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INFORME ANEXO DEL PROYECTO SIP 20060438
RESUMEN
El hongo Rhizopus stolonifer, agente causal de la pudrición blanda, penetra a los frutos
a través de heridas, multiplicándose con una rápida velocidad de crecimiento y
desarrollándose en una amplia gama de temperaturas y humedades. Con el desarrollo
del proyecto hemos demostrado una mayor actividad enzimática de poligalacturonasa y
pectin metil esterasas en frutos de jitomate infectados con Rhizopus stolonifer
comparados con frutos control. También hemos encontrado que la adición de diferentes
concentraciones de quitosano inhiben el crecimiento de R. stolonifer. Los mecanismos
de acción por los cuales el quitosano presenta este efecto antifúngico no han sido del
todo establecidos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del quitosano sobre la
membrana celular de R. stolonifer. Se inocularon cultivos de papa-dextrosa a una
concentración de 1 X 105 esporas/mL de R. stolonifer, después se adicionó quitosano a
una concentración de 0.5, 1 y 2 mg/mL. Los matraces se incubaron a temperatura
ambiente a 200 rpm y se extrajeron después de 24, 48 y 72 horas, a partir de estas
condiciones se realizaron las siguientes determinaciones: Cinéticas de crecimiento,
morfológica microscópica, evaluación de pH, determinación de K y actividad
enzimática de la H+ATPasa. En los medios de cultivo donde se creció R. stolonifer en
presencia de quitosano en general se observó una afectación en el peso húmedo del
micelio, deformaciones del micelio, incremento del pH del medio, salida de potasio y
decremento en la actividad específica de la H+ATPasa. Estos resultados indican que el
quitosano afecta el funcionamiento de la membrana celular de R. stolonifer.
INTRODUCCIÓN
Los productos vegetales son importantes en la dieta humana; sin embargo, son
susceptibles a plagas y enfermedades. Los hongos fitopatógenos generan pérdidas
económicas y frecuentemente se controlan con compuestos antifúngicos sintéticos, los
cuales pueden presentar un efecto negativo en la biosfera y provocar el desarrollo de
cepas fúngicas resistentes. Actualmente se buscan alternativas ecológicas para el control
de plagas y enfermedades.
El hongo Rhizopus stolonifer, agente causal de la pudrición blanda, penetra a los frutos
a través de heridas, multiplicándose con una rápida velocidad de crecimiento y
desarrollándose en una amplia gama de temperaturas y humedades. Estas características
le facilitan colonizar rápidamente a su hospedero, tan solo 4 días han sido suficientes
para pudrir totalmente los frutos. Durante el proceso de pudrición blanda las hifas
producidas por el hongo secretan enzimas pectinolíticas que degradan las sustancias
pécticas presentes en la lámina media y en la pared celular primaria vegetal provocando
la pérdida de cohesión en los tejidos celulares y facilitando la excreción de los líquidos
presentes en el interior de la célula (maceración celular). Hemos demostrado una mayor
actividad enzimática de poligalacturonasa (Villanueva-Castillo, 2004) y pectin metil
esterasas (Vicente-López, 2004) en frutos de jitomate infectados con R. stolonifer
comparados con frutos control.
Por otro lado, existen reportes que señalan reducciones significativas de algunas
pudriciones postcosecha cuando los frutos fueron tratados con quitosano, por lo que se
considera a este polisacárido como una alternativa natural para controlar a estas
enfermedades y mantener la vida de anaquel de productos hortofrutícolas (Bautista-
Baños y col. 2006). También hemos encontrado in vitro que la adición de diferentes
concentraciones de quitosano inhiben el crecimiento micelial, la esporulación y la
morfología de las esporas de R. stolonifer. La respuesta in situ evidenció el potencial
antifúngico del quitosano en el control de las pudriciones postcosecha causadas por este
hongo fitopatógeno (Hernández-Lauzardo y col. 2006).
El quitosano esta constituido por unidades de glucosamina, es biodegradable y no tóxico
y se obtiene por desacetilación de la quitina (cutícula de crustáceos, exoesqueleto de
artrópodos, paredes celulares de hongos. Se considera que la naturaleza policatiónica
del quitosano es fundamental para que este compuesto presente actividad antifúngica.
