Post on 06-Dec-2014
INGENIERIA GENETICA
La manipulación deliberada de la información genética,
con miras al análisis genético o al mejoramiento
de una especie
Historia• 1919: Karl Ereky, ingeniero húngaro, utiliza por primera vez la
palabra biotecnología. • 1953 James Watson y Francis Crick describen la estructura
doble hélice de la molécula de ADN. • 1965: El biólogo norteamericano R. W. Holley «leyó» por
primera vez la información total de un gen de la levadura compuesta por 77 bases, lo que le valió el Premio Nobel.
• 1970: el científico estadounidense Har Gobind Khorana consiguió reconstruir en el laboratorio todo un gen.
• 1973: Se desarrolla la tecnología de recombinación del ADN por Stanley Cohen, de la Universidad de Stanford, y Herbert W. Boyer, de la Universidad de California, San Francisco.
Historia
• 1976: Har Gobind Khorana sintetiza una molécula de ácido nucleico compuesta por 206 bases.
• 1976: Robert Swanson y Dr. Herbert Boyer crean Genentech, la primera compañía de biotecnología.
• 1982: Se produce insulina para humanos, la primera droga derivada de la biotecnología.
• 1983: Se aprueban los alimentos transgénicos producidos por Calgene. Es la primera vez que se autorizan alimentos transgénicos en Estados Unidos.
• 2003 Cincuenta años después del descubrimiento de la estructura del ADN, se completa la secuencia del genoma humano.
• 2004: La ONU y el Gobierno de Chile organizan el Primer Foro Global de Biotecnología, en la Ciudad de Concepción, Chile (2 al 5 de marzo)
Ingeniería Genética
• Es la tecnología de la manipulación y transferencia del ADN de unos organismos a otros, que posibilita la creación de nuevas especies, la corrección de defectos genéticos y la fabricación de numerosos compuestos.
5
Controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo:
-Metabolismo
-Forma
-Desarrollo
-Reproducción
-Constituyen el enlace esencial entre generaciones
-Pueden ser el origen de muchas enfermedades
Genes
6
French Anderson
Pionero de la terapia genética
“ya existe toda base científica necesaria, pero no tendremos
hasta dentro de 10 o 5 años la eficiencia y seguridad para
llevar a transferencias genéticas de forma ética”
7
Otro factor limitante: el banco de genes no tienen depositados
a la espere de clientes todos los complejos conjuntos de genes
que determinan la inteligencia, el buen comportamiento,
higiene mental perfecta.
Lo ideal de recurrir a la ingeniería genética es que se utilice
para prevenir o corregir enfermedades serias y no para tener
un hijo mas inteligente, o para que sea alto y de ojos celestes.
La ciencia sigue progresando a velocidad de un tren bala,
llegando a menudo a una estación determinada mucho antes
de que haya podido analizarse y comprenderse a fondo todas
las consecuencias derivadas de sus adelantos.
Ingeniería Genética
• En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer producen el primer organismo recombinando partes de su ADN en lo que se considera el comienzo de la ingeniería genética.
8
Ingeniería Genética
• La Ingeniería Genética se basa en la clonación molecular.
• Un fragmento de DNA se recombina con un vector y se introduce en un hospedador adecuado.
• Los vectores de clonación mas utilizados son los plasmidos y los bacteriófagos.
9
- 1971 Kathleen Dannna y Daniel Nathans, marcaron el inicio de la era del
DNA recombinante, con el aislamiento de una enzima de una bacteria y la
utilización de esta para cortar DNA víridico.
DNA recombinante Creación de nuevas combinaciones de segmentos
o de moléculas de DNA que no se encuentran
juntas de manera natural
Unión de segmentos de DNA que
provienen de diferentes fuentes
biológicas.
Producir cantidades
potencialmente ilimitadas de un
gen
11
NUCLEASAS
Nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiester
de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos. La vida media para el
enlace fosfodiester en el DNA a pH 7 y 24 ˚C se ha estimado en 130.000
años. En las mismas condiciones, la vida media del ARN es de solamente 4
años.
nucleasas
endonucleasas actúan en posiciones
internas de la cadena, reduciéndola a
fragmentos cada vez más pequeños.
exonucleasas degradan los ácidos nucleicos desde
un extremo de la molécula. Algunas actúan en la
dirección 5' 3'y otras en la dirección 3'—>5',
eliminando nucleótidos del extremo 5‘ o del 3‘
respectivamente
13
Las Endonucleasas o enzimas de restricción son enzimas que hidrolizan los
ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos.
-Son producidas por las bacterias, como un mecanismo de defensa contra las
infecciones víridicas, donde actúan como un mecanismo de defensa, para
degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen
la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA
extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
- Se han identificado mas de 200
-Todas se unen a DNA
- reconocen una secuencia específica de nucleotidos denominada secuencia
de reconocimiento.
- tienen un patrón de corte específico
5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’
-Palindromo: La rotura se produce en ambas hebras de DNA, debido a que la
lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, ya que la mayoría de las
secuencias de reconocimiento contienen un tipo de simetría en el que la secuencia
nucleotídica se lee igual en ambas cadenas del DNA en dirección 5´- 3´.
- Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5
de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien
extremos romos.
La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
17
18
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son
extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la
bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra
representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie,
una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de
enzimas que se han aislado de esa cepa. Ejemplo:
Eco RI E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
- No permiten ejercer ningún control estricto sobre la posición del corte respecto de la
secuencia especifica de la molécula de DNA reconocida por la enzima.
- Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
- Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la
secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases
antes o después de la secuencia que reconocen.
- Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio del corte.
- Son menos útiles.
2. Tipo II:
- Sólo tienen actividad de restricción.
- Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
- generan una serie reproducible de fragmentos cuyas secuencias son predecibles si se
conoce la secuencia de la molécula DNA diana
- Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan ATP.
- Se encuentra EcoRl
20
EcoRI fue una de las primeras enzimas de restricción aisladas .
Los fragmentos de DNA producidos por digestión por esta enzima, tienen
colas protuberantes de cadena sencilla (extremos cohesivos o pegajosos)
que pueden formar puentes de hidrogeno con colas complementarias de
cadena sencilla de fragmentos de DNA que provengan de cualquier otra
fuente.
5’- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3’3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5’
5’- ATCGTTGCCTACAATTG3’- TAGCAACGGATGTTAACTTAA
AATTCCCAATAACCCTT -3’ GGGTTATTGGGAA -5’
Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restricción
Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa de restricción EcoRI, que es
5’-GAATTC-3’
En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azarsería de
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324
O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucleótidos
23
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y
“Southern Blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas
marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores
apropiados, creación de DNA recombinante.
24
Factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden
afectar la actividad de las mismas:
1. Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza,
contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, altas concentraciones de
sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en
lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3. DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg+.
4. Contaminantes con carga (-).
5. DNA contaminado con otro DNA.
6. Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7. Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es
reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej.
si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para
la enzima).
25
Ligasas: unen moléculas de DNA, sintetizando enlaces fosfodiester entre nucleótidos ubicados en los extremos de dos moléculas diferentes o en los dos extremos de una misma molécula.
26
27
28
Una enzima que sintetiza DNA se denomina DNA polimerasa y una que copia una molécula existente de DNA o de RNA se denomina DNA polimerasa dependiente del molde
31
32
Características de las DNA polimerasas
33
Comparación de las DNA polimerasas
DNA polimerasa I
35
Esta enzima cuenta con tres actividades. Tiene
actividad polimerasa, de síntesis en dirección
5’a 3’. Una actividad 3’a 5’ exonucleasa,
remoción de nucleótidos erróneos o conocida
como proofreading o revisora. Y finalmente,
una actividad 5’a 3’ exonucleasa, que a partir
de un nick (rompimiento del enlace entre dos
nucleótidos vecinos) resintetiza una porción de
DNA removiendo la ya existente. La ADN Pol l
no lleva a cabo el proceso de replicación, es la
encargada de la eliminación de los cebadores
y el "relleno" del espacio que dejan con ADN
(actividad exonucleasa 3' → 5' y actividad
polimerasa 5' → 3').
36
37
Fragmento Klenow
El fragmento de Klenow es un fragmento proteico de gran tamaño
perteneciente a la enzima DNA polimerasa I, procedente de E. coli. Este
fragmento puede separarse del resto de la enzima gracias a la proteasa
subtilisina. La Subtilisina es una proteasa (una enzima que realiza la
digestión de las proteínas, inicialmente se obtuvo de la bacteria Bacillus
subtilis
Fragmento Klenow
39
Debido a que la actividad exonucleasa 5' → 3' de la DNA
polimerasa I de E. coli la hace ineficaz para muchas
aplicaciones, el fragmento Klenow, el cual carece de esta
actividad, puede resultar muy útil en investigación, debido a
que es extremadamente útil para tareas basadas en:
- Síntesis de DNA de doble cadena a partir de muestras de
cadena simple
- Relleno de extremos 3' de fragmentos de DNA
- Digerir extremos 3' protuberantes
- Preparación de sonda de DNA radioactivas
40
DNA polimerasa T4
41
DNA polimerasa del fragmento T7
42
Taq DNA polimerasa
43
44
Usos de la Taq polimerasa:
Transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una
enzima de tipo ADN-polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de
doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario. Enzima presente
en los retrovirus.
46
47
48
49
RNA polimerasas DNA dependientes
50
51
52
Desoxinucleotidil transferasa terminal: es una DNA pol que
realiza la síntesis de ADN utilizando sólo una sola cadena de ADN
- La mayoría de las ADN polimerasas requieren de doble cadena
de ADN como sustrato, en donde se utiliza el 5 '→ 3' como un
primer capítulo y la cadena complementaria 3 '→ 5' se utiliza como
una plantilla.
Cataliza la adición de nucleótidos al extremo 3 'de una molécula de
ADN. A diferencia de la mayoría de las polimerasas de ADN no
requiere una plantilla El sustrato preferido de esta enzima es un
saliente 3 ', pero también puede añadir nucleótidos a extremos
romos. El cobalto es un cofactor necesario, sin embargo, la enzima
cataliza la reacción en Mg y Mn in vitro.
53
La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para crear extremos de
cadena sencilla mediante la adición de «colas» de nucleótidos. Si a uno de los
DNA se le añade una cola de poli-dA, y al otro DNA se le añade una cola de poli-
dT, se forman colas complementarias, y los fragmentos pueden unirse mediante
puentes de hidrógeno. Entonces, por ligación, pueden formarse moléculas
recombinantes.
Las moléculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos.En este método se utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adición de fragmentos de poli-dA y de poli-dT.Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y para crear moléculas de DNA recombinante, que son unidas covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
54
Tras el tratamiento con una endonucleasa, ¿Como se pueden examinar los fragmentos de DNA resultantes?
55
Electroforesis en gel de agarosaSeparación del DNA en diferentes longitudes