen total se carga en uno de los pocillos del gel.

• Cargar 5μl de estándar de peso molecular.

• Correr el gel por 40 minutos a 100Volts.

• Retirar el gel de la cámara y visualizar en transiluminador UV.

Usar guantes para manipular el Bromuro de etidio y la agarosa, y lentes con protección UV para

manipular el transiluminador.

5.2.2 Protocolo determinación de fierro

Determinación de ferroso.

• Tomar 0.1ml de muestra diluida hasta una concentración de 100ppm de ferrroso.

• Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.

• Agregar 2 ml de agua destilada. Agitar.

• Leer absorbancia a 510nm contra blanco.

Page 72: biolixiviacion cuantificacion bacterias

69

Determinación de Fierro total.

• Tomar 0.1ml de muestra diluida hasta una concentración de 100ppm de ferroso

• Agregar 0.1ml de hodroxilamina. Agitar.

• Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.

• Agregar 1.9ml de agua destilada. Agitar.

• Leer absorbancia a 510nm contra blanco.

Determinación de ferroso en soluciones con alta concentración de férrico.

• Tomar 0.1ml de muestra sin diluir.

• Agregar 1ml de solución NaF 0.5M en tubo plástico. Agitar.

• Agregar 0.4ml de solución de fenantrolina. Agitar.

• Agregar 1ml de agua destilada. Agitar.

• Leer absorbancia a 510nm contra blanco.

Las diluciones de la muestra original son hechas en agua ácida (pH 1.6).

5.3 ANEXO IV. CEPAS UTILIZADAS EN EL DISEÑO DE PRIMERS

5.3.1 Acidithiobacillus thiooxidans

Cepas utilizadas en el diseño.

1. S000018546 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AJ459803

2. S000018551 Acidithiobacillus thiooxidans; B-53; X75269

3. S000021079 Acidithiobacillus thiooxidans; "ATCC19377 = type strain"; Y11596

Page 73: biolixiviacion cuantificacion bacterias

70

4. S000467259 Acidithiobacillus thiooxidans; OGCS3; AY830898

5. S000467260 Acidithiobacillus thiooxidans; ONAS8; AY830899

6. S000467261 Acidithiobacillus thiooxidans; ORCS8; AY830900

7. S000467262 Acidithiobacillus thiooxidans; OYCS3; AY830901

8. S000467263 Acidithiobacillus thiooxidans; NBRC13701; AY830902

9. S000474032 Acidithiobacillus thiooxidans; WJSo; AY495961

10. S000538630 Acidithiobacillus thiooxidans; DQ067562

11. S000630428 Acidithiobacillus thiooxidans; PIAC10; AY552079

12. S000630429 Acidithiobacillus thiooxidans; COSI13.1; AY552080

13. S000630430 Acidithiobacillus thiooxidans; SACA46; AY552081

14. S000630437 Acidithiobacillus thiooxidans; DAMS; AY552088

15. S000630439 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed6.3; AY552090

16. S000630441 Acidithiobacillus thiooxidans; CASQ23; AY552092

17. S000712735 Acidithiobacillus thiooxidans; SZS; DQ676508

Cepas de Acidithiobacillus Thiooxidans que reconocen entre ambos partidores.

