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Genotipado en la salud humanaInforme de VigilanciaTecnológica
Genotipadoen la salud humana
• Diagnóstico predictivo• Farmacogenómica• Desarrollo de nuevos fármacos
Informe de VigilanciaTecnológica
4
GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboración
conjunta entre Genoma España y la Fundación General
de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional
de la Innovación MADRID+D.
Genoma España y la Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid (FGUAM), agradecen la colaboración
ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial
para la realización de este informe, en especial a:
– Dr. Ángel Carracedo Álvarez
(Universidad de Santiago de Compostela)
– Dr. Jaume Bertranpetit Busquets
(Universitat Pompeu Fabra)
– Dr. Javier Benítez Ortiz (CNIO)
– Dr. Juan Carlos Tercero López (PharmaMar)
– Dr. Xavier Estivill Palleja
(Centre de Regulació Genòmica)
La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo
la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Genotipado en la salud humana. Informe de Vigilancia
Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM.
Genoma España no se hace responsable del uso que se
realice de la información contenida en esta publicación. Las
opiniones que aparecen en este informe corresponden a los
expertos consultados y a los autores del mismo.
© Copyright:Fundación Española para el Desarrollo
de la Investigación en Genómica y
Proteómica/Fundación General de la Universidad
Autónoma de Madrid.
Autores: Marta López (CIBT)
Paloma Mallorquín (CIBT)
Miguel Vega (Genoma España)
Edición: Silvia Enríquez (Genoma España)
Referencia: GEN-ES05003
Fecha: Abril 2005
Depósito Legal: M-18733-2005
ISBN: 84-609-4800-5
Diseño y realización: Spainfo, S.A.
Índice de contenido
• RESUMEN EJECUTIVO 7
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS DEL INFORME 8
2. INTRODUCCIÓN AL GENOTIPADO 9
3. VARIACIÓN GÉNICA: SNPS 10
4. APLICACIONES DEL GENOTIPADO DE SNPs DE ALTO RENDIMIENTO 14
4.1. Diagnóstico predictivo 174.2. Farmacogenética y farmacogenómica 18
4.2.1. Ensayos de predicción de efectos secundarios o toxicidad 224.2.2. Ensayos de eficacia mediante farmacogenómica 254.2.3. Identificación de nuevos pacientes 27
4.3. Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos 29
5. ESTRATEGIAS DE IDENTIFICACIÓN DE SNPs 34
6. TÉCNICAS DE GENOTIPADO DE SNPs 37
6.1. Amplificación de SNPs 376.2. Discriminación alélica 38
6.2.1. Hibridación específica de alelo 396.2.2. Minisecuenciación o extensión de sondas (SBE) 396.2.3. Ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo (OLA) 396.2.4. Rotura invasiva específica de alelo (Invader®) 396.2.5. Otros métodos de discriminación alélica 39
6.3. Formatos de reacción 416.3.1. Reacciones homogéneas 416.3.2. Reacciones en un soporte sólido 43
6.4. Mecanismos de detección 456.5. Otras tecnologías de genotipado 46
6.5.1. Pirosecuenciación 466.5.2. Miniaturización 46
7. PLATAFORMAS COMERCIALES DE GENOTIPADO DE SNPs DE ALTO RENDIMIENTO 48
5
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
8. BARRERAS EN LA IMPLANTACIÓN DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADODE ALTO RENDIMIENTO 51
8.1. Coste final de implantación de la tecnología 528.2. Limitaciones tecnológicas en el genotipado de alto rendimiento de SNPs 538.3. Aspectos de mercado relativos al genotipado de SNPs 548.4. Aspectos reguladores 54
9. OPORTUNIDADES DE MERCADO DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADODE ALTO RENDIMIENTO (INCENTIVOS) 56
9.1. Déficit de innovaciones de producto 569.2. Disminución del tiempo necesario para desarrollar un nuevo fármaco 569.3. Combinación de fármacos/tests de diagnóstico 56
10. TENDENCIAS FUTURAS DE LAS TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADO 58
11. CENTRO NACIONAL DE GENOTIPADO (CEGEN) 62
12. CONCLUSIONES 65
ANEXOS
Anexo I. Proyectos españoles en genotipado de SNPs y farmacogenómica 68Anexo II. Marco regulador en farmacogenómica 80Anexo III. Fichas de empresas relacionadas con el genotipado de SNPs 82
REFERENCIAS 93
GLOSARIO 95
6
El genoma del ser humano es un 99,9% idénticoentre individuos, la diferencia del 0,1% secompone de más de 2 millones de variacionesdenominadas polimorfismos, la mayoría SNPs(Single Nucleotide Polymorphism), que consistenen cambios puntuales en los nucleotidos ounidades estructurales que componen el ADN.Estos cambios puntuales tienen una enormerelevancia ya que son responsables, entre otros,de la respuesta concreta de un paciente a untratamiento o la aparición de una enfermedad.
Una vez que el Proyecto Genoma Humano haalcanzado su objetivo, la secuenciación de nuestrogenoma, la segunda fase consiste en eldenominado proyecto HapMap, cuyo objetivo esidentificar estos polimorfismos y asociarlos aenfermedades prevalentes. Correlacionando esasvariantes con la incidencia de enfermedades, sepodrá dar un salto adelante en la identificación degenes de susceptibilidad a numerosasenfermedades (diagnóstico predictivo), yrespuesta al tratamiento con distintos fármacos(farmacogenómica). Por otro lado, el desarrollo denuevos fármacos se beneficiaría del uso detécnicas de genotipado durante las fases clínicas,en las cuales sería posible identificar pacientescon mayor probabilidad de éxito frente a unfármaco, y con riesgo de sufrir efectossecundarios debidos al tratamiento.
Hasta hace relativamente poco tiempo el estudiode los SNPs era considerado una utopía por sualto coste y la falta de una tecnología apropiada.Actualmente existen numerosas plataformas en el mercado que permiten el genotipado deSNPs a gran escala con un coste cercano al 1 céntimo de € por SNP, capaces de obtenerdatos de millón y medio de estos SNPdiariamente.
Las principales barreras relativas a laimplantación de tecnologías de genotipado de altorendimiento consisten en el coste de los estudiosde genotipado, la segmentación del mercado, y laescasa regulación por parte de las agencias delmedicamento. No obstante, la agencia europea(EMEA) y la americana ya están trabajando en eldesarrollo de protocolos que permiten introducirel genotipado de los pacientes sometidos aensayos clínicos y terapias.
7
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Resumen ejecutivo
8
El objetivo del presente informe pretende realizarun análisis de las aplicaciones de las tecnologíasde genotipado en salud humana, haciendoespecial hincapié en las ventajas que presentanfrente a las técnicas moleculares clásicas. Por otrolado, se describen las principales tecnologías degenotipado de SNPs de alto rendimiento,destacando aquellas técnicas que se emplean deforma habitual en las plataformas comercialesdisponibles en la actualidad.
La segunda parte del informe recoge un análisisacerca de las principales barreras relativas a laimplantación de tecnologías de genotipado, asícomo las oportunidades de mercado, tendencias yestrategias futuras más relevantes.
1. Introducción y objetivos del informe
El genoma consiste en el conjunto de genes que
especifican todos los caracteres que pueden ser
expresados en un organismo, y la genómica por
tanto es la disciplina que se encarga del estudio de
estos genes y su expresión. El proyecto Genoma
Humano nació como un esfuerzo internacional con
el objetivo de identificar los genes que configuran
nuestro patrimonio genético, así como las proteínas
formadas a partir de la información presente en el
genoma y la función de cada una de ellas en el
organismo. En 1991 surge oficialmente el Proyecto
Genoma Humano con la idea de finalizar la
secuenciación del genoma humano para el año
2020. Durante los primeros años se desarrollaron
estrategias que permitieron ir identificando genes y
su posición relativa en el genoma (mapas
genéticos) para posteriormente realizar un análisis
más detallado mediante la identificación de la
secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN
(mapas físicos). A partir de 1998, una vez
ordenado el genoma o la mayoría del mismo,
comenzó la segunda etapa, consistente en descifrar
los 3.000 millones de bases (unidades
constituyentes del ADN) que configuran el ADN.
Esto fue posible gracias al desarrollo técnico
experimentado en esos años, principalmente de la
mano de las nuevas tecnologías moleculares tales
como la secuenciación y la informática1.
La conclusión del Proyecto Genoma Humano
en abril del 2003 puso de manifiesto
la necesidad de afrontar nuevos desafíos.
Entre estos desafíos el más inmediato consistía
en elaborar un mapa de variaciones genéticas
humanas comunes dirigidas a acelerar la
búsqueda de genes que contribuyen al cáncer,
diabetes, enfermedad del corazón, esquizofrenia y
muchas otras condiciones comunes.
Las estrategias empleadas en la elaboración de
estos mapas son fundamentalmente tres: las
técnicas proteómicas, técnicas de genotipado y
análisis de los perfiles de transcripción.
Mientras que las primeras son herramientas que
se emplean en el estudio del conjunto de
proteínas que se pueden obtener a partir del
genoma, las terceras consisten en el análisis de
los procesos que activan en un determinado
momento los genes. En cuanto a las técnicas
de genotipado, estas se centran en el estudio de
la diversidad genética mediante el análisis
de las variaciones existentes en el genoma entre
individuos y poblaciones. El propósito
del presente informe reside en evaluar las
técnicas de genotipado actualmente
disponibles, así como las barreras y
oportunidades que se avecinan para la industria
farmacéutica.
9
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
2. Introducción al genotipado
Proteómica GenotipadoAnálisis de la expresión
génica
> 100.000 proteínas> 10 millones de variaciones
en el genoma< 25.000 genes
ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN GÉNICA
1 Benítez Ortiz, J. (2002). El genoma humano: aplicaciones en la práctica pediátrica. Vox Paediatrica, 10, 1 (7-12).
Fig. 1. Estrategias de análisis de la variación génica mediante técnicas genómicas y proteómicas.Fuente: elaboración propia.
El genoma de un individuo se organiza en cromosomas, los cuales contienen genes o unidades de herencia,formados a su vez por secuencias de ADN, molécula que contiene y transmite la información genética. ElADN está compuesto por dos cadenas enrolladas alrededor de sí mismas para formar una “doble hélice”.Cada cadena está formada por millones de bloques químicos llamados “bases”. El ADN solamente contienecuatro bases diferentes designadas por las letras A, T, G y C, cuyo orden secuencial determina el mensajepara un gen concreto. Menos del 0,1% del genoma humano es variable entre los distintos individuos. Lasformas más frecuentes de variación del ADN se denominan SNPs o Polimorfismos2 de una sola base,que consisten en sustituciones de una base por otra. Cada una de las formas variantes de un gen o de unmarcador particular como pueden ser los SNPs, se denominan alelos. Por tanto, diferentes alelos de ungen producen variaciones en las características hereditarias.
10
3. Variación génica: SNPs
2 Polimorfismo genético: Existencia de múltiples variantes de un gen (por tanto de la proteína que codifica) que debe existiral menos en el 1% de la población. En el ADN humano aproximadamente 1 de cada 20-500 nucleótidos es polimorfo, esdecir varía de un individuo a otro.
3 García Alonso, Fernando. Siglo XXI: desafíos científicos y sociales. Capítulo 3: Farmacología y Genética. Pág. 37-43.4 International HapMap Project (http://www.hapmap.org/index.html.en).
A A G G
GA
T T C C
CC CTTA
Individuo A
Individuo B
Fig. 2. Polimorfismo genético: SNP.Fuente: Pharmacogenomics. A Strategic Market Outlook and Business Analisis. Front Strategic Consulting, INC. 2003.
Los SNPs están presentes en el genoma humano
con una frecuencia de uno por cada 1.000 pares
de bases. Son, por tanto, diferentes de las
mutaciones, que aparecen con menor frecuencia y
en la mayoría de los casos se encuentran
asociadas a enfermedades hereditarias. El interés
inicial de los SNPs consistía en la utilidad de éstos
para determinar la susceptibilidad de padecer una
determinada enfermedad. Por ejemplo, en el gen
Apo E, se han mapeado cuatro millones de bases
buscando marcadores de susceptibilidad en
pacientes que padecieran la enfermedad de
Alzheimer. De esta forma, se han podido localizar
aquellos SNPs asociados con la aparición de la
enfermedad, y que por tanto podrían utilizarse
como indicadores de susceptibilidad o como
métodos de confirmación del diagnóstico una vez
que se producen los primeros síntomas3.
En principio los polimorfismos no alteran el
fenotipo o características visibles de un
organismo, si bien es cierto que en determinadas
condiciones ambientales pueden afectar a la
función génica. Aproximadamente el 80% de los
SNPs reside en regiones no codificantes, es decir,
regiones no relacionadas con secuencias que
contienen la información esencial para la
expresión de un gen. Sin embargo, el 20%
restante podría estar relacionado con variaciones
genéticas de algún gen de interés. Por tanto,
existen miles de variaciones genéticas que
contribuyen directamente a la diversidad
estructural genética del ser humano. Para definir
la frecuencia de estas variaciones en las distintas
poblaciones se pusieron en marcha diversos
proyectos de secuenciación a gran escala, como el
Proyecto Genoma Humano, así como proyectos de
genotipado a gran escala en los que participan
numerosos países como es el caso del Proyecto
HapMap4, actualmente vigente.
Uno de los frutos del proyecto Genoma Humano
ha sido el descubrimiento de millones de
variantes de secuencias de SNPs en el genoma
humano. La mayoría de estas variantes son SNPs, lo que supone una oportunidad para estudiar la basegenética de enfermedades complejas por medio de estudios de población5. Hasta la fecha se hanidentificado más de 9 millones de SNPs de los que han sido validados y depositados en bases de datospúblicas unos cinco millones6.
Aunque existen otros tipos de polimorfismos genéticos también presentes en abundancia en el genomatales como repeticiones de fragmentos de secuencias no codificantes, éstos no presentan la misma utilidad que los SNPs como marcadores en mapas genéticos7.
11
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
5 Kwok, Pui-Yan (2001). Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.2:235-58.
6 HapMap Project Data (http://www.hapmap.org/downloads/index.html.en).Single Nucleotide Polymorphism database, dbSNP; (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP): base de datos pública de SNPs yotros polimorfismos mantenida por el National Center for Biotechnological Information (NCBI).H-Invitational Database, H-InvDB, Japón; (http://h-invitational.jp): base de datos online, de acceso libre, que recoge lamayoría de las funciones de los genes humanos . Proyecto colaborativo que participan más de 150 científicos de 40instituciones y empresas de todo el mundo.The SNP Consortium, TSC. (http://snp.cshl.org): consorcio entre compañías farmacéuticas, bioinformáticas y centrospúblicos de investigación para la creación de un mapa de dominio público de SNPs existentes en genoma humano.
7 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics. Current Opinion in ChemicalBiology 4:440–444.
Ventajas de los SNPs frente a otros polimorfismos genéticos:
• Presentes en el genoma con alta frecuencia: 1 SNP cada 1.200 pares de bases (aproximadamente10 millones distribuidos por todo el genoma).
• Menos susceptibles de presentar mutaciones en la línea germinal, lo que significa que su herenciaes más estable.
• Pueden estar presentes dentro de las zonas de regulación de los genes, por lo que podrían ser losresponsables directos de las características de interés.
• La sustitución de una base por otra generalmente sólo permite que existan dos posiblescombinaciones (A-T, C-G), lo que facilita la estimación estadística de su incidencia en la población.
Estas modificaciones de una sola base en lasecuencia de ADN o SNPs, pueden ocurrir en losgenes que contienen la información necesariapara el funcionamiento de receptores, proteínas
transportadoras o enzimas metabolizantes defármacos, por lo que pueden dar lugar a unapatología así como alteraciones en el metabolismode medicamentos.
Presencia de SNPs
• Receptores
• Proteínas transportadoras de fármacos
• Enzimas metabolizantes de fármacos
• Sin relevancia
• Causantes de enfermedad
• Alteraciones en el metabolismo de fármacos
Consecuencia delos SNPs
A
A
G
SNP
G
G
C
C C
Fig. 3. Presencia de SNPs en el genoma y efectos en el organismo.Fuente: Wieczorek, S. J.; Tsongalis, G. J. (2001). Pharmacogenomics: will it change the field of medicine? Clinica ChimicaActa 308, 1–8.
Genotipado de SNPs
La genética busca correlacionar la variación en la
secuencia de ADN con las diferencias fenotípicas o
características visibles de un individuo. Hasta la
fecha, se han conseguido grandes avances a la
hora de relacionar fenotipos característicos con
variaciones en un solo gen. Sin embargo, la
mayoría de los fenotipos, incluidas las
enfermedades más comunes y las respuestas
variables a los fármacos, tienen un origen complejo
en el cual se ven involucrados múltiples factores
genéticos (los genes y sus productos) y no
genéticos (factores ambientales). Para desentrañar
este grado de complejidad es necesaria una
completa descripción de la variación genética en el
genoma humano, así como el desarrollo de
herramientas analíticas que permitan emplear esta
información para comprender la base genética de
las enfermedades8.
El análisis de SNPs es la forma más sencilla de
determinar la existencia de polimorfismos del
ADN. La mayoría de los SNPs conocidos hasta
hace un par de años habían sido identificados a
partir de proyectos de secuenciación como el
Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, aunque
las técnicas de secuenciación son muy efectivas a
la hora de identificar SNPs, su elevado coste y
lentitud no hacen recomendable este tipo de
técnica para su uso como plataforma de
genotipado a gran escala9.
12
8 Collins, F. S. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature Vol 422, 24 April.9 Freimuth, R. R.; et al. (2004). High-throughput genotyping methods for pharmacogenomics studies.
Curr. Pharmacogenomics, 2, 21-33.10 Roses, A. D. (2002). Genome-based pharmacogenetics and the pharmaceutical industry. Nature Reviews.
Drug discovery, Vol. 1, July, 541-549.
Características de un ensayo de genotipado ideal:
• Ensayo sencillo y rápido.
• Bajo coste del ensayo en términos de reactivos y tiempo.
• Reacciones robustas.
• Análisis sencillos, automatizados y precisos.
• Ensayo flexible y escalable, capaz de desarrollar desde unos pocos cientos a millones de ensayospor día.
Sin embargo, no existe un método de genotipadoideal que pueda ser de utilidad en todas lasaplicaciones clínicas de los SNPs. Por este motivo,los retos a los que se enfrenta en la actualidad lacomunidad científica consisten en incrementar lavelocidad del proceso, reducir el coste de losensayos y desarrollar múltiples ensayos enparalelo (multiplexado), realizando mejoras en labioquímica, ingeniería y software analítico.
La consecución de este tipo de mejoraspermitirían además elaborar mapas de SNPs de alta densidad, es decir, mapas de granprecisión en los cuales la distancia entre losmarcadores o SNPs sería mínima. Estos mapas de
SNPs de alta densidad, secuencialmente
ordenados gracias a la información proporcionada
por los datos del Proyecto Genoma Humano,
podrían ser empleados para identificar nuevos
perfiles genéticos asociados a la eficacia de
fármacos o a reacciones adversas de
medicamentos. El primer experimento que avaló
esta hipótesis se realizó sobre una región del
genoma relacionada con la susceptibilidad de
padecer la enfermedad de Alzheimer. Esta técnica
se ha utilizado para identificar genes de
susceptibilidad en pequeñas regiones identificadas
en mapas de ligamiento para varias
enfermedades tales como migraña con aura,
psoriasis y la enfermedad de Crohn10.
Otras técnicas complementarias al genotipado deSNPs aplicado a la salud humana son las técnicasproteómicas. La identificación de ARN ymarcadores de proteínas para el screeening,diagnóstico, pronóstico y monitorización deenfermedades requieren del acceso a tejidosafectados por la patología. Estas muestras sesometen posteriormente a estudios de análisis dela expresión génica12 para clasificar el tipo depatología, siendo el cáncer la enfermedad másestudiada hasta el momento mediante estaestrategia. Debido a que las proteínas sufrenmodificaciones que no vienen determinadas en susecuencia de ADN pero que pueden resultardeterminantes para el desarrollo de laenfermedad, el uso de herramientas proteómicastambién es necesario en el descubrimiento demarcadores moleculares asociados a patologías.Algunas de las tecnologías proteómicasempleadas pueden ser geles bidimensionales deelectroforesis, espectrometría de masas oherramientas bioinformáticas13.
13
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Las estrategias de genotipado aplicadas a la salud humana son actualmente posiblesfundamentalmente debido a tres factores11:
• Disminución del coste en el genotipado a gran escala debido a grandes avances tecnológicos.
• Disponibilidad de un gran número de SNPs como potenciales marcadores moleculares.
• Nuevos métodos estadísticos para analizar los datos procedentes del genotipado y detectarasociaciones entre fenotipos.
11 Hosford, D. A. (2004). Pharmacogenetics to predict drug-related adverse events. Toxicologic pathology, 32 (suppl. 1): 9-12.12 Expresión génica: proceso por el cual todos los organismos transforman la información codificada en los ácidos nucleicos
en las proteínas necesarias para su desarrollo y funcionamiento (Fuente: Glossary of Genetic Terms, NHGRI;http://www.genome.gov/sglossary.cfm).
13 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDSin Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
Las técnicas de genotipado se detallan en el punto 6 del presente informe.
La aplicación inmediata derivada de las técnicasde genotipado de SNPs es la medicinapersonalizada o a la carta, que consiste en eldiseño de terapias individualizadas en base algenotipo de cada individuo. La variación genéticapermitiría por tanto estudiar la predisposición delser humano a desarrollar ciertas enfermedades ylas diferentes respuestas que cada individuopuede mostrar frente a tratamientos con fármacosdiferentes. La medicina personalizada se centraen la hipótesis de que las enfermedades sonheterogéneas, desde sus causas hasta susdistintos grados de progresión tras laadministración de un fármaco, y por tanto la
enfermedad de cada paciente ha de ser tratadade forma individual. A medida que seperfeccionan las herramientas genómicas, elconocimiento de las bases moleculares ygenéticas de las enfermedades aumenta. Losrecientes descubrimientos en la patología delcáncer han demostrado la importancia que poseenlos patrones de expresión génica en diversostumores, incluyendo leucemias y cáncer demama. Otros ejemplos los constituyen lasenfermedades cardiovasculares, en las cuales elsíndrome QT largo y la cardiomiopatía hipertróficafamiliar han demostrado poseer una elevadaheterogeneidad genética14.
14
4. Aplicaciones del genotipadode SNPs de alto rendimiento
14 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDSin Biotechnology. Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
Desarrollo de terapiasbasadas en la genética
Análisis genético parapredecir el riesgo a sufrirla enfermedad
Desarrollo y prescripciónde medicamentos
Basado en variacionesgenéticas entreindividuos
Basado en diferenciasgenéticas entreenfermedades
USO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA
Fig. 4. Aplicaciones principales derivadas del uso de la información genética.Fuente: Phillips, K. A. (2004). Genetic testing and pharmacogenomics: Issues for determining the impact to healthcaredelivery and costs. The American Journal of Managed Care. Vol. 10, No. 7, 425-432.
Los beneficios que aportaría la medicina personalizada no sólo revertirían directamente a los pacientes yespecialistas sanitarios, sino que la industria farmacéutica tendría la oportunidad de disminuir el tiempo ycoste derivado del desarrollo de fármacos que no son adecuados para ciertos grupos de pacientes. Existenotra serie de factores que contribuyen en gran medida a que la medicina personalizada sea una claraapuesta de futuro en biotecnología, y que se recogen en el siguiente cuadro:
Como consecuencia de esta necesidad, ha sido necesario desarrollar una serie de tecnologías que permitanel descubrimiento de marcadores de diversa naturaleza, genéticos y proteicos fundamentalmente. Gracias alas técnicas de genotipado, los marcadores genéticos16 son en la actualidad la principal estrategia en lamedicina personalizada.
El análisis clínico de mutaciones o polimorfismos relevantes puede llevarse a cabo mediante diferentesestrategias:
15
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
15 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDSin Biotechnology. Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
16 Marcadores genéticos: fragmentos de ADN de tamaño variable y posición conocida, que pueden utilizarse como puntosde referencia en estudios de genómica. Los marcadores más simples son los SNPs.
Beneficios de la medicina personalizada15
Para la industria farmacéutica:
• Aumento de la eficiencia y reducción del coste de la identificación de dianas terapéuticas y nuevosfármacos.
• Reducción del tiempo y coste de los ensayos clínicos.
• Diferenciación del producto en el mercado.
Para los pacientes y médicos:
• Mayor probabilidad de buenos resultados con un fármaco.
• Baja probabilidad de efectos secundarios.
• Estrategias preventivas.
• Estrategias dirigidas.
• Costes reducidos.
• Mejora en la salud.
Método Análisis Ventajas Desventajas
Farmacológico
Bioquímico
Genético
Estudiosfarmacocinéticos
Estudios clínicos
Actividad enzimática,función del receptor otransportador
Análisis de la secuencia
Control de laconcentración delmetabolito/fármaco
Control de la eficacia ytoxicidad (necesario paraevaluar la relevancia delos polimorfismosgenéticos)
Control directo de lafunción de la proteínacodificada por el gen deinterés
Información completa dela secuencia
Inviable en análisisclínicos rutinarios
No es adecuado para elanálisis de pacientesindividuales
Proporcionan escasainformación
Proceso laboriosoBaja especificidad (puededetectar polimorfismosirrelevantes)
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE VARIACIONES EN EL GENOMA DEBIDASA POLIMORFISMOS
(Continúa en página siguiente)
Las tecnologías de genotipado de SNPs de alto rendimiento forman parte de un proceso secuencial en elcual la identificación de SNPs es sólo el primer paso, dando lugar a tres aplicaciones básicas en saludhumana, la farmacogenómica, el diagnóstico predictivo y el descubrimiento y desarrollo de nuevosfármacos.
