Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias

BiológicasLaboratorio de Microbiología General

Influencia del pH y la temperatura sobre el crecimiento microbiano.

Equipo: 2

pH en el medio • El grado de acidez y alcalinidad en los medios de cultivo se expresa en

términos de concentración de Hidrogeniones. En medios acuosos las bases y los ácidos se disocian en iones H+ y OH-

• El pH en un medio afecta directamente a un microorganismo y a enzimas e influye en la solubilidad de muchas moléculas que de alguna manera indirecta ejercen alguna influencia sobre el microorganismo.

• Solubilidad CO2• Velocidad de fotosíntesis• Disponibilidad de nutrientes (NH4, PO4)• Movilidad de metales pesados• Velocidad de replicación

• Todos los microrganismo tienen un pH mínimo, máximo y optimo de crecimiento.

• La mayoria de los ambientes naturales tien un valor de pH entre 5 y 9 y los microorganismos con pH obtimo de esten orden son los mas comunes.

Acidofilos • Los organismos que crecen mejor a bajo pH constituyen un tipo de

extremofilos llamados acidófilos. El grupo de los hongos son mas acidófilos que las bacterias, muchos hongos crecen en forma optima a pH 5 o inferior e incluso algunos crecen bien a pH 2.

• algunas bacterias son acidófilas estrictas incapaces de crecer a pH neutro. Algunas producen su ambiente ácido por ejemplo Sulfolobus que produce ácido sulfúrico.

Alcalófilicos • Unos cuantos extremofilos presentan un pH optimo de crecimiento muy

elevado a veces tan alto como pH 10 se denominan alcalófilos. Los microorganismos alcalófilos se encuentran por lo general en hábitat muy básicos como lagos sódicos y suelos muy carbonatados.

• Algunos alcalóficos tienen aplicación industrial porque producen enzimas hidroliticas como proteasas y lipasas que funcionan bien a pH alcalino y se usan como aditivos de los detergentes domésticos.

pH intracelular • Una característica de los microorganismos que viven en pH extremo es

que su pH intercelular es próximo a la neutralidad para poder llevar a cabo la síntesis quimiosmótica de ATP.

Regulación del pH intracelular

Largo plazo

Mecanismo de acción inmediata ante las

alteraciones agudas del pH

Mecanismos de acción más lenta que

corrigen las alteraciones crónicas

Corto plazoBombas de H+

Acción inmediata ante las alteraciones agudas del pH

• Mediado por la propia capacidad tamponadora de la célula, gracias a proteínas, esto se logra debido a la alta cantidad de proteínas que posee y es muy eficaz ya que su pK es muy cercano al pH intracelular

• Tampón Carbónico/Bicarbonato:  H+ + HCO–3 Æ H 2CO3  Æ CO2 + H2O

• Tampón Fosfato :  H+ + HPO2-4 Æ H2 PO4–

• Tampón Proteinato:  H+ + Protein2– Æ HProtein (n–1)–

Intercambiador Na+/H+• extrae H+ del citoplasma a cambio de Na+ extracelular, actuando como

un basificador celular; y una familia de proteínas que son capaces de transportar bicarbonato a ambos lados de la membrana celular, los intercambiadores C I - / C 0 3 H

• De esta familia de intercambiadores se han descrito, hasta la fecha, tres formas:

1º• Un intercambiador Cl-/CO3H- independiente de Na+, que actúa

extrayendo CO3H- intracelular en intercambio por Cl- extracelular, por lo que acidifica el citoplasma y promueve la recuperación del pHi tras una sobrecarga alcalina intracelular

2º• Un intercambiador Cl-/CO3H- dependiente de Na+, que saca Cl- y

H+ de la célula en intercambio por CO3H- y Na+ extracelulares, cuyo efecto es la alcalinización celular.

3º• El balance en las concentraciones de ácidos y bases dentro de la

célula tiende a desequilibrarse porque existe una tendencia a la acumulación de ácidos en el citoplasma, que acaece como consecuencia de los siguientes procesos:

• 1) la entrada pasiva de protones; • 2) la entrada de ácidos débiles;• 3) la salida de bases débiles; • 4) la salida del ión CO3H-, y 5) los productos generados en las

reacciones del metabolismo celular.

Transporte activo • Movimiento de moléculas en contra del gradiente

de concentración.

• Activo primario: por bombas de ATP• Activo secundario: cotransporte

Primario • Está representado por una hidrogenion-potasioadenosina-trifosfatasa

(H+, K+ ATP-asa), una enzima magnesio-dependiente que está conformada por dos sub-unidades polipéptidas, una mayor o alfa que reacciona con el ATP citosólico para obtener energía, y una menor o beta cuya función no ha sido establecida.

