Laboratorio 4:

Tinción de microorganismos

Biol 3725L

Repaso de diluciones1 ml

9 .9ml99 ml 9 ml

0.1 ml 1 ml

9 ml

1 ml

9 ml

1 ml

9 .9ml99 ml 9 ml

0.1 ml

1 / 100 10-3

1 / 10 10-1

0.1/ 101/ 100 10-5

9 ml

1/10 10-6

9 ml

1/10 10-7

10-8

25 UFC2 UFC

1 ml

10-7

1 ml

10-6

265 UFC

1 ml

TMTC

¿Cuántas colonias viables tengo?1. Escojo el plato que tenga

entre 25 – 250 UFC.2. Utilizo la fórmula de:

UFC * (1/factor de dilución)

Reportar datos:

1. Placas con estriado: obtuvo o no colonias discretas

2. Dilución en serie: reporte UFC/mL para las tres placas utilizadas en su sub-grupo (incluya los cálculos)

Objetivos

• Conocer el mecanismo básico y ventajas de una tinción.

• Aprender conceptos básicos relacionados a: • Proceso de preparación de un frotis• Tinción Gram• Tinción Gram

• Tinción Ácido-Resistente• Tinción de Esporas

• Tinción de Cápsula (negativa).

• Identificar características en las bacterias en estudio en base a las diferentes tinciones.

Tinciones de microorganismos

• Tinción Gram (práctica)

• Tinción de Cápsulas - Tinción Negativa (práctica)

• Tinción de Esporas (práctica)

• Tinción Ácido-Resistente (teoría)

• Tinción de flagelos (teoría)

Morfología y agrupación de bacterias

Ya se han discutido métodos de clasificación por morfología y medios de cultivo.

Ahora utilizaremos tinciones con el fin de poder seguir caracterizando a las bacterias.

Espiroquetas

CocoBacilo

Morfología y agrupación de bacterias: Tinción

• La tinción es una de las técnicas más utilizadas en los laboratorios de microbiología para clasificar microorganismos.

• El tinte es un compuesto orgánico que le da contraste a la célula. célula.

• cromógeno (solvente orgánico que le provee las propiedades de color)

• auxócromo (grupo químico que se ioniza con el cromógeno y forma sales que se pegan a las fibras y tejidos).

• La adhesión del tinte va a depender de la carga que posea.

Tinción

Tipos de Tinciones

• Simple

• Tamaño, arreglo y forma

• Un solo tinte

• Directa

•Diferencial•Separar y clasificar los microorganismos observados de acuerdo a sus características

• Específica•Para identificar estructuras:

•Ejemplos: Tinción de flagelos,

• Tiñe bacteria

• Negativa

• tiñe el fondo pero no a la bacteria

características

•Más de un tinte

•Ejemplos: Tinción Gram y Ácido resistente

de flagelos, cápsulas y esporas.

(-)

(-)

(-)(-)

(-)(-)

(-)

(-)

(-)(-)

(-)

(-)

(+)

methylene blue

Tinción simple: un solo tinte , afinidad por carga c on componentes de la superficie de la célula

Ejemplo : azul de metileno

(-)

(-)(-)

(-)

methylene blue

Tinción diferencial: permite detectar tipos distinto s de células

Pasos de la Tinción Gram

Cristal violeta (1 minuto)

Lavar con aguaYodo (1 minuto)

Azul-Violeta Rojo

(Streptococcus sp.) (Escherichia coli)Yodo (1 minuto)Lavar con agua

Alcohol etílico al 95% (20 segundos)

Lavar con aguaSafranina (1 minuto)

Lavar con agua Secar con bibolous

paperGram+= azul-violeta, Gram – = rojo

(Streptococcus sp.) (Escherichia coli)

Desventajas de técnicas de tinción:

• requieren fijar la muestra con calor: (células mueren)

• calor + químicos pueden distorsionar la forma original de las células

Tinción Gram

• Tinte primario- Cristal Violeta (CV), tiñe la bacteria color violeta.

• Agente mordante- Yodo, forma un complejo insoluble con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a con CV. Ayuda a adherir el tinte a la célula. Ayuda a resistir la decoloración.

• Agente decolorizante- alcohol etílico al 95%, sirve como solvente de lípidos y agente deshidratante de proteínas. Remueve el cristal violeta.