16
Método Análisis Ventajas Desventajas
Genético(continuación)
Análisis de la expresióngénica
Análisis de SNPs
Información potencialsobre predisposicióngenéticaPotencial control directosobre el efecto de losfármacos
Análisis rápido y simpleen el paciente una vezidentificados los SNPsresponsablesInformación sobrepredisposición genéticaInformación sobre larespuesta a fármacos
Relevante sólo paragenes diana y cascadasde señalización
Extensos ensayos clínicosacerca de la relevanciade los SNPsPotencial bajasensibilidad (puedeperder información sobregenes funcionales)
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE VARIACIONES EN EL GENOMA DEBIDASA POLIMORFISMOS (continuación)
Tabla 1. Métodos de análisis de variaciones en el genoma debidas a polimorfismos.Fuente: Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43–53.
Identificación de SNPs
Validación de SNPs
Genotipado de SNPs dealto rendimiento
Farmacogenómica
Diagnóstico predictivo
Descubrimiento y desarrollode fármacos
Empleo de tests dediagnóstico de SNPs en
pacientes
Estudios de asociación (relaciónentre SNPs y estados patológicos)
Desarrollo de tests dediagnóstico de SNPs
Genotipado de SNPs dealto rendimiento en
ensayos clínicos
Fig. 5. Aplicaciones del genotipado de SNPs de alto rendimiento en salud humana.Fuente: Pharmacogenomics. A market & cost-benefit analysis. Front Strategic Consulting, INC. 2001.
Las técnicas de genotipado se detallan en el punto 6 del presente informe.
4.1. Diagnóstico predictivo
En sus comienzos, la genética clínica se basaba
en estudios familiares de enfermedades altamente
recurrentes en determinadas familias. Aunque
estos estudios demostraban que existían
evidencias de que había factores genéticos
asociados a un metabolismo variable de los
fármacos, las conclusiones no podían ser
aplicadas en la gran mayoría de los ensayos
clínicos, ya que éstos eran llevados a cabo en
individuos sin parentesco17.
El diagnóstico genético es de utilidad cuando
existe una estrategia preventiva para reducir el
riesgo en personas predispuestas a padecer una
enfermedad o para disminuir su mortalidad a
través de medidas terapéuticas precoces. Un
ejemplo lo constituye el diagnóstico predictivo de
algunos tipos de cánceres hereditarios a través
del estudio de genes de susceptibilidad. La
aplicación de este tipo de estudios en familias con
historia de cáncer colorrectal no polipósico
hereditario, por ejemplo, permite identificar los
portadores de mutaciones de los genes de
susceptibilidad implicados. De esta manera, se
puede seleccionar aquellos individuos que van a
beneficiarse de colonoscopias periódicas que
detecten precozmente la enfermedad y mejoren
su pronóstico18.
Por tanto, el diagnóstico predictivo mediante
técnicas de genotipado es decisivo a la hora de
realizar un diagnóstico temprano de una
enfermedad crónica. Esta anticipación permitiría
el tratamiento adecuado del paciente sin la
necesidad de pasar por terapias fallidas antes de
encontrar el medicamento apropiado, conllevando
un mejor pronóstico de la enfermedad. En
consecuencia, no sólo se evitaría un gran número
de efectos secundarios derivados del empleo de
fármacos no adecuados para la patología a tratar,
sino que reduciría drásticamente el gasto en
medicamentos innecesarios.
17
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
17 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics. Current Opinion in Chemical Biology 4:440–444.18 Benítez Ortiz, J. (2002). El genoma humano: aplicaciones en la práctica pediátrica. Vox Paediatrica, 10, 1 (7-12).
Inicio de la terapia
Comienzo desíntomas
Comienzo de laenfermedad
Diagnóstico y pronóstico
Sev
erid
ad c
línic
a
Tiempo (meses - años)
Predisposición
Fig. 6. Investigación, intervención y oportunidades de la medicina personalizada en diferentes estadíos de una enfermedad.Fuente: Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care.TRENDS in Biotechnology Vol.19 No.12 December, 491-496.
Aunque existen numeros ejemplos de polimorfismos de genes que se emplean para predecir la posiblepredisposición a sufrir una patología, la gran mayoría consisten en polimorfismos de genes concretos. Unclaro ejemplo es el gen codificante de la apolipoproteína E (Apo E), cuyos polimorfismos se encuentranasociados a una distinta predisposición a padecer hipercolesterolemia.
4.2. Farmacogenética y farmacogenómica
No existe un consenso respecto a la definición de farmacogenética y farmacogenómica, ya que enocasiones la literatura científica emplea diferentes acepciones dando lugar a confusión19. Para lospropósitos del presente informe, no se realizará una distinción entre farmacogenética y farmacogenómica,empleándose el segundo término de manera global para referirnos al análisis de información genética deun individuo o una población con el objeto de estudiar la respuesta a diversos fármacos.
18
19 Tanto la agencia estadounidense del medicamento (FDA, http://www.fda.gov), como la Agencia Europea delMedicamento (EMEA, http://www.emea.eu.int) consideran la farmacogenética como el estudio de variaciones en lasecuencia de ADN entre individuos en relación a la respuesta frente a un fármaco. La FDA define la farmacogenómicacomo el estudio de la variabilidad en la expresión de genes en referencia a la susceptibilidad de desarrollar unaenfermedad y a la respuesta frente a un fármaco, todo ello a nivel celular, tisular, individual o en poblacionesdeterminadas (Draft Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions, Glossary, pag. 15(http://www.fda.gov/cder/guidance/5900dft.pdf). La EMEA es más concreta al definir los tests farmacogenómicos comoensayos que permiten el estudio de variaciones interindividuales mediante mapas de SNPs, haplotipos, y alteraciones enla expresión génica que pueden correlacionarse con alguna función farmacológica o respuesta terapéutica (Position paperon terminology in pharmacogenetics. Committee for proprietary medicinal products (CPMP). EMEA/CPMP/3070/01,November 2002. (http://www.emea.eu.int/pdfs/human/press/pp/307001en.pdf).
20 Wallace, R. W. (1999). Pharmacogenomics: the next logical step. DDT, Vol. 4, No. 3, March.21 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS
in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
Farmacogenética
Disciplina que se ocupa de estudiar las diferentes respuestas de los individuos frente a los fármacosbasándose en los patrones de variabilidad genética de cada paciente.
Farmacogenómica
Término más amplio que persigue buscar genes candidatos de respuesta a determinados fármacos opersonalizar medicamentos empleando herramientas genómicas.
Existen grandes diferencias entre la genómica
clásica y la farmacogenómica en cuanto a su
aproximación a la enfermedad. Mediante las
técnicas genómicas, se busca descodificar las
instrucciones genéticas que permitan entender
cómo estos genes participan en complejas redes
biológicas. Un gen que causa una enfermedad es
identificado como una variante del gen normal
presente en la mayoría de la población. Tal
variación puede ser tan pequeña como la
sustitución de un único aminoácido que conlleva
el mal funcionamiento de una proteína. Para la
mayoría de las enfermedades con base genética,
sin embargo, la situación es mucho más
compleja, y varios defectos genéticos presentes
en una población pueden contribuir a la misma
enfermedad. Por tanto, el mismo agente
terapéutico podría no ser efectivo como
tratamiento para todos los individuos que sufran
una enfermedad poligénica, que es como se
denominan a las enfermedades causadas por más
de un gen20. Mientras que la genómica clásica
compara individuos afectados con los no
afectados, la farmacogenómica compara
entre individuos afectados, identificando aquellos
que responden a los fármacos y los que no
responden.
El último objetivo de la farmacogenómica es
definir una enfermedad a nivel molecular de tal
manera que las herramientas preventivas y
terapéuticas de las que se disponga puedan
frenar o mitigar los efectos de la enfermedad.
Durante el progreso de una enfermedad crónica,
la farmacogenómica impacta en el curso de la
enfermedad en el momento en el que comienza la
terapia mediante fármaco21. El análisis
farmacogenómico del paciente permitiría
identificar aquellos fármacos y dosificaciones de
los mismos para los cuales el paciente desarrolla
una respuesta óptima. De la misma forma, es
posible identificar los medicamentos o
concentraciones de los mismos que desencadenan
reacciones de toxicidad en algunos pacientes.
La variabilidad de la respuesta a los fármacos entre
individuos puede estar motivada por un conjunto de
factores, como por ejemplo la edad, raza, género,
interacciones entre otros fármacos, enfermedades
concomitantes, y las funciones renales y hepáticas.
Al mismo tiempo, dentro de una población existe
siempre una proporción de individuos que son
genéticamente susceptibles a sufrir reacciones
adversas derivadas del uso de determinados
fármacos o bien no responden al tratamiento de
manera adecuada. Hasta ahora, las medidas que se
tomaban con estos pacientes consistían en el
tratamiento con otros fármacos alternativos en caso
de disponer de ellos, o bien el abandono de la
medicación. La disponibilidad de tests que permitan
la identificación de estos pacientes es una prioridad,
ya que hasta la fecha sólo pueden identificarse tras
su exposición al fármaco22.
19
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Inicio de la terapia
Comienzo desíntomas
Comienzo de laenfermedad
Diagnóstico y pronóstico
Sev
erid
ad c
línic
a
Tiempo (meses - años)
Farmacogenómica
Fig. 7. Investigación, intervención y oportunidades de la medicina personalizada en diferentes estadíos de una enfermedad.Fuente: Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care.TRENDS in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
22 Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43–53.
Efectos inesperados:
• Efectos secundarios severos• Respuesta inadecuada
Pacientes bajo tratamiento con fármacos
Fig. 8. Segmentación de la población en función de la respuesta a fármacos.Fuente: Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43–53.
La farmacogenómica no sólo estudia la farmacodinámica, es decir, el mecanismo de acción de un fármaco sobreuna diana, sino también la farmacocinética, que consiste en el estudio de cómo se absorben y distribuyen losfármacos en el organismo. El metabolismo de los fármacos, es decir, su absorción, biotransformación,distribución y excreción, puede variar en gran medida entre individuos, y por tanto representa un área donde lafarmacogenómica juega un papel relevante.
Las distintas agencias reguladoras del medicamento requieren a las compañías farmacéuticas una serie deestudios necesarios para formalizar el registro de un nuevo agente terapéutico, entre los que se encuentran losestudios farmacodinámicos y farmacocinéticos.
20
Dianas de fármacosTransportadores
de fármacosEnzimas metabolizadoras
de fármacos
Farmacodinámica Farmacocinética
Variabilidad de la eficaciay toxicidad del fármaco
FARMACOGENÉTICA/FARMACOGENÓMICA
Fig. 9. Variabilidad entre pacientes en eficacia de fármacos y riesgo de toxicidad.Fuente: Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS inGenetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
La farmacodinámica describe los efectos
farmacológicos de un medicamento en el
organismo23. Numerosos fármacos interaccionan
con dianas proteicas de manera específica, tales
como enzimas y receptores. Muchas de estas
dianas han demostrado tener polimorfismos que
influyen en la respuesta del paciente ante un
tratamiento farmacológico determinado. El
conocimiento de estos polimorfismos puede
emplearse para predecir la eficacia de un
fármaco.
La farmacocinética describe los niveles de un
fármaco y sus metabolitos en los diferentes
tejidos, así como su absorción, distribución,
metabolismo y eliminación24. La farmacocinética
ha sido el área inicial de la investigación clínica
aplicada a la farmacogenómica, y es la que
permanece más activa. Una de las razones
consiste en que existen pocas enzimas
metabolizadoras de fármacos (drug-metabolizing
enzymes, DMEs) en el mercado de fármacos
actual, además de escasos polimorfismos
asociados a estas enzimas. Este problema podría
verse solucionado por el desarrollo de nuevos
fármacos mediante la identificación de
polimorfismos asociados a estas enzimas.
Aplicaciones clínicas de la farmacogenómica
La posibilidad de asociar los polimorfismos genéticos
con la capacidad de respuesta de un paciente a un
determinado medicamento ha supuesto un avance
primordial para la farmacogenómica. En la
actualidad, es posible conocer qué polimorfismos
están asociados con la respuesta terapéutica a un
medicamento concreto, como por ejemplo los
polimorfismos que condicionan una mejor respuesta
terapéutica a pravastatina en pacientes con
hipercolesterolemia, o a formoterol en pacientes
23/24 Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS inGenetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
asmáticos25. La mayoría de los fármacos actúan por medio de la interacción con proteínas tales como receptores,enzimas y proteínas de señalización intracelular. Estas proteínas presentan variaciones dentro de cada individuodeterminadas por polimorfismos genéticos, que afectan a la sensibilidad a los fármacos. Mediante el análisis deSNPs en muestras obtenidas de pacientes enrolados en fases tempranas de ensayos clínicos, es posible predecirtanto la eficacia como la aparición de efectos adversos del medicamento en concreto.
21
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
25 García Alonso, Fernando. Siglo XXI: desafíos científicos y sociales. Capítulo 3: Farmacología y Genética. Pág. 37-43.26 Ventana terapéutica: cociente entre la Concentración Máxima Efectiva (no tóxica) y la Concentración Mínima Efectiva.
Factores a tener en cuenta en las aplicaciones clínicas de la farmacogenómica
• Eficacia: % de pacientes tratados con éxito.
• Toxicidad: % de pacientes que desarrollan efectos secundarios.
• Ventana terapéutica: rango de dosis en la cual un fármaco muestra la mayor eficacia y menor toxicidad.
Las aplicaciones clínicas de la farmacogenómicase encuentran dirigidas al empleo de estrategiasterapéuticas más efectivas en función del perfilgenómico del paciente. Para ello se debe tener encuenta lo que se denomina “ventanaterapéutica”26, que indica el rango de dosisadecuado para cada paciente en función de laeficacia y toxicidad del fármaco. Debido a lavariabilidad genética entre invididuos, estaventana terapéutica es muy estrecha para lamayoría de fármacos, por lo que su eficacia seencuentra limitada. El fármaco ideal presentaríauna ventana tearapéutica amplia, lo que significaría la posibilidad de administrar bajas
dosis del fármaco manteniendo su efectividad, y dosis elevadas del mismo sinpresentar efectos tóxicos. La farmacogenómicapermite extender la ventana terapéutica de losfármacos mediante la segmentación de lapoblación en grupos con ventanas terapéuticasmás amplias, y que por tanto se beneficiarían dela formulación de fármacos más efectivos yseguros. Por otro lado, las técnicasfarmacogenómicas posibilitan descartar aquellospacientes que por su perfil genético nodesarrollan una respuesta adecuada, o bien sonmás susceptibles de desarrollar efectossencundarios tras la administración del fármaco.
A
B
C
D
E
B
D
Dosis del fármaco
Fármaco ideal
Ventana terapéutica amplia
Farmacogenómica
Ampliación de la ventana terapéutica
Mayoría de fármacos
Ventana terapéutica estrecha
Dosis del fármaco
Dosis del fármaco
A
C
E
Fig. 10. Ajuste de la dosificación de fármacos.Fuente: adaptado de Pharmacogenomics: Dilemas and Challenges. University of Michigan. Gus Rosania, 2003;http://www-personal.umich.edu/~grosania/Regulatory Issues Lecture.ppt.— —
La farmacogenómica puede dividirse en tres aplicaciones en función de la categoría de pacientes sometidosal tratamiento. Las dos primeras se emplearían para excluir pacientes de los ensayos clínicos, mientras quela última aumentaría el potencial de mercado del fármaco27.
22
27 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
28 Hosford, D. A. (2004). Pharmacogenetics to predict drug-related adverse events. Toxicologic pathology, 32 (suppl. 1): 9-12.29 Johson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics,
Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
Ensayos de predicciónde efectos secundarios o
toxicidad
Efectossecundarios
raros
Efectossecundarios
comunes
Ensayos de eficacia mediantefarmacogenómica
Respondedores por debajodel umbral óptimo
Fármaco A.2Fármaco
A.1Fármacoexcluido
Identificación de nuevospacientes potenciales
Respondedores dentrodel umbral óptimo
Fármaco A
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA FARMACOGENÓMICA
Fig. 11. Aplicaciones clínicas de la farmacogenómica en base al tipo de pacientes.Fuente: adaptado de Pharmacogenetics and Personalized Medicine, EGeen International; http://www.egeeninc.com.
Estratificación de pacientes en función de la respuesta clínica
Reformulación del fármaco A en función del genotipado de pacientes
4.2.1. Ensayos de predicción de efectos secundarios o toxicidad
Las técnicas farmacogenómicas permiten identificar
pacientes con predisposición a experimentar
efectos secundarios derivados del tratamiento con
determinados fármacos. Esta aplicación concreta
de la farmacogenómica también se denomina
toxicogenómica. La variabilidad en la respuesta
terapéutica es debido en la mayoría de los casos a
dificultades metabólicas causadas por variantes de
enzimas conocidas. Los polimorfismos más
frecuentes relacionados con la toxicidad de los
fármacos se encuentran en enzimas
metabolizadoras de fármacos.
Durante el proceso de desarrollo de un fármaco,
la farmacogenómica puede emplearse para
predecir posibles Reacciones Adversas
Medicamentosas (RAM) tales como hepatoxicidad,
nefrotoxicidad, cardiotoxicidad oinmunosupresión. Estas reacciones sonresponsables de más de un 3% de lashospitalizaciones en la mayoría de los paísesdesarrollados28. Aunque el riesgo de producirtoxicidad se puede reducir mediante ladisminución de la dosis, no todos los efectossecundarios tóxicos son debidos a dosis elevadas,como la cardiotoxicidad, hepatotoxicidad,rabdomiolisis y agranulocitosis. Aunque este tipo de toxicidad no es frecuente que seproduzca en la población, es motivo suficientepara que un fármaco no sea aprobado por lasagencias de medicamentos o bien sea retirado delmercado. Por este motivo, en la actualidad seestán desarrollando técnicas de genotipado quepermitan identificar pacientes susceptibles desufrir esta clase de toxicidad. Para realizar estetipo de análisis es necesario que exista una basede datos de pacientes que hayan mostrado algúntipo de toxicidad relacionada con la administraciónde medicamentos29.
Otra técnica que permite analizar el perfil
toxicológico de un fármaco es el análisis de la
expresión génica mediante microarrays de ADN,
los cuales permiten elaborar perfiles moleculares
de toxicidad. Algunas compañías que están
trabajando en el desarrollo de estos tests son
Affymetrix, Genelogic y Curagen30. Actualmente el
análisis genómico del perfil toxicológico es una
práctica común durante la fase preclínica de
desarrollo de nuevos fármacos. Los tests
genéticos de toxicidad más frecuentes son
aquellos que estudian la asociación entre el nuevo
compuesto terapéutico y el gen HERG, asociado a
la susceptibilidad de desarrollar arritmias tras la
administración de determinados fármacos31. Otro
ejemplo común es el polimorfismo del gen NAT2,
responsable de variaciones genéticas en el
metabolismo de numerosos fármacos,
presente en el 50% de la población caucásica, que
posee un mayor riesgo de sufrir efectos secundarios
para numerosos fármacos comercializados32. El
empleo de tests farmacogenómicos para identificar
este polimorfismo permitiría recuperar algunos
fármacos antes de ser abandonados tras un ensayo
clínico que no ofreciera resultados positivos. Por
tanto, los marcadores farmacogenómicos podrían
introducirse en las distintas fases de los ensayos
clínicos, así como en las etapas de estratificación y
selección de pacientes.
23
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
30 Affymetrix (http://www.affymetrix.com/index.affx).Genelogic (http://www.genelogic.com).Curagen Corp. (http://www.curagen.com).
31 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDSin Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496.
32 Garte, S.; et al. (2001). Metabolic gene polymorphism frequencies in control populations. Cancer Epidemiol BiomarkersPrev. Dec. 10 (12), 1239-48.
33 EU Approves Roche’s AmpliChip as In Vitro Device; Competitors Consider Next Moves. Pharmacogenomics Reporter,Sept. 9, 2004 (http://www.pgxreporter.com).
Ensayos de predicción de efectos secundarios mediante farmacogenómica
• Pueden salvar un fármaco candidato que en otras circunstancias habría sido abandonado.
• No descalifican pacientes que van a desarrollar efectos secundarios para el ensayo.
• Eleva el coste de los ensayos clínicos al requerir un mayor número de pacientes.
• No sirven para seleccionar pacientes antes de iniciar una nueva fase clínica.
En la actualidad varias compañías biotecnológicas
disponen de tests farmacogenómicos que
permiten la identificación de polimorfismos
relacionados con el metabolismo de fármacos. Los
principales tests toxicogenómicos se centran en el
genotipado de genes de enzimas de la familia del
citocromo p450, relacionada con la toxicidad de
un gran número de fármacos. En este sentido,
existen cuatro tests de genotipado desarrollados
por diferentes compañías, mediante los cuales es
posible identificar un número variable de SNPs en
distintos genes de la familia del citocromo p450.
Tan solo uno de los tests de genotipado,
desarrollado por Roche Diagnostics y con un
precio por unidad que ronda los 400 €, ha sido
aprobado para su uso en los 25 países de la U.E.
como método de diagnóstico in vitro para
identificar polimorfismos del gen del citocromo
p450. El resto de tests es probable que obtengan
la autorización en los próximos meses, mientras
todavía no se ha autorizado ningún test
toxicogenómico de diagnóstico in vitro en
EE.UU.33. Una segunda estrategia consiste en la
identificación de polimorfismos de la enzima
tiopurina metiltransferasa (TPMT), que ha dado
lugar a un test de genotipado comercializado por
la empresa Prometheus Laboratories Inc.,
autorizado en la U.E. para su uso como test
toxicogenómico asociado al tratamiento con
azatioprina (ImuranTM, fármaco frente a la artiritis
reumatoide comercializado tambien por
Prometheus).
Otro tipo de ensayos similares son los ensayos depredicción de efectos secundarios raros, los cualesidentifican pacientes con riesgo de sufrir efectossecundarios poco convencionales, y quegeneralmente se ponen de manifiesto una vez elfármaco se encuentra en el mercado. Al contrarioque los efectos secundarios más comunes, queestán asociados a rutas metabólicas ygeneralmente se descubren durante los ensayospreclínicos, los efectos secundarios raros tiendena estar provocados por genes no relacionadas con
rutas metabólicas. Estas variaciones genéticas noson fáciles de identificar ya que pueden tener unorigen muy diverso, como modificaciones de lasdianas terapéuticas o incluso rutas norelacionadas con el mecanismo de acción delfármaco, por lo que rara vez se ponen demanifiesto durante los ensayos clínicos.
Este es el caso de Lotronex39, un fármacoempleado en el síndrome de colon irritable, queprovoca un raro efecto secundario en 1 de cada
24
Empresa Producto Polimorfismos Estado actual
PrometheusLaboratories Inc.34
RocheDiagnostics35
GE Healthcare36
Jurilab37
TM BioscienceCorp.38
PRO-PredictRxTPMT
AmpliChip CYP450Test
CodeLink P450Bioarrays
DrugMEtTMGenotyping Test
Tag-ItTM MutationDetection Kits
Polimorfismos de la enzimaTiopurina metiltransferasa(TPMT)
Polimorfismos de enzimasde la familia del citocromop450 (CYP2D6 y CYP2C19)
Polimorfismos de enzimasde la familia del citocromop450 (CYP2D6, CYP2C9,CYP2C19, CYP1A1, CYP1A2,CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, yCYP 1B1 (110 SNPs)
Polimorfismos de enzimas dela familia del citocromo p450(CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19,y CYP3A5), Tiopurinametiltransferasa (TPMT),enzima N-acetiltransferasa 2(NAT2) y gen de resistencia amúltiples fármacos (MDR1).(27 SNPs)
Polimorfismos de enzimasde la familia del citocromop450 (CYP2C9, CYP2C19,CYP2D6)
• Lanzamiento: octubre2002
• Aprobación: U.E.
• Pendiente deaprobación: EE.UU.
• Lanzamiento: junio 2003
• Aprobación: U.E.,EE.UU.
• Lanzamiento:septiembre 2003
• Pendiente deaprobación: EE.UU. yU.E.
• Lanzamiento:marzo 2004
• Pendiente de aprobación:EE.UU. y EU (posibleaprobación en U.E.)
• Competidor directo deRoche y TM Bioscienceen Europa
• Lanzamiento: junio2004
• Pendiente de aprobación:EE.UU. y U.E.
• Competidor directo deRoche y Jurilab enEuropa
TESTS TOXICOGENÓMICOS DISPONIBLES EN LA ACTUALIDAD
Tabla 2. Principales tests toxicogenómicos.Fuente: elaboración propia.
34 Prometheus Laboratories Inc. (http://www.prometheuslabs.com).35 Roche Diagnostics, con tecnología de Affymetrix (http://www.roche-diagnostics.com).36 GE Healthcare, antes Amersham Biosciences (http://www.gehealthcare.com).37 Jurilab (http://www.jurilab.com).38 TM Bioscience Corp. (http://www.tmbioscience.com).39 Lotronex Questions and Answers web, FDA (http://www.fda.gov/cder/drug/infopage/lotronex/lotronex-qa.htm).
6.500 pacientes. Debido a que los ensayos clínicos generalmente no suponen más de 5.000 pacientes, esteefecto no fue detectado hasta que el fármaco salió al mercado y el número de pacientes tratados fue losuficientemente numeroso. En estos casos, los análisis farmacogenómicos permitirían rescatar algunos deestos fármacos que ofrecen resultados efectivos en determinadas poblaciones de pacientes.