Los mecanismos de acción por los cuales el quitosano presenta este efecto antifúngico
no han sido del todo establecidos, aunque existen algunas propuestas al respecto. Una
de éstas plantea que las cargas positivas del quitosano pueden interaccionar con las
cargas negativas de los esfingolípidos de la membrana celular del hongo (Zakrzewska y
col. 2005). Los mismos autores comentan que los esfingolípidos de la membrana celular
de los mamíferos no poseen carga negativa lo que podría explicar el porque son poco
sensibles al polisacárido. La interacción específica del quitosano con la membrana
celular puede generar una modificación de la permeabilidad de la misma permitiendo el
flujo de diferentes compuestos y iones entre ellos el potasio (K+) y también podría
afectar la actividad de enzimas membranales principalmente la H+ATPasa, enzima
fundamental de la membrana celular que puede constituir hasta el 10% de la proteína de
la membrana plasmática de hongos y consumir hasta el 25% de ATP para el transporte
activo de compuestos indispensables para el metabolismo celular, lo que podría afectar
significativamente el desarrollo del microorganismo. Los trabajos antes citados han sido
realizados fundamentalmente con levaduras. No existen antecedentes en hongos
filamentosos.
Por lo anterior y considerando la importancia que tiene el quitosano como alternativa
natural en el control de hongos postcosecha se propuso el presente proyecto de
investigación con el objetivo de evaluar el efecto del quitosano sobre la membrana
celular del hongo filamentoso Rhizopus stolonifer. Este trabajo puede contribuir a
generar conocimiento básico que permita la mejor comprensión del modo de acción del
quitosano lo cual repercuta de manera positiva en optimizar el uso de este compuesto
para controlar enfermedades poscosecha. Nuestra hipótesis considera que la aplicación
de quitosano a Rhizopus stolonifer afectará su crecimiento, morfología y el
funcionamiento de los procesos de transporte de la membrana celular del hongo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico.
Se utilizó la cepa R3 de Rhizopus stolonifer del cepario de hongos fitopatógenos del
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del IPN, el cual es resembrado y purificado
constantemente. Esta cepa fue aislada de tomates (Lycopersicon esculentum Mill.)
infectados naturalmente y cosechados en el municipio de Yautepec, Morelos.
Estrategia experimental.
Se cultivó R. stolonifer en cajas petri de PDA (papa-dextrosa-agar), posteriormente se
llevó a una cámara de incubación a una temperatura de 27°C durante 72 hrs., a
continuación se tomaron las cajas y se lavaron con agua estéril para obtener las esporas
separadas del micelio. Se tomaron dos gotas de la solución de esporas y mediante el uso
de una cámara de Neubauer se procedió al conteo de esporas, el numero total de esporas
se multiplico por el factor de conversión de 50,000 para obtener como resultado la
concentración de esporas/mL de la solución original, esta suspensión se llevo a una
concentración final de 1 X 105 esporas/mL.
Por otro lado se prepararon cultivos líquidos de PD (papa-dextrosa) y a continuación se
agregó quitosano a una concentración de 0.05, 0.1 y 0.2% (0.5, 1 y 2 mg/mL). Se
inoculó 0.5 mL de la concentración final de esporas a cada matraz.
Una vez inoculados los matraces se incubaron a temperatura ambiente con agitación
constante de 200 revoluciones por minuto. Después de 24, 48 y 72 horas., se extrajeron
los matraces y a partir de estas condiciones se realizaron las siguientes determinaciones:
Cinéticas de crecimiento.
Se cuantificó el crecimiento del hongo evaluando gravimétricamente el peso húmedo
del micelio crecido a las 24, 48 y 72 horas.
Determinación de la morfológica microscópica.
La caracterización morfológica del micelio y las esporas de la cepa R3 de R. stolonifer
se realizó de acuerdo a lo señalado por Hernández-Lauzardo en 2006 y adicionalmente
se realizaron tinciones con el fluorocromo piranina según la técnica descrita por
Enríquez-Freire y col. (1999) y Thevissen y col. (1999).
Evaluación de pH.
Se determinó el valor de pH para cada condición directamente en el medio de cultivo
mediante un electrodo convencional.
Determinación de K+.
Se realizó utilizando un electrodo específico que determina la concentración de iones
potasio y se evaluaron las concentraciones de K+ en el medio de acuerdo a lo descrito
por Enríquez-Freire y col. (1999).
Establecimiento de la actividad H+ATPasa en la membrana celular de R. stolonifer.
Obtención de la membrana celular.- Los micelios obtenidos de las condiciones de
cultivo en presencia y ausencia de quitosano fueron centrifugados a 4000 rpm durante
10 min., a 4 ºC. Después se lavaron dos veces con agua destilada. Una vez obtenida la
biomasa se resuspendió en un amortiguador de rompimiento (Hepes 50 mM a un pH
6.8). La ruptura se realizó utilizando perlas de vidrio en una relación de 75g de perlas
por 50 mL de amortiguador, se agitó con un vortex durante 10 ciclos de un minuto por
uno de descanso. El producto homogenizado se filtró a través de una gasa y se procesó
por centrifugación diferencial, la fracción microsomal se obtuvo después de centrifugar
a 100000 G, se extrajeron las membranas totales y se resuspendieron en 1 mL de
amortiguador de Hepes 50mM a pH 7.5 conteniendo 300 mM de sacarosa y se
almacenó a -70ºC.