• Contratinte- Safranina, tiñe de rojo la bacteria.

Resultados - Tinción Gram

Gram Negativo Gram Positivo

Gram +

Su pared celular contiene una capa gruesa de peptidoglicano

Gram -

Reacción se basa en la diferencia en la composición

química de la pared bacteriana.

Su pared celular contiene una capa fina de peptidoglicano

G M G M G M G M

Peptidoglicano : polímero de dos azúcares modificadas (N-acetil glucosaminay N-acetil ácido murámico ) y tetrapéptidos

enlace β, 1-4

Pared celular procariota

G M G M G M G MM

G = N-acetil glucosamina

M = N-acetil ácido murámico (mureína)

3 4

tetrapéptido (4 amino ácidos)

Pared celular procariota

G M G M G M G MG M G M G M G M

G M G M G M G MM G M G M G M G MM

G M G M G M G MG M G M G M G M

G M G M G M G MM G M G M G M G MM

G M G M G M G MG M G M G M G M

G M G M G M G MM G M G M G M G MM

G M G M G M G MG M G M G M G M

G M G M G M G MM G M G M G M G MM

Tinción GramFundamento

• Membrana externa de las Gram –• es soluble en solventes orgánicos como el alcohol

• la capa de peptidoglicano es demasiado delgada como para retener el complejo cristal violeta/yodo que se formó

• por lo que va perdiéndose el color azul-violeta.• por lo que va perdiéndose el color azul-violeta.

• Las Gram + no tienen su capa susceptible a la acción de solventes orgánicos• se deshidratan los poros y se cierran

• reteniéndose el complejo cristal violeta/yodo y por consiguiente el color azul-violeta.

Preparación de la muestra para proceso de TinciónPreparación de frotis:

Limpiar la laminilla con papel de lentes.

Prepara el frotis

Medio líquido- solo se coloca una porción del cultivo con el “loop” en porción del cultivo con el “loop” en la laminilla.

Medio sólido- se coloca una gotitade agua destilada en la laminilla y se diluye la porción de cultivo en ella. Se esparce bien.

Secar a temperatura ambiente

Fijación por calor

Control positivo Control negativoDesconocido

Tinción GramLaminilla

Control positivo

Gram + (Bacillus cereus)

Control negativo

Gram – (E. coli)

Desconocido

1. Cubrir frotis con tinte cristal violeta (1 minuto).2. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.3. Cubrir frotis con yodo (1 minuto).4. Enjuague con agua destilada.5. Enjuague la laminilla con alcohol etílico 95% (no exceder los 30 seg).6. Enjuague la laminilla con agua destilada.7. Cubrir frotis con tinte safranina (1 minuto).8. Enjuague con agua destilada para remover el exceso de tinte.9. Secar laminillas con papel “bibulous” para remover el exceso de agua.

Secuencia de reacciones

Tinción de Cápsulas• Cápsula- estructura gelatinosa secretada por algunas

bacterias• capas de polisacáridos o proteínas que revisten el exteriorde un bacteria• Función: adherencia y formación de biopelículas (capas de

crecimiento bacteriano) y protección contra fagocitosis (macrófagos, sistema inmunológico)crecimiento bacteriano) y protección contra fagocitosis (macrófagos, sistema inmunológico)

• La cápsula se compone de polisacáridos, glicoproteínas y polipéptidos.

• La mayoría de las cápsulas están compuestas de polisacáridos, por lo que son solubles en agua.

Tinción de Cápsulas

cápsula

Tinción de Cápsulas� Tinte primario- Cristal Violeta 1%- tiñe todo el frotis color oscuro

� Decolorante y Contratinte- Sulfato de Cobre 20%-se usa para enjuagar el tinte primario

� No se enjuaga con agua porque la cápsula es soluble en agua -� No se enjuaga con agua porque la cápsula es soluble en agua -función de decolorante

� El CuSO4 es absorbido en el material de la cápsula que ha sido decolorada - función de contratinte.

� La cápsula aparece azul clara en un fondo oscuro.

Tinción de Cápsulas

• Preparación de un frotis cargado (“heavy”).

• Dejar secar a temperatura ambiente.

• Cristal violeta 1% (5-7 minutos).