Paradójicamente, cuanto menor sea el número de efectos secundarios, más difícil es conseguir salvar unfármaco del abandono de los ensayos clínicos. Esto es debido a que se necesita un número elevado depacientes que desarrollen estos efectos secundarios para que los resultados sean concluyentes, por lo quelos ensayos clínicos estándar nunca muestran un número de pacientes suficientemente elevado.
25
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Ensayos de predicción de efectos secundarios raros mediante farmacogenómica
• Útiles en medicamentos que ya se encuentran en el mercado (vigilancia postmarketing).
• Eleva el coste de los ensayos clínicos al requerir un mayor número de pacientes.
Ensayos de eficacia mediante farmacogenómica:
• Descalifican pacientes que responden a placebos y los que no ofrecen respuesta, reduciendo elnúmero de pacientes necesarios para el ensayo.
• Reducen el coste de los ensayos clínicos.
• Suponen la pérdida de un 2% de los beneficios esperados al reducir el número de pacientespotenciales.
4.2.2. Ensayos de eficacia mediantefarmacogenómica
Generalmente los pacientes son tratados
mediante dos tipos de estrategias terapéuticas
consistentes en terapias de prueba-error y
protocolos establecidos. La farmacogenómica
beneficiaría a aquellos pacientes en los que se
emplea la primera estrategia, ya que se evitaría el
periodo de prueba con medicamentos no efectivos
o que desencadenen graves efectos secundarios.
La identificación de la terapia más adecuada
acortaría el tiempo de espera en el cual la
enfermedad se encuentra sin tratar, decrecería el
riesgo de efectos secundarios debido a toxicidad,
y reduciría los costes asociados al tratamiento del
paciente. Para aquellos pacientes tratados
mediante protocolos, como es el caso de
pacientes oncológicos, la farmacogenómica
permitiría la identificación de pacientes que no
van a responder a los tratamientos
convencionales40.
Los ensayos de eficacia mediante farmacogenómica
identifican pacientes con menor probabilidad de
éxito frente a un fármaco, es decir, aquellos
pacientes que no van a mostrar ninguna respuesta
significativa frente al tratamiento, debido a que no
metabolizan correctamente el fármaco, o a que
poseen una combinación inusual de genes de
susceptibilidad. Un fármaco típico provoca una
respuesta inadecuada en alrededor de un tercio de
los pacientes, aunque algunas veces este porcentaje
es mucho mayor. Un claro ejemplo es la tacrina
(CognexTM), primer medicamento frente al
Alzheimer, ineficaz en un 50% de los pacientes. Esta
variabilidad en la respuesta es debida en este caso a
diferentes polimorfismos del gen ApoE, por lo que
sería predecible mediante un test
farmacogenómico41.
40 Johson J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics,Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
41 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
Para que un test farmacogenómico tenga utilidad clínica ha de existir suficiente evidencia de que lainformación genética tiene el valor clínico necesario, lo que no ocurre en la mayoría de los casos. Estoresulta esencial en el caso de los ensayos de eficacia mediante técnicas farmacogenómicas, en los cuales lasustitución de una base nucleotídica por otra en la secuencia de ADN (mutación), y la contribución relativade la enzima codificada por dicha secuencia al metabolismo del fármaco determinan el valor clínico delpolimorfismo.
26
Factores a tener en cuenta en los ensayos de eficacia mediante farmacogenómica:
• Tipo de mutación: los polimorfismos que afectan a los genes que codifican enzimasmetabolizadoras pueden ser ocasionados por mutaciones que aumenten o disminuyan la actividadde la enzima, dando lugar por tanto a diferentes efectos en la respuesta al fármaco. (Ejemplos:genes TPMT, CYP2D6 y CYP2C19).
• Contribución relativa de la enzima a la acción del fármaco: en muchas ocasiones los polimorfismos enenzimas metabolizadoras de fámacos tienen poco efecto sobre el modo de acción del fármaco. Estoes debido a que existen otras enzimas que contribuyen con su acción en una proporción mayor.
Los polimorfismos genéticos en las enzimasmetabolizadoras de fármacos dan lugar a tressubgrupos distintos con característicascuantificables en cuanto a su habilidad parametabolizar fármacos en metabolitos activos oinactivos. Los metabolizadores extensivos(extensive metabolizer, EMs) son aquellosindividuos capaces de metabolizar fármacoseficientemente, los metabolizadores lentos (poormetabolizers, PMs) poseen deficiencias en elmetabolismo, generalmente como consecuenciade una mutación o deleción de ambos alelos deun gen, y los metabolizadores rápidos (ultra rapidmetabolizers, UMs) poseen una amplificacióngenética que tiene como consecuencia unasobreexpresión del gen. En estos últimos unadosis de fármacos puede ocasionar unasobredosis, mientras que en los metabolizadoreslentos podría ocasionar reacciones adversas,toxicidad o pérdida de eficacia42. Los ejemplosmás frecuentes de mutaciones de enzimasresponsables del metabolismo de fármacos seencuentran en las enzimas CYP2D6 (cuyasvariantes están presentes en el 7-10% de loscaucasianos y el 1-2% de asiáticos, y esresponsable del metabolismo de analgésicoscomunes, antidepresivos, antipsicóticos ytratamientos cardiovasculares), la enzimaCYP2C19 (en el 2-5% de los caucasianos y el 18-23% de asiáticos) y la enzima CYP3A4(responsable del metabolismo de alrededor del55% de los fármacos que se comercializan
actualmente, que sin embargo no presenta unaelevada variación genética43).
Por otra parte, el efecto farmacológico de losfármacos se encuentra regulado por medio demúltiples proteínas y cascadas de señalización. Lavariabilidad en la secuencia de alguna de ellaspuede contribuir a variar la respuesta de unfármaco. Por otra parte, las proteínasrelacionadas con la fisiología o patofisiología delsistema, aunque no directamente en la cascadade señalización, puede provocar la variabilidad dela respuesta del fármaco44.
Uno de los ejemplos característicos de losensayos de eficacia mediante técnicasfarmacogenómicas es el relativo a los tests degenotipado de resistencia al VIH. Estos tests sonde gran utilidad a la hora de adecuar eltratamiento antirretroviral de los pacientes enfunción de la efectividad que demuestran entratamientos a largo plazo. El método degenotipado en este caso consiste en lasecuenciación directa de fragmentos variables delgenoma del VIH, debido a que este virus sufregran número de mutaciones responsables de laresistencia a los fármacos antirretrovirales.Existen dos tests disponibles comercialmente queemplean esta estrategia y que cada vez seutilizan con más frecuencia, el test ViroSeq™ HIV-1 desarrollado conjuntamente por CeleraDiagnostics y Applied Biosystems45, y el test degenotipado TRUGENE™ de Bayer Healthcare46.
42/43 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomic: applications in pharmaceutical R&D. DDT Vol. 6, No. 4. February, 180-185.44 Johson J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics
Vol.19 No.11 November, 660-666.45 ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System (http://www.celeradiagnostics.com/cdx/ViroSeq).46 Trugene genotyping test (http://www.trugene.com).
4.2.3. Identificación de nuevospacientes
Estos ensayos identifican pacientes queaparentemente no son adecuados para sertratados con el fármaco, pero que potencialmentepodrían responder a él mediante un reajuste de ladosificación o de la formulación. Estasmodificaciones reducirían los efectos secundariosy en ocasiones podrían mejorar la eficacia.
Un ejemplo es la Ciclofosfamida, agente
quimioterapéutico que sólo funciona cuando es
metabolizado por las enzimas CYP3A4 y CYP3A5.
Se ha demostrado que algunos pacientes poseen
una variación genética que suprime la actividad
de las enzimas y por tanto merma la cantidad del
fármaco circulante en sangre. La identificación de
estos pacientes antes del comienzo del
tratamiento posibilitaría la prescripción de una
dosificación adecuada a sus necesidades47.
27
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Identificación de nuevos pacientes como potenciales ususarios de fármacos ya existentes:
• Expanden las capacidades de mercado al identificar nuevos pacientes potenciales.
• Se ha de evaluar la conveniencia de este tipo de ensayos siempre y cuando los beneficioseconómicos que aporten superen a los costes de los ensayos.
Recientemente la FDA ha aprobado el empleo de varios kits farmacogenómicos conjuntamente con laadministración de fármacos dirigidos a subpoblaciones determinadas. En concreto, el kit HER2 FISHpharmDx™ desarrollado por la compañía DakoCytomation48 resulta eficaz para la identificación de pacientessusceptibles de desarrollar una respuesta eficaz mediante la administración de Erbitux™ (cetuximab)49, unfármaco empleado frente al cáncer de colon.
47 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceutical industry.The Boston Consulting Group, Inc.
48 HER2 FISH pharmDx™ (http://www.dakocytomation.com/prod productrelatedinformation?url=her2 fish pharmdx info center).49 Erbitux™ (cetuximab) (http://www.imclone.com/index start.php).
_ _ _ _ __
Fármaco Proteína/gen Asociación genética
Tiopurinas
Fármacoscardiovasculares,antidepresivos,antipsicóticos, codeína
Warfarina
Omeprazol
5-FU
Irinotecan
6-Mercaptopurina (6MP)
ABT-761
Pravastatina
Clozapina
TPMT
CYP2D6
CYP2C9
CYP2C19
Dihidropirimidinadeshidrogenasa
UGT 1A1
Tiopurina metiltransferasa(TPMT)
5-LO
Colesteril estertransferasa (CETP)
Estromelisina 1
Receptor de serotonina(5HT2A)
Toxicidad hematológica
Aumento del efecto del fármaco y de la toxicidad
Disminución del efecto del fármaco, mayor riesgode sangrado, menor dosis requerida
Disminución del efecto del fármaco en eltratamiento de úlceras
Toxicidad severa del 5-FU
Toxicidad en el tratamiento del cáncer de colon
Toxicidad en el tratamiento de leucemia
Eficacia del fármaco en el tratamiento del asma
Eficacia del fármaco en el tratamiento de laaterosclerosis coronaria
Velocidad de la restenosis en la aterosclerosis coronaria
Consecuencias a largo plazo derivadas deltratamiento de la esquizofrenia con el fármaco
EJEMPLOS MÁS FRECUENTES DE ALELOS RELACIONADOS CON RESPUESTA A FÁRMACOS
(Continúa en página siguiente)
28
Fármaco Proteína/gen Asociación genética
Fluvoxamina
Acetilcolina
Claritromicina
Hidroclotiazida
Isoniazida
Insulina
Numerosos,anticonvulsivos,inhibidores de laproteasa, digoxina
Transportador deserotonina (5HTT)
Receptor nicotínico α-7(CHRNA7)
Canal de potasio (MiRP1)
α-Aducina
N-acetiltransferasa 2
Receptor activado porproliferador delperoxisoma (PPARγ2)
ABCB1
Eficacia del fármaco en el tratamiento de ladepresión psicótica
Afinidad de la acetilcolina y otros agonistas
Inducción del síndrome QT largo
Eficacia del fármaco en el tratamiento de lahipertensión
Aumento del riesgo de neuropatía y hepatotoxicidaden el tratamiento de la tuberculosis
Variación a la sensibilidad hacia la insulina
Diferencias en la concentración del fármaco enplasma y su eficacia
β bloqueantes ADRB1 Disminución de la presión sanguínea mediante β bloqueantes
β agonistas ADRB2 Broncodilatación y respuesta cardiovascularhacia β agonistas
Antipsicóticos DRD3 Eficacia antipsicótica diversa, inducción de discinesiatardía, acatisia inducida por psicofármacos
Diuréticos ADD1 Respuesta antihipertensiva variable, diferenciasen el grado de reducción de riesgo de infarto demiocardio y trombosis
Diuréticos,antidepresivos
GNB3 Eficacia del fármaco variable
Tacrina, estatinas APOE Eficacia del fármaco variable en tratamientofrente a Alzheimer
Estrógenos,anticonceptivos orales
Protrombina y Factor 5 Aumento del riesgo de tromboembolismo venoso
Levodopa ADRD5, Parkina Eficacia del fármaco variable en tratamientofrente al Parkinson
Aspirina, Inhibidores deglicoproteína IIb/IIAa
ITGB3 Eficacia del fármaco variable en tratamientoantiplaquetario
Abacavir HLA Riesgo de reacción e hipersensibilidad
Carmustina MGMT Aumento de la respuesta del glioma a la carmustina
Inhibidores de la ACE ACE (Enzima convertidorade la angiotensina)
Toxicidad en tratamientos de enfermedadesrenales
Antihipertensivos AGT (angiotensinógeno) Eficacia del fármaco variable en tratamientoantihipertensivo
Metotrexato MTHFR (5,10-metilentetrahidrofolatoreductasa)
Toxicidad en el tratamiento con metotrexato
Metilfenidato Receptor de laserotonina (SLC6A4)
Eficacia del fármaco en el tratamiento deltrastorno de déficit de atención porhiperactividad
EJEMPLOS MÁS FRECUENTES DE ALELOS RELACIONADOS CON RESPUESTAA FÁRMACOS (continuación)
Tabla 3. Ejemplos más frecuentes de alelos relacionados con respuestas a fármacos, toxicidad y farmacocinética (Fuente: Johnson, A. (2003) Pharmacogenetics:potential for individualized drug therapy through genetics. TRENDS in Genetics Vol.19 No.11 November, 660-666; Destenaves, B, Thomas, F. (2000) Newadvances in pharmacogenomics, Curr. Op. in Chem. Biol. 4, 440-444; Johnson, J.A. et al (2002) Molecular diagnosis as a predictive tool: genetics of drug efficacyand toxicicty. TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 8, N. 6, 300-305; Goldstein, D.B., et al (2003) Pharmacogenetics goes genomic. Nature reviews vol.4, 937-947). Acrónimos: ABCB1, P-glycoprotein; ADD1, a-adducin; ADRB1, b1 -adrenoceptor; ADRB2, b2 -adrenoceptor; APOE, apolipoprotein E; CYP2D6,cytochrome P450 2D6; CYP2C9, cytochrome P450 P2C9; DRD3, dopamine receptor D3; F5, Factor V; GNB3, G-protein b3; TPMT, thiopurine S-methyltransferase.
29
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
4.3. Descubrimiento y desarrollo de nuevosfármacos
Una vez que se han identificado las causas que
provocan la variación de la respuesta a un
determinado fármaco, es posible identificar otras
proteínas que interaccionen con parte de esa ruta
metabólica, y que puedan ser por tanto
empleadas como nuevas dianas. Por este motivo,
la farmacogenómica no sólo permite la predicción
individual de la eficacia y toxicidad de fármacos,
sino también el desarrollo de nuevos fármacos
más eficaces y seguros50.
El descubrimiento de fármacos ha sido
tradicionalmente un proceso lineal, en el cual no
tenía lugar retroalimentación por parte de etapas
posteriores del proceso. Sin embargo, los avances
en genómica y proteómica han modificado el
escenario en el cual se desarrollan los ensayos
clínicos. De esta forma, técnicas como el
genotipado de SNPs de alta resolución ofrecen la
posibilidad no sólo de reducir y optimizar los
resultados de cada una de las fases clínicas, sino
que permiten la retroalimentación en etapas
tempranas del proceso. El primer fármaco
candidato desarrollado mediante estrategias
genómicas surgió de la colaboración entre
Millenium Pharmaceuticals y Bayer en el campo
de la terapia anticancerígena, comenzando la fase
I de los ensayos clínicos en el año 200151. A partir
de entonces, el número de fármacos candidatos
identificados mediante tecnologías genómicas y
proteómicas ha ido en aumento,
fundamentalmente gracias a la disponibilidad de
plataformas de genómicas de alto rendimiento.
50 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics, Curr. Op. in Chem. Biol. 4, 440-444.51 Bayer: Investor Relations, Stockholders' Newsletter 2001, Focus
(http://www.bayer.com/aktionaersbrief1q2001/im blickpunkt en.html)
Descubrimiento de fármacosFase Preclínica
• Identificación de dianasmoleculares: nuevas oportunidades deinvestigación en el descubrimiento defármacos.
• Validación de dianas: acumulación deinformación que relacione la diana con laenfermedad y demuestre su validezcomo candidata a la siguiente etapa.
• Identificación de fármacoscandidatos: moléculas y compuestosque posean cierta actividadfarmacológica.
• Optimización de fármacoscandidatos: elección de los fármacoscon actividad más adecuada ymodificación de los mismos paraconseguir un fármaco candidato.
Desarrollo de fármacosFase I-IVEnsayos clínicos llevados a cabo en humanos para evaluar la seguridad,impacto en el estado patológico, dosificación óptima y estudioscomparativos con otros medicamentos.
Fase I: test de seguridad en un grupo de 20 a 100individuos sanos.
Fase II: test de seguridad e impacto en el estado patológico sobre varios cientosde pacientes.
Fase III: test de seguridad,impacto, dosificación y estudioscomparativos sobre varioscientos de pacientes
Estudios post-marketingFase IV
• Vigilancia de reaccionessecundarias.
• Monitorización devariaciones en el producto.
• Encuestas y pruebas.
• Recogida de muestras.
• Revisión de la informaciónmédica y etiquetado.Datos sobre ventas ymarketing.Nuevo Fármaco de Investigación
(Investigational New Drug, IND)
Nueva Aplicación de Fármaco (New Drug Approval, NDA)
Análisis preclínicos deeficacia y efectossecundarios a corto plazo
Continuación de análisis preclínicos sobre efectossecundarios a largo plazo (se solapa con estudios clínicosde Fase I-III)
Fig. 12. Esquema resumen del proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos.Fuente: Global Pharmaceutical Research & Development, Discovery & development overview,http://abbott.com/gprd/GPRD DiscDevProc DiscDevOverview.html.
_ _
_ _
La estrategia de las compañías farmacéuticas y
biotecnológicas para el descubrimiento y validación
de polimorfismos relevantes consiste en la
construcción de bancos de ADN a partir de
ensayos clínicos a gran escala en los cuales se
clasifica a los pacientes en función de su etnia,
características patológicas y respuesta a fármacos.
Mediante el estudio retrospectivo de estos bancos de
ADN se pretende identificar y validar polimorfismos
relevantes mediante el empleo de técnicas de
secuenciación y genotipado de alta resolución, en
conjunción con la información presente en bases de
datos públicas, comerciales y privadas, y
herramientas bioinformáticas. Una vez que se han
identificado y caracterizado en términos de
expresión, funcionalidad y frecuencia, debe
establecerse una serie de estudios de asociación de
los polimorfismos con la progresión de la
enfermedad y efecto de fármacos, con el objetivo de
confirmar su potencial comercial. Estos marcadores
validados serán potencialmente útiles en la
aceleración del proceso de identificación de
compuestos candidatos, elección de pacientes
durante los ensayos clínicos, y desarrollo de técnicas
de diagnóstico molecular.
Las aplicaciones clínicas de la farmacogenómica se
producen actualmente en las etapas más tempranas
del desarrollo clínico de un fármaco, es decir en la
etapa inicial de la fase I, en la cual es posible
realizar estudios prospectivos con el objetivo de
enrolar sujetos con genotipos particulares, que sean
capaces de predecir la capacidad metabólica de un
individuo. Esta aplicación se denomina perfil
farmacogenómico (“pharmacogenomic profiling”),
y puede ser empleada para estratificar los ensayos
basados en pacientes que son más susceptibles de
beneficiarse de esta terapia.
Sin embargo, la principal oportunidad de la
utilización de técnicas de genotipado durante las
etapas de descubrimiento y desarrollo de un
fármaco se produce durante las fases II y III, en
las cuales se toman decisiones económicas
cruciales. En la fase II se realizaría un genotipado
de los pacientes que forman parte de los ensayos
clínicos con el fin de identificar los polimorfismos
genéticos que se encuentren asociados a
respuestas favorables a fármacos, así como riesgo
de toxicidad52. Los fármacos en fase II que fallan
debido a problemas de toxicidad o falta de
eficacia, podrían ser rediseñados usando
marcadores farmacogenómicos. Posteriormente, la
realización de ensayos de genotipado durante la
fase III posibilitaría la identificación de aquellos
pacientes que responden (“respondedores”) y que
no responden (“no respondedores”) a los fármacos
mediante marcadores farmacodinámicos. Algunos
medicamentos que han mostrado problemas de
eficacia en ensayos con grandes poblaciones, han
probado ser eficaces y seguros para grupos más
pequeños, por lo que sería posible identificar los
segmentos de la población que se beneficiarían
potencialmente de este fármaco53. Un ejemplo
reciente consiste en un medicamento denominado
BiDil®54, que ha demostrado su eficacia en
pacientes afectados por problemas coronarios de
raza negra55. Aunque la ausencia de eficacia en
pacientes de raza blanca impidió en un principio
su autorización por parte de la FDA, los estudios
farmacogenómicos apuntan a que este fármaco
será el primero dirigido exclusivamente a
pacientes de un grupo de población concreto, y se
espera su autorización por parte de la FDA a
finales del año 200456.
30
52 Johnson, J. A.; Evans, W. E. (2002). Molecular diagnostics as a predictive tool: genetics of drug efficacy and toxicity.TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 8, No. 6, June, 300-305.
53 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomics: applications in pharmaceutical R&D. DDT, Vol. 6, No. 4, February, 180-185.54 NitroMed®, BiDil® (http://www.nitromed.com/BiDil.shtml).55 Taylor A. L.; et al. (2004). Combination of Isosorbide Dinitrate and Hydralazine in Blacks with Heart Failure. N. Engl. J.
Med. 351:2049-2057, Nov. 11.56 Elmundosalud.com (http://elmundosalud.elmundo.es/elmundosalud/2004/11/12/corazon/1100285072.html).
No obstante, el empleo de marcadoresfarmacogenómicos debe además integrarse enetapas tempranas del proceso de identificación ydesarrollo de nuevos fármacos. Esta anticipaciónaportaría por un lado grandes beneficios a la horade incluir estos marcadores en fases posteriores delos ensayos clínicos, ahorrando por tanto tiempo yesfuerzo que podría proporcionar informaciónrelevante antes de que el ensayo se encuentre enestado avanzado. Por otra parte, los polimorfismostipo SNP no sólo servirían como marcadores
farmacogenómicos, sino también son de gran valoren etapas tempranas de validación de dianas en lascuales se precisa determinar la correlación entrelas variantes genéticas identificadas y el procesopatológico. La aplicación temprana de lafarmacogenómica durante las etapas preclínicas espor tanto esencial y permitiría redefinir enocasiones el ensayo, así como identificar nuevasdianas terapéuticas y grupos de poblaciónpotencialmente beneficiarios de estos nuevosagentes terapéuticos58.
31
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Aplicación de las técnicas de genotipado durante el proceso de desarrollo de un nuevosfármacos57:
• Desarrollo preclínico: selección de mejores fármacos candidatos por medio de la determinacióntemprana de genes candidatos altamente influenciados por polimorfismos genéticos.
• Ensayos clínicos fase I: estratificación de pacientes basándose en la susceptibilidad a desarrollardistintas respuestas frente a la administración de un fármaco candidato.
• Ensayos clínicos fase II y III: determinación de la influencia de los polimorfismos en la eficacia delos fármacos. Nueva estratificación de pacientes.
57 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics, Curr. Op. in Chem. Biol. 4, 440-444.58 Meyer, J. M.; Ginsburg, G. S. (2002). The path to personalized medicine. Current Opinion in Chemical Biology, 6:434–438.
Fase II
Fase I
Fase III Proceso de aprobación
Fase IV
Nuevos genescandidatos
Toxicologíaanimal
Toxicologíahumanamolecular
Modelosanimales
Fármacocandidato
Validación dedianas
Marcadores farmacogenómicos
Fig. 13. Empleo de la farmacogenómica en el proceso de identificación y desarrollo de nuevos fármacos.Fuente: Meyer, J. M.; Ginsburg, G. S. (2002). The path to personalized medicine. Current Opinion in Chemical Biology, 6:434–438.
Hasta la fecha, las barreras que limitaban el uso
potencial de técnicas de genotipado durante los
ensayos preclínicos y clínicos eran
fundamentalmente el elevado número de SNPs y
de sujetos a evaluar para lograr unos resultados
consistentes. Por otro lado, el alto coste de los
métodos de genotipado de gran resolución
probablemente ha desfavorecido el empleo de
análisis basados en el estudio completo del
genoma, en detrimento de métodos menos
inclusivos como las estrategias basadas en genes
candidatos59.
En los últimos años, la disponibilidad de
herramientas bioinformáticas más sofisticadas, el
acceso a grupos de poblaciones apropiadas y la
disminución en el coste total del genotipado de
polimorfismos de una sola base (hasta 1 céntimo
de dólar por SNP), ha modificado el escenario
sustancialmente. Sin embargo, aunque los
modelos económicos sugieren que existen
beneficios derivados del uso de las técnicas de
genotipado de alto rendimiendo, la mayoría de las
compañías farmacéuticas se muestran reticentes
a la hora de aplicar esta estrategia. Uno de los
motivos principales de esta reticencia es debido a
la preocupación acerca de la postura de la FDA
frente a las nuevas aplicaciones de fármacos
(NDA, New Drug Applications) que incluyen
estrategias farmacogenómicas60. No obstante, las
últimas iniciativas de la FDA sugieren que esta
situación de incertidumbre será en breve
sustituida por una regulación en la que el perfil
farmacogenómico sea considerado imprescindible
para completar el proceso de aprobación de un
nuevo fármaco. Esto es debido a que las ventajas
que aporta la farmacogenómica durante el
proceso de identificación y descubrimiento de
fármacos son cada vez más necesarias para
satisfacer unas necesidades que actualmente
frenan el desarrollo de nuevas entidades
terapéuticas.