Purificación de las membranas.- Se utilizó un gradiente de 2 fases compuesto por
dextran T 500 7% y polietilénglicol al 7% en el regulador de rompimiento a pH 6.8. La
fracción microsomal se ajustó a una concentración de 10 mg/mL en un volumen final de
3 mL Los gradientes se centrifugaron a 4000 G durante 10 min. a 4ºC. y se recuperó la
fase superior del gradiente que contenía la fracción de las membranas celulares.
Actividad de la H+ATPasa.- Se realizó de acuerdo a lo descrito por Valdez-Solana y col.
2005. La fracción enzimática se sometió a una solución de sulfato de amonio que
contenía ATP y piruvato cinasa. El ensayo se realizó a 30°C durante 30 min. y se
terminó con la adición de 10 µL de ácido tricloroacético al 30%. Para la cuantificación
de proteína se utilizó el método de Lowry modificado. La actividad enzimática se
realizó midiendo el fosfato inorgánico (Pi) producido por la reacción de la H+ATPasa
(ATP ADP + Pi) en el que el Pi del medio reacciona con molibdato de amonio
formando el complejo fosfomolibdato de amonio, el cual se reduce por el compuesto
ELON (1- amino- 2 naftol- 4 sulfónico) produciendo un complejo azul de molibdeno
que absorbe a 660 nm y los valores se analizaron utilizando el programa Sigma Plot
RESULTADOS
Cinéticas de crecimiento
En la figura 1 se presentan los resultados de la cinética de crecimiento de R. stolonifer
en ausencia y presencia de quitosano de bajo peso molecular. Se observa dentro de las
primeras 48 horas que la presencia de quitosano afecta el crecimiento micelial del
hongo, este efecto tiende a disminuir e incluso a desaparecer a las 72 horas. Estos
resultados son acordes al efecto antifúngico del quitosano reportado por Bautista-Baños
y col. en 2006.
PESO HUMEDO
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
20 30 40 50 60 70 80
TIEMPO (hrs)
MA
SA (m
g) S/Q0.5 mg/mL1 mg/mL2 mg/mL
Figura 1. Cuantificación del peso húmedo del micelio de Rhizopus stolonifer crecido en
el medio de papa-dextrosa en ausencia y en presencia de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano
durante 72 horas.
Determinación de la morfológica microscópica.
En general las observaciones microscópicas de R. stolonifer crecido con diferentes
concentraciones de quitosano (0.5, 1 y 2 mg/mL), revelaron que afecta la morfología de
la hifa, observándose mayores deformaciones (ramificaciones y engrosamientos) en los
hongos tratados con quitosano como se observa en la figura 2. Este efecto del quitosano
ha sido reportado en otros hongos fitopatógenos (El Ghaouth y col. 1992).
Figura 2. Micelio de Rhizopus stolonifer tratado con 0.5 mg/mL de quitosano, teñido
con piranina y observado en un microscopio de fluorescencia (40 X).
Evaluación de pH
En la figura 3 se observa claramente el efecto de las diferentes dosis de quitosano sobre
el pH del medio de cultivo donde crece R. stolonifer. El control sin inocular y sin
quitosano no presenta cambios de su pH (5.5). R. stolonifer sin quitosano acidifica el
medio de 5.5 a 4.5 en 72 horas. En todos los tratamientos adicionados de quitosano se
observa un incremento en el pH de 5.5 hasta 7.0. El quitosano induce en R. stolonifer el
incremento en el pH del medio de cultivo. Estos resultados resultan novedosos y hasta
ahora no encontramos ningún reporte previo en la literatura.
Nivel del pH del medio
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (h)
pH
S/Q
0.5mg/mL
1mg/mL
2mg/mL
Control
Figura 3. Evaluación del pH del medio de cultivo donde crece Rhizopus stolonifer
tratado con concentraciones de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano.
Determinación de K+
En la figura 4 se observa la respuesta de R. stolonifer tratado con quitosano. El control
sin tratar se mantiene durante 6 minutos en el nivel basal de -165 mV, mientras que en
los tres tratamientos con quitosano se observa un cambio de potencial hasta alcanzar en
el tratamiento con 1 mg/mL -145 mV en 6 minutos. Estos datos nos indican una rápida
salida de K+ del micelio de R. stolonifer tratado con quitosano. En este modelo de
estudio, estos resultados no tienen precedentes.
igura 4. Determinación de salida de K+ de Rhizopus stolonifer tratado con
Salida de potasio
-175
-170
-165
-160
-155
-150
-145
-140
0 1 2 3 4 5 6 7Tiempo (min)
Pot
enci
al (m
V)
Control
0.5mg/mL
1mg/mL
2mg/mL
F
concentraciones de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano.
