CROMATOGRAFÍA

Invención de la Cromatografía

Mikhail Tswett Botánico Ruso (1872-1919)

Mikhail Tswett

Inventa la cromatografía en 1901 durante su investigación con pigmentos vegetales.

Utilizó la técnica para separar varios pigmentos vegetales como clorofilas, xantofilas y los carotenoides.

Cromatografía…

Papel

HPLC Gas

Capa delgada

Columna

CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDOS

PLANAR COLUMNA

IEC SEC

FLUIDO SUPERCRÍTICO

BPC

TLC PC

GASES

GSC GLC

LSC

BPC-NP GPC GFC BPC-RP

Problemas de Sorción ABsorción ADsorción

Ley de Distribución (Reparto) • Una sustancia (ácido benzóico HB) que se reparte entre dos

disolventes inmiscibles entre sí acorde con:

O2H

org

CC

K =[ ][ ] O2H

orgD HB

HBK =

HB ⇔ H+ + B- [ ] [ ]

[ ] O2H

O2HO2Ha HB

BHK−+

=

[ ][ ] O2H

org

HB.concHB.conc

D = [ ][ ] [ ] O2HO2H

org

BHBHB

D −+=

Ley de Distribución (Reparto)

[ ]

[ ] [ ]

+

=

+O2H

O2H

org

HKa1HB

HBD

a pH = 3 9.93

101105.61

100

3

5=

××

+=

−

−D

a pH = 5 3.13

101105.61

100D

5

5=

××

+=

−

−

a pH = 7 15.0

101105.61

100D

7

5=

××

+=

−

−

si Kd=100 y Ka=6.5x10-5

[ ]

+

=

+O2HH

Ka1

KdD

Extracciones sucesivas

• Si queremos extraer 4 g de ácido butírico de 500 mL de H2O usando 500 mL de eter, donde Kd=3.0

( )5.0/X

5.0/X40.3CCKd O2Horg−

===

X = 1.0

3.0g

1.0g

Recobro – 75%

Extracciones sucesivas

250 mL 250 mL

500 mL 500 mL

2.40g

1.60g

0.96g

0.64g

colectar

transferir

colectado = 3.36g quedan = 0.64g

Recobro – 84%

Eficiencia de extracción

Nunca llega a cero

EXTRACCIÓN CONTINUA (CRAIG)

Teoria de la Cromatografía

• Existen dos modelos para explicar la cromatografía

• Teoría de platos – viejo – Desarrollado por Martin y Singe 1941

• Modelo cinético – actual – Desarrollado por Van Deempter 1956 – Explica los procesos dinámicos de separación

•Destilación fraccionada en la cual se repite el ciclo de vaporización y condensación sucesivamente,

•Plato teórico el número de ciclos eficaces de vaporización y condensación en una destilación fraccionada.

Destilación Fraccionada

http://www.esacademic.com/pictures/eswiki/77/McCabe-Thiele_diagram.svg

Cromatografía: Constante de Distribución (recomendado por la IUPAC)

(antes: Coeficiente de Partición)

ccK

M

Sc = estacionaria

móvil

A móvil ↔ A estacionaria

K ~ Constante Cromatografía linear

>>>K >>> Retención en la fase estacionaria Tiempos de Retención

¿Como manipular K?

CS = nS/VS, CM = nM/VM

Cromatografía Tiempos de Retención

tM = Tiempo de Retención fase móvil (tiempo muerto) tR = Tiempo de Retención del analito (soluto) tS = Tiempo en la fase estacionaria (Tiempo de Retención adjustado) L = largo de la columna

Cromatografía: Velocidades Relación lineal de migración del soluto!