32
59 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomic: applications in pharmaceutical R&D. DDT Vol. 6, No. 4 February, 180-185.60 Johnson, J. A.; Evans, W. E. (2002). Molecular diagnostics as a predictive tool: genetics of drug efficacy and toxicity.
TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 8, No. 6, June, 300-305.61 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomic: applications in pharmaceutical R&D. DDT, Vol. 6, No. 4, February, 180-185.
Beneficios derivados de la utilización de técnicas de genotipado durante los ensayos clínicos61:
• Reducción del tiempo necesario para desarrollar un fármaco y demostrar su eficacia en poblacionesespecíficas.
• Optimización de la utilidad clínica demostrando la relación entre subtipos y eficacia.
• Reducción del tiempo necesario para llevar al mercado el fármaco demostrando su especificidad enuna población determinada.
• Caracterización de la respuesta e identificación de grupos de riesgo.
• Aumento de la reinversión mediante la diferenciación entre poblaciones que responden y que noresponden al fármaco.
Por otra parte, la identificación de marcadoresgenéticos polimórficos durante la fase clínica dedesarrollo de un nuevo fármaco ofrece una nuevaventaja competitiva a las empresasbiotecnológicas y farmacéuticas. Un ejemploclásico que ilustra esta tendencia es el desarrollode un test farmacogenómico para lospolimorfismos de la proteína HER2, ligados a lapresencia de determinadas variantes de cáncer demama presentes en un 30% de la poblaciónafectada. La empresa Genentech62 desarrolló laHerceptina, un fármaco dirigido cuya
administración requiere de la realización de untest previo que aunque no es esencialmente untest farmacogenómico, muestra el potencial queeste tipo de test podría ejercer a la hora de lanzarun nuevo fármaco al mercado con un valorañadido63. Adicionalmente, Genentech fue capazde llevar a cabo la fase III de los ensayos clínicosde su fármaco con éxito, mediante laidentificación de pacientes con perfilesfarmacogenómicos que se correspondían a lossectores de la población a los que finalmentedirigió su nuevo fármaco.
33
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Ejemplo de caso práctico en el que se emplean técnicas farmacogenómicas durante la faseclínica de desarrollo de un fármaco
Supongamos que está en desarrollo una nueva molécula. En los ensayos en fase II realizados en1.000 pacientes sólo ha podido demostrarse eficacia en un 30% de los pacientes, sin que se conozcaun marcador de respuesta terapéutica (cosa que ocurre con frecuencia en la práctica). En estasituación es previsible que el ensayo en fase III frente a placebo necesite de un elevado número depacientes, ya que un 70% de ellos no van a responder al tratamiento. Pero si a través de un perfilde SNPs, realizado en los 1.000 pacientes de la fase II, fuéramos capaces de predecir cuáles son lospacientes que van a responder, en el reclutamiento de pacientes para la fase III sólo incluiríamosaquellos con el perfil farmacogénómico adecuado. De esta forma, el estudio en fase III requeriríamenos pacientes, sería más rápido y, por supuesto, más económico. Por otra parte, no sería éticoincluir en el estudio a aquellos pacientes con un perfil farmacogenómico que nos indica una bajaprobabilidad de obtener respuesta terapéutica, ya que los estaríamos exponiendo a la posibilidad depadecer los potenciales efectos adversos del medicamento en desarrollo64.
Si el resultado de este estudio en fase III fuese positivo, sería posible que las autoridadesreguladoras diesen una autorización provisional sólo para aquellos pacientes con un perfilrespondedor. Una vez que el fármaco se hubiese comercializado, sería posible tomar muestrassanguíneas de los pacientes que han tomado el medicamento e intentar de nuevo establecer unperfil de SNPs que prediga la aparición de efectos adversos. Esto se haría, lógicamente, comparandoel perfil de los pacientes que sufrieran un efecto adverso con los que no lo hubieran sufrido. Dadoslos graves problemas metodológicos a los que se enfrenta hoy en día la farmacovigilancia, estosupondría un avance fundamental para detectar precozmente la aparición de efectos adversos65.
62 Genentech (http://www.gene.com/gene/index.jsp).63 Kirkwood, S. C.; Hockett, R. D Jr. (2002). Pharmacogenomic biomarkers. Dis Markers.18(2):63-71.64/65 García Alonso, Fernando. Siglo XXI: desafíos científicos y sociales. Capítulo 3: Farmacología Y Genética. Pág. 37-43.
El análisis de SNPs se engloba en dos categorías diferentes, aquellas que permiten el descubrimiento deSNPs, y las que se emplean para el detección de SNPs. Las técnicas genómicas que permiten laidentificación de SNPs son en general semejantes que las que se emplean para realizar la identificación delos polimorfismos. Sin embargo, las estrategias a seguir varían en función del ensayo y el conocimientoprevio acerca de la base genética de la patología de interés. Ambas aproximaciones se engloban dentro delgenotipado de SNPs, por lo que para los propósitos del presente informe se considerará como genotipadode SNPs a todas aquellas técnicas que permitan el descubrimiento, identificación y detección de SNPs.
34
5. Estrategias de descubrimiento e identificación de SNPs
Descubrimiento e identificación de SNPs Detección de SNPs
Identificación de posibles polimorfismoscaracterísticos de un fenotipo determinado.
• Diagnóstico predictivo.
• Farmacogenética y farmacogenómica.
• Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos.
GENOTIPADO DE POLIMORFISMOS (SNPs)
Fig. 14. Aplicaciones del genotipado de SNPs.Fuente: Twyman RM, Primrose SB (2003) Techniques patents for SNP genotyping. Pharmacogenomics. Jan;4(1):67-79.
Las tres aplicaciones principales del genotipado de
SNPs que se han mencionado anteriormente
pueden plantearse por medio de dos estrategias
diferenciadas: la llamada estrategia del gen
candidato y la elaboración de mapas de
ligamiento a partir de genoma completo.
La aproximación del gen candidato requiere del
conocimiento previo de la acción farmacológica del
fármaco, así como la patogénesis de la enfermedad
para poder identificar los genes relevantes. La
identificación de los genes candidatos es la primera
etapa que sigue esta estrategia, y se consigue por
medio de fuentes variadas tales como la literatura
científica, herramientas bioinformáticas, o incluso
técnicas de análisis de expresión génica como
pueden ser los microarrays de ADN. Posteriormente,
se realiza el genotipado de SNPs de la región del
genoma que contiene estos genes candidatos con el
objetivo de poder identificar polimorfismos relevantes
para las patologías estudiadas. Esta estrategia tiene
la ventaja de ir dirigida específicamente a las zonas
de interés en el genoma. No obstante, su prinicpal
limitación consiste en que los SNPs que se
encuentran en regiones del genoma fuera de los
genes quedan excluidos al no tenerse en cuenta
desde la primera etapa.
La segunda estrategia consiste en el análisis del
genoma completo mediante mapas de genéticos,
los cuales no precisan de un conocimiento previo
acerca del papel que juegan los distintos genes
asociados con las patologías estudiadas. Este tipo de
estudios requieren datos procedentes de grandes
poblaciones de individuos, así como el genotipado
de cientos de miles de SNPs para conseguir
resultados relevantes. La identificación de SNPs
relacionados con genes de interés se realiza por
medio de estudios de asociación genética, más
apropiados para el análisis genético de
enfermedades complejas en las que están
implicados múltiples genes. Esta técnica consiste en
la medición del Desequilibrio de Ligamiento (DL)
entre un marcador y una enfermedad determinada,
mediante el análisis de una población de individuos
afectados e individuos de control. Se considera que
existe DL en una región cromosómica cuando se
observan grupos de marcadores genéticos o
haplotipos que tienden a transmitirse conjuntamente
a la siguiente generación. Esta estrategia permite
refinar la localización de un gen y ofrece una mayor
eficacia cuando se aplica en enfermedades
complejas. No se debe confundir el DL con los
análisis de ligamiento, que no proporcionan datos
relativos a la distancia entre genes66.
66 Análisis de ligamiento: Técnica que emplea principalmente datos familiares para analizar la transmisión de la informacióngenética entre generaciones. La información procedente de estos estudios permite determinar si un marcador está ligado a ungen involucrado en una enfermedad en particular. Esta estrategia se ha convertido en una aproximación exitosa debido a laposibilidad de genotipar un vasto número de individuos, permitiendo así la identificación de posibles genes relacionados condiversas patologías. No obstante, este tipo de análisis no tiene la capacidad de proporcionar la distancia genética, útil a la horade afinar la posición de genes en la elaboración de mapas genéticos.
La principal limitación de esta estrategia consiste en que debido a que la fuerza del equilibrio de ligamientodisminuye con la distancia entre marcadores genéticos, es necesario genotipar cientos de miles de individuospara obtener un gran número de SNPs que avalen la asociación genética. Los estudios de asociación a granescala tan solo serán económicamente posibles si se consigue un alto rendimiento mediante métodos queconsuman pequeñas cantidades de reactivos y ADN. Las tecnologías de alto rendimiento buscan laminiaturización e integración mediante la robótica, microfluídica y microarrays. La combinación de lafarmacogenómica con nuevas tecnologías como la proteómica y estudios de expresión génica permitirían laintegración de los datos genómicos con información sobre ARN mensajero y expresión de proteínas.
35
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Selección de genes candidatos
Genes que codifican enzimas conocidasrelacionadas con el metabolismo de fármacos,transportadores, dianas y genes patogénicos.
Mapas de ligamiento del genoma
SNPs próximos en el espacio que se heredan engrupo junto con genes de predisposición a sufrirdeterminadas enfermedades y respuesta afármacos.
Identificación de SNPs en zonas cercanas a genes candidatos.
Identificación de alelos potenciales en distintas poblaciones.
Estudios de asociación genética
• Identificación de la población afectada
• Genotipado de SNPs de alto rendimiento
• Análisis estadístico y modelización de datos
Identificación de SNPs en zonas quepresentan desequilibrio de ligamiento.
Identificación de genes en bloques de SNPs.
DESCUBRIMIENTO DE POLIMORFISMOS (SNPs)
DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS (SNPs)
Fig. 15. Esquema del proceso de descubrimiento e identificación de SNPs mediante estrategias de genes candidatos yanálisis de ligamiento del genoma completo.Fuente: Adaptado de: Ring, HZ; Kroetz, DL (2002) Candidate gene approach for pharmacogenetic studies.Pharmacogenomics 3(1),47-56.
Dentro de los estudios de asociación genética,cada variante génica puede analizarse de maneradirecta o indirecta. En el primer tipo, se estudiacada variante de manera aislada con el fin dedescubrir su implicación en la enfermedad. Elestudio indirecto consiste en el análisis de clusterso bloques de variantes génicas próximas en elgenoma denominados haplotipos67, y en labúsqueda de posibles variantes culpables de laenfermedad. Ya que la mayoría de las variantesgenéticas forman clusters o haplotipos, es posible
identificar aquellos polimorfismos que esténrelacionados con la enfermedad usando unnúmero reducido de SNPs68. Esta últimaestrategia es la que se emplea en el proyectointernacional HapMap, iniciado en el año 2002con el objetivo de caracterizar patrones dedesequilibrio de ligamiento y haplotipos a lo largodel genoma humano, así como para identificarsubgrupos de SNPs que capturen la mayoría de lainformación acerca de estos patrones y permitirestudios de asociación genética a gran escala69.
67 Haplotipos: variantes genéticas que se observan en una región cercana, ligada a un gen o alelo concreto del mismo cromosoma.68 Tollman, P.; et al. (2001). A Revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceutical
industry. BCG Report. The Boston Consulting Group, Inc.69 Collins, F. S. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature, Vol. 422, 24 April.
Este proyecto, cuya duración prevista es de tresaños y cuenta con un presupuesto inicial de 100millones de dólares, es el mayor esfuerzo engenómica desde que finalizó el proyecto GenomaHumano. Este proyecto proporcionará el enlaceentre la secuencia del genoma y la forma en lacual el genoma influye en el riesgo a sufrirdeterminadas enfermedades70.
Los estudios de asociación genética son complejosy los resultados estadísticos dependen de un grannúmero de factores como la frecuencia delcarácter (por ejemplo, la toxicidad severa no esuna característica común), la frecuencia del alelodentro de la población estudiada, el número degenes que contribuyen, el riesgo relativo asociadocon el alelo deletéreo y la densidad demarcadores usados71. Por otro lado, para obtenerdatos de asociación genética estadísticamenterelevantes es necesario realizar el análisis de almenos 500.000 SNPs. De esta forma, en unexperimento tipo en el que participen 1.000individuos, se llegan a analizar más de 500millones de SNPs, lo que significa que si en seismeses el proyecto se ha completado, la capacidad
de genotipado necesaria ha supuesto una mediade 2.800 ensayos al día. La necesidad de poneren marcha proyectos de este tamaño ha sido unincentivo para el desarrollo de plataformas degenotipado a gran escala en las cuales grandesempresas farmacéuticas y consorcios públicos handemostrado su interés72.
Los SNPs que se encuentran próximos en elespacio se heredan en grupo junto con genes depredisposición a sufrir determinadasenfermedades. Identificando estos SNPs esposible por tanto localizar estos genes depredisposición así como las proteínas quecodifican, que podrían a su vez convertirse endianas terapéuticas frente a estas patologías73.
Algunas compañías privadas como Celera,Curagen y Genset, están desarrollando mapas dealta densidad de SNPs que planean usar enestudios de asociación genética. El valor de losSNPs depende de su localización precisa en elgenoma y de su frecuencia, ya que una frecuenciade alelos menor al 10-20% posee un valorlimitado en los estudios de asociación.
36
70 Dennis C. (2003). The rough guide to the genome. Nature. Apr 1;428(6982):467.71 Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). New advances in pharmacogenomics, Curr. Op. in Chem. Biol. 4, 440-444.72 Twyman, R. M.; Primrose, S. B. (2003). Techniques patents for SNP genotyping. Pharmacogenomics. Jan;4(1):67-79.73 Syvanen, A. C. (2001). Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat. Rev. Genet.
Dec;2(12):930-42.
Las técnicas que permiten el genotipado de SNPs son muy diversas y pueden ser empleadasconjuntamente. Estas técnicas se pueden dividir en aquellas que están relacionadas con la química de lareacción, y las técnicas que permiten la detección de los SNPs.
37
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
6. Técnicas de genotipado de SNPs
74 Tsuchihashi, Z.; Dracopoli, N. C. (2002). Progress in high throughput SNP genotyping. Pharmacogenomics J.;2(2):103-10.75 PCR (reacción en cadena de la polimerasa): técnica que se emplea para obtener un número ilimitado de copias de
cualquier fragmento del ADN, incluso a partir de muestras muy reducidas.
Tecnologías implicadas en el genotipado de SNPs
Amplificación de la muestra:
• PCR.
• Amplificación de ADN por círculo rodante.
• Método Invader®.
Discriminación alélica:
• Hibridación.
• Extensión de cebradores.
• Ligamiento.
• Rotura.
Mecanismos de detección:
• Luminiscencia.
• Fluorescencia.
• Fluorescencia time-resolved.
• Transferencia de energía entre fluorocromos (FRET).
• Fluorescencia por polarización.
• Electricidad.
• Espectrometría de masas.
• Electroforesis capilar.
Formatos de reacción:
• Reacciones homogéneas.
• Reacciones en un soporte sólido.
Las técnicas de genotipado se pueden clasificar en
función de las tecnologías que permiten la
amplificación, identificación y detección de SNPs74.
6.1. Amplificación de SNPs
Debido principalmente a la elevada complejidad
del genoma humano, es imposible el genotipado
directo del genoma, que sí puede realizarse en
organismos con genomas más sencillos como las
levaduras. La gran mayoría de los métodos de
genotipado necesitan de una etapa previa de pre-
amplificación de la región genómica que contiene
los SNPs antes de proceder a la identificación de
los mismos. Esta amplificación se realiza por
medio de la reacción en cadena de la
polimerasa75 (PCR). Esta técnica encarece el
proceso del genotipado, por lo que se han
realizado notables esfuerzos por desarrollar
métodos que eviten el uso de la PCR, como son el
método Invader® y la amplificación de ADN por
círculo rodante.
Sin embargo, estos métodos no son adecuados
para el análisis de SNPs de alto rendimiento
debido a la necesidad de utilizar grandes
cantidades de ADN genómico. Aunque se pudiera
reducir esta cantidad, siempre se necesitaría más
ADN que en los ensayos que emplean pasos
previos de PCR. Por ello, la combinación de estos
ensayos con pasos previos de amplificación serían
métodos adecuados en el genotipado de alto
rendimiento. Esto se ha realizado con éxito para
el ensayo Invader, habiéndose conseguido hasta
300.000-400.000 genotipos por este método.
6.2. Discriminación alélica
Una vez amplificadas las secuencias de ADN, el
siguiente paso consistiría en la identificación de los
SNPs. Algunas de las técnicas que se pueden
emplear son más adecuadas que otras para realizar
ensayos de genotipado de alto rendimiento.
Las técnicas de detección de polimorfismos más
sencillas se basan en la identificación de estas
secuencias polimórficas por medio del análisis de
la estructura de los fragmentos de ADN. De esta
forma, los fragmentos que contengan
polimorfismos asumirán una conformación
espacial que se puede diferenciar mediante
técnicas como la electroforesis o cromatografía
líquida. Aunque este tipo de detección de
polimorfismos es el más frecuente, no es una
aproximación aceptable al genotipado ya que no
es una técnica fiable y es un proceso muy
costoso.
Todo ello llevó a la creación de una serie de
métodos de análisis que permitían la identificación
de secuencias específicas de polimorfismos, en
concreto de SNPs, denominándose en general
técnicas de discriminación alélica. Cada uno de
estos métodos posee sus pros y sus contras, y la
elección del más adecuado dependerá de los
recursos disponibles, la complejidad del
experimento y de los objetivos del mismo.
Todas las técnicas de discriminación alélica
emplean unas sondas78 específicas de alelos o
variantes génicas, que están diseñadas para
unirse con la secuencia diana (hibridar) sólo
cuando se apareen perfectamente79.
38
Métodos de amplificación libres de PCR
Método Invader® :
Basado en la rotura específica de un nucleótido por endonucleasas específicas que reconocenestructuras de ADN no apareadas en forma de brazo, en la presencia de un oligonucleótido invasor(oligo “Invader”). La combinación de esta reacción con una reacción secundaria que usa oligos contransferencia de energía entre fluorocromos (FRET), genera una señal específica de alelos enreacciones homogéneas77 e isotermales. Esta técnica no sólo permite la amplificación del ADN de lamuestra, sino que también se emplea en la discriminación de alelos (ver siguiente punto).
Amplificación por ADN por círculo rodante:
La discriminación de los alelos se realiza por medio de ligamiento específico de oligonucleótidoscomplementarios de la misma forma que ocurre con el ensayo de ligamiento de oligonucleótidos(OLA). La principal diferencia con éste último es que la sonda de ligamiento crea un ADN circular quepuede ser amplificado mediante síntesis circular de ADN por medio de una polimerasa. Esta técnicatiene una alta sensibilidad debido al alto grado de amplificación de la señal por la amplificacióncircular del ADN, y a la especificidad de la discriminación de alelos por la ADN ligasa. Por tanto no esnecesaria la PCR previa.
76
76 Invader® (Third Wave Technologies, Inc.).77 Reacciones homogéneas: “reacciones en un sólo tubo”.78 Sonda: fragmento de material biológico que se emplea en ciertas técnicas de laboratorio para detectar genes o proteínas
y estudiar sus funciones. En este caso se compone de un fragmento de ADN de secuencia conocida, diseñadoespecíficamente para que se una al ADN de la muestra.
79 Kwok, P-Y. (2001). Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235–58.
6.2.1. Hibridación específica de alelo
Un único desparejamiento es suficiente paradesestabilizar la hibridación y prevenir que lasonda alélica se alinee con la secuencia diana.Cuando las sondas alélicas son inmovilizadas enuna superficie sólida, las muestras marcadas deADN son capturadas, y la hibridación esvisualizada por medio del marcaje de las sondas.Sabiendo la localización de las secuencias de las sondas en el soporte sólido, es posibleconocer el genotipo de la muestra de ADN diana.Este es el mecanismo más simple aplicado algenotipado de alto rendimiento ya que noparticipan enzimas.
El principal reto para asegurar una discriminaciónalélica robusta reside en el diseño de la sonda. Latasa de éxito podría aumentar considerablementemediante el empleo de sondas más sofisticadas, yel uso de estrategias para aumentar lahibridación.
6.2.2. Minisecuenciación o extensión de sondas (SBE, Single Base Extension)
Existen numerosas variantes de este métodobasadas en la PCR, método por el cual la enzimaADN polimerasa es capaz de incorporar lasunidades básicas que componen el ADN, losdesoxirribonucleótidos, a la secuencia de un ADNmolde. En el caso de la detección de SNPs, elfragmento de ADN que contiene el SNP sirvecomo molde para la sonda, que se unirá a estefragmento sólo si ambas son complementarias enel sitio polimórfico. Con la ayuda de la ADNpolimerasa, la sonda se irá extendiendo.Monitorizando la extensión de este primer seconsigue identificar el alelo presente en lamuestra de ADN. Esta técnica es la más frecuenteen el genotipado de SNPs y análisis demutaciones puntuales. Varias tecnologías degenotipado emplean la minisecuenciación juntocon otras técnicas de discriminación alélica.
6.2.3. Ligamiento de oligonucleótidosespecíficos de alelo (OLA)
Este método se basa en la unión de una sonda al
fragmento de ADN que contiene el SNP mediante
la ayuda de la ADN ligasa, enzima altamente
específica que participa en el proceso de
reparación de ADN.
Aunque el ligamiento tiene el máximo nivel de
especificidad y es el más fácil de optimizar de
entre todos los mecanismos de discriminación
alélica, es la reacción más lenta y requiere el
número mayor de sondas modificadas. Sin
embargo, mediante la combinación de técnicas de
PCR y OLA se puede amplificar el ADN diana y por
tanto mejorar la señal. Varias plataformas que
actualmente se comercializan emplean esta
estrategia de discriminación alélica.
6.2.4. Rotura invasiva específica de alelo (Invader®)
La técnica Invader® (Third Wave Technologies,
Inc.), emplea dos tipos de sondas
simultáneamente, una sonda denominada
invasora o “invader” y una segunda sonda
complementaria a la anterior tan solo en el lugar
donde se encuentra el polimorfismo. Esta segunda
sonda forma una estructura en forma de brazo
que se encuentra desapareada, y es reconocida
por una enzima específica que rompe la sonda
justo en el sitio donde se localiza el SNP. Un vez
liberado este brazo, tiene lugar una segunda
reacción en la que participa una sonda FRET (ver
más adelante).
6.2.5. Otros métodos de discriminación alélica
Algunos de los primeros métodos de genotipado
de SNPs empleaban una química de reacción
denominada hibridación mediante oligonucleótidos
específicos de alelo (ASO)80. El uso de sondas
39
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
80 Oligonucleótidos específicos de alelo (Allele-Specific Oligonucleotide, ASO).
ASO como sondas de hibridación o sondas de PCR
son la base de los ensayos de genotipado
homogéneos, llamados de esta forma porque no
precisan pasos previos de separación y se
monitorizan mediante PCR en tiempo real. Esta
última técnica permite la monitorización o
medición continua de los productos de reacción
amplificados durante la reacción de PCR.
El análisis de polimorfismos de fragmentos de
restricción (RFLPs81), también supuso una de las
primeras técnicas empleadas para el genotipado
de SNPs. Esta técnica consiste en el empleo de
enzimas endonucleasas que cortan el ADN
previamente amplificado en sitios localizados y
específicos para cada enzima. Cuando existe una
alteración en la secuencia estas enzimas no son
capaces de reconocer los sitios de corte y no se
produce la rotura del ADN. El análisis de RFLPs es
una técnica relativamente sencilla ya que no
necesita de instrumentación compleja, aunque no
es posible su empleo como técnica de genotipado
a gran escala ya que posee una capacidad de
genotipado muy limitada82.
40
81 Polimorfismos de fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs).82 Freimuth, R. R.; et al. (2004). High-throughput genotyping methods for pharmacogenomics studies. Curr.
Pharmacogenomics, 2, 21-33.
Hibridación específica de alelo
Minisecuenciación o "primer extensión"
Ligamiento de oligonucleótidos específicos de alelo (OLA)
Hibridación
Primer hibridado y extendido
Oligos ligadosOligos no ligados
Primer no hibridado ni extendido
Sin hibridación
(Sonda)
(Sonda)
(Fragmento de ADN)
(Sonda)
CC
C
A
A
G
C
CP
PG
C
C
G
G
G
C
G
Figura 16 (continúa en la página siguiente)
6.3. Formatos de reacción
Tal y como se ha señalado en los apartadosanteriores, cada método de genotipado consisteen una serie de reacciones químicas a las quesigue un paso de detección por el cual seidentifican los SNPs. El formato de la reacciónrefleja principalmente los requerimientos de lamodalidad de detección. En general, lasreacciones bioquímicas son más robustas ensolución, pero la captura de los productos dereacción en soportes sólidos permite la detecciónen paralelo al aumentar sustancialmente elrendimiento. De esta forma, podemos dividir lastecnologías de genotipado en dos tipos en funciónde su soporte, aquellas que se realizan ensolución, también denominadas reacciones“homogéneas”, y las que necesitan un soportesólido.
