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PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE
ADN BACTERIANO
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO MEDIANTE EL KIT MINI
QUIAMP ADN DE LA FIRMA QUIAGEN
Las condiciones que se deben tomar en cuenta para el proceso de
extracción son las siguientes:
1. Las centrifugaciones se deben realizar a temperatura ambiente.
2. El baño maría a una temperatura de 56ºC.
3. Equilibrar el Buffer AE a temperatura ambiente para la elución.
4. Verificar que el Buffer AW1 y AW2 estén diluidos.
Seguidamente se empieza con la extracción.
1. Mezclar las 30 muestras obtenidas de un lote convirtiéndolas en una
sola muestra en un tubo falcón, una vez bien mezcladas se retiró un
alícuota de 600 µl de muestra.
2. Añadir 20 µl de proteinasa K y 600 µl de buffer AL a la muestra, se
mezcló en un vortex por 15 segundos. Esto para asegurar una lisis
eficiente.
3. Centrifugar momentáneamente para remover las gotas del interior de la
tapa. Se incubó a 56 ºC por 10 minutos.
4. Añadir 600 µl de etanol (96 – 100%) a la muestra y mezclar en un
vortex. Centrifugar momentáneamente para remover las gotas del
interior de la tapa.
5. Aplicar cuidadosamente 700 µl de la mezcla del paso 4 a la columna
QIAamp Mini spin (en tubo colector de 2ml) sin mojar el borde de la
columna. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Colocar
la columna QIAamp Mini spin en tubo colector limpio de 2 ml (provisto)
y descartar el tubo que contenía el filtrado.
6. Repetir el paso 5 por aplicación de los 700 µl de la mezcla remanente
del paso 4 a la columna.
7. Cuidadosamente abrir la columna QIAamp Mini spin y añadir 500 µl
del Buffer AW1 sin mojar los bordes, cerrar la tapa y centrifugar a 8000
rpm por 1 minuto. Colocar la columna QIAamp Mini spin en tubo
colector de 2 ml limpio (provisto) descartar el tubo colector que contiene
el filtrado.
8. Cuidadosamente abrir la columna QIAamp Mini spin y añadir 500 µl de
Buffer AW2 sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar a 14000 rpm
por 3 minutos.
9. Colocar la columna QIAamp Mini spin en un tubo colector de 2 ml
limpio (no provisto) y descartar el tubo colector anterior con el filtrado.
Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.
10.Colocar la columna QIAamp Mini spin a un tubo de 1.5 ml nuevo (no
provisto) y descartar el tubo colector. Cuidadosamente abrir la columna
QIAamp Mini spin y añadir 150 µl del Buffer AE (agua destilada)
incubar a temperatura ambiente por 1 minuto y luego centrifugar a 8000
rpm por 1 minuto.
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO POR CHOQUE TÉRMICO
1. Del pool de 30 muestras se retira un alícuota de 1ml de muestra.
2. Después centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos. Desechar el
sobrenadante.
3. Lavar el pellet tres veces con 1 ml de PBS, centrifugar 10 minutos a
10000 rpm.
4. Tras el último lavado resuspender el pellet en 25 µl de PBS.
5. Después someter a un choque térmico durante 10 minutos a 100 ºC y
pasar a hielo durante 10 minutos.
6. Por último centrifugar 5 minutos a 10000 rpm, pasando el sobrenadante
a otro tubo. En este sobrenadante se encuentra el ADN preparado para
su estudio.
PREPARACION DE SOLUCIONES
PBS (solución salina fosfatada)
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2PO4 1,44 g
K2HPO4 0,24 g
H2O destilada c.s.p. 1000 ml
Ajustar a pH 7,4. Autoclavar. Conservar entre 4-8°C
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO MEDIANTE CHOQUE
TÉRMICO Y MÉTODO POR COLUMNA CON RESINA
1. Del pul de 30 muestras retirar un alícuota de de 1ml de muestra.
2. Seguidamente centrifugar por 20 minutos a 10000 rpm. Desechar el
sobrenadante.
