TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS DE

MICROSATÉLITESUTILIZADOS EN

IDENTIFICACIÓN HUMANA

ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN

HUMANA • Casos forenses : apareamiento de

evidencia y sospechoso• Test de paternidad• Investigaciones históricas• Investigaciones de personas

desaparecidas• Desastres en masa • Base de datos de convictos

ADN como evidencia ...

• 99 – 99.9% del ADN humano es idéntico de persona a persona

• 1 – 0.1% del ADN humano diferente es usado en métodos de identificación

• Huella genómica o “fingerprinting”

Muestra obtenida de la escena del crimen o de

una prueba de paternidad

Biología

Extraccion de ADN

Extraccion de ADN

Cuantificacion de ADN

Cuantificacion de ADN

Amplificación PCR de marcadores STRs

Amplificación PCR de marcadores STRs

TecnologíaSeparación y Detección de

productos PCR ( Alelos de STRs)

Determinación genotipo muestra

GenéticaComparación del

genotipo de la muestra con otros resultados

Comparación del genotipo de la muestra

con otros resultados

Análisis de los resultados (comparación con datos poblacionales)

Análisis de los resultados (comparación con datos poblacionales)

Entrega de resultados (cálculos

estadísiticos)

Entrega de resultados (cálculos

estadísiticos)

Pasos en el procesamiento de una muestra de ADN

MARCADORES MOLECULARES

• En análisis forense de ADN se utilizan:– RFLPs– VNTRs– STRs– SNPs– ADN mitocondrial– ADN cromosoma Y

CARACTERISTICAS MARCADORES

MORFOLOGICOS • Recesivos en la naturaleza• Problemas con dominancia

incompleta, epistasis, baja penetrancia

• Mutaciones causan fenotipo deletéreo

• Influenciados por el medio ambiente• Fenotipo transitorio • Difícil para combinar

CARACTERISTICAS DE UN MARCADOR POLIMORFICO

IDEAL

• Expresión codominante• Ensayo no destructivos• Penetrancia completa• Alto polimorfismo• Distribución al azar a lo largo

del genoma• Ensayos automatizados

Comparación de los métodos de tipificación

RFLPs

• Tiene alto poder de discriminación• 20-80 alelos diferentes (una localización)• Combinación varios usado determinar

un tipo individualizado.• Métodos de análisis de RFLP extensos• Sondas multi-locus difíciles de

automatizar• Requiere una amplia cantidad de ADN

sin degradar.

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN

• Souther blot • Aislar ADN• Digestión ADN con

ENZIMA restricción• Fragmentos de ADN –

electroforesis • SONDA • Membrana

VNTRs

• Forma variable de los RFLPs

• Repeticiones en tandem de número variable

• Minisatélites (10 – 100 pb)

• Diferencias en el número de repeticiones pueden ser detectadas por diferencias de longitud

MICROSATELITES (STRs)

• Secuencias repetidas en tandem de 2-7pb.• Variación en longitud (unidades de repetición)• Utilizados en diversos campos:

• Identificación genética humana• Diagnóstico predictivo enfermedades base

genéticaSTRs (2- 7 pb)• Muy frecuentes y repartidos por todo el

genoma eucariótico• Modelo de herencia mendeliano,

codominantes y multialélicos• Altamente polimórficos: Variación en la

longitud (Nº repeticiones)

MICROSATELITES (STRs)

GATA

11 repeticiones

10 repeticiones

La region de repetición es variable entre las muestras mientras que las regiones flanqueantes donde se alinean los primers son constantes.