6.3.1. Reacciones homogéneas
Algunas de las reacciones de genotipado realizadasen solución no requieren manipulaciones extra unavez que la reacción ha tenido lugar, mientras queotras tienen un número de pasos adicionales dereactivos. Los sistemas de lectura por fluorescenciatales como Taqman, Molecular beacon y Scorpionassay, se diseñaron inicialmente para ser empleadoscomo métodos de marcaje en la PCR en tiempo real,una técnica que permite la detección y cuantificaciónde pequeñas cantidades de ADN83. Las tres técnicasmencionadas anteriormente se basan en el empleode dos marcadores que emiten fluorescencia cuandodejan de estar en proximidad (quenching84). Estosmétodos de detección son los más frecuentes en losensayos de genotipado de alto rendimiento basadosen análisis homogéneos, aunque se han desarrolladovariantes de estas técnicas tales como AlphascreenTM
(Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay)85.
41
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Rotura invasiva específica de alelo ("Técnica Invader®")
T
(Sitio de rotura)(Sonda con un brazo no apareado)
1. Rotura del brazo noapareado medianteenzimas de restricción
2. Identificación del brazono apareado mediante unasonda FRET
3. Liberación defluorescencia
(Oligo "Invader")
(Fragmento de ADN)
Sin rotura niseñalfluorescente
(Sonda FRET)
C
C
C
G G
Fig. 16. Métodos de discriminación alélica empleados en tecnologías de genotipado de alto rendimiento. Fuente: elaboración propia.
83 Tsuchihashi, Z.; Dracopoli, N. C (2002). Progress in high throughput SNP genotyping methods. Pharmacogenomics J.;2(2):103-10.
84 Quenching (extinción o atenuación de la emisión de la fluorescencia): transferencia de energía entre dos moléculasmarcadas con el mismo fluorocromo, que están suficientemente cercanas.
85 AlphaScreen™ Beads, Perkinelmer(http://las.perkinelmer.com/catalog/Category.aspx?CategoryName=AlphaScreen+Beads)
42
TaqmanTM
1. Unión de la sonda al fragmento de ADN.
2. Alineamiento y extensión del cebador.
3. Desplazamiento de la sonda por la enzima polimerasa.
4. Emisión de fluorescencia.
Molecular beacons
1. Sonda “Molecular beacon”.
2. Hibridación de la sonda con un fragmento de ADN.
3. Emisión de fluorescencia al abrirse la sonda.
ScorpionTM
1. Sonda y cebador.
2. Alineamiento de la sonda con el fragmento de ADN y extensión.
3. Emisión de fluorescencia al abrirse la sonda.
Figura 17. Nuevos métodos de marcaje por fluorescencia.Fuente: Lockley A. K.; Bardsley R. G. (2000). DNA-based methods for food authentication. Trends in Food Science &Technology 11, 67-77.
Los ensayos homogéneos son en general másrobustos, altamente flexibles y menos laboriosos.La principal desventaja es la limitada capacidadde multiplexado o reacciones simultáneas que sepueden realizar con este tipo de ensayos.
6.3.2. Reacciones en un soportesólido
• Biochips y microarrays de ADN
Un biochip o microarray de ADN consiste en unaserie de oligonucleótidos o fragmentos de ADNanclados a un soporte. Además de lasaplicaciones ya conocidas de análisis de laexpresión génica, estos chips pueden emplearsepara realizar reacciones específicas de alelo y deesta forma efectuar ensayos de genotipado dealto rendimiento. Aunque esta herramienta harevolucionado los ensayos de análisis de laexpresión génica, posee una serie de limitacionesen el genotipado de SNPs a gran escala.
En sus comienzos, los microarrays de ADNposeían un uso limitado en cuanto al genotipadode SNPs debido a la dificultad de obtener unabuena relación señal/ruido en la hibridaciónespecífica de alelo. La especificidad dediscriminación entre fragmentos de ADNcompletamente coincidentes y no coincidentes en
la hibridación se encuentra limitada, y es másbaja que la discriminación enzimática medianteADN polimerasas (característica de laminisecuenciación) y ADN ligasas (técnica OLA).Este problema ha sido solucionado con lacombinación de sondas unidas a un soporte comopuede ser un chip, con técnicas de extensión debases en las que intervienen ADN polimerasas. Deesta forma, aumenta la especificidad y posibilitael multiplexado de la reacción.
Algunas de las limitaciones propias de lasreacciones que tienen lugar en soportes sólidos86
se han solucionado con la tecnología “Tag array”aplicada al genotipado de SNPs. En este caso seproduce una reacción de extensión que se realizapor medio de sondas que poseen un marcador enuno de sus extremos. Estas secuenciasmarcadoras no participan en la reacción deextensión, sino que se emplean para capturar losoligos en la superficie del chip. Tras ladiscriminación alélica que se produce por lareacción de extensión, los primeros soncapturados por medio de hibridación entre elmarcador y los oligos anclados en la superficie. Lagran ventaja que ofrece esta técnica consiste enque se pueden usar algunos de los chipsgenéricos actuales, lo que contribuye a aumentarla flexibilidad y disminuir el coste del ensayo87.Las principales compañías que han desarrolladoestas plataformas son Orchid Bioscience, AppliedBiosystems, y Affymetrix.
43
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
86 Una reacción en fase sólida es generalmente menos eficiente debido a la falta de difusión de los primers. Requiere que elextremo 3´del primer esté libre ya que los nucleótidos se añaden por este extremo por la ADN polimerasa (por estemotivo, algunos chips como el de Affymetrix no son válidos para el genotipado de SNPs, ya que el extremo 3´seencuentra anclado a la superficie sólida).
87 Tsuchihashi, Z.; Dracopoli, N. C (2002). Progress in high throughput SNP genotyping methods. Pharmacogenomics J.;2(2):103-10.
G/C CG T C
A AG T
A/G
T/T
A/C
Fig. 18. Microarrays de ADN en el genotipado de SNPS.Fuente: Hirschhorn, J. N. (2000). SBE-TAGS: An array-based method for efficient single-nucleotide polymorphismgenotyping. PNAS, 24, Vol. 97, No. 22; 12164-12169.
• Métodos que emplean partículas
El concepto de este tipo de ensayos es muy
similar al de los chips de ADN, con la diferencia
de que en este caso los oligos están anclados a
pequeñas microesferas de 3-5 micras de
diámetro. Estos sistemas pueden combinarse con
la mayoría de las reacciones químicas de
discriminación de alelos empleadas en los
métodos basados en chips de ADN, tales como
reacciones de extensión de sondas y ligamiento
de oligonucleótidos.
44
Ejemplos comerciales de métodos de genotipado que emplean micropartículas:
Luminex 100™ (Luminex):
Emplea microesferas recubiertas por dos fluorocromos. Estas pueden identificarse y separarse mediante citometría. Si se dispone de unos cientos de microesferas diferentes con una relación de fluorescencia distinta, es posible realizar cientos de reacciones de detección enun mismo tubo. Cada tubo se comporta como un chip de ADN con cientos de posibles posiciones.Aunque tiene un buen nivel de resolución, el número de posibles combinaciones de cantidades demarcador fluorescente para la identificación de microesferas es de 100, por lo que limita elmultiplexado a 100 reacciones en un mismo tubo.
BeadArray™ (Illumina):
Las microesferas se capturan en pocillos sólidos hechos de fibra óptica. El diámetro de estos pocilloses similar al de las microesferas, permitiendo que una única esfera quepa en cada uno de estospocillos, y funcionen como si estuvieran en una placa de chip de ADN. Al contrario que el sistema deLuminex, la reacción de genotipado se lleva a cabo después de que las microesferas se inmovilicenen esta plataforma, por lo que este método es más similar a un chip de ADN que a una suspensión.Es necesario realizar un análisis previo de la identidad de las microesferas en cada pocillo. Esteproceso se realiza por medio de una serie de hibridaciones con oligos fluorescentes.
45
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Mecanismos de detección de discriminación alélica empleados en el genotipado de SNPs
Luminiscencia
La emisión de luz se produce por medio de una reacción química en la que interviene la enzimaluciferasa, que actúa cada vez que se añade un desoxirribonucleósido en el cebador de ADN.
Fluorescencia
La detección por fluorescencia es un método muy directo y fácil de implementar que puedeemplearse en la captura de marcadores fluorescentes en un soporte sólido, gel o electroforesiscapilar, o monitorización de la formación de híbridos de ADN de doble cadena.
Fluorescencia time-resolved
Este método es posible cuando se emplean marcadores fluorescentes cuya vida media de emisión defluorescencia es larga, siendo la mayoría de ellos lantánidos.
Transferencia de energía entre fluorocromos (FRET)
Método de detección muy frecuente en los ensayos de genotipado homogéneos. Emplea dosmarcadores que deben encontrarse en proximidad para emitir fluorescencia. Este requerimiento deproximidad es lo que hace a FRET un buen método de detección para un gran número demecanismos de discriminación alélica.
Fluorescencia por polarización
Cuando la luz se excita en el plano de la luz polarizada, la emisión de fluorescencia también serápolarizada. El grado de polarización se determina por la temperatura, la viscosidad del solvente, y elvolumen molecular de la molécula de fluorescente. Este método es más adecuado para genotipadode bajo rendimiento debido a que no es posible el multiplexado.
Electricidad
La monitorización de los cambios en las propiedades eléctricas de los productos de las reacciones dediscriminación alélica tienen lugar en un soporte sólido donde los oligos se han depositado sobreelectrodos. Las propiedades eléctricas de la sonda se alteran cuando el ADN complementario a lasonda se alinea con él, acentuándose cuando se emplea un marcador ferromagnético. La deteccióneléctrica combina la tecnología de semiconductores con la bioquímica. Ejemplo: NanoChip®(Nanogen, Inc.).
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas mide el peso molecular de los productos formados en la reacción, por loque es el método de detección más directo al aprovechar las propiedades intrínsecas de lasmoléculas de ADN, y no ser necesario el empleo de marcadores. Es un método de alta resoluciónque es capaz de diferenciar fácilmente entre moléculas de ADN que se distinguen entre sí tan soloen una base nucleotídica. El tipo de espectrometría de masas más frecuente es la reacción deextensión de un único nucleótido con MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time oflight), que comercializan compañías como Sequenom.
6.4. Mecanismos de detección
Durante el proceso de genotipado, la detección deposibles reacciones de discriminación alélica sepuede realizar por tres métodos: monitorizaciónde luz emitida por los productos de la reacción,medición de la masa de los productos o ladetección en el cambio de las propiedadeseléctricas de los mismos.
La monitorización de la emisión de luz es lamodalidad de detección más empleada en elgenotipado, que puede realizarse medianteluminiscencia, fluorescencia, transferencia deenergía entre fluorocromos (FRET), yfluorescencia de polarización (FP)
88.
88 Kwok, P-Y. (2001). Methods for genotyping single nucleotide polymorphims. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235–58.
6.5. Otras tecnologíasde genotipado
6.5.1. Pirosecuenciación
La pirosecuenciación se desarrolló inicialmentecomo un método de secuenciación alternativo almétodo de Sanger, que también puede emplearsepara el genotipado de SNPs. Esta técnica empleauna cascada de reacciones enzimáticas paradetectar la incorporación de nucleótidos durantela síntesis de ADN. Cuando un nucleótido esincorporado por medio de la enzima ADNpolimerasa, se produce una reacción lumínica enla que interviene la enzima luciferasa, al igual queocurría en la detección por luminiscencia. Laversión comercial que existe actualmente sedenomina PyrosequencingTM, que sin embargo noes adecuada para el genotipado de altorendimiento ya que posee una capacidad demultiplexado limitada89.
6.5.2. Miniaturización
El empleo de técnicas de miniaturización en laquímica y detección de SNPs es una estrategiaalternativa en el genotipado de polimorfismos. Unejemplo característico es la tecnología LabChip®desarrollada conjuntamente por Caliper y Aclara,que permite la identificación de SNPs por mediodel empleo de redes de microcanales. La principalventaja de este tipo de plataformas reside en quelos volúmenes de reactivos necesarios son muyreducidos, y por tanto disminuiría el coste delgenotipado en gran medida, y la automatizacióndel ensayo90.
46
89 Tsuchihashi, Z.; Dracopoli, N. C. (2002). Progress in high throughput SNP genotyping methods. Pharmacogenomics J.;2(2):103-10
90 Jenkins, S.; Gibson, N. (2002). High-throughput SNP genotyping. Comp Funct Genom. 3: 57–66.
47
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
91 Kwok, P-Y (2001). Methods for genotyping single nucleotide polymorphims. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:235–58.
Técnica Ventajas Desventajas Combinaciones
PCR
Método Invader®
Círculo rodante
Hibridación específica de alelo
Extensión de sondas
OLA
Rotura invasiva específica de alelo(Invader®)
Reaccioneshomogéneas
Reacciones ensoporte sólido
Taqman
Biochips ymicroarraysde ADN
Molecularbeacon
Partículas
Scorpion
Luminiscencia
Fluorescencia
Automatizable
Automatizable, alta sensibilidad,buena relación señal/ruido
Alta sensibilidad
Mecanismo simple
Robustez, flexibilidad, requiere unmenor número de sondas
Alta especificidad
No requiere PCR
Sencillez, rapidez
Elevada capacidad de multiplexado
Poder de multiplexado muy elevado
Buena relación señal/ruido
Versátil, permite el multiplexado
Encarece el ensayo
Requiere alta cantidad de ADN(>50ng)
Requiere gran cantidad de ADN(100ng) por genotipo
Limitada capacidad dediscriminación
Require un paso previo deseparación
Reacción lentaRequiere gran cantidad de sondas
Requiere gran cantidad de ADN
Limitada capacidad demultiplexadoElevado coste de las sondas
Elevado precio
Necesita de un mecanismo dedetección de las partículas
Pasos enzimáticos adicionales
Necesidad de purificar el producto
FRET (Amplifluor)
TaqmanMolecular beaconsSondas light-up91
Espectrometría de masasFluorescenciaFRET
PCR
Hibridación
HibridaciónExtensiónOLA
Hibridación
HibridaciónExtensiónOLA
Hibridación PCR
Fluorescencia “time resolved” Alta sensibilidad, bajo ruido defondo
Necesidad de emplear agentesquelantes conjugados con lasonda para unir los agentesfluorescentes
FRET Simplicidad Elevado coste de las sondas Extensión, OLA, Taqman,Molecular beacon, Invader
Fluorescencia por polarización Necesidad de menor cantidad deagente fluorescente
Productos no específicosincrementa el ruido de la señal,no es posible el multiplexado
ExtensiónTaqmanInvader
Electricidad Sin detección lumínica niprocesamiento de productos dereacción
En desarrollo
Espectrometría de masas Sensibilidad, no necesitamarcadores, rapidez, multiplexado
Requiere un elevado grado depurezaCoste del espectrómetro demasas
HibridaciónExtensiónPCR
Pirosecuenciación Sensibilidad, altamente específico Multiplexado reducidoElevado coste
Ampl
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ción
Otr
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iscr
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n al
élic
aD
etec
ción
TECNOLOGÍAS QUE SE EMPLEAN EN LAS TÉCNICAS DE GENOTIPADO
Tabla 4. Tecnologías que se emplean en las técnicas de genotipado.Fuente: elaboración propia.
Las plataformas comerciales que se encuentran
actualmente en el mercado poseen características
diferentes que les hacen adecuadas para diversos
tipos de ensayos de genotipado. Cabe puntualizar
que no existe una tecnología de genotipado ideal,
ya que el presupuesto y los objetivos iniciales
condicionarán la elección de la plataforma.
De esta forma, los requerimientos de reactivos,
pasos preliminares tales como la PCR, o
equipamiento complementario como puede ser un
espectrómetro de masas, instrumentación de
electroforesis capilar, o microarrays, van a
condicionar la capacidad de genotipado y el precio
final de la plataforma. Casi todos los métodos de
genotipado mencionados en el presente informe
requieren de al menos un reactivo fluorescente
que encarece drásticamente el coste del ensayo.
Hasta el momento no se ha realizado una
estimación del coste promedio por reacción de
genotipado, ya que para cada método el coste de
los reactivos varía significativamente, y en
muchos casos son los propios laboratorios los que
preparan los reactivos para reducir de esta forma
los costes92.
En los últimos 5 años se han solicitado más de
500 patentes en la oficina estadounidense de
patentes, la mayoría de ellas relativas a
tecnologías que se emplean en plataformas para
el genotipado de SNPs de alto rendimiento. Estas
tecnologías son principalmente técnicas de
discriminación de alelos, técnicas de detección de
productos específicos de alelos, y nuevos
formatos de análisis. En algunos casos, estas
patentes se refieren a materiales o
instrumentación, y en ocasiones procedimientos.
Esta situación es mucho más compleja debido a
que cada método consiste a menudo en una
combinación de componentes y formatos de
varias técnicas de genotipado, por lo que es una
práctica común la adquisión de patentes y
licencias por parte de las empresas
biotecnológicas dedicadas al genotipado de
SNPs93.
La siguiente tabla recoge las principales
plataformas que se están empleando con más
frecuencia en los ensayos de genotipado
de SNPs a gran escala (al menos 2.000 genotipos
al día), tanto por centros públicos de
investigación como consorcios privados y
empresas. Estas plataformas combinan diversas
tecnologías que se han mencionado
anteriormente, relativas a la química que permite
la identificación de polimorfismos así como la
detección de SNPs, dando lugar a ensayos con
diferentes capacidades de genotipado y coste
asociado.
48
7. Plataformas comerciales de genotipadode SNPs de alto rendimiento
92 Freimuth, R. R.; et al. (2004). High-throughput genotyping methods for pharmacogenomics studies. Curr.Pharmacogenomics, 2, 21-33.
93 Twyman, R. M.; Primrose, S. B. (2003). Techniques patents for SNP genotyping. Pharmacogenomics. Jan;4(1):67-79.
49
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
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Debido a las innovaciones basadas en tecnologías de genómica y las estrategias de análisis, se han creadotres sectores específicos en los cuales las empresas de biotecnología están especializadas. Estasegmetación de las empresas que realizan genotipado de SNPs también se observa en campos deaplicación clínica. De esta forma, las empresas son más activas en el genotipado de enzimas relacionadascon el metabolismo (relacionadas con la respuesta a fármacos), toxicogenómica y oncogenómica94.
50
94 Thomas, F. (2002). Business models for pharmacogenomic companies. TARGETS Vol. 1, No. 6 December 2002. 177-181.95 Se han tomado en cuenta aquellas empresas que poseen al menos 5 colaboraciones con otras empresas del sector
farmacéutico y/o biotecnológico.
Descubrimiento depolimorfismos
• Asociación entre genes yenfermedades
• Asociación entre genes yrespuesta a fármacos
• Identificación y validaciónde SNPs
• Genética de poblaciones
Ensayos clínicos
• Ensayos clínicos
• Recuperación de fármacos
Comercialización de un producto propio
• Asociación entre genes y respuesta afármacos
• Herramientas de diagnóstico basadas enADN
• Perfil genético
• Genética de poblaciones
Operacionesinternas
Operacionesexternas
Operacionesinternas
Operacionesexternas
Operacionesexternas
DiagnósticoIntegraciónfármaco/
diagnóstico
MODELOS DE MERCADO EN FARMACOGENÓMICA Y GENOTIPADO
Fig. 19. Segmentación del mercado de la farmacogenómica.Fuente: Pharmacogenomics 2003: A strategic market outlook and business análisis. Navigant Consulting Inc, Jan 2003;Tetlow, S. (2003). Successful Pharmacogenomics business models. Life Sciences Reports. Cambridge Healthtech Institute.
En los últimos 10 años se ha venido produciendo un
aumento en las fusiones y adquisiciones entre
compañias farmacéuticas y biotecnológicas. El
motivo principal reside en la necesidad de las
primeras de adquirir productos que puedan
potenciar la salida al mercado de nuevos fármacos.
Las principales compañías farmacéuticas y
biotecnológicas que poseen una estrategia dirigida
hacia el genotipado de SNPs proceden de los
sectores que se encuentran estrechamente
relacionados. Por un lado aquellas empresas
dedicadas al diagnóstico molecular, y por otro
empresas que en los últimos años se han
especializado en tecnologías de automatización de
ensayos, como las tecnologías de microsistemas y
microarrays. La puesta en marcha de plataformas de
genotipado de SNPs de alta resolución requiere en
muchos casos de la colaboración entre dos o más
empresas, que suelen compartir tecnología y
conocimiento. Estos acuerdos tienen lugar
generalmente en forma de colaboraciones, que en
muchos casos comienzan con licencias no exclusivas
que permiten el uso de tecnologías propias. Estas
licencias pueden ser en ocasiones únicas para su
uso en actividades de I+D, o bien pueden conllevar
la comercialización de plataformas que incluyan la
tecnología licenciada. En el presente informe se ha
realizado una valoración de los acuerdos de
colaboración y licencia más importantes de los
últimos 5 años en los que han participado empresas
que ofrecen servicios o productos relacionados con
el genotipado de SNPs, y que se encuentran
recogidos en la siguiente tabla 6.
Como resultado de este estudio comparativo, se
observa que entre las empresas más activas en
cuanto a acuerdos de licencia y colaboración95, se
encuentran principalmente aquellas que ofrecen
distintas plataformas de genotipado de SNPs
disponibles comercialmente y recogidas también
en la tabla 6, además de algunas empresas
farmacéuticas multinacionales.
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
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Tabla 6. Acuerdos y licencias entre empresas relacionadas con el genotipado de SNPs.Fuente: datos procedentes de Biocentury Publications Inc.
51
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
A la hora de analizar el impacto económico de las
tecnologías de genotipado de alto rendimiento se
debe diferenciar entre las aplicaciones de
diagnóstico y predisposición a sufrir una
enfermedad (diagnóstico predictivo), y el análisis
de la respuesta a un determinado fármaco
(farmacogenómica). Mientras que la primera se
pone de manifiesto en las primeras fases de
descubrimiento del fármaco, la segunda tiene
mayor relevancia en las etapas de desarrollo96.
El impacto de las tecnologías de genotipado en la
productividad de las actividades de I+D de las
empresas procede de un aumento en la
flexibilidad de las etapas de desarrollo clínico de
fármacos. En la actualidad, el escenario con el
que se encuentra la industria farmacéutica
comprende dos posibilidades, apostar por un
fármaco y llevarlo hasta las fases clínicas y
finalmente comercializarlo, o bien abandonarlo en
caso de que no supere los ensayos clínicos. La
farmacogenómica proporciona un escenario con
mayores matices, permitiendo la exclusión de
pacientes genéticamente predispuestos a mostrar
una respuesta pobre frente al tratamiento o
efectos secundarios derivados del mismo. Como
consecuencia, los ensayos clínicos pueden ser
acortados y los fármacos fallidos disminuirán97.
8. Barreras en la implantaciónde tecnologías de genotipado de alto rendimiento
96/97/98 Tollman, P.; et al. (2001). A Revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
OPCIONES ACTUALESOPCIONES DISPONIBLES MEDIANTE
TÉCNICAS DE GENOTIPADOY FARMACOGENÓMICA
Fig. 20. Nuevas opciones que permite la farmacogenómica en el proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos.Fuente: Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
Abandono del fármaco antes decomercializarlo
Continuación de los ensayos clínicos hastallegar al mercado
Continuación de los ensayos clínicos demanera más segura, eliminando lospacientes con mayor riesgo de sufrir
toxicidad o respuestas pobres
Optimización de ensayos clínicos,reduciendo su tamaño y duración
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Las barreras más importantes que frenan la implantación de estrategias de genotipado de alta resolucióny farmacogenómica en la industria farmacéutica se pueden resumir en tres factores: el coste de losensayos clínicos, las limitaciones tecnológicas y aspectos de mercado98.
8.1. Coste final de implantación de la tecnología
El mercado farmacéutico está estimado en más de
1,1 trillones de dólares y, de acuerdo con el informe
RB-191 World Pharmaceutical Markets publicado
este año por Business Communications Company,
Inc., éste experimentará un crecimiento de un 7,8%
hasta el año 2008, sensiblemente inferior a los
crecimientos observados en años anteriores. Se
estima que la industria del diagnóstico “in vitro” de
compone actualmente de un mercado de 33
millones de dólares, de los cuales el diagnóstico
molecular representa cerca del 3%.
Los tests genéticos y moleculares se llevan sólo
1 billón de las ventas mundiales, aunque esta
tendencia está creciendo a una velocidad del
30-50% según datos del año 2002. En la
actualidad se considera que hasta 2.500 genes y
500 proteínas son candidatos a ser empleados en
tests moleculares. Así, en los próximos
5-10 años, las aplicaciones clínicas del diagnóstico
molecular revolucionarán el proceso de
descubrimiento y desarrollo de fármacos99.
Affymetrix, una de las compañías que ha
apostado por las tecnologías de genotipado de
alta resolución, estima que el mercado basado en
el análisis de genotipado puede proporcionar un
volumen de negocio emergente de unos 200
millones de dólares100.
Según el precio actual del coste de los ensayos de
genotipado se estima que el coste del mismo
podría suponer más de 10 millones de $ en un
ensayo clínico del genoma completo. Por este
motivo, el genotipado no se realizará hasta que las
técnicas actuales no se mejoren y disminuya el
coste final del ensayo. Una de estas mejoras podría
consistir en la discriminación de alelos para
identificar haplotipos. Hasta el momento esto ha
sido imposible mediante las técnicas actuales de
identificación de SNPs basadas en la PCR. Por este
motivo actualmente se persiguen las estrategias de
gen candidato, ya que tiene la ventaja de que tan
solo es necesario analizar un número reducido de
genes, en vez de todo el genoma como ocurre con
el genotipado del genoma completo. Los genes
candidatos identificados pueden ser secuenciados y
luego analizados para identificar marcadores
polimórficos que puedan tener relevancia clínica101.
La aplicación de la farmacogenómica en el estudio
de la respuesta a fármacos potencialmente
presenta numerosas ventajas de mercado.