• Enjuagar con CuSO4

• Secar con “bibulous paper”

• Cryptococccus laurentii

Tinción simple-negativa

• La tinción se logra mediante una mezcla del tinte y el cultivo de bacteria.

• El tinte utilizado es “ India Ink” (Se puede utilizar también eosina o nigrosina).

Tinción de Cápsulas

eosina o nigrosina).

• Se le conoce como efecto de cielo estrellado.

Efecto de Cielo estrellado

Tinción de CápsulasTinción simple-negativa

• Célula vegetativa- forma metabólicamente activa = bacterias.

• Esporas- forma metabólicamente inactiva y altamente resistente.

• Los miembros del género anaerobio Clostridium y del géneroaerobio Bacillus pueden existir metabólicamente activos o inactivos.

Formación de esporas como método de sobrevivencia

En condiciones ambientales hostiles ocurre esporogénesis la cual forma la endospora.cual forma la endospora.

En condiciones ambientales favorables, ocurre germinación, lo cual forma la célula vegetativa (bacteria).

Formación de esporas como método de sobrevivencia

Endosporas

• La esporogénesis y la germinación no son medios de

reproducción, son mecanismos de supervivencia de

la célula.

• La composición química de la bacteria la hace

resistente a:resistente a:

• Calor extremo o excesivo

• Congelación

• Radiación

• Desecación

• Agentes químicos

Tinción de Esporas

• Tinte primario- Verde Malaquita, requiere calor para la penetración de este tinte.

• Agente decolorante- Agua, remueve el exceso de tinte, decolora la célula vegetativa.célula vegetativa.

• Contratinte- Safranina, tiñe las células vegetativas.

• Note: De obtener una coloración roja al final del proceso de tinción observando bajo el microscopio, solo se puede determinar que se tienen células vegetativas. No se puede concluir que es Gram -, eso sería otro procedimiento a realizar si se quisiera determinar si es Gram + o -.

“Beaker”

Agua

Parrilla de metal Laminilla con

frotis

Tinción de Esporas

1. Cubrir frotis con tinte verde malaquita y permita que el colorante humee, pero no hierva.

2. Espere 5 minutos. Si durante los 5 minutos el tinte se seca añada más tinte.

Hot Plate

el tinte se seca añada más tinte.

3. Enjuague la laminilla con agua destilada.

4. Coloque tinte safranina (30 seg).

5. Seque la laminilla en papel “bibulous”.

6. Observe y dibuje la coloración, morfología y arreglo de las bacterias bajo el microscopio.

Resultado

Espora (color verde)

Célula vegetativa (color rojo)

Bacillus cereus

Tinción Ácido-Resistente

• Las familias Mycobacteriae

y Nocardiaceae son ácido resistente.

• Los microorganismos ácido-• Los microorganismos ácido-resistentes se caracterizan por tener una pared celular gruesa de cera (lipoidal) que contiene ácido micólico.

Tinción Ácido-Resistente

• Tinte primario- Carbolfucsina-tinte rojo fenólico (5%). Puede penetrar la pared celular de las micobacterias.

• Agente decolorizante- alcohol ácido

(3% HCl +95% alcohol etílico).(3% HCl +95% alcohol etílico).

• Contratinte-Azul de metileno- se utiliza para teñir de azul las bacterias que quedaron incoloras.

• Los organismos que son decolorados por el alcohol ácido no son ácido resistente.

• Azules: no son ácido resistentes (no tienen ácido micólico en la pared)

Tinción Ácido-Resistente

Observar laminillas!!!Mycobacterium tuberculosis

Tinción de flagelos

• Tipo de tinción en la que se pueden visualizar el (los) flagelo(s).

• Utiliza 2 tintes:

• Ácido tánico (agente mordante: engruesa los flagelos)

• Rosalina (colorante que los define)

Mobiluncus spp.

Resumen resultados de tinciones

Tinción Gram (estructura de pared celular)

Tinción de esporas Tinción de cápsula

Recapitulación

• ¿Cuál es la diferencia entre una tinción simple y una diferencial?

• ¿Qué tipo de tinción es la Gram?

• ¿Cuál es el fundamento?

• Reactivos utilizados en la tinción Gram

• ¿Qué otro tipo de tinciones puede mencionar?

• ¿Cuales son algunas limitaciones de las tinciones?