3. Lavar el pellet tres veces con 1 ml de PBS, luego centrifugar por 10
minutos a 10000 rpm.
4. Tras el último lavado resupender el pellet en 25 µl de guanidina.
5. Someter a un choque térmico, durante 10 minutos a 100 ºC y pasar a
hielo durante 10 minutos.
6. Centrifugar por 5 minutos a 10000 rpm, pasando el sobrenadante a
otro tubo.
7. Al sobrenadante añadir 5,83 µl de SDS. Llevar a baño maría a una
temperatura de 56ºC por 10 minutos.
8. Después agregar 8,9 µl de acetato de potasio, seguidamente incubar
en hielo por 30 minutos. Centrifugar por 3 minutos a 10000 rpm.
9. Retirar un alícuota de 40 µl a otro tubo de 1,5 ml.
10. Agregar 20 µl de Binding matriz de resina a la columna Magic Miniprep
Minicolumnas de promega y hacer pasar por esta los 40 µl de la
solución anterior.
11.Lavar tres veces con solución de lavado y tras el último lavado
centrifugar por 20 segundos a 2000 rpm. Con el fin de eliminar todo el
etanol
12.Eluir con 30 µl de agua. Y el ADN extraído es conservado a -20°C.
PREPARACION DE SOLUCIONES
PBS (solución salina fosfatada)
NaCl 8 g
KCl 0,2 g
Na2PO4 1,44 g
K2HPO4 0,24 g
H2O destilada c.s.p. 1000 ml
Ajustar a pH 7,4. Autoclavar. Conservar entre 4-8°C
Preparación de Binding matrix de resina (25 ml)
Resuspender 5 g de Resina Diatomaceous, en 50 ml de agua bidestilada.
Agitar y dejar decantar por lo menos 30 minutos. Descartar el sobrenadante.
Resuspender lo restante en T.E. Hasta completar 25 ml. Autoclavar y
almacenar a 4 °C.
Solución de guanidina HCl: 7M guanidina – HCl; 50 mM Tris-HCl, pH
8,0; 20 mM EDTA
Mezclar:
66,84 g de Guanidina – HCl
5 ml 1 M Tris HCl, Ph 8,0
4 ml 0,5 M EDTA 4 g para 100ml
Calentar suavemente hasta disolver y completar a 100 ml con agua. Autoclavar
Solución de lavado
10 mM Tris – HCl, pH 8,0 (1ml de 1M stock)
1 mM EDTA, pH 8,0 (0,2 ml de 0,5 M stock)
50% de etanol (50ml de etanol absoluto)
EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO POR EL MÉTODO
CLÁSICO
1. Del pool de 30 muestras sacar un alícuota de 1,5 ml, centrifugar y
resuspender el pellet en 800 µl de Buffer de lisis. Añadir 0.8 µl de RNAsa
e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente y 15 minutos en hielo.
2. Añadir 24 µl de Proteinasa K (20 mg/ml) a la solución del paso anterior e
incubar durante 45 minutos a 55°C.
3. Añadir 288 µl de acetato de amonio 7,5 M y 800 µl de cloroformo.
Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos.
4. A la fase acuosa añadir 800 µl de cloroformo, centrifugar por 10 minutos
a 10000 rpm.
5. Recuperar nuevamente la fase acuosa, a esta agregar 2 volúmenes de
etanol al 95% mezclar suavemente. Centrifugar a 8000 rpm por 10
minutos seguidamente eliminar todo el etanol.
6. Añadir 1000 µl de etanol al 70 % y agitar suavemente. Centrifugar a
10000 rpm por 5 minutos para eliminar todo el etanol.
7. Secar los pellets recuperados con el fin de eliminar todo el etanol.
8. Resuspender el pellet en 30 µl de agua libre de DNAasas. Conservar las
muestras a -20 °C para su posterior estudio.