52
99 Ross, J. S.; Ginsburg, G. S. (2002). Integrating diagnostics and therapeutics: revolutionizing drug discovery and patientcare. DDT Vol. 7, No. 16 August. 859-864.
100 ”Affymetrix set for strong second half” (Noticia: Forbes, 19/08/2004)http://www.forbes.com/markets/2004/08/19/0819automarketscan07.html).
101 Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics: implications for laboratory medicine. Clinica Chimica Acta 308, 43–53.
Ventajas de mercado del empleo de la farmacogenómica en estudios de respuestaa fármacos
• Sobreprecio de los medicamentos.
• Incremento del valor de las acciones.
• Nuevos pacientes potenciales.
53
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Algunos modelos económicos estiman el coste quesupone el desarrollo de un nuevo fármaco en unamedia de 880 millones de dólares. En el caso de quese empleasen técnicas de farmacogenómica en cadauna de las fases de desarrollo de un fármaco, laspredicciones más optimistas aseguran que el costefinal de cada fármaco se vería reducido en 335millones de dólares, esto es, un 38% del costeprevisto. Sin embargo, las técnicas defarmacogenómica no siempre consiguen los
resultados esperados, por lo que las estimacionesmás próximas a la realidad reducen la rebaja en losgastos a 80 millones de dólares, un 9% del preciototal estimado en un inicio. Esta rebaja es sinembargo, un importante aliciente para las empresasfarmacéuticas que se encuentran en un ambientemuy dinámico, donde los nichos de mercadodependen en gran medida de saber aprovechar losavances tecnológicos disponibles102.
102 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
200 400 600 800 1.000M$
800
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Biología
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Cribado Optimización Preclínica Clínica
Química Desarrollo
Fig. 21. Potencial de la farmacogenómica para las empresas farmacéuticas. Comparación entre el coste de desarrollo de unfármaco antes de la era genómica, los costes potenciales derivados del uso de las técnicas farmacogenómicas, y los costesesperados tras su utilización a lo largo de todo el proceso.Fuente: Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming thebiopharmaceutical industry. The Boston Consulting Group, Inc.
8.2. Limitaciones tecnológicasen el genotipado de altorendimiento de SNPs
Los estudios de la respuesta de un fármaco
mediante técnicas de farmacogenómica no
siempre son aplicables a todos los medicamentos
en sus fases clínicas. La farmacogenómica tan
solo será útil en aquellos casos es los que exista
una variación genética clara asociada a la
respuesta. En algunos casos, la respuesta de un
fármaco puede verse modificada debido a factores
medioambientales, como por ejemplo la ingesta
de ciertos alimentos, mientras que en otras
ocasiones son múltiples genes los que contribuyen
de manera conjunta a la variabilidad genética,
complicando de esta forma los análisis
estadísticos y procedimientos técnicos.
Aunque ambas condiciones se cumplan, existetodavía un reto mucho más complejo desolventar, que consiste en encontrar los genes ymarcadores polimórficos relevantes para realizaruna selección de pacientes que tomen parte enlos ensayos clínicos. Para desarrollar un ensayode farmacogenómica robusto se requieren almenos 1.000 pacientes. La fase I de un ensayoclínico maneja un número menor de pacientes,por lo que no es posible realizar un estudioprospectivo de pacientes para identificar aquellosque no responden al fármaco antes de pasar a lafase II. Esta selección de pacientes sí podríarealizarse como etapa preliminar a la preparaciónde la fase clínica III, aunque no siempre esprocedente la utilización de las técnicas defarmacogenómica. En un ensayo clínico estándarla frecuencia de prevalencia de variacionesgenéticas es aproximadamente de un 30%. Dado
que la mayoría de las variantes genéticas son
muy infrecuentes, la utilidad de los tests de
farmacogenómica en los ensayos clínicos no está
muy clara, ya que se necesitaría un número
mayor de pacientes para encontrar marcadores
polimórficos que sean de utilidad103.
En el caso de los tests farmacogenómicos que
analizan los efectos secundarios este problema no
es tan acuciante ya que las variaciones
metabólicas se determinan frecuentemente
durante los ensayos preclínicos. Sin embargo,
este tipo de tests no son de utilidad para
seleccionar pacientes antes de realizar los
ensayos clínicos, ya que estos últimos necesitan
reclutar a un número de pacientes elevado en el
caso de los ensayos de eficacia, lo que no ocurre
con los ensayos de efectos secundarios104.
8.3. Aspectos de mercadorelativos al genotipadode SNPs
A la hora de analizar la respuesta a un fármaco,
los pacientes se pueden dividir en dos grupos,
aquellos que toman un medicamento durante
largos periodos de tiempo o incluso toda la vida,
y aquellos que abandonan el tratamiento debido a
su ineficacia o efectos secundarios. En el primer
grupo, los tests farmacogenómicos reducirían el
número de potenciales beneficiarios de este
medicamento al eliminar los pacientes que
responden a placebo y aquellos que presentan
efectos secundarios. En un principio parecería que
esta selección de pacientes reduciría la cuota de
mercado, sin embargo, muchas compañías se
están aventurando a reproducir los análisis
farmacogenómicos de sus competidores para no
quedarse atrás. La farmacogenómica permitiría
aumentar los beneficios de las empresas
farmacéuticas al acrecentar el precio de los
medicamentos dirigidos a segmentos de población
concretos, elevar el valor de sus acciones, y
descubrir nichos de mercado en nuevos pacientes.
No obstante, en la actualidad tan solo un 2% de
registros de nuevos fármacos incluyen análisis
farmacogenéticos en los ensayos clínicos y
únicamente se estudia su eficacia y seguridad en
determinadas poblaciones de pacientes, el 6%
de los fármacos registrados, generalmente con
fármacos antitumorales105.
8.4. Aspectos reguladores
Los factores responsables del retraso o fallo en la
aprobación de nuevas aplicaciones de fármacos
están a menudo relacionados con aspectos
reguladores, que pueden obstaculizar la
comercialización del medicamento.
Recientemente, la agencia del medicamento
estadounidense (FDA), ha realizado una serie
recomendaciones a las compañías farmacéuticas
para que realicen estudios farmacogenómicos
durante el proceso de desarrollo de un nuevo
fármaco106. Estas recomendaciones han dado
lugar a la publicación de una guía que ha
permitido la creación de comités internos en
farmacogenómica dentro de algunas compañías
farmacéuticas. La labor de estos comités consiste
54
103/104 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
105 El análisis genético optimizará el reclutamiento en ensayos clínicos (El Correo Farmacéutico, 12/07/2004;http://www.correofarmaceutico.com/edicion/noticia/0,2458,508134,00.html).
106 Draft Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions (http://www.fda.gov/cder/guidance/5900dft.pdf).
55
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
principalmente en revisar los datos procedentes de investigaciones propias, ensayos clínicos y literatura,para predecir las características básicas de los pacientes “respondedores” y “no respondedores”, y aquellosque son más susceptibles a desarrollar efectos secundarios107. Esta agencia ha identificado algunos de losaspectos más problemáticos que podrían solucionarse por medio de estudios farmacogenómicos:
107 Its, R. K.; Demers, L. M. (2004). Pharmacogenomics and pharmacogenetics: Future role of Molecular Diagnostics in theClinical Diagnostic Laboratory. Clinical Chemistry, 50: 1526-1527.
108 Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. The Boston Consulting Group, Inc.
Relevancia de la farmacogenómica durante el proceso de aprobación de fármacos:
• Relaciones entre la dosis y el efecto: determinación de dosis adecuadas de tolerancia e intervalosterapéuticos.
• Diseño experimental y desarrollo clínico: adecuación del fármaco a la indicación apropiada.
• Medición de riesgos y beneficios: necesidad de determinar la seguridad del compuesto en relacióncon otros fármacos alternativos, la indicación terapéutica más adecuada en cuanto a la severidadde la enfermedad, y la probabilidad de ser empleada en poblaciones de alto riesgo.
Como conclusión, cabe decir que aunque los beneficios proporcionados por la implementación de lafarmacogenómica durante los ensayos clínicos previos a la aprobación de un fármaco, son menores que losderivados del diagnóstico predictivo, las ventajas competitivas que aporta añadirían un enorme valor almercado farmacéutico. Es muy probable que los distintos tipos de farmacogenómica se veanimplementados en distintos momentos. La detección de efectos secundarios será probablemente la primeraen adoptarse, ya que las compañías farmacéuticas no desean que sus fármacos candidatos fallen en lasúltimas etapas del desarrollo clínico. En el caso de los ensayos de eficacia, lo más seguro es que seanintroducidos a largo plazo, debido principalmente a la inquietud que plantea la fragmentación delmercado108.
Las técnicas de genotipado de SNPs de altorendimiento ofrecen una serie de oportunidadesde negocio para la industria farmacéutica ybiotecnológica109.
9.1. Déficit de innovacionesde producto
Las compañías farmacéuticas necesitan encontrarnuevas formas de mejorar la productividad yaumentar el número y calidad de nuevosfármacos. Hasta la fecha, las estrategiastradicionales se centraban en el descubrimiento ydesarrollo de pequeñas moléculas terapéuticas,que en la actualidad están llegando a su límite.En el año 2001, el número de dianas descritasascendía a menos de 450 del total de 10.000dianas estimadas en el genoma humano. Ladiversidad de dianas se centra fundamentalmenteen receptores y enzimas que participan endistintos tipos de reacciones. Por otra parte, lafinalidad clínica de las dianas no es muy diversa,ya que un tercio de los fármacos que seencuentran en el mercado, excluyendo losantibióticos, se emplean frente a desórdenes delSistema Nervioso Central y otro tercio frente aenfermedades cardiovasculares y cáncer110.
9.2. Disminución del tiemponecesario paradesarrollar un nuevofármaco
Mediante el modelo actual de desarrollo de nuevasentidades farmacéuticas, se consigue una tasa decrecimiento anual del 8%, mientras que lascompañías farmacéuticas podrían crecer mucho
más. Las proyecciones financieras sugieren quenecesitarían aprobar de 3 a 5 nuevas entidadesquímicas al año para alcanzar al menos una tasa decrecimiento anual del 10%. Para conseguirlo, laindustria farmacéutica debe reducir el tiempo ycoste derivado del descubrimiento y desarrollo denuevos fármacos, que requiere como media de 10 a12 años y como mínimo 500 millones de dólares porcompuesto111. Las tecnologías de genotipado deSNPs y otras técnicas farmacogenómicas permitiríanacelerar el desarrollo clínico de nuevos fármacos pormedio del diseño de ensayos clínicos que muestrenuna mejor seguridad y eficacia, y por tantodisminuir el coste total.
9.3. Combinación de fármacos/tests de diagnóstico
Las empresas dedicadas al diagnóstico genéticoson en principio quienes se beneficiarían enmayor medida de la oportunidades de negocioque les brindan las tecnologías de genotipado acorto plazo. En contraste con los incentivoscontrapuestos a los que se enfrenta la industriafarmacéutica, las empresas de diagnóstico puedenaprovecharse del cambio que se está produciendoen las primeras como resultado de una mayordisponibilidad de información genética.
La combinación de la administración de fármacoscon la realización de tests de genotipado resultaráde especial interés para las empresas dediagnóstico, las cuales incrementarán su mercadoal resultar necesario el empleo de dichos testspara realizar ensayos de susceptibilidad yestratificación de pacientes. Esta circunstanciadará lugar a una integración de la industriafarmacéutica y de diagnóstico, que
56
9. Oportunidades de mercado de las tecnologías de genotipadode alto rendimiento
109/110/111 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomics: applications in pharmaceutical R&D. DDT, Vol. 6, No. 4.February, 180-185. Roses, A. D. (2001). How will pharmacogenetics impact the future of research and development?Drug Discov Today. Jan 1;6(2):59-60.
57
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
tradicionalmente han operado por separado y se han regulado de manera independiente por las agenciascompetentes112.
Los analistas de la industria predicen que por medio de estas mejoras, las compañías farmacéuticasaumentarían sus beneficios del orden de 200-500 millones de dólares por cada fármaco. Las compañíasfarmacéuticas están empezando a integrar la farmacogenómica en sus programas de desarrollo de nuevosfármacos113.
Fuerzas de mercado en farmacogenómica114
• Disponibilidad de Bases de Datos de SNPs.
• Reducción del coste del desarrollo de fármacos.
• Mayor soporte de los pacientes.
• Aumento del número de estudios de asociación de genes.
• Mejora en la recuperación de fármacos.
Cuellos de botella de la farmacogenómica115
• Ambiente económico actual.
• Reducción de la venta de fármacos mediante segmentación.
• Identificación de fenotipos.
• Precio de SNPs.
112 Lindpaintner, K. (2002). The impact of pharmacogenetics and pharmacogenomics on drug discovery. Nature Reviews.Drug Discovery. Vol 1, June. 463-469.
113 Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomics: applications in pharmaceutical R&D. DDT Vol. 6, No. 4, February,180-185.
114/115 Pharmacogenomics: A strategic Market Outlook and Business Análisis (2003). Sample pages. Frontline StrategicConsulting, Inc. Strategic Market Reports.
La implantación de tecnologías de genotipado en la industria farmacéutica y la práctica clínica vienedeterminada por el desarrollo de una estategia adecuada en la cual cada paso es fundamental paraconseguir el éxito del paso posterior. El siguiente gráfico pone de manifiesto los pasos que se deben seguirpara lograr trasladar el conocimiento de la variabilidad de la secuencia de ADN, en aplicacionesfarmacogenómicas y de diagnóstico predictivo que sean de utilidad clínica.
58
10. Tendencias futuras de las tecnologíasde genotipado
Farmacogenómica y diagnóstico predictivo
Estudios que documenten el suficiente grado devariabilidad para predecir su utilidad
Estudios relevantes en la población que imitenla práctica clínica
Estudios clínicos sobre el impacto del polimorfismogenético
Estudios in vitro funcionales
Estudios de la variabilidad de secuenciaen los genes candidatos
Fig. 22. Pasos necesarios para conseguir implantar una estrategia basada en el genotipado de SNPs. Fuente: Johnson, J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS inGenetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
El grado de aceptación de las tecnologías degenotipado por parte de los diferentes actoresimplicados varía en función de sus intereses ygrado de conocimiento de sus limitaciones yventajas. De esta forma, la demanda de lospacientes es la principal fuerza que impulsa haciala implantación final de las técnicasfarmacogenómicas en la práctica clínica, mientrasque las oportunidades de negocio crean un interéspor parte de la industria farmacéutica a la hora de
incluir en sus programas de I+D poyectos defarmacogenómica y nuevas líneas de negociobasadas en tests de genotipado. Otros actoresimplicados en la aplicación final de las tecnologíasde genotipado son proveedores y aseguradoras,así como las autoridades gubernamentales y lapropia sociedad. La siguiente tabla supone unarelación de las perspectivas de cada uno de losactores en cuanto a los usos de los análisisgenéticos:
59
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
El principal reto al que nos enfrentamos consiste
en documentar suficientemente la
variabilidad en la respuesta a los fármacos.
En algunos casos tan solo se requiere la
información de polimorfismos o genes, aunque en
otros casos se necesita realizar estudios
complejos con un número muy elevado de genes
o bien una aproximación genómica al problema.
Esta aproximación no se basa en el conocimiento
de la acción del fármaco, aunque la realización de
un mapa de SNP no es posible en muchas
ocasiones en el presente. Sin embargo, esta
posibilidad resultará posible en un futuro próximo
a medida que las tecnologías de genotipado sean
más rápidas y más baratas. El proyecto HapMap
permitirá conocer un gran número de secuencias
variables en el genoma humano. De hecho,
muchos mantienen que la farmacogenómica
puede ser uno de los primeros frutos que proceda
de los datos obtenidos a partir de los proyectos
del Genoma Humano y HapMap116.
• La creación de estas bases de datos requiere
por otra parte de la disponiblidad de un gran
número de muestras que sean representativas
de la población de interés. Por este motivo
varios países están poniendo en marcha
proyectos de creación de bancos de muestras
biológicas a gran escala. En el caso de España,
el Banco Nacional de ADN, ubicado en el Centro
de Investigación del Cáncer (CIC) de
Salamanca, es una iniciativa lanzada a
comienzos del año 2004 por Fundación Genoma
España, la Universidad de Salamanca y la
Consejería de Sanidad de la Junta de Castilla y
León. El objetivo principal del proyecto consiste
en la realización del mapa genético de la
población sana española y la creación de
infraestructuras a las que otros bancos e
instituciones puedan acceder. La información
obtenida se pondrá a disposición del Centro
Nacional de Genotipado así como de aquellos
centros de investigación públicos o privados que
ActoresPredicción del
riesgo a sufrir unaenfermedad
Desarrollo defármacos basadoen la variacióngenética de laenfermedad
Desarrollo defármacos basado
en la variación genéticadel paciente
Pacientes
Proveedores
Industria
Aseguradoras
Gobierno
Sociedad
Muestra de interés, perodudas respecto a su usofinal
Retos en suimplementación
Conflicto de interesesentre empresasfarmacéuticasPotencialmente sólointeresante paraempresas centradas enel diagnóstico
Conflicto de cobertura
Preocupación poraspectos reguladores ysociales
Costes y beneficiosdesconocidos
Alta demanda
Implementación másprobable
Alto interés paraempresas farmacéuticasy de diagnóstico
Alta cobertura
Poca preocupaciónacerca de aspectosreguladores y sociales
Costes y beneficiosdesconocidos
Muestra de interés, perodudas respecto a su usofinal
Desconocido, retos deimplementación variables
Conflicto de interesesentre empresasfarmacéuticasAlto interés paraempresas centradas en eldiagnóstico
Desconocido, probablecobertura
Cierta preocupaciónacerca de aspectosreguladores y sociales
Costes y beneficiosdesconocidos
EMPLEO DE ANÁLISIS GENÉTICOS EN FUNCIÓN DE LOS ACTORES IMPLICADOS
Tabla 7. Perspectivas acerca de los usos de los análisis genéticos.Fuente: Phillips, K.A.; et al. (2004). Genetic testing and pharmacogenomics: Issues for determining the impact tohealthcare delivery and costs. Am J Manag Care. 10:425-432.
116 Johnson J. A. (2003). Pharmacogenetics: potencial for individualized drug therapy through genetics. TRENDS inGenetics, Vol. 19, No. 11, November, 660-666.
lo soliciten. Su plan de trabajo en una primera
fase consistirá en crear una colección de
muestras de ADN de individuos sanos, fase que
se prolongará durante aproximadamente un año
y durante la cual se recolectarán unas 7.000
muestras procedentes de 1.300 individuos. Por
otro lado, el Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares (CNIC)117 y el Centro de
Trasplantes de Medicina Regenerativa (CENTMER)
están desarrollando iniciativas similares118.
• Actualmente los tests de genotipado que se
realizan centran su análisis en la variabilidad
genética de un único gen. Se espera que en
poco tiempo estos tests sean reemplazados por
kits de diagnóstico que contengan un panel
de diferentes genes y secuencias polimórficas
de interés que permitan realizar un análisis
completo de enfermedades complejas. Este tipo
de diagnóstico molecular será empleado con
mayor frecuencia a medida que su importancia
clínica sea establecida definitivamente, las
técnicas de genotipado estén disponibles a un
coste más bajo y se desarrolle un formato fácil
de manejar y de interpretar sus datos119.
• Los grupos de investigación que necesitan
emplear técnicas de genotipado para sus
proyectos, generalmente recurren a técnicas
más asequibles como geles de agarosa
mediante enzimas de restricción o bien PCR en
tiempo real (Roche). Estas técnicas encarecen el
coste de cada SNP identificado, elevándolo en el
caso de la PCR en tiempo real a
aproximadamente 3€ el SNP, mientras que las
plataformas de genotipado de las que
dispone el Centro Nacional de Genotipado
disminuye este coste hasta 4-25 céntimos el
SNP identificado120. Por tanto, este tipo de
plataformas a gran escala no sólo permite el
abaratamiento del coste de cada SNP, sino que
además posibilitaría el análisis de un mayor
número de muestras en menor tiempo.
• Según los expertos consultados para larealización del presente informe121, laestimación de la demanda de plataformas degenotipado dependerá en gran medida de losconsorcios entre investigadores que actualmenteexisten, así como de las políticas de apoyo a laimplementación de tecnologías de genotipadoen España. Por otra parte, es primordial señalarque aproximadamente el 70-75% de losproyectos de investigación en biomedicinaimplican labores de genotipado que hasta lafecha eran realizadas de manera rudimentariapor los propios investigadores. Estos ensayoscarecen de los controles de calidad necesariospara asegurar su validez, y por otra parteresultan demasiado caros para ser costeadospor un sólo grupo de investigación. De la mismaforma, las plataformas de genotipado de SNPsde alto rendimiento que existen en el mercadono permiten en su mayoría el empleo en laclínica, y tienen una capacidad de genotipadomuy superior a lo necesario en estos casos.
La reciente creación del Centro Nacional deGenotipado (CEGEN)122 pretende que estastareas sean encargadas al centro, que de estaforma proporcionará los controles de calidadpertinentes, y abaratará los costes finales alposibilitar la realización de ensayos a granescala mediante las plataformas másadecuadas. Para que este cambio tenga lugar nosólo es imprescindible la existencia de centrosde genotipado como el CEGEN, sino que ademáslos investigadores han de acostumbrarse apermitir que ciertos aspectos de sus proyectossean realizados por centros especializados queposean la tecnología apropiada. Según losexpertos consultados, se estima que en lospróximos años el diagnóstico de los pacientes serealice en un 50% de los casos por medio demétodos tradicionales, mientras que elporcentaje restante se realizará por medio detécnicas de diagnóstico genético, queactualmente sólo supone un 1%. Por otra parte,
60
117 CNIC (http://www.cnic.es).118 España tendrá el mayor banco de ADN de Europa. El Diario Médico. 20 de abril de 2004.119 Johnson, J. A.; Evans, W. E. (2002). Molecular diagnostics as a predictive tool: genetics of drug efficacy and toxicity.
TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 8, No. 6, June, 300-305.120 CEGEN, Costes de genotipación (http://cegen.crg.es/primera.php?que=cost&lang=cast).121 Comunicación personal del Dr. Ángel Carracedo (Universidad de Santiago, Centro Nacional de Genotipado).122 Centro Nacional de Genotipado, CEGEN (www.cegen.org).
61
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
es necesario que se realice un trabajo adecuado
de estandarización de la recogida de información
clínica con una coordinación entre los grupos de
investigación y centros hospitalarios
participantes.
• El impacto de las técnicas farmacogenómicas
como el genotipado de SNPs se pone de
manifiesto en España no sólo mediante la
participación de numerosos grupos de
investigación en proyectos a gran escala, sino
también mediante la implicación de empresas
biotecnológicas españolas. En concreto, la
empresa biotecnológica Pharmamar
perteneciente al grupo Zeltia123, puso en marcha
hace dos años un programa de investigación
farmacogenómica basado en la búsqueda de
marcadores moleculares de respuesta a
fármacos antitumorales a partir de la
información clínica y molecular generada en los
ensayos clínicos de 3 de sus fármacos
candidatos, mediante el empleo de
herramientas genómicas. Un primer estudio
tiene como objetivo el análisis de la expresión
génica y polimorfismos SNP en muestras de
tumorales de pacientes de sarcoma tratados con
Yondelis y su correlación con la respuesta y
evolución clínica del paciente. Los resultados de
estos ensayos se presentaron en septiembre del
año 2004, y anticipan la posibilidad de la
consecución de sistemas de terapia oncológica
personalizada124. Otras empresas españolas que
han introducido programas de farmacogenómica
en sus líneas de investigación son la empresa
sevillana Neocodex125, uno de cuyos objetivos es
el análisis de marcadores de susceptibilidad
genética en la población a partir de la
generación de bancos de ADN y tejidos de
pacientes con enfermedades comunes en
España.
123 Grupo Zeltia (http://www.zeltia.es).124 PharmaMar presents the first results of its pharmacogenomics anticancer drug development programme at the EORTC-NCI-AACR
Conference. 04 October 2004 (http://www.pharmamar.com/en/press/news release.cfm?newsReleaseID=89&year=2004).125 Neocodex (http://www.neocodex.es).
—
SNPs probados como marcadoresgenéticos viablesIdentificación de polimorfismospara importantes patologías
Rie
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e no c
onse
guir la
impla
nta
ción
de
la far
mac
ogen
óm
ica
Tiempo o acciones llevadas a cabo por la industria farmacéutica
Estudios de la variabilidadde secuencia en los genes candidatos
Recomendación de lafarmacogenómica en losensayos clínicos por la FDA
Empleo de kits degenotipado por partede clínicos
Fig. 22. Factores de riesgo determinantes para la implantación de la farmacogenómica y genotipado.Fuente: Tetlow, S. (2003). Successful pharmacogenomic business models. Life Science Reports. Cambridge HealthtechInstitute.
62
11. Centro Nacional de Genotipado(CEGEN)
Centro Nacional de Genotipado (CEGEN)126
Objetivo del proyecto:
El Centro Nacional de Genotipado (CEGEN) fue creado a finales del año 2003 como una iniciativa de laFundación Genoma España promovida desde los Ministerios de Sanidad y Consumo y de Ciencia yTecnología, con el objetivo de proporcionar a grupos de investigación en biomedicina pertenecientes ainstitutos, universidades, hospitales y empresas, la capacidad de realizar proyectos de genotipado deSNPs a gran escala que les permitan jugar un papel activo a nivel internacional. La duración delproyecto comprende el periodo 2003-2008, y la capacidad de genotipado prevista es de 4.000.000genotipos anuales.