• Este primer componente intercambia el H+ citoplasmático derivado del agua por un K+ del fluido canalicular utilizando la energía extraída del ATP.

Co transporte Simporte

• Dos moléculas son transportados por una misma proteína en la misma dirección una a favor del gradiente y la otra en contra (Na+/glucosa o Na+/aminoácidos)

Antiporte • Dos moléculas son transportadas

por la misma proteína pero en direcciones diferentes. Una a favor del gradiente y la otra en contra (Na+/Ca2+ o Na+/H+)

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN

SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

EFECTO DE LA TEMPERATURA

Es un factor ambiental físico que afecta todas las reacciones bioquímicas y por lo tanto el crecimiento de los microorganismos.

A temperaturas bajas es que el agua se congela, y deja de ser el medio para reacciones metabólicas, además los cristales rompen la membrana.

Las temperaturas altas afectan a los tres tipos fundamentales de moléculas biológicas: lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, produciendo cambios estructurales que desembocan en su desnaturalización.

Afecta la solubilidad de los gases en el agua, de manera que a altas temperaturas puede haber requerimiento de O2 y/o de CO2.

Cerca de los 100 °C la membrana se hace fluida y puede ser letal.

Antes de los 75 °C, la clorofila se degrada perdiéndose la capacidad fotosintética.

TEMPERATURAS

CARDINALES

Limite de temperatura de crecimiento:Los límites de temperatura dentro de los cuales pueden encontrarse organismos vivos son amplios y van desde -18 oC hasta 113 oC.

ÓPTIMA

MÍNIMA

MÁXIMA

: µ máxima

TEMPERATURAS CARDINALES

Mínima, óptima y máxima de crecimiento de los microorganismos.

Habitats de los microorganismos estenotérmicos: temperaturas constantes a lo largo del año

Habitats de los microorganismos euritérmicos: temperaturas extremas a lo largo del año

Desierto de Utha

Desierto de Israel

Desierto de Sonora

LÍMITES DE TEMPERATURA DE CRECIMIENTOEstenotérmicos: crecimiento de temperatura muy estrecha. Ejemplo: Neisseria gonorrhoeae (30 y 38)

Euritérmicos: crecimiento en temperatura muy amplia. Ejemplo: Enterococcus faecalis (0 a 44ºC)

Clasificación de los microorganismos con base a la temperatura óptima de crecimiento

• Termofílicos/extremos Mesofílicos Psicrofílicos/Facultativos

PSICROFÍLICOS• Tienen una temperatura óptima de crecimiento menor 15C.

• Sus enzimas trabajan eficientemente a estas temperaturas bajas.

• Regiones congeladas la mayor parte del año: Ártico y del Antártico.

Adaptaciones para crecer óptimamente a

temperaturas bajas

Mantener una fluidez de la membrana para funcionar adecuadamente. -Alto contenido de ácidos grasos insaturados en la membrana. -Procesos de transporte activos y eficientes en la membrana. -Enzimas eficientes con actividad óptima a bajas temperaturas.

• Membranas con altas proporción de ácidos grasos insaturados que la hacen más fluida en un ambiente frío o congelado

PSICROFÍLICOS FACULTATIVOS -Pueden crecer a temperaturas menores de 15 C.

-Su temperatura óptima: 25 a 30 C.

-Ejemplos: -Micrococcus - Corynebacterium - Streptococcus - Flavobacterium - Arthrobacter

MESOFÍLICOS• Crecen a una temperatura óptima de: 20 - 42 C.

• Están ampliamente distribuidos en la naturaleza.

• Ejemplos: La mayoría de las bacterias, hongos, protozoarios y algas.

• Pueden ser patógenas o saprofitas

TERMOFÍLICOS

o Temperatura óptima de crecimiento: 45 a 70 oC.o Aislamiento: suelos (50 oC), pastura, compostas,

basureros, silos (60-65oC), fenómenos volcánicos, aguas termales.

Bacillus stearothermophillus

Bacillus infernus

Termus aquaticus Chloroflexus aurantiacus

Adaptaciones para crecer óptimamente a altas temperaturaso Alto contenido ácidos grasos saturados en su

membrana citoplasmática.o Estabilidad de las proteínas con enzimas

eficientes.o Solutos termoprotectores.o Alto contenido G - C.o DNA estabilizado.o Sintetizan proteínas de choque térmico (hsp).

• Su membrana es una bicapa de fosfolípidos con una mayor cantidad ácidos grasos saturados unidos por un enlace éster.

• Los ácidos grasos saturados la hacen más rígida en un ambiente caliente que la solubilizaría.

Proteínas termoestables

Tienen mayor cantidad de residuos hidrofóbicos, Más aminoácidos con carga y menos aminoácidos sin carga ó

polares, que en las proteínas mesófilas.