PREPARACION DE REACTIVOS
Buffer de lisis (100 mM tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 2 M NaCl)
1 M tris-HCl pH 8,0 1,0 ml
0,5 M EDTA 0,2 ml
3M NaCl 6,6 ml
Agua destilada c.s.p. 10 ml
Esterilizar en autoclave
Conservar en congelación
EXTRACCION DE ADN BACTERIANO DE BRUCELLA
1. Medir 500 µl de la muestra (plasma).
2. Añadir 500 µl de tampón o buffer Nº 1
3. Dejar en hielo durante 30 minutos
4. Centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente
5. Descartar el sobrenadante
6. Añadir 500 µl de SSC 1x
7. Llevar a vortex
8. Centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos
9. Descartar el sobrenadante
10.Añadir 500 µl del tampón Nº 2
11.Mezclar y agitar
12.Añadir 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml)
13. Incubar durante 2 horas a 50 ºC
14.Añadir 500 µl de cloroformo
15.Llevar a vortex
16.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos
17.Transferir el sobrenadante a un tubo limpio
18.Añadir 1/3 de volumen (es decir del sobrenadante) 7.5 M de acetato de
amonio
19.Anadir dos volúmenes de etanol absoluto y mezclar
20.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos
21.Descartar el sobrenadante
22.Añadir 400 µl de etanol al 70 % para lavar el pellet de ADN
23.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos (repetir paso 22 y 23 dos
veces)
24.Secar el pellet a temperatura ambiente
25.Disolver el pellet de ADN en 50 µl de agua libre de RNAasas y DNAasas
26.Almacenar a -20º C.
PREPARACION DE REACTIVOS
Buffer Nº 1 :
20 mM NaCl
20 mM EDTA
20 mM Tris HCl pH =7.5, 0.5 % TRITON
Buffer Nº2
10 mM NaCl
50 mM EDTA
50 mM Tris HCl pH =7.5, 1% TRITON
Buffer Nº 2
10 Mm NaCl 175.3 g.
50 mM EDTA,
50mM Tris HCl pH 7.5 ,
1% SDS
20 X SSC
NaCl 175.3 g
Citrato de sodio 88.2 g
Citrato de sodio 88.2 g.
Disolver en 800 ml de agua, ajustar el Ph A 7,2 mediante la adicion de unas
gotas de HCl concentrado, también ajustar el volumen a 1000 ml. Diluir para
usar en el protocolo a 1X SSC.
PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE
ARN VIRAL
EXTRACCIÓN DE ARN VIRAL POR EL KIT COMERCIAL (QIAGEN).
Para iniciar el proceso de extracción se debe preparar el material y
reactivos siguiendo las indicaciones provistas por el kit de manera que estén
listos para ser utilizados.
El Kit utilizado para la extracción de ARN en el presente trabajo fue: Kit
QIAamp Viral ARN (Qiagen).
Spin Protocolo Mini QIAamp
Procedimiento:
1. Con una pipeta se añade 560 μl de tampón AVL preparados en un tubo
de microcentrífuga de 1.5 ml.
2. Añadiendo 140 μl de suero en tubo de microcentrífuga que contiene el
Buffer AVL, se mezcla durante 15 segundos para garantizar la eficacia
de la lisis, es necesario que la muestra este bien mezclada a fondo con
buffer AVL para obtener una solución homogénea.
3. Se incuba a temperatura ambiente (15 –25º C) durante 10 min. Para que
la lisis de partículas virales sea completa después de 10 min a
temperatura ambiente.
4. Se centrifuga brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la
tapa.
5. Se añade 560 μl de etanol (96-100%) a la muestra y se mezcla por
agitación manual 15 segundos. Después se centrifuga brevemente para
eliminar las gotas del interior de la tapa. Es importante que la muestra
este homogéneamente mezclada.
6. Se añade cuidadosamente 630 μl de la solución desde el paso 5 a la
columna de la Mini QIAamp (en un tubo de 2 ml) sin mojar el borde. Se
Cerró la tapa y centrifugo a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Se coloca
a la columna Mini QIAamp en un tubo de 2ml para recoger y luego
desechar el tubo que contiene el filtrado. Cerrando cada columna con el
fin de evitar la contaminación cruzada durante la centrifugación. Si la
solución no ha pasado completamente a través de la membrana, se
somete a centrifugación de nuevo a una velocidad mayor hasta que toda
la solución haya pasado.