Descripción del proyecto:
Inicialmente y durante el año 2004, el CEGEN llevará a cabo un total de cinco proyectos piloto degenotipado a gran escala que utilizarán las distintas plataformas de genotipado en los tres nodos. Losproyectos piloto están orientados hacia el estudio de enfermedades, tanto psiquiátricas comooncológicas, y a la investigación sobre dinámica genómica y genética evolutiva.
El CEGEN está organizado siguiendo una estructura en red que comprende tres nodos geográficamenteseparados con una dirección de coordinación única con sede en la Universidad Pompeu Fabra (UPF) enBarcelona. Los distintos nodos están basados en diferentes plataformas tecnológicas para el genotipado:
• Nodo de Barcelona gestionado por el Centro de Regulación Genómica (CRG) y la Universidad PompeuFabra (UPF). Plataforma de genotipado: “ABI PRISM 3730, SNPlex”.
• Nodo de Santiago de Compostela en la Universidad de Santiago de Compostela (USC). Plataforma degenotipado: “Sequenom Mass Array”.
• Nodo de Madrid en el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). Plataforma degenotipado: “Illumina Bead Scanner”.
Además de las tres plataformas tecnológicas citadas existe un grupo bioinformático de apoyo con sedeen la UPF en Barcelona y CNIO Madrid cuyas funciones básicas son dar soporte a los usuarios finales delcentro tanto en la fase pre-genotipación (selección de SNPs) como en la fase post-genotipado(tratamiento estadístico de genotipos).
Inicialmente y durante el año 2004, el CEGEN llevará a cabo un total de cinco proyectos piloto degenotipado a gran escala que utilizarán las distintas plataformas de genotipado en los tres nodos. Losproyectos piloto están orientados hacia el estudio de enfermedades, tanto psiquiátricas comooncológicas, y a la investigación sobre dinámica genómica y genética evolutiva. Los proyectos seránllevados a cabo por grupos liderados por investigadores de las tres sedes del CEGEN y las cuatroinstituciones participantes (CNIO, UPF, CRG y USC). El quinto proyecto piloto está dirigido porinvestigadores de una institución externa al CEGEN (Hospital Clínico de Barcelona) y tiene como misiónponer a punto los mecanismos de relación con usuarios externos al CEGEN. Todos estos proyectos pilotodeben conducir al pleno desarrollo del Centro Nacional de Genotipado previsto para el año 2005.
126 Centro Nacional de Genotipado, CEGEN (http://www.cegen.org).
63
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Nodo de BarcelonaCentro de Regulación Genómica
(CRG)-Universitat Pompeu Fabra (UPF)
Nodo de Santiago de Compostela
Universidad de Santiagode Compostela (USC)
Nodo de Madrid
Centro Nacional InvestigacionesOncológicas (CNIO)
Gestión del proyecto: Dr. Xavier Estivill(CRG) y Dr. Jaume Bertranpetit (UPF)
Gestión del proyecto:Dr. Ángel Carracedo
Recursos humanos: • Doctores: 5• Licenciados: 6• Técnicos: 2Formación mayoritaria: BiologíaMolecular y Genética.
Recursos humanos: • Doctores: 5• Licenciados: 3• Becarios: 3• Técnicos: 2Formación mayoritaria: Genéticamolecular, Genética de poblaciones.
Recursos humanos:• Doctores: 1• Licenciados: 2• FP I: 1Formación mayoritaria: Genéticamolecular, genética de poblaciones,epidemiología.
Servicios:• Extracción de ADN (Chemagic
Magnetic Separador Module1,CHEMAGEN®): capacidad de 96muestras/día.
• Cuantificación de ADN (PicoGreen,Molecular Probes): capacidad de 480muestras/día (5 placas de 96muestras).
• Genotipado a media-gran escala(SNPlex, Applied Biosystems):capacidad de 70.656genotipos/semana.
Servicios:• Extracción de ADN (FREEDOM EVO
150 (TECAN®): capacidad de 96muestras/día.
• Cuantificación de ADN (PicoGreen,Molecular Probes): capacidad de 480muestras/día (5 placas de 96muestras).
• Genotipado a media-gran escala(SNPlex, Applied Biosystems):capacidad de 70.656genotipos/semana.
• Genotipado a media-gran escala.(MassArray - Sequenom): capacidad:45.000 genotipos/semana.
Servicios:• Extracción de ADN (Magna Pure LC,
Roche): Capacidad de 32 muestras de1ml cada 2 horas.
• Cuantificación de ADN (PicoGreen,Molecular Probes): capacidad de 480muestras/día (5 placas de 96muestras).
• Genotipado gran escala (Illumina):capacidad de 200.000 - 1.000.000genotipos/semana.
• Genotipado a pequeña-media escala(sondas TaqMan): capacidad de20.000 genotipos/semana.
Equipos:• Robot para la extracción automatizada
de DNAs de 16 cabezales (ChemagicMagnetic Separador Module1,CHEMAGEN®).
• Fluorímetro para placas (Gemini XPS,Molecular Devices).
• Secuenciador automático de 96capilares (3730XL DNA Analyzer, ABI).
• Plataforma automatizada de manejode líquidos (FREEDOM EVO 150,TECAN®), con un brazo pipeteador-dispensador con cabezal de 96 pocillos(TE-MO) y un brazo dispensador de 8canales (Li-HA), así como un brazo detransporte RO-MA (TECAN®).
• Plataforma automatizada de manejode líquidos (Aquarius, TECAN®), conun cabezal de 96 pocillos.
• Estación de lavado (Power-Wash 384,TECAN®).
• 6 termocicladores duales de 384pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• 2 termocicladores duales de 96pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• 2 termocicladores de gradiente de 96pocillos (Eppendorf).
Equipos:• Robot para la extracción automatizada
de DNAs de 16 cabezales (ChemagicMagnetic Separador Module1,CHEMAGEN®).
• Fluorímetro para placas (Gemini XPS,Molecular Devices).
• Secuenciador automático de 96capilares (3730XL DNA Analyzer, ABI).
• Plataforma automatizada de manejode líquidos (FREEDOM EVO 150,TECAN®), con un brazo pipeteador-dispensador con cabezal de 96 pocillos(TE-MO) y un brazo dispensador de 8canales (Li-HA), asi como un brazo detransporte RO-MA (TECAN®).
• Plataforma automatizada de manejode líquidos (Aquarius, TECAN®), conun cabezal de 96 pocillos.
• Estación de lavado (Power-Wash 384,TECAN®).
• 6 termocicladores duales de 384pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• 2 termocicladores duales de 96pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• 2 termocicladores de gradiente de 96pocillos (Eppendorf).
Equipos:• Robot de extracción automatizada de
DNA Magna Pure LC (Roche). • Illumina Bead Scanner 500G.• 7900HT Sequencer Detection System.
Real time Taqman PCR (AppliedBiosystems).
• Plataforma automatizada de manejode líquidos Beckman FX, con un brazopipeteador-dispensador con cabezal de96 pocillos y un brazo dispensador de8 canales.
• 3 termocicladores duales de 384pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• 1 termocicladores duales de 96pocillos (GeneAmp 9700, AppliedBiosystems).
• Centrifuga 5810 sin refrigeración. • Rotor basculante A-4-81 standard
P/5810. • Minicentrifuga. • 2 bloques térmicos (Scigene). • Incubadora (Memmert). • Agitador de placas (VWR). • Microselladora (Eppendorf).
Además de los tres nodos existe un grupo bioinformático de apoyo coordinado por la UPF junto a grupos locales en los tres nodos,cuyas funciones básicas son dar soporte a los usuarios finales del centro tanto en la fase pre-genotipación (selección de SNPs)
como en la fase post-genotipado (tratamiento estadístico de genotipos).
Gestión del proyecto:Dr. Javier Benítez
64
Sistema de genotipado SNPlexTM (Applied Biosystems)
Sistema de genotipado Bead ArrayTM (Illumina)
Sondas ZipChuteTM
Paso 1:Detección
Paso 2:Análisis
Paso 3:Agrupamientode genotipos
Analizador de ADN AppliedBiosystems 3730xl
(Identificación de alelos)
Software GeneMapper versión 3.5
Sistema de genotipado MassArrayTM (Sequenom)
Paso 1: AmplificaciónPaso 2: DefosforilaciónPaso 3: Ensayo MassEXTENDTM
Paso 4: Acondicionamiento de la muestraPaso 5: Transferencia a un MicroarrayPaso 6: Análisis de la muestra
Alelo 1 Alelo 2
T/C
T/T C/C
Extensión de sondas
Fig. 24. Esquema de funcionamiento de las tres plataformas de genotipado que forman parte del CEGEN.Fuente: adaptado de http://www.illumina.com; http://www.appliedbiosystems.com; www.sequenom.com.
Tecnología BeadArrayTM
Paso 1: Extensión especifica de alelos
Paso 2: PCR
Paso 3: Captura del producto en el array
Paso 4. Lectura
65
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
El empleo progresivo en los últimos años de las
tecnologías genómicas como el genotipado de
SNPs, ha generado una ingente cantidad de datos
a la espera de ser procesados para su utilización
clínica. A corto plazo los principales objetivos se
centran en predecir la susceptibilidad a sufrir
determinadas enfermedades, así como la
probabilidad de identificar las diferentes
respuestas a un fármaco para cada paciente. A
largo plazo, se pretende mejorar la calidad del
diagnóstico médico y administración de
fármacos127, mediante la práctica de una medicina
personalizada. Por tanto, las aplicaciones
principales de las técnicas de genotipado en salud
humana se centran en el diagnóstico preventivo,
la farmacogenómica y el desarrollo de nuevos
fármacos.
La identificación de variantes genéticas que se
correspondan con marcadores de enfermedad o
respuesta a fármacos requiere la búsqueda de
millones de SNPs en el genoma humano, con el
fin de encontrar aquellos que demuestren su
validez como marcadores de utilidad desde el
punto de vista clínico. Este proceso es costoso y
requiere la práctica de técnicas de genotipado a
gran escala, además del acceso a poblaciones de
pacientes bien caracterizadas128. Por otra parte,
ha de desarrollarse una sofisticada metodología
informática para poder interpretar y manejar los
datos derivados del genotipado, así como conocer
de manera detallada los complejos mecanismos
de la enfermedad129.
El campo de la farmacogenómica, la adopción de
métodos de asociación genética basados en el
estudio de haplotipos será una de las
tendencias que a medio plazo se podrá apreciar.
Para ello es indispensable el desarrollo de
métodos matemáticos e informáticos que
permitan detectar interacciones entre genes, así
como métodos que posibiliten el intercambio de
información entre bases de datos relevantes130. La
participación española en la segunda fase del
Proyecto Genoma Humano, también conocida
como HapMap, a través del Centro Nacional de
Genotipado supone un punto clave que permitirá
a España situarse dentro de los grupos de
investigación internacionales líderes en
tecnologías de genotipado. Por otra parte, la
participación española en el proyecto HapMap
posibilitará a los investigadores la obtención de
una gran cantidad de genotipos en tiempos cortos
y a un precio mucho más económico que con las
tecnologías tradicionales empleadas hasta la
fecha.
Gran parte de los expertos implicados en las
tecnologías que conllevan el desarrollo de
nuevos fármacos perciben un incremento
paulatino de los costes totales, tendencia que no
se acompaña con la disminución observada en los
retornos de inversión. Por otro lado, la existencia
de patentes de secuencias de ADN que forman
parte de tests farmacogenómicos o son
empleados en el desarrollo de nuevos fármacos,
afectan igualmente a los costes de licencia y
negociaciones derivadas de su uso. Esta situación
pone de manifiesto un escenario que supone una
amenaza a tener en cuenta por la industria
farmacéutica en los próximos 10 años131. Según el
grado de optimismo de las previsiones
económicas, se estima que los costes totales de
desarrollo de nuevos fármacos basándose en
técnicas farmacogenómicas podrían verse
reducidos en unos porcentajes variables que
oscilan entre el 9 y el 38%. Además, la aplicación
de estrategias de genotipado durante los ensayos
clínicos podría generar un entorno más positivo
que posibilitara la reducción de la tasa de
fracasos de fármacos candidatos. Estas
estrategias serían de gran valor para aquellos
medicamentos con una alta probabilidad de
provocar reacciones adversas medicamentosas,
así como en tratamientos a largo plazo, en los
cuales los efectos secundarios sólo pueden ser
observados tras años de tratamiento. Por tanto,
una de las aplicaciones de las tecnologías de
12. Conclusiones
127 Tollman, P.; et al. (2001). A Revolution in R&D. How genomics and genetics are transforming the biopharmaceuticalindustry. BCG Report. The Boston Consulting Group, Inc.
128 Collins, F. S. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature, Vol. 422, 24 April.129 Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001). Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. TRENDS
in Biotechnology, Vol. 19, No. 12, December, 491-496.130 Collins, F. S. (2003). A vision for the future of genomics research. Nature, Vol. 422, 24 April.131 Lesko, L. J.; Woodcock, J. (2002). EEL (Ethical, Economic, Legal & Social) Article. The Pharmacogenomic Journal 2, 20-24.
genotipado descritas en el presente informe como
“descubrimiento y desarrollo de nuevos
fármacos”, puede dar lugar a las aplicaciones
relacionadas más directamente con el desarrollo
de nuevos productos de valor comercial, como las
relacionadas con el diagnóstico predictivo y los
tests farmacogenómicos.
De las posibles aplicaciones clínicas de las
técnicas de genotipado, la farmacogenómica es
la que muestra mayores perspectivas de
implantación a corto plazo. Esta aplicación
consiste por un lado en la estratificación de los
pacientes en función de su genotipo, lo que
contribuye a incrementar el tamaño del mercado
mediante el ajuste de la dosificación de los
fármacos. Una segunda estrategia consiste en la
estratificación de la enfermedad en función del
genotipo del paciente, lo que en permitiría la
salida de nuevos fármacos dirigidos a segmentos
de la población para los cuales los medicamentos
actuales no resultan eficaces. Por otra parte,
terapias basadas en perfiles genéticos individuales
proporcionarían beneficios generales a la salud
pública, ya que sería posible gestionar más
eficientemente los riesgos que se presentan una
vez que el fármaco ha sido aprobado, y por tanto
disminuyendo la posibilidad de que éste provoque
efectos secundarios no descritos previamente y
que en ocasiones presentan consecuencias graves
para salud de los pacientes.
En cuanto al aspecto que concierne a la
regulación de los estudios farmacogenómicos
durante los ensayos clínicos, la postura de la
agencias reguladoras será determinante para la
implementación de las tecnologías de genotipado
en el proceso de desarrollo de un nuevo fármaco.
Actualmente existen numerosos ejemplos de
codesarrollo de fármacos junto con métodos de
diagnóstico basados en tecnologías de genotipado.
Aunque sería deseable que las agencias
reguladoras instasen a las compañías
farmacéuticas a realizar este codesarrollo, esta
situación sólo tendría lugar en aquellos casos en
los que el potencial fármaco mostrase eficacia
únicamente en un subconjunto de la población. Por
otra parte, la posibilidad de analizar la
predisposición a desarrollar efectos secundarios
severos, eliminaría a estos individuos de los
ensayos clínicos y terapia, mejorando el perfil de
seguridad del fármaco. Esta estrategia permitiría a
las agencias reguladoras la aprobación de fármacos
que en otras condiciones serían desestimados por
falta de efectividad o seguridad.
Las estrategias de la industria farmacéutica en el
desarrollo y comercialización de nuevos fármacos
sufrirán un cambio significativo durante los
próximos 10 años debido a la ralentización de las
expectativas económicas del sector. Como
consecuencia, cada vez será más frecuente
encontrar empresas farmacéuticas cuya estrategia
se base en la comercialización de fármacos
junto con un test de genotipado. La
combinación de un fármaco con su test
correspondiente proporcionaría por tanto un valor
añadido a fármacos que por sí mismos no
generían una nueva oportunidad de negocio.
Los avances tecnológicos de los últimos años han
permitido el desarrollo de nuevas plataformas
de genotipado de alto rendimiento,
disminuyendo los costes de genotipado
significativamente hasta valores cercanos
a 1 céntimo por SNP. De esta forma, se ha visto
reducido el alto coste que suponían las
estrategias de genotipado del genoma completo.
Debido a la diversidad de tecnologías y
plataformas de genotipado es posible elegir
aquellas cuyo rendimiento y coste se ajuste más
a las necesidades del ensayo. Por tanto se puede
decir que no existe un método de genotipado
ideal de utilidad en todas las aplicaciones, y los
retos a los que se enfrenta en la actualidad la
ciencia consistirán en incrementar la velocidad del
proceso, reducir el coste de los ensayos, así como
desarrollar múltiples ensayos en paralelo
(multiplexado), realizando mejoras en la
bioquímica, ingeniería y software analítico.
La puesta en marcha de programas de desarrollo
de nuevos agentes terapéuticos por medio de
estrategias farmacogenómicas se está
implementando paulatinamente en el caso de
disciplinas tales como la oncología, donde los
análisis genéticos se encuentran más extendidos
en la práctica clínica. Para el resto de áreas como
por ejemplo las patologías psiquiátricas,
enfermedades neurodegenerativas, autoinmunes y
trastornos cardiovasculares, los programas de
farmacogenómica como parte integrante del
proceso de I+D de desarrollo de nuevos fármacos
suponen todavía un reto, y su implementación
probablemente dependerá de los resultados
observados en fármacos anticancerígenos.
Es evidente que la industria farmacéutica invierte
cada vez más en proyectos relacionados con
técnicas farmacogenómicas como el genotipado
de SNPs, actividad que se pone de manifiesto en
las colaboraciones con consorcios públicos o
66
67
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
privados, centros de investigación yuniversidades, así como acuerdos puntuales entrelas propias empresas competidoras del sector. Esesencial que se produzcan colaboracionessemejantes entre el sector industrialbiotecnológico y farmacéutico, con centros deinvestigación y hospitales españoles, en los cualesse están desarrollando líneas de investigación demuy diversa índole relacionadas con la prácticadel genotipado. En este sentido, existen iniciativasprometedoras de reciente creación como el CentroNacional de Genotipado (CEGEN) creado porGenoma España, que ofrece servicios degenotipado a gran y pequeña escala a grupos deinvestigación y empresas; y el nuevo Instituto deMedicina Predictiva y Personalizada, que será unode los pilares de la nueva biorregión catalana, ycuyo objetivo consiste en el desarrollo de técnicasde diagnóstico molecular que permitan determinarel perfil genético de cada paciente, así como elestudio de las bases moleculares de la respuestade fármacos. Por otra parte, a finales de enerodel 2005 se creó la Sociedad Española deFarmacogenética y Farmacogenómica, que tieneentre sus objetivos establecer los caucesnecesarios para que la industria farmacéuticapueda entrar en contacto con los gruposinvestigadores.
Tal y como se recoge en el Anexo I del presenteinforme, los proyectos de investigaciónespañoles se encuentran predominantementeenfocados a la identificación de polimorfismosrelacionados con patologías de alta incidencia enla población, destacando sensiblemente el cáncercon aproximadamente un 30% del total deproyectos identificados, y seguidos en relevanciapor trastornos cardiovasculares y lasenfermedades autoinmunes, con una participaciónde en torno al 17 y 12% respectivamente.Adicionalmente, los trastornos psiquiátricos,enfermedades neurodegenerativas y diabetes,constituyen ámbitos de interés para los grupos deinvestigación españoles, dando lugar aaproximadamente el 10% del total de proyectos
cada uno. Otras patologías que se estudian
mediante estrategias de genotipado son la
esterilidad, el SIDA o la osteoporosis, con un
número menos significativo de proyectos de
investigación. Finalmente, la contribución de
proyectos de investigación con participación
española relativos a estudios poblacionales de
polimorfismos de ADN de interés supone un 4%
del total de grupos de investigación españoles.
Para realizar este tipo de análisis es necesaria la
existencia de una base de datos de pacientes que
hayan mostrado algún tipo de toxicidad
relacionada con la administración de
medicamentos. Por otra parte, es indispensable la
creación de un sistema de recogida de muestras
biológicas que permitan el almacenamiento de
datos genéticos necesarios para caracterizar
poblaciones. Iniciativas de este tipo como es el
caso del Banco Nacional de ADN, permitirán en
un futuro conocer el perfil genético de la
población española y las diferencias que puedan
existir asociadas a las patologías más prevalentes,
tales como las cardiovasculares o el cáncer.
En un futuro, el médico podrá acceder al perfil
genético del paciente almacenado en un soporte
informático, junto con información sobre su estilo
de vida, y los resultados de los análisis moleculares
y tests de monitorización. Estos datos permitirán
establecer unos baremos que indiquen la
probabilidad de que el paciente desarrolle alguna
de las enfermedades crónicas más comunes. Los
determinantes genéticos de los efectos de los
medicamentos permanecen estables a lo largo de
la vida de pacientes y, por tanto, tan solo sería
necesario realizar los tests genéticos una vez en la
vida, es por ello que el objetivo de la medicina del
futuro será por tanto fundamentalmente
preventivo. De esta forma, los médicos
recomendarán modificaciones en el estilo de vida y
terapias profilácticas en función de la
susceptibilidad del paciente a desarrollar diferentes
enfermedades crónicas a lo largo de su vida.
68
ANEXO I. Proyectos españoles en genotipado de SNPs y farmacogenómica
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado
Centro oempresa
Instituto deInvestigacionesBiomédicas(CSIC-UAM)
Departamento
Bioquímica
Biologíamolecular ycelular del cáncer
Biologíamolecular ycelular del cáncer
Centros de Investigación pertenecientes al CSIC
Título del proyecto
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetestipo 2 mediante aplicación de transcriptómica, genómicafuncional y análisis masivo de SNPs.
Patología molecular de tumores del sistema nervioso:correlaciones clínico-analíticas de posible significado predictivo
Patología molecular de los tumores sólidos infantiles.Aportación al diagnóstico y a la individualización deltratamiento
Diseño de un microchip de cDNA para la detección deresistencia a la quimioterapia en pacientes con cáncer depulmón
Tecnología: identificación de cinco nuevos polimorfismos deun sólo nucleótido (SNPs) en el gen del retinoblastoma(RB1). Estos SNPs pueden ser utilizados como marcadoresgenéticos del locus RB1 o como marcadores de pronósticoclínico en pacientes con retinoblastoma y otros tumoresdependientes de RB1
Duración
2002-2004
1998-2001
2003-2005
2001-2003
—
Financiación
PN
FIS
FIS
PN
—
Desarrollo de un microarray específico para laidentificación de alteraciones genéticas con valordiagnóstico y pronóstico en tumores sólidos infantiles
2003-2003 PN
Estudio de los factores moleculares predictivos derespuesta al tratamiento de cáncer no microcítico depulmón mediante análisis del transcriptoma a través demicroarrays
2002-2004 FIS
Estudio de los factores moleculares predictivos derespuesta al tratamiento de cáncer no microcítico depulmón mediante análisis de las rutas de muerte ysupervivencia celular
2003-2004 CAM
Genómica del cáncer: Genotipado de tumores (Red deCentros) 2002-2005 FIS
Red Temática de Investigación Cooperativa de Centros deCáncer: Genómica del Cáncer. Genotipado de Tumores 2003-2003 FIS
Regulación de laexpresión génica
Línea: estudio genómico mediante microarrays de DNAde patologías relacionadas con la resistencia a insulina
Línea: estudio de asociación genética a genes candidatospara el Síndrome de Ovario Poliquístico
Centro deInvestigacionesBiológicas(CIB-CSIC)
Biología celular ydel desarrollo
Desarrollo de SNPs y biochips aplicables al diagnósticomolecular de la esterilidad humana 2001-2001 PN
Biotecnología
Desarrollo de SNPs y biochips aplicables al diagnósticomolecular de la esterilidad humana 2002-2002 PN
Biotecnología
Análisis de genes implicados en la patogenia de ladiabetes mellitus no insulin-dependiente: papel del IRS-1 y del receptor de sulfonilureas
1997-1999 CAM
Institutode Biomedicinade Valencia(IBV-CSIC)
Unidad de PatologíaMetabólicaExperimental
Regulación de la transcripción por glucosa en células betapancreáticas. Estudio de polimorfismo en patologíashumanas
2000-2003 MEyC
Unidad deGenéticaMolecular
Identificación y caracterización de dianas terapéuticasrelacionadas con la enfermedad de Parkinson 2002-2003 FRA
Caracterización genómica y proteómica de la enfermedadde Parkinson. 2002-2005 PN
Genética Molecular de las demencias familiares 2000-2001 GeneralitatValenciana
Análisis genético de la esclerosis múltiple en España 2000-2002 MSyC
(Continúa en página siguiente)
69
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
Institutode Biomedicinade Valencia(IBV-CSIC)
Departamento
Unidad deGenética yMedicina Molecular
Centros de Investigación pertenecientes al CSIC
Título del proyecto
Aproximación genética al estudio de las enfermedadesneurológicas: genes, modelos animales y epidemiologíagenética
Duración
2001-2003
Financiación
Biología, clínica y terapia de las ataxias cerebelosas:genética y genómica funcional y comparada 2003 FIS
Centrode BiologíaMolecularSevero OchoaCBMSO (CSIC)
Bioquímica yBiologíaMolecular
Factores genéticos de la enfermedad de Alzheimeresporádica 2000-2000 CAM
Genes de susceptibilidad para la enfermedad deAlzheimer 2002-2004
Obra SocialCaja de
Madrid/AFAL
Analisis molecular de la enfermedad de Alzheimer 2001-2003 CAM
IPBLN, Institutode Parasitologíay BiomedicinaLópez-Neyra(CSIC)
Biología Celular eInmunología
Marcadores inmunogenéticos de susceptibilidad/severidaden la artritis reumatoide 2000-2003 PN
Determinación de la expresión génica global en células Timplicadas en esclerosis múltiple 2002-2005 FIS
Bases farmacogenéticas de la eficacia clínica y toxicidaddel metotrexato en la artritis reumatoide 2003-2006 FIS
Marcadores inmunogenéticos de susceptibilidad/severidaden la artritis reumatoide 2000-2003 CICYT
Líneas: estudio de las bases genético-moleculares de lasusceptibilidad/severidad de las enfermedadesautoinmunes (artritis reumatoide y espondilitisanquilosante) e infecciosas (brucellosis y enfermedad deChagas). Identificación y caracterización de marcadoresinmunogenéticos de riesgo/progresión. Diseño ydesarrollo de nuevos métodos de tipificación depolimorfismo en genes candidatos.