1. S000018546 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AJ459803

2. S000018551 Acidithiobacillus thiooxidans; B-53; X75269

3. S000021079 Acidithiobacillus thiooxidans; "ATCC19377 = type strain"; Y11596

4. S000467259 Acidithiobacillus thiooxidans; OGCS3; AY830898

5. S000467260 Acidithiobacillus thiooxidans; ONAS8; AY830899

6. S000467261 Acidithiobacillus thiooxidans; ORCS8; AY830900

7. S000467262 Acidithiobacillus thiooxidans; OYCS3; AY830901

8. S000467263 Acidithiobacillus thiooxidans; NBRC13701; AY830902

9. S000474032 Acidithiobacillus thiooxidans; WJSo; AY495961

10. S000538630 Acidithiobacillus thiooxidans; DQ067562

11. S000630428 Acidithiobacillus thiooxidans; PIAC10; AY552079

12. S000630429 Acidithiobacillus thiooxidans; COSI13.1; AY552080

13. S000630430 Acidithiobacillus thiooxidans; SACA46; AY552081

14. S000630431 Acidithiobacillus thiooxidans; BRAN50; AY552082

15. S000630432 Acidithiobacillus thiooxidans; STAM61; AY552083

Page 74: biolixiviacion cuantificacion bacterias

71

16. S000630434 Acidithiobacillus thiooxidans; QUEI69; AY552085

17. S000630436 Acidithiobacillus thiooxidans; ATCC 19377; AY552087

18. S000630437 Acidithiobacillus thiooxidans; DAMS; AY552088

19. S000630438 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed3.3; AY552089

20. S000630439 Acidithiobacillus thiooxidans; Sed6.3; AY552090

21. S000630441 Acidithiobacillus thiooxidans; CASQ23; AY552092

22. S000712735 Acidithiobacillus thiooxidans; SZS; DQ676508

23. S000712738 Acidithiobacillus thiooxidans; BY-s; DQ676511

5.3.2 Sulfobacillus thermosulfidooxidans

Cepas utilizadas en el diseño.

1. S000006675 Sulfobacillus thermosulfidooxidans (T); AT-1; X91080

2. S000148467 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; DSM 9293; AB089844

3. S000438420 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; BC1; U75648

4. S000460459 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; G2; AY140233

5. S000712407 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; YN22; DQ650351

Cepas de Sulfobacillus thermosulfidooxidans que reconocen entre ambos partidores.

1. S000006675 Sulfobacillus thermosulfidooxidans (T); AT-1; X91080

2. S000148467 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; DSM 9293; AB089844

3. S000438420 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; BC1; U75648

4. S000460459 Sulfobacillus thermosulfidooxidans; G2; AY140233

Page 75: biolixiviacion cuantificacion bacterias

72

5.4 ANEXO V. TABLA DE NMP

Combinación de

positivos NMP/100ml

Combinación de

positivos NMP/100ml

0 0 0 <2 4 2 0 22 0 0 1 2 4 2 1 26 0 1 0 2 4 3 0 27 0 2 0 4 4 3 1 33 4 4 0 34 1 0 0 2 1 0 1 4 5 0 0 23 1 1 0 4 5 0 1 31 1 1 1 6 5 0 2 43 1 2 0 6 5 1 0 33 5 1 1 46 2 0 0 5 5 1 2 63 2 0 1 7 2 1 0 7 5 2 0 49 2 1 1 9 5 2 1 70 2 2 0 9 5 2 2 94 2 3 0 12 5 3 0 79 5 3 1 110 3 0 0 8 5 3 2 140 3 0 1 11 3 1 0 11 5 3 3 180 3 1 1 14 5 4 0 130 3 2 0 14 5 4 1 170 3 2 1 17 5 4 2 220 5 4 3 280 4 0 0 13 5 4 4 350 4 0 1 17 4 1 0 17 5 5 0 240 4 1 1 21 5 5 1 350 4 1 2 26 5 5 2 540 5 5 3 920 5 5 4 1600 5 5 5 ≥2,400

Page 76: biolixiviacion cuantificacion bacterias

73

5.5 ANEXO VI. FECHA DE RECEPCIÓN DE MUESTRAS

Tabla XVIII. Fecha de recepción de muestras de refino

Fecha Día Muestra

17-Ago 0 P1

14-Sep 28 P2

21-Sep 35 P3

26-Sep 40 P4

03-Oct 47 P5

12-Oct 56 P6

03-Nov 78 P7

13-Nov 88 P8

17-Nov 92 P9

21-Nov 96 P10

Page 77: biolixiviacion cuantificacion bacterias

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6 BIBLIOGRAFÍA

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