7. Se destapa cuidadosamente el Mini QIAamp columna, y se repite el paso
6.
8. Luego se añade cuidadosamente 500 μl de Buffer AW1 a la columna. Se
cierra la tapa, y se centrifuga a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Se
pone la columna Mini QIAamp en un tubo limpio de 2 ml tubo de
recogida (siempre), y se desecha el tubo que contiene el filtrado.
9. Posteriormente se añade cuidadosamente a la columna, 500 μl de Buffer
AW2. Se centrifuga a toda velocidad (20.000 x g, 14.000 rpm) durante 3
min y se elimina el sobrenadante.
10. Se pone la columna Mini QIAamp en un nuevo tubo de 2 ml de colección
y se desecha el tubo con el filtrado. Se centrifuga a alta velocidad
(14.000 rpm) por 1 min.
11. Se pone la columna Mini QIAamp en un tubo limpio de 1,5 ml de
microcentrífuga. Se desecha el tubo que contiene el filtrado.
Cuidadosamente se abre la columna Mini QIAamp y se añade 60 μl de
Buffer AVE para la elución a temperatura ambiente. Se cierra la tapa, y
se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 6000 x g
(8000 rpm) durante 1 min.
Las extracciones obtenidas en caso de no ser procesadas
inmediatamente pueden ser conservadas a – 20ºC o – 80ºC hasta que se
procesen.
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ARN VIRAL
UMSAGEN
Preparación de las muestras
Se prepararon 200µl de las muestras en 300 µl de cloruro de Guanidina y
conservadas a -20 ºC hasta el momento de la extracción del RNA y DNA.
Procedimiento
Trabajar a 4ºC.
Descongelar la muestra y agitar en vortex y agregar: 60 µl Acetato de
Sodio y 200 µl Cloroformo, mezclar enérgicamente en vortex y dejar 10
min a -20ºC.
Centrifugar a 10000 rpm 15 min a 4ºC.
Recuperar cuidadosamente la fase acuosa (sobrenadante) en otro tubo
eppendorf.
Agregar 500 µl de Isopropanol y mezclar suavemente por inversión.
Dejar a - 20 ºC por 60 min
Centrifugar a 10.000 rpm 15 min a 4ºC y decantar el sobrenadante.
Agregar 500 µl de Etanol frío al 70 %, mezclando suavemente por
inversión.
Centrifugar a 10.000 rpm 5 min a 4 oC y decantar totalmente el
sobrenadante.
Resuspender el sedimento con 50 µl de agua DEPC fría a esto añadir 5 µl
de Acetato de Sodio (mantiene el ph estable) y 100 µl de Etanol absoluto
frío Mezclar bien por inversión y dejar a - 20 ºC por una noche.
Centrifugar a 13000 rpm 15 min a 4 oC y decantar totalmente el
sobrenadante.
Secar el sedimento a temperatura ambiente hasta la eliminación total del
sobrenadante.
Resuspender el sedimento con 30 µl de agua DEPC y conservar el RNA
extraído a -20ºC (Chomczynski, and Sacchit, . 1986).
Reactivos
Agua DEPC 0.1 %
Dietil Pirocarbonato 1ml
Agua csp 100ml
Tiocianato de guanidina 4 M
Guanidina tiocianato 23.64 g
N- Lauril Sarcrosil 250 mg
Citrato de sodio . 2 H2O 367 mg
Beta Mercaptoetanol 14.3M 350 µl
Agua DEPC csp 50 ml
PROTOCOLO CONVECIONAL PARA LA EXTRACCIÓN DE
ARN VIRAL
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo nuevo de 2ml añadir 1,5 ml de Buffer I y 300ul de suero