M

R

tLtLv

=

=

µ

Velocidad = distancia/Tiempo largo de Columna/ Tiempos Retención Velocidad del soluto: Velocidad de la fase móvil :

Cromatografía Velocidad/Retención, Tiempo y Kc

SSMM

MM

VcVcVcv

soluto de totales molesmóvil fase en soluto de molesv

móvil fase en tiempo de fracción v

+×=

×=

×=

µ

µ

µ

Cromatografía Relaciones de Velocidad

MS

M

S

MMSS

SSMM

MM

V/VK11v

ónDistribuci de Constante ccK

Vc/Vc11v

VcVcVcv

+×=

=

+×=

+×=

µ

µ

µ

Cromatografía Factor de Retención : ¿ya casi?

M

MRA

AMR

A

MSAA

MS

tttk

k11

tL

tL

k11v

Retención) de (Factor V/VKk

V/VK11v

−=

+×=

+×=

=

+×=

µ

µ

Tiempo de retención ajustado

Tiempo de Retención Relativo : RRT = tR/tRs

tRs = Tiempo de Retención del estándar interno

Cromatografía Factor de Selectividad : ¿los podemos separar?

MAR

MBR

M

MBRB

M

MARA

A

B

A

B

t)t(t)t(

tt)t(ky

tt)t(k

kkKK

−−

=

−=

−=

=

=

α

α

α

B se retiene mas que A a >1

Constante de Distribución

Factor de Retención

Tiempo de Retención

Cromatografía Eficiencia de Columna – Platos Teoricos Teoría de

Platos y Velocidades

LH

HLN

platos de número Nplato de altura H

2σ=

=

==

σ desviación estándar σ2/L varianza por unidad largo.

L = largo del empaque de la columna

Cromatografía Relación entre largo de la columna y Tiempos de

Retención

R

R

R

t/L

tL

tiempo en estándar desviación retención de tiempo t

distancia en estándar desviación )(distancia columna la de largo L

στ

τστ

σ

=

=

====

Cromatografía Relación entre largo de la columna y Tiempos de

Retención

2

22

16

4

4

R

R

R

R

tLW

LH

tLW

WtL

tL

==

=

=

=

=

σ

σ

τ

τσ

τσ

~96% ± 2τ Tangent at

Inflection point

Cromatografía Determinación del número de platos teóricos

2

2/1

R

2R

Wt54.5N

Wt16N

platos de número N

=

=

=

W1/2

Resumen de la Teoría de Platos

• Da cuenta de la forma de los picos y la velocidad de movimiento

• No toma en cuenta el “efecto” de ensanchamiento de banda

• No indica efectos de otros parámetros • No indica como ajustar los parámetros

experimentales

Teoría Cinética

• Ensanchamiento de Banda debida a procesos de transferencia de masa

FORMAS DE PICO • Ideal Ancho Cabeceo Coleo Doblete

TIEMPO

Simetría de la Señal

INFORMACIÓN DEL CROMATOGRAMA

1. POSICIÓN DEL PICO – tR función de K (Termodinámica)

2. ANCHO DE PICO – N, H (Cinética) Responsable de ensanchamiento de banda

3. FORMA DEL PICO – Simétrica o asimétrica

EL TIEMPO DE RETENCIÓN DEPENDE DIRECTAMENTE DEL COEFICIENTE DE REPARTO

tR = tM + t'R

tR = tM (1 + k')

Recuerda que K = k'β

tR = tM (1 + K /β)

ENSANCHAMIENTO DE BANDA

1.

2.

3.

HETP = H = σ2 / tR

N = 16 tR / Wb( )2 = tR / σ( )2

H = L / N = tR / tR / σ( )2 = σ2 / tR

ECUACIÓN DE VAN DEEMTER – 1956 (PARA COLUMNAS DE CG EMPACADAS)

HETP = H = A + B / µ + C µ

DISPERSIÓN DE PICO t 0

t 1

t 2

EFECTO MULTICANAL (Difusión de Eddy)

INICIAL CAMA EMPACADA FINAL

1

2

3

1

2

3

lento

rápido

DIFUSIÓN LONGITUDINAL (FASE MÓVIL )

t1 t2 t3

TRANSFERENCIA DE MASA LENTA ( MÓVIL A ESTACIONARIA )

Moléculas de Soluto

GRÁFICO DE VAN DEEMTER

C

A

B

Velocidad Lineal promedio (µ)