Proteínas de choque térmico (hsp).

• No todas las proteínas de choque térmico son chaperoninas ni todas las chaperoninas son proteínas de estrés térmico.

• Tienen un papel protector y evitan que las proteínas alcancen un estado de agregación irreversible.

TERMOFÍLICOS EXTREMOS E HIPERTERMOFÍLICOS

Termofílicos extremos:Temperatura óptima de crecimiento de 70 a 80 oC.

Hipertemofílicos:Temperatura óptima de crecimiento > 90 oC.

Se pueden aislar de: manantiales calientes o géiseres (93 – 100 o C), de chorros de vapor, suelos volcánicos ó fumarolas y volcanes marinos (350 C).Ejemplos: bacterias y arqueas

Adaptaciones para crecer a temperaturas extremas

o Arqueas: o La membrana citoplasmática: Presencia lípidos isopreno unidos con enlace éter. Su membrana es una bicapa con enlace diéter. Son más rígidas, estables y resistentes al calor.

Bicapa de glicerol diéter

glicerol difitanil-glicerol-diéter

Adaptaciones del DNA celular para estabilidad en temperaturas extremas

• Presentan una DNA girasa reversa:

• La enzima funciona para volver a enrollar el DNA y no existe en ningún otro tipo de organismo

Objetivos• Observar el efecto que ejerce el pH de un medio de

cultivo sobre el crecimiento microbiano.• Observar el efecto de la temperatura de incubación

sobre el crecimiento microbiano y determinar las temperaturas cardinales de los microorganismos.

Resultados obtenidos pH

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 11

0

1

2

3

4

Escherichia coli Lab 3

Equipo 1Equipo 2Equipo 3Equipo 4

Cre

cim

ient

o ap

roxi

mad

o (+

/-)

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Escherichia coli Lab 4

Equipo 1Equipo 2Equipo 3Equipo 4

Crec

imie

nto

apro

xim

ado

(+/-)

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Saccharomyces cerevisiae Lab 3

Equipo 1Equipo 2Equipo 3Equipo 4

Crec

imie

nto

apro

xim

ado

(+/-)

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Saccharomyces cerevisiae Lab 4

Equipo 1Equipo 2Equipo 3Equipo 4

Crec

imie

to a

prox

imad

o (+

/-)

pH: 3 pH: 5 pH:7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Pseudomonas aeruginosa Lab 3

Equipo 5Equipo 6Equipo 7Equipo 8

Cre

cim

ient

o ap

ro-

xim

ado

(+/-

)

pH: 3 pH: 5 pH:7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Pseudomonas aeruginosa Lab 4

Equipo 5Equipo 6Equipo 7Equipo 8

Crec

imie

nto

apro

xim

ado

(+/-)

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 11

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Bacillus CFW Lab 3

Equipo 5Equipo 6Equipo 7Equipo 8

Cre

cim

ient

o ap

roxi

mad

o (+

/-)

pH: 3 pH: 5 pH: 7 pH: 9 pH: 110

1

2

3

4

Bacillus CFW Lab 4

Equipo 5Equipo 6Equipo 7Equipo 8

Crec

imie

nto

apro

xim

ado

(+/-)

Equipo 4 Lab 3

Equipo 8 Lab 3

Resultados temperatura

4 28 37 45 550

1

2

3

4

5

Saccharomyces cerevisiae

Equipo 1 Lab 3Equipo 5 Lab 3Equipo 1 Lab 4Equipo 3 Lab 4

Temperatura (ºC)

Cre

cim

ient

o (+

/-)

4 28 37 45 550

1

2

3

4

Klebsiella pneumoniae

Equipo 2 Lab 3Equipo 6 Lab 3Equipo 8 Lab 4Equipo 2 Lab 4

Temperatura (ºC)

Crec

imie

nto

(+/-)

4 28 37 45 550

1

2

3

4

Micrococcus luteus

Equipo 3 Lab 3Equipo 7 Lab 3Equipo 6 Lab 4Equipo 7 Lab 4

Temperatura (ºC)

Cre

cim

ient

o (+

/-)

4 28 37 45 550

1

2

3

4

Bacillus CFW

Equipo 4 Lab 3Equipo 8 Lab 3Equipo 4 Lab 4Equipo 5 Lab 4

Temperatura (ºC)

Cre

cim

ient

o (+

/-)

Equipo 4 Lab 3

Equipo 4 Lab 3

Bibliografia• Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A. Microbiología. 4ª

edición. McGraw-Hill Interamericana, 1999. Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J. Brock Biología de los Microorganismos.

• http://www.revistanefrologia.com/es-publicacion-nefrologia-articulo-biologia-molecular-los-mecanismos-transporte-reguladores-del-ph-intracelular-X0211699594006828.