Establecimiento de la actividad H+ATPasa en la membrana celular de R. stolonifer
Cuadro 1. Actividad enzimática total y específica de H+ATPasa de la membrana celular
de Rhizopus stolonifer crecido en medio de papa-dextrosa en ausencia y presencia de
quitosano.
Medio de cultivo Actividad enzimática total
de H+ATPasa (nmol/min.)
Actividad específica de
H+ATPasa (nmol/mg/min.)
Sin quitosano 7.3 122
Con quitosano (1 mg/mL) 7.7 82
En el cuadro 1 se observa que la actividad enzimática total de H+ATPasa de la
membrana de R. stolonifer no es afectada por el quitosano; sin embargo, resulta
evidente la afectación que causa el quitosano en la actividad específica de la H+ATPasa
al causar una disminución de 122 a 82 nmoles/mg/min. Este efecto negativo del
quitosano sobre la H+ATPasa de algún hongo fitopatógeno no ha sido reportado.
En general podemos concluir que el quitosano afecta el crecimiento de R. stolonifer
genera deformaciones en el micelio, induce un incremento en el pH del medio de
cultivo, provoca la salida de K+ y afecta negativamente la actividad específica de la
H+ATPasa. Estos resultados indican que el quitosano afecta el funcionamiento de la
membrana celular de R. stolonifer.
IMPACTO
Los resultados obtenidos en este proyecto de investigación indican que el quitosano
afecta el crecimiento, morfología y el funcionamiento de los procesos de transporte de
la membrana celular de R. stolonifer. Los resultados que muestran afectación en los
procesos de transporte del hongo no tienen precedentes por lo que estamos
contribuyendo en el esclarecimiento de los mecanismos de acción de este polímero que
tiene un gran potencial como alternativa natural en el control de hongos postcosecha en
productos hortofrutícolas. Por lo anterior, consideramos que nuestro proyecto tiene
impacto en los sectores académico y productivo de bienes y servicios. Finalmente, con
este proyecto estamos participando en la formación de recursos humanos altamente
calificados.
LITERATURA CITADA
Bautista-Baños S., Hernández-Lauzardo A. N., Velázquez-del Valle M. G., Hernández-
López M., Ait-Barka E., Bosquez-Molina E., Wilson C. L. 2006. Chitosan as a
potencial natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural
commodities. Crop Protection 25: 108- 118.
El Ghaouth A., Arul J., Grenier J. y Asselin A. 1992. Antifungal activity of chitosan on
two postharvest pathogens of strawberry fruits. Phytopathology 82: 398-402.
Enríquez-Freire E., López R. y Peña A. 1999. Potassium ion efflux induced by cationic
compound in yeast. Biochimica et Biophysica Acta 1418: 147-157.
Hernandez-Lauzardo A. N., Hernández-Martínez M., Velázquez-del Valle, M. G.,
Guerra-Sánchez M. G. y Melo-Giorgana G. E. 2006. Actividad actifúngica del
quitosano en el control de los hongos fitopatógenos Rhizopus stolonifer Ehrenb. (Ex Fr.)
Vuill. y Mucor spp. Revista Mexicana de Fitopatología (enviado).
Hernandez-Lauzardo A. N., Bautista-Baños S., Velázquez-del Valle, M. G. y Trejo-
Espino J. L. 2006. Identification of Rhizopus stolonifer Ehrenb. (Ex Fr.) Vuill., causal
agent of Rhizopus rot disease of fruits and vegetables. Revista Mexicana de
Fitopatología 24 (1): 65-69.
Thevissen K., Terras F. y Broekaert W. 1999. Permeabilization of fungal growth. Applied and Environmental Microbiology 65: 5451-5458.
Valdez-Solana M., Guerra G., Pardo J., Villa-Tanaca L. y Amora-Lazcano E. 2005.
Caracterización bioquímica de la H+ATPasa de membrana plasmática de Ustilago
maydis en la forma micelial en condiciones de estrés nutricional. Memorias del XIV
congreso de bioenergética y biomembranas. Sociedad mexicana de bioquímica. México,
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Vicente-López, M. L. 2004. Estudio de las pectin metil esterasas fúngicas causantes de
la pudrición blanda en el fruto de jitomate (Lycopersicon esculentum, Mill.). Tesis de
Licenciatura. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Veracruzana. Orizaba,
Veracruz.
Villanueva-Castillo, B. 2004. Determinación de la actividad enzimática de PG en el
proceso de maceración causado por Rhizoupus stolonifer en jitomate (Lycopersicon
esculentum, Mill). Tesis de Licenciatura. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad
Veracruzana. Orizaba, Veracruz.
Zakrzewska A., Boorsma A., Brul S., Klaas J., H. y Klis F. M. 2005. Transcriptional
response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound
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