mezclar la solución y dejar a temperatura ambiente por 1min
2. Centrifugar a 7,312rpm /10 min a temperatura ambiente.
3. Separar el sobrenadante (en el que está el ARN) en un tubo nuevo de
2ml
4. Añadir 0,1 vol. de acetato de sodio 3M pH 5,2, mezclar bien y añadir 0,5
vol. de etanol frio en hielo, mezclar y guardar la solución por más de 2
hrs a 0 ºC
5. Centrifugar a 7,300 rpm /10 min./0ºC, descartar el sobrenadante y secar
el pellet a temperatura ambiente
6. Disolver el pellet en un pequeño volumen de buffer II (1,5ml de buffer II)
es difícil disolver el pellet, y se puede utilizar un homogeneisador
7. Añadir 0,5 vol. de etanol frio en hielo y mezclar inmediatamente,
almacenar la solución por más de 2hrs a – 20ºC
8. Centrifugar a 7,300 rpm /10 min, decantar el sobrenadante y secar el
pellet a temperatura ambiente
9. Repetir el paso 7 y 8 (3V)
10.Disolver el pellet en EDTA 0,02M pH 8 (750ul), como sigue: añadir
aproximadamente la mitad de la solución de EDTA 0,02M pH 8 y llevar a
vortex por 1-2 min. Luego centrifugar por 2 min. a 5.700 rpm. Recuperar
el sobrenadante en un tubo; luego añadir la segunda mitad de la
solución EDTA 0,02M pH 8 al pellet y llevar a vortex 1 o 2 min. hasta
disolver el pellet y finalmente formar un pool de las soluciones de
EDTA .
11.Añadir igual volumen de cloroformo y llevar a vortex
12.Centrifugar a 7,300 rpm /10 min. a temperatura ambiente transferir la
fase acuosa a otro tubo y repetir la extracción con solventes orgánicos
(cloroformo)
13.Transferir la fase acuosa a otro tubo nuevo y añadir 3 vol. de acetato de
sodio 4M pH 7,0 y guardar por más de 1 hora / -20ºC
14.Centrifugar a 7,300 rpm /20 min a 0ºC. Bajo ésta condición los restos de
ADN se encuentran solubles y el ARN es precipitado
15.Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con acetato de sodio 3M pH 7,0
a 4ºC Centrifugar a 7,300 rpm /20 min a 0ºC
16.Retirar tanto como sea posible el sobrenadante y disolver el pellet en un
mínimo volumen de 0,2% de SDS, 0,05M EDTA Ph8 1ml/gr
Nota : si el SDS precipita añadir 0.1N de NaOH gota a gota en ajitación
hasta llegar a un pH 7,5
17.Añadir 2vol. de etanol frio y dejar más de 2 hrs a 0ºC y recuperar el
ARN por centrifugación 7,300 rpm /10 min a 4ºC
18.Lavar el pellet con etanol a 70% centrifugar brevemente y el pellet secar
al aire
19.Disolver el pellet de ARN en un vol. pequeño de agua, añadir 3 vol. de
etanol y guardar la solución a -70ºChasta que sea utilizado.
20.Para recuperar el ARN remover una alícuota y añadir acetato de sodio
3M pH 5,2 a una concentración final de 0,3 M mezclar bien y almacenar
a -70ºC
REACTIVOS
Buffer 1
Guanidina HCl 8M (M = 95.6)
0.1 M de acetato de sodio (pH 5.2)
5 mM dithiothereitol
0.5 % sodium lauryl sarcosinate
Añadir 191g de guanidina HCl , 8.35 ml de 3 M de acetato de sodio y 6.25 ml
de 0.2 M dithiothreitol. Anadiri H20 237.5 ml y mezclar bien. Anadir 12.5 ml de
sodium lauryl sarcosinate al 10 % mezclar bien.
Buffer II
Guanidina HCl 8M (M = 95.6)
0.2 M de acetato de sodio (pH 5.2)
1 mM dithiothereitol
20 m M EDTA (pH 8.0)
Añadir 191g de guanidina HCl , 8.35 ml de 3 M de acetato de sodio y 1.25 ml
de 0.2 M dithiothreitol. Añadir 10 ml de y añadir 250 ml de H20 y mezclar bien.
.
PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE
ADN VIRAL
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN VIRAL
La extracción del ADN se realizara según el procedimiento descrito por Deka et
al del 2005 citado por Lata Jain el 2006 que se describe a continuación:
a. Medir aproximadamente 500μl de la muestra que contiene el virus.
b. Tratar con 10μl al 10% de dodecil sulfato de sodio (concentración final
0,2%) y 8μl de proteinasa K (250μg/ml).
c. Incubar la mezcla a 56 ° C durante una hora en un baño maría.
d. Luego mezclar con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol
isoamílico (25:24:1) y centrifugar a 14.000 rpm durante 15 min
e. La fase acuosa se somete a un ciclo más de lavado con fenol:
cloroformo: alcohol-isoamílico.
f. Luego mesclar con un volumen igual de cloroformo: -alcohol isoamílico
(24:1).
g. Dejar el ADN en incubación durante toda la noche a -20 ° C en un
volumen 1/10 de acetato de sodio 3M y volumen igual de isopropanol
h. Precipitar por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 min.
i. El pellet de ADN debe ser lavado dos veces con 500μl de etanol al 70%
a -20 ° C y centrifugar a 14.000 rpm durante 15 min.
j. luego secar el pellet al aire y resuspender en 80μl de agua ultra pura
libre de RNAsa y DNAsa para su uso en PCR.
k. Almacenar las muestras extraídas a -20 ° C.
PROTOCOLOS DE AMPLIFICACION – DETECCION DE Micoplasmosis
aviar
PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL PARA LA
DETECCIÓN DE Mycoplasma gallisepticum Y Mycoplasma synoviae
1. Preparación de la mezcla
Para la reacción de PCR, se prepara una mezcla con los siguientes
reactivos: Master mix, agua ultra pura y SEQ Mg-Ms-IPC en una placa de
congelación con el fin de evitar la degradación del ADN y reactivos.
MEZCLA REACTIVOS POR MUESTRA
(µl)
PARA 6
MUESTRAS (µl)
MEZCLA
Mg – MS
Master Mix 12,5 75
Agua libre de
DNasas
5,5 33
SEQ Mg-Ms-IPC 2 12
VOLUMEN
TOTAL DE LA
REACCION
20 120
2. El paso siguiente es crear una hoja de Píate para la ejecución de la
PCR. Donde cada cuadro representa el pocillo donde se encuentran las
muestras y controles.
3. Seguidamente realizar el programa de cicláje para la PCR en tiempo
real.
Desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 minutos por 1 ciclo
Desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto por 45
Hibridación y extencion a 60 ºC durante 1 minuto y 30 segundos ciclos
4. Agitar la mezcla cuidadosamente, para asegurar una adecuada
homogenización.
5. Añadir 20 µl de la mezcla Multiplex Mvcoplasma aviar a cada uno de
los pocillos de la placa PCR. Posteriormente añadir 5 ul del control
negativo (CN), las muestras a los diferentes pocillos, control positivo
externo (CPE) para Mycoplasma gallisepticum y control positivo externo
(CPE) para Mycoplasma synoviae, (Ver tabla anexada).
Posillo
1
Posillo 2 Posillo 3 Posillo 4 Posillo 5
Mezcla para la reacción
PCR
20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl
Control negativo 5 µl
Muestra 1 5 µl
Muestra 2 5 µl
Control positivo
externo para
Mycoplasma
gallisepticum
5 µl
Control positivo externo
para Mycoplasma
synoviae
5 µl
Total 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl
PROTOCOLO DE AMPLIFICACION USANDO EL SISTEMA SYBER GREEN
CON EL KIT DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE MYCOPLASMA
GALLISEPTICUM Y MYCOPLASMA SYNOVIAE ELABORADO POR EL
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR PROINPA
La amplificación por PCR en tiempo real usando el fluorocromo SYBR Green
se realizo con 5 μl de DNA molde y un volumen final de reacción de 15 μl. Los
diferentes reactivos se prepararon en dos soluciones diferentes Mezcla 1 y
Mezcla 2 con las siguientes concentraciones:
Tabla 1: Mezcla 1 para la reacción PCR
Stock Concentración Final 5 µl
Tampón PCR 10 X 1 µl
dNTPs 5 mM 0,3 µl
Cebadores 10 pmol 0.75 µl
H20 PCR 2,95 µl
Tabla 2: Mezcla 2 para la reacción PCR
Stock Concentración Final 5 µl
Tampón PCR 10 X 0,5 µl
H20 PCR 4,4 µl
Taq Polimerasa 0,1 µl
Estas mezclas fueron preparadas para determinar Mycoplasma gallisepticum y
Mycoplasma synoviae individualmente, es decir detectar un patógeno en un
solo tubo de reacción.