Longitud de la unidad de repetición

• Mononucleótido• Dinucléotidos• Trinucleótidos• Tetranucleótidos (AGAT or

GATA)

• Pentanucleótidos• Hexanucleótidos

ANALISIS DE STRs

• Pequeñas cantidades de ADN – ADN degradado

• Se pueden analizar por medio de PCR: < 350 pb: análisis por PCR

• Utilidad– Identificación individual– Caracterización genética de las razas

SNPs (polimorfismo de nucleótidos simples)

Copias (extensión de primers )

DNA MOLDE 5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Adición de primers

(alineamiento)

5’3’

3’5’

Forward primer

Reverse primer

AMPLIFICACION DE ADN CON LA TÉCNICA DE PCR

Cadenas separadas

(denaturación)

5’

5’3’

3’

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

En 32 ciclos con un 100% de eficiencia se pueden producir hasta 1.07 billones de copias de ADN molde

Multiples copias de ADN por PCR

Original DNA target region

Thermal cycleThermal cycleThermal cycle

Multiplex PCR

• Se pueden analizar hasta 10 loci simultáneamente

• Alta sensibilidad menos de 1 ng de ADN

• Util en análisis de muestras degradadas y de mezclas

• Ventajas: disminuye costos, tiempo, contaminación del ADN

MULTIPLEX PCR

• Diferentes marcadores fluorocromos pueden ser usados para el análisis de loci donde se sobrelapan el tamaño de los alelos

• Separación de productos PCR:– TIPIFICACION MANUAL: Tinción de

nitrato de plata– DETECCION FLUORESCENTE

SEMIAUTOMATICA•Electroforesis capilar•Electroforesis en geles de

poliacrilamida

EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX

D3 FGAvWA 5-FAM (blue)

D13D5 D7 NED (yellow)

A D8 D21 D18 JOE (green)

Estandar interno GS500

ROX (red)

AmpFlSTR® Profiler Plus™

9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR

100 pb 400 pb300 pb200 pb

Separación por tamaño

Sep

ara

ció

n p

or

colo

r

Amplificación de Múltiplex

OPTIMIZACION DE LAS TEMPERATURAS

Activación prePCR 95ºC 12 – 15 min

Tº desnaturalización 95ºC 30 – 60 seg

Tº alineamiento Depende de Tm

Tº extensión 72ºC 20 – 60 seg

Extensión Final 72ºC 7 – 10 min

PROBLEMAS Y SOLUCIONES

• Que hacer cuando se obtienen fragmentos inespecíficos de largo tamaño?– Disminuir el t de alineamiento– Aumentar la Tº de alineamiento– Disminuir el t de extensión– Disminuir la Tº de extensión– Disminuir la cantidad de primer, ADN

molde, taq polimerasa– Chequear los primers en BLAST– Combinar algunas o todas las

anteriores

Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar, el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia emitida por los colorantes es colectada por el detector a longitudes de onda particulares y registrados como señales digitales en el computador.

El instrumento de secuenciación automática genera un cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden de estos colores corresponde a el orden de las bases en el ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente desde el cromatograma.

¿Cuántos alelos distintos se pueden detectar por cada individuo heterocigótico, empleando una sonda de locus único, en un análisis de huella dactilar de ADN?

a. 1b. 2c. 4d. 8

Los alelos VNTR que se analizan en los experimentos de huella dactilar de ADN son altamente variables entre individuos. ¿En qué difieren entre sí los numerosos alelos VNTR de un mismo locus?

A. En el número de sitios internos de corte para la endonucleasa de restricción HaeIII.

B. En el número de genes que codifican proteínas.

C. En el número de sitios de metilación del ADN.

D. En el número de veces que se repite una secuencia sencilla de ADN.

¿En qué método habitual de biología molecular se basa el análisis de alelos VNTR en el estudio medicolegal de perfiles de ADN?

A. Clonación B. Imunotransferencia C. Reacciones de PCR D. Hibridación de Southern

Se usan cálculos de probabilidad en las aplicaciones medicolegales de la huella de ADN para determinar si:

A. El ADN de dos orígenes diferentes tiene alelos coincidentes.

B. Las muestras de ADN se han degradado antes del análisis.

C. Una coincidencia entre alelos de muestras diferentes de ADN puede ser casual.

D. Una muestra desconocida de ADN procede de un varón o de una mujer.

Conclusiones

• Se dispone de muchos tipos de marcadores

• Escogencia de los marcadores para estudios de identificación dependen de muchos factores.

• Todos los marcadores moleculares no son iguales. Ninguno es ideal. Algunos son mejores que otros.