— —
Estudio de las bases moleculares de la susceptibilidad y/oprogresión de la artritis reumatoide: búsqueda de nuevosmarcadores inmunogenéticos
1997-2000 CICYT
Inst. de Catálisisy Petroquímica(CSIC)
Biocatálisis Desarrollo de una plataforma tecnológica defarmacogenómica funcional basada en DNA microarrays 2001-2001 PN
Biotecnología
Instituto deBiología yGenéticaMolecular (U. deValladolid-CSIC)
Facultad deMedicina Línea: diagnóstico genético del cáncer — —
Instituto delFrío (CSIC) —
Evaluación de la capacidad antioxidante del plasma enuna población de pacientes con enfermedad de Alzheimerestratificada por los polimorfismos de riesgo genético
2000 CAM
Centro deInvestigacióndel Cáncer (CIC)
Servicio deOncologíaMédica
Línea: estudios de determinación de genes desusceptibilidad familiar al cáncer de mama — —
(Continúa en página siguiente)
70
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa Departamento
Universidades
Título del proyecto Duración Financiación
Bioquímica i deBiologiaMolecular
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetesde tipo 2 mediante la aplicación de transcriptomica,genómica funcional y análisis masivo de SNPs
2002-2004 PN
Ciència Animal idels Aliments Equip automàtic d'anàlisi de SNPs per Pyrosequencing 2003-2004 UAB
Psiquiatria iMedicina Legal
Farmacogenòmica del tractament de les malaltiesmentals greus 2001-2003 TV3
Universidad de Barcelona
Bioquímica iBiologia Molecular(Farmacia)
Perfil genómico de la resistencia al metotrexato;mecanismos moleculares de regulación de la DHFR yreparación génica
2002-2005 CICYT
HemopatologíaLaboratorio dePatología,Hospital Clìnic
NODO IDIBAPS Red centros de cáncer. Investigación decáncer. Genómica de cáncer. Genotipado de tumores 2003-2005 MSyC
AnatomíaPatológica
Línea: mecanismos genéticos y moleculares en eldesarrollo y progresión de tumores humanos — —
Hospital ClínicServicio deEndocrinología yNutrición
Aproximación a las diferencias clínicas, metabólicas ygenotípicas de la Diabetes mellitus tipo 1A(inmunológica) y la Diabetes mellitus tipo 1B (idiopática)(PI020318)
2002-2002 FIS
Genética
Bases genéticas de la osteoporosis: estudios deasociación y estudios funcionales de nuevospolimorfismos en los promotores de genes candidatos(PM99-0131-C02-02)
2000-2002 CICYT
Microbiologia iParasitologiaSanitàriesFisiopatologia iTractament de lesMalaltiesRespiratòries
Resistencia de Mycobacterium tuberculosis en el área deBarcelona. Caracterización fenotípica y genotípica.Detección directa en muestra clínica.
2002-2004 FIS
Medicina
Nuevos estudios inmuno-genotípicos en la clasificación ytratamiento de la leucemia aguda mieloide (LMA) ysíndromes mielodisplásicos (SMD). Neoplasiashematológicas (LMA) y (SMD)
2003-2003 MSyC
Departaments dela Fundació Clínic
Receptors polimòrfics del sistema immune innat (MBL,TLR) i susceptibilitat a infeccions bacterianes en pacientsinfectats pel VIH: un estudi de casos i controls
2003-2005FundacióLa Marató
de TV3
Departaments dela Fundació Clínic
Estudio genético y molecular de la hipertensión arterialesencial. Análisis de genes candidatos de la regulación dela reabsorción renal de sodio
1997-1999 FIS
Salut Pública Genotipaje de GSTM3 y GSTM1 A/B en relación con lasusceptibilidad individual al cáncer de pulmón 1997-1997 FIS
FarmacologíaClínica, HospitalClínico deBarcelona
Polimorfismos taqla, taqlb Y -141C Del/Ins en el gen d2del receptor de la dopamina y susceptibilidad a sufrirefectos extrapiramidales inducidos por antipsicóticos enpacientes con esquizofrenia
2002-2004FundacióLa Marató
de TV3
(Continúa en página siguiente)
UniversidadAutónoma deBarcelona
MedicinaBases genéticas de la osteoporosis: estudios deasociación y estudios funcionales de nuevospolimorfismos en los promotores de genes candidatos.
2000-2003 CICYT
Facultad deVeterinaria,Bioquímica yBiologíaMolecular
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetesde tipo 2 mediante la aplicación de transcriptómica,genómica funcional y análisis masivo de SNPs
2002 PN
Medicina Impacte dels marcadors genetics sobre el pronostic ievolucio del cancer del epitelio folicular de tiroides FIS
71
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Psiquiatria iPsicobiologiaClínica
Marcadores genéticos individuales como predictores de larespuesta al tratamiento farmacológico en la depresiónmayor: análisis genético combinado de los polimorfismoscyp2d6 y cyp2c19 y del gen sert
2000-2001 FIS
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
Universidad de Barcelona
Departamento
Departaments dela Fundació Clínic
Universidades
Título del proyecto
Importancia de los polimorfismos geneticos de lasglicoproteinas plaquetarias que intervienen en laadhesion (Ib-alfa y Ia/IIa) en el desarrollo dearteriosclerosis prematura y trombosis en los pacientescon síndrome antifosfolipídico)
Duración
2000-2001
Financiación
FIS
Departaments dela Fundació Clínic
Papel de los inhibidores de la fibrinolisis y suspolimorfismos genéticos en la incidencia y evolución delos síndromes coronarios agudos
2002-2005 FIS
MedicinaEfectos de los polimorfismos genéticos del sistemarenina-angiotensina-aldosterona en la presentaciónclínica y evolución de la miocardiopatía alcohólica
2002-2005 FIS
Genética Línea: desarrollo de herramientas bioinformáticas para elestudio de la evolución molecular — —
Bioquímica yBiologíamolecular
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetesde tipo 2 mediante la aplicación de transcriptómica,genómica funcional y análisis masivo de SNPs
2002-2004 PN
Genes de susceptibilidad a la diabetes de tipo 2 y dianasen la terapia antidiabética: DOR y SSAO/VAP-1 2002-2004 PN
Development of bioinformatic tools for the study ofmolecular evolution — —
UniversidadPompeu Fabra
CienciesExperimentals IDe La Salut -Unitat de BiologiaEvolutiva
A multiple candidate-gene, high-density SNP scanningapproach to assessment of genetic susceptibility inchronic obstructive lung disease
2001-2004 U.E.
Genomic variation in the Spanish population: defining thehaplotypes for genomic regions of biomedical interest anddevelopment of a high-throughput genotyping resourcenetwork
— —
Línea: Diversitat i dinàmica del genoma (Variació mundialdel desequilibri de lligament (LD) en regions gèniques) — —
Detección de Selección en Genes de Interés Evolutivo 2004 GenomaEspaña
Universitat de Lleida
Ciencias MedicasBásicas
Proyecto coordinado: variabilidad del locus VDR yprogresión de la infección por el VIH. Subproyecto a:progresión a SIDA y expresión de interleucinas ycorreceptores en pacientes VIH+ según su genotipo VDR
2002 FIS
Universitat de València
MedicinaPreventiva
Susceptibilidad genética y estilos de vida como factoresde riesgo cardiovascular en población de la comunidadvalenciana
2000 FIS
Universidad de Zaragoza
AnatomíaPatológica, MedicinaLegal y Forense yToxicología
Análisis de la variabilidad en población aragonesa depolimorfismos microsatélites del cromosoma Y.Aplicaciones médico-forenses
1999-2001 Gobierno deAragón
Universidad de Salamanca Medicina Estudio de polimorfismos asociados con el alcoholismo en
la población de Castilla y León 1999-2000Junta
de Castillay León
Universidadde Málaga
Bioquímica yBiologíaMolecular
Polimorfismos genéticos asociados a la enfermedadcardiovascular y su significación genético-epidemiológica.Expresión funcional de genotipos combinados por sureflejo en los parámetros bioquímicos del SRAA y RECEP
1998-1999 CICYT
Universidad ReyJuan Carlos Bioquímica
Tecnología: riesgo cardiovascular en pacientes diabéticosmediante el genotipado de genes relacionados con eldesarrollo de la enfermedad
— —
(Continúa en página siguiente)
72
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa Departamento
Universidades
Título del proyecto Duración Financiación
UniversidadAutónoma de Madrid
MedicinaEstudio del valor pronóstico del polimorfismo de losmicrosatélites del TNF- alfa y de su producción in vitro enpacientes con artritis reumatoide de reciente comienzo.
2000-2002 Schering-Plough S.A.
BiologíaLínea: bases genéticas y moleculares de enfermedadespsiquiátricas (maniacodepresión, ludopatía y suicidio).Genes de susceptibilidad en enfermedades psiquiátricas
— —
Farmacología yterapeútica (HUla princesa)
Línea: farmacogenética del metabolismo de fármacos — —
BioquímicaIdentificación de genes de susceptibilidad a la diabetesde tipo 2 mediante la aplicación metrascriptomica.Genómica funcional y análisis masivo de SNPs
2002-2004 PN
Medicina,Servicio deReumatología
Research of genetic factors predisposing to rheumatoidarthritis 1996-1998 U.E.
Evolving evidence based treatment strategies for infantilehyperinsulinism using clinical, genetic and cell biologicalinsights into a heterogenous disease
2001-2004 U.E.
Fac. Medicina,Unidad deInmunología
Novel methods for predicting preventing and treatingattacks in patients with hereditary angioedema 2002-2005 U.E.
Universidade de Santiago de Compostela
AnatomíaPatolóxica eCienciasForenses
Genes implicados en la susceptibilidad al cáncer de mama 2004 Genoma España
Desarrollo de grandes multiplexes de SNPs decromosoma y para su análisis mediante “DNAmicroarays” con fines forenses.
2002-2005 PGI y DT
Diagnóstico genético de la Miocardiopatía hipertróficafamiliar (en colaboración con el CHU Juan Canalejo de ACoruña)
2004-2005 —
Identificación de genes implicados en susceptibilidad atrastornos psiquiátricos (en colaboración con el nodo deBarcelona del CEGEN y el Institut Universitari dePsiquiatría Pere Mata de Reus)
2004-2006 FIS-CEGEN
(Continúa en página siguiente)
Estudio de factores genéticos relacionados con eldesarrollo de hipertrofia ventricular izquierda enpacientes con hipertensión arterial (en colaboración conel CHU Juan Canalejo)
2004-2006 —
Construcción de un chip de ADN para el diagnóstico de laretinosis pigmentaria autosómica recesiva y la amaurosiscongénita de Leber (en colaboración con Universitat deBarcelona)
2004-2005 ONCE
Uso de la tecnología SNPlex para análisis forenses 2004-2005
Instituto de Medicina
Forensede Oslo
UniversidadComplutense
Microbiología,Fac. Farmacia
Servicios Técnicos: secuenciación de DNA, análisis defragmentos de DNA: genotipado, PCR cuantitativa (Q-PCR),microarrays de DNA
— —
InstitutoPluridisciplinar
Línea: polimorfismo génico de dianas de psicofármacos.el transportador de serotonina como diana deantidepresivos selectivos de la recaptación de serotoninaen el tratamiento de la bulimia nerviosa
— —
UniversidadSan Pablo Microbiología
Estudio de marcadores moleculares y resistencia aantibióticos en microbiota normal y patógena de origenhumano y animal
2002-2004UniversidadSan Pablo-
CEU
73
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
Universidade de Santiago de Compostela
Departamento
Universidades
Título del proyecto Duración Financiación
Fisiología Línea: farmacogenómica — —
MedicinaHigh throughput analysis of single nucleotidepolymorphisms (SNPS) for the forensic identification of persons
2002-2002 U.E.
Genética Línea: tecnologías de genotipado en loci microsatélites — —
Inst. MedicinaLegal
Polimorfismos de ADN microsatelite (STRS) autosómicos,polimorfismos de cromosoma y y polimorfismos de ADNmitocondrial en la población de Galicia Oriental (comarcasde la montaña de Lugo y Orense): análisis genético
1999 Xuntade Galicia
Bioloxía Animal.AntropoloxíaBiolóxica:Estructura eEvolución dasPoboacións
Líneas: polimorfismos xenético-moleculares; xenética depoboacións humáns: biodemografía — —
Medicina.Laboratorio deInvestigación enNefroloxía
Líneas: secuenciación automática de DNA, detección demutacións, bioinformática, polimorfismos SNPs — —
Universidadde Extremadura
Facultad de MedicinaDepartamento de Farmacologíay Psiquiatría
Metabolism and Clinical Effects of Psychotropic Drugs -From molecular genetics to patient care 1996-1999 U.E.
Identificación precoz de factores responsables de lavariabilidad interindividual en el metabolismo defármacos en el hombre
1997 DGES
Early identificacion of factors responsible for interindividualvariability in the metabolism of drugs in man 1997 U.E.
Análisis de factores genéticos y ambientales en lacaracterización del tabaquismo como factor de riesgo enel cáncer de pulmón
— FIS
CYP2D6 y CYP2C9: diferencias interétnicas y relación conla personalidad 2003 PN
biomedicina
Universidadde Oviedo
Unidad dereumatologíaHospital MonteNaranco
Euroas: European Genomic Bank and Clinical, Genetic and Immunogenetic Databases of AnkylosingSpondylitys and the other Spondylarthropathes
2002-2005 U.E.
Inst. Univ.Oncología
Susceptibilidad genética individual y factoresambientales, ocupacionales y de estilos de vida en laetiología y pronóstico del cáncer de pulmón en Asturias
2001 FIS
(Continúa en página siguiente)
Universidadde Cantabria
BiologíaMolecular
Estudio genético y funcional de mutaciones asociadas ahipoalfalipoproteinemia y riesgo aterogénico 1996-1999 CICYT
Estudio de Factores genéticos antiaterogénicos asociadosa la expresión de ApoE — FIS
Genética de la Apolipoproteína E y proteínas asociadas — FIS
Genética de Hiperlipidemias (red) — FIS
Fisiología yFarmacología,Genética Forense
Estudio preliminar de la utilidad del análisis depolimorfismos de ADN en la valoración de la reducción dedaño mediante un programa de intercambio de jeringuillasen población usuaria de drogas por vía parenteral
2002 —
Valoración estadística de análisis genotípicos de muestrasbiológicas 2002 —
74
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa Departamento
Universidades
Título del proyecto Duración Financiación
Universitat de les IllesBalears
Genética
Plataforma de genotipación para la identificación defactores genéticos implicados en la susceptibilidad y en larespuesta farmacológica de las enfermedades mentales.Red de genotipación y psiquiatría genética. Proyecto:marcadores de vulnerabilidad genética y neurobiológicade los trastornos esquizofrénicos y esquizoafectivos enlas islas Baleares
2003-2003 —
Universidad de Las Palmas
Ciencias Médicasy Quirúrgicas
Influencia del polimorfismo genético en la evolución de lamasa ósea en el hiperparatiroidismo primario 1999-2001 FIS
Universidad de Murcia
Bioquímica,BiologíaMolecular eInmunología
Genes reguladores de la melanización. Relacionesfenotipo-genotipo 2001-2004 PN
Universidad de Navarra
Neurociencias
Líneas: modificación de la expresión génica por el estrés.Estudio genético y farmacológico de la enfermedad deHuntington. Factores genéticos e influencia del estrés enel desarrollo de la esquizofrenia
— —
—
Estudio sobre la asociación de los polimorfismosgenéticos que codifican los receptores de péptidosnatriuréticos y diferentes fenotipos clínicos de pacientescon hipertensión esencial
2001 —
Psiquiatría yPsicología Médica
Análisis de polimorfismos genéticos en los genes de laHistamina 2, receptores y transportadores de serotoninaen pacientes afectos de esquizofrenia y su relación con larespuesta al tratamiento antipsicótico.
2002-2003 Gobiernode Navarra
BiologíaCardiovascular
Evaluación de nuevos polimorfismos de la NAD(P)Hoxidasa vascular como marcadores genéticos de riesgode estrés oxidativo en las enfermedadescardiovasculares.
2002-2004 Gobiernode Navarra
Fisiología ynutrición
Estudio de genes candidatos sobre la susceptibilidad aldesarrollo de obesidad 2004-2005 FCRG
Universidad de Sevilla
BioquímicaMédica y BiologíaMolecular
Línea: análisis de marcadores genéticos asociados a lasformas remitentes recidivantes de esclerosis múltiple.Colaboración en el proyecto Europeo GAMES.
— —
UniversidadMiguelHernández
Instituto deBiología Moleculary Celular
Línea: marcadores tempranos de resistencia antitumoral. 2005 Lab. Indas
Citología eHistología Normaly Patológica
Línea: evaluación de la predisposición genética al riesgode extensión del infarto agudo de miocardio. — —
(Continúa en página siguiente)
Universidad de Granada
Bioquímica yBiologíaMolecular
Marcadores inmunogenéticos de susceptibilidad/severidaden la artritis reumatoide 2000-2003 CICYT
Bases genético-moleculares de la artritis reumatoide:identificación de marcadores genéticos de predisposicióny pronóstico
2003 PNbiomedicina
Medicina legal ytoxicología
Líneas: polimorfismos del DNA aplicado a las cienciasforenses. Marcadores de alcoholismo crónico. Técnicasbioquímicas aplicadas al diagnóstico postmortem dealcoholismo
— —
75
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa Departamento
Otros Centros de Investigación
Título del proyecto Duración Financiación
Instituto deSalud Carlos III(ISCIII)
Centro Nacionalde Microbiología,Unidad deVirologíaMolecular
Aplicación de un ensayo fenotípico de susceptibilidad aantirretrovirales frente al VIH-1 al estudio de laresistencia en aislados de pacientes en tratamiento. Redde investigación en SIDA (RIS)
— —
Área deBioinformáticaMédica
Línea: SNPs, haplotipos, farmacogenética, medicinapersonalizada — —
Instituto deInvestigacionesBiomédicasAugust Pi iSunyer(IDIBAPS)
Hospital Clínicoe IDIBAPS
Red de centros de Genética Clínica y Molecular.Integración de la Investigación Clínica, Molecular yEpidemiológica en Genética Humana
2003-2005 MSyC
—Estudio genético de susceptibilidad a melanoma:correlación genotipo-fenotipo y aplicación al diagnósticoprecoz en familias y pacientes con melanoma múltiple
2001-2003 FIS
Agresiónbiológica ymecanismos derespuesta
Línea: genética toxicológica — —
Oncología yhematología
Línea: marcadores de riesgo de cáncer. Línea deepidemiología biológica basada en el estudio depolimorfismos en genes que codifican enzimas implicadasen el metabolismo de carcinógenos (GSTm1, GSTT1,GSTP1 y NQO1
— —
Institut CatalaD'oncologia
ServeiD'epidemiologia iRegistre delCancer
Environmental factors, Helicobacter Pylori Infection,Genetic Suceptibility and the Gastric Cancer Risk in theEuropean Population
2001-2004 U.E.
Fundación parala InvestigaciónMédicaAplicada,Universidad deNavarra
Histología yAnatomíaPatológica
The use of molecular biomarkers in early lung cancerdetection 2002-2005 U.E.
Centre deRegulacióGenòmica(CRG)
—
Identificación y caracterización de Genes y Proteínasinvolucrados en la audición. Epidemiología Genética.Correlación Genotipo-Fenotipo-Bases Genéticas yMoleculares de los Trastornos de Audición
2003-2005 FIS
Estudio de vías funcionales en enfermedadespsiquiátricas 2003-2005 FIS
Development of high-troughput molecular tools for theanalysis of segmental duplications inneurodevelopmental, neurological and behavioraldisorders, and study of genomic variability andsusceptibility to human disease
2004 GenomaEspaña y FIS
Plataforma de genotipación para la identificación defactores genéticos implicados en la susceptibilidad y en larespuesta farmacológica de las enfermedades mentales.Red de genotipación y psiquiatría genética
2003-2005 FIS
(Continúa en página siguiente)
Centro NacionaldeInvestigacionesOncológicas(CNIO)
Patologíamolecular
Análisis masivo de SNPs en genes de baja penetrancia ysusceptibilidad a padecer cáncer de mama 2003-2006 PN
Bioinformática Línea: análisis de variabilidad genética
GenéticaHumana
Análisis de polimorfismos (SNPs) involucrados en cáncerde mama mediante estudios caso-control. 2004 Genoma
España
Búsqueda de gen BRCAX con 4500 SNPs a través de todoel genoma —
Evolución de poblaciones (1.000 individuos de distintaspoblaciones) con los mismos genes del cáncer — —
76
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa Departamento
Otros Centros de Investigación
Título del proyecto Duración Financiación
(Continúa en página siguiente)
Centred'Investigacionsen Bioquimica iBiologiaMolecular(CIBBIM)
— Líneas: Molecular profiling of target genes in tumors ofthe mutator phenotype, Genetics of Aging — —
Centre deTransfusió iBanc de Teixits/MedplantGenetics
— Blood grouping and genotyping: Improving patient safetyand blood transfusion compatibility (BloodGen) 2003-2006 U.E.
Institut deRecercaOncològica(IRO)
Centro deGenética Médicay Molecular
Estudio de la variabilidad alélica de gas6 y su relacióncon la patología aterotrombótica 2003-2004 Fundación
Sira Carrasco
Transportadores heteroméricos de aminoácidos:Estructura, genómica funcional y fisiopatología (cistinuria,lisinuria con intolerancia a proteínas)
2003-2006 PN
Línea: análisis de la susceptibilidad genética al cáncergástrico — —
InstitutMunicipalD'investigacioMedica
Medicina interna Genetic markers for osteoporosis 2003-2006 U.E.
InstitutoMunicipal deInvestigaciónMedica
NeumologíaAlteraciones musculares en pacientes con enfermedadpulmonar obstructiva crónica (EPOC): susceptibilidadgenética y relación con mediadores inflamatorios
2001 FIS
Inst.Universitario deCiencias daSaúde
—
Estudio de la presencia de mutaciones en el gen de labeta miosina en las miocardiopatías hipertróficasprimarias (hipertrófica y dilatada familiar: análisis de lacorrelación genotipo-fenotipo)
2002-2005 PGI y DT
Institut Cataláde la Salut —
Evaluación de genes de susceptibilidad a migraña:estudios de asociación a variantes polimórficas tipo SNP yanálisis de cosegregación
2003 PNBiomedicina
Institutd'InvestigacionsBiomediques deBarcelona (IIBB)
—Interacción fenotipo/genotipo en la hipercolesterolemiafamiliar monogénica. Implicaciones para el desarrollo delproceso ateroesclerótico
1999-2001 PN
Fundació privadaClinic per a laRecercaBiomédica
Unidad deeritropatología
Análisis genético y molecular de los trastornos congénitosde la membrana eritrocitaria que cursan con anemia-estudio de la correlación entre genotipo, alteraciónproteica y expresividad clínica
2001 PNBiomedicina
Centro NacionaldeInvestigacionesOncológicas(CNIO)
Grupo deGenética Humanay Cáncer Familiar
Línea: búsqueda de genes en cáncer de mamahereditario — —
Unidad deanálisis demicroarrays
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetestipo 2 mediante aplicación de transcriptómica, genómicafuncional y análisis masivo de SNPs.
2002-2004 PN
Biotecnología
Desarrollo y validación de un sistema in silico para eldesarrollo de SNPs que causen cambio de aminoácido yla predicción de su efecto fenotípico
2002-2004 FIS
SNP analysis, tools and applications 2003 ESF
77
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
FundaciónJiménez Díaz(UAM)
Departamento
Medicina interna
Hospitales
Título del proyecto
Línea: genética de la enfermedad cardiovascular
Duración
—
Financiación
—
Hospital Clinicde Barcelona Neumología
A multiple candidate-gene, high-density SNP scanningapproach to assessment of genetic susceptibility inchronic obstructive lung disease
2001-2004 U.E.
HospitalUniversitarioMiguel Servet
Laboratorio deInvestigaciónMolecular
Línea: relación entre fenotipo y genotipo en laHipercolesterolemia Familiar
Mapa de mutaciones del receptor LDL y desarrollo de unsistema de diagnóstico de las hipercolesterolemias familiares 1999-2001 DGES
Hospital ClínicoSan Carlos
Servicio deInmunología
Líneas: Polimorfismos genéticos en la esclerosis múltiple,colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedadceliaca, diabetes tipo 1, artritis reumatoide
— —
Genética de las enfermedades inflamatorias intestinalescrónicas y su relación con los diferentes fenotipos clínicos 2003 PN
Biomedicina
Medicina Interna III
Línea: genómica y proteómica en la enfermedad cardiacaexperimental y humana: identificación de nuevas dianasdiagnósticas y terapéuticas
— —
Hospital Univ.Vall d'Hebron Neurología
Análisis de la relación genotipo-fenotipo en formasgenéticamente diferenciadas de esclerosis lateralamiotrófica familiar