Para la detección simultanea de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma
synoviae se realizaron modificaciones en cuanto al volumen del mezcla 1,
como se observa en la tabla 3.
Tabla 3: Mezcla 1 usada para la detección simultanea de Mycoplasma
gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Stock Concentración Final 5 µl
Tampón PCR 10 X 1 µl
dNTPs 5 mM 0,3 µl
Cebadores para Mg 10 pmol 0,75 µl
Cebadores para Ms 10 pmol 0,75 µl
H20 PCR 2,2 µl
Tabla 4: Mezcla 2 usada para la detección simultanea de Mycoplasma
gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Stock Concentración Final 5 µl
Tampón PCR 10 X 0,5 µl
H20 PCR 4,4 µl
Taq Polimerasa 0,1 µl
El volumen de la mezcla 2 no sufrió ninguna modificación.
Para la amplificación se utilizó el siguiente programa de ciclaje:
Desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos por 1 ciclo
Desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto
Hibridacion a 60 ºC durante 1 minuto y 30 segundos por 35 ciclos
Elongación a 72 ºC durante 30 segundos
Para el análisis de las curvas de disociación (Tm), se añadió un ciclo en el que
tiene lugar un incremento paulatino de temperatura desde 55 a 90 °C, en 35
min.
PREPARACION DE REACTIVOS
Tampón PCR 10 X (10ml)
Tris H Cl 1M pH 8,3 1ml (100 mM)
MgCl2 (203,30 g/mol) 0,046 g (20mM)
KCl (74,55 g/mol) 0,3728 (500 mM)
Enrasar a 10 ml y autoclavar. Almacenar a -20 ºC
Solución dNTPs 5 Mm (400 µl)
dATP 100 mM 20 µl
dGTP 100 mM 20 µl
dCTP 100 mM 20 µl
dTTP 100 mM 20 µl
PROTOCOLOS DE AMPLIFICACION – DETECCION DE
diarrea viral bovina
DETECCIÓN DEL VIRUS DE DIARREA VIRAL BOVINA (VDVB)
MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON EL KIT TAQVET
BVD ( FAST IPI) A PARTIR DE SANGRE ENTERA CON EDTA COMO
ANTICOAGULANTE
El kit utilizado para la detección del vDVB mediante RT-PCR en tiempo
real fue: Kit TaqVet BVD (Fast IPI) que se utiliza para procesar una muestra
por pocillo, apartir de sangre entera con EDTA como anticoagulante.
Protocolo.-
1. Se realiza una pre-dilución de las muestras antes de ser procesadas la
sangre entera con (EDTA), debe realizarse una dilución 1/10 con agua
ultrapura libre de RNasa, Posteriormente se realiza una nueva dilución
1/10 con el reactivo BVD Fast Buffer
2. Se añade 5 ul de la pre-dilución de la muestra y 45 µl de BVD Fast
Buffer.
3. De la dilución obtenida en el paso 2 será analizada 5ul por RT-PCR.
4. Una vez preparado, el tubo que contiene el Fast Mix BVD en una placa
de refrigeración.
5. Se añade 20 μl de Fast Mix BVD y se mezcla la muestra en un tubo de
ensayo de 1,5 ml (para evitar la contaminación de la sonda" BVD Fast
Mix).
6. Se dispensa 20 μl de la mezcla por pocillo en la microplaca de PCR.
7. Luego se añade 5 μl de muestra diluida en DVB rápido de buffer en los
pozos de la microplaca, que se utilizará para la prueba en sus
respectivos pocillos.