H = A + Bµ ( )+ C × µ ( )

Ecuación de Van Deemter

(1+εp/εe) 2 Dm

u 2λ dp + qs k

(1+k)2 df

2

Ds u + +

dp2

Dm f(k) u

1. Columnas empacadas

H = A + B/u + (CS + CM)u

λ: factor de empaque de la columna (0.5~1.5) dp: tamaño de las partículas de empaque εp: porosidad interna de la partícula εe: porosidad entre las partículas Dm: coeficiente de disfusión del soluto en la fase móvil. k: factor de capacidad k = K (Vs/Vm) Ds: coeficiente de disfusión del soluto en la fase estacionaria. qs: factor del recubrimiento de la fase estacionaria (2/3 para capa delgada). df: espesor de la fase estacionaria

2. Columnas Capilares—open tubular

2Dm

u 2k

3(1+k)2 df

2

Ds u + d2

Dm u

H = B/u + (CS + CM)u

1+6k+11k2

96(1+k)2 +

¡sin difusión de eddy!

Hmin = 2*(BC)1/2

uopt = (B/C)1/2

H = B/u + Cu

Fase líquida Sílica Fundida

Término C – Transferencia de Masa COLUMNAS CAPILARES

d2

Dm 1+6k+11k2

96(1+k)2 Cm =

2k 3(1+k)2

df2

Ds

d2

Dm 1+6k+11k2

96(1+k)2 + CS + CM =

H = B/u + (CS + CM)u El cociente de los valores de CS y Cm contribuye al término de resistencia a la transferencia de masa y se determina por la relación de fases.

(Vm/Vs) = d/4df , cuando, d>>df

Hmin = 2*(BC)1/2

uopt = (B/C)1/2

El Efecto del Gas Portador

H = B/u + (CS + CM)u DAB = 1.00 x 10-3 T1.75

P[(sum vi)A1/2 + (sum vi)B

1/2] ( )

MWA

1 MWB

1

DAB = kT/(6πηBrA)

gas

líquido

2Dm

u 2k

3(1+k)2 df

2

Ds u + d2

Dm u

H = B/u + (CS + CM)u

1+6k+11k2

96(1+k)2 +

T u df d k

Parámetros que afectan H

HPLC - ECUACIÓN VAN DEEMTER (Modificada)

HETP= H = A +Bu

+ CS + CM[ ]u

4 fuentes independientes de ensanchamiento de banda

Minimiza cada término, Minimiza “H”, Maximiza Eficiencia

HPLC – DIFUSIÓN de EDDY

A = 2λdp

La clave son partículas pequeñas, empacadas eficientemente.

usualmente 10 y 5 micras

existen de 3 micras

HPLC – DIFUSIÓN LONGITUDINAL

Un factor muy pequeño en HPLC

La difusión en líquidos despreciable

B / v =2γD mobile

v

HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA – FASE ESTACIONARIA

Q = Factor de Configuración R = Constante; f (K ) df = Espesor de fase estacionaria D stat = Coef. difusión en fase estacionaria v = velocidad de flujo (cm / sec )

Clave: película delgada

Csv =QRDf

2vD stat

HPLC – TRANSFERENCIA DE MASA – FASE ESTACIONARIA

w = Coeficiente de Columna dp = Diámetro de partícula v = Velocidad de flujo (cm / seg ) D mov.= Coeficiente de difusión en

fase móvil

Clave: partículas pequeñas

Cmv = wdp2vD mobile

ECUACIÓN DE VAN DEEMTER DETALLADA

H = 2λdp( ) + 2γDmv

+

QRdf2v

Ds+ ωdp2v

Dm

Eficiencia de la Columna Variables Cinéticas

Ensanchamiento de Banda Velocidad de Flujo de la Fase Móvil

Cromatografía de Líquidos Cromatografía de gases

Vea las diferencias en Flujo y Altura de Plato Teórico

¿Porqué la CG normalmente tiene altos H, pero también alta eficiencia?