8. Se tapa bien la serie de tubos PCR para iniciar la amplificación.
9. Se programa el equipo para el procesamiento de la muestras
10. De esta manera inicio el proceso de la PCR en tiempo real.
DETECCIÓN DEL VIRUS DE DIARREA VIRAL BOVINA VDVB
MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON EL KIT TAQVET
BVD (FAST IPI) MODIFICADO APARTIR DE LA EXTRACCIÓN
DE UN POOL DE 20 MUESTRAS DE SUERO.
El kit utilizado para la detección del vDVB mediante RT-PCR en tiempo
real fue: Kit TaqVet BVD (Fast IPI) que se utiliza para procesar una muestra
por pocillo, apartir de sangre entera con EDTA como anticoagulante, este kit
se utilizó para procesar un pool de 20 muestras por pocillo como se realiza en
otros kits de RT-PCR en tiempo real con algunas modificaciones.
Protocolo.-
1. Las muestras que se obtuvieron del producto de la extracción de ARN
fueron procesadas sin ningún tratamiento previo.
2. Una vez que este todo preparado se puso el tubo "BVD Fast Mix en una
rejilla de refrigeración.
3. Se agito en un vortex suavemente el tubo "BVD Fast Mix
4. Se añadió 20 μl de “Fast BVD” y mezclo la muestra en un tubo de
ensayo de 1,5 ml (para evitar la contaminación de la sonda" BVD Fast
Mix).
5. Se dispenso 20 μl de la mezcla por pocillo en la microplaca de PCR.
6. Luego se añadió 5 μl del producto de la extracción de ARN en los pozos
de la microplaca, que se utilizará para la prueba en sus respectivos
pocillos.
7. Se cubrió la placa con un adhesivo para iniciar la amplificación.
8. Se programo el equipo para el procesamiento de la muestras
9. De esta manera inicio el proceso de la PCR en tiempo real.
Para ambos procedimientos el programa de ciclaje es:
Primera etapa: 48°C – 30 min – repetición: 1
Segunda etapa: 95°C – 10 min – repetición: 1
Tercera etapa: 95°C – 15 seg. - repetición : 45
Cuarta etapa: 60°C – 1 min – repetición : 45
TÉCNICA DE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON UN KIT
DISEÑADO PARA LA DETECCIÓN DE LA DIARREA VIRAL
BOVINA (DVB) APARTIR DE LA EXTRACCIÓN DE UN POOL DE
20 MUESTRAS DE SUERO.
1.- Preparación de mesclas de amplificación mix 1 y mix 2
2.- Se trabaja con el producto de la extracción de las muestras procesadas por
RT-PCR en tiempo real.
3.- Al producto de la extracción se realiza una retro-transcripción previa para
convertir de ARN a ADNc y de esta manera poder trabajar con el equipo de RT-
PCR en tiempo real.
4.- Se dispensa 5ul a cada pocillo del mix 1 y 5ul mix 2.
3.- Luego se añade 5ul de las muestras a cada tubo PCR.
4.- Colocar los tubos en el equipo de RT-PCR en tiempo real LSI SLAN (Es
muy importante trabajar en la placa refrigerante para evitar la degradación tanto
de los reactivos como de las muestras durante el proceso).
Reactivo Cantidad 1
muestra
Cantidad 12
muestras
Mix 1
Tampon PCR 10X 1ul 12ul
dNTP 5 milimolar 0.3ul 3.6ul
Primer 10 pmol 0.7ul 9ul
Agua de PCR 2.95ul 35.4ul
Mix 2
Tampon PCR 4.4ul 52.8ul
Agua de PCR 0.1ul 1.2ul
Taq plimerasa 5ul 60ul
Syber green 0.05 0.6
5.- Los tiempos y temperaturas de reacción utilizados se los describe a
continuación.
Etapa Nº de ciclo Temperatura Tiempo
Primera 1 ciclo 95ºC 10 min
Segunda 35 ciclos 94ºC
72ºC
1min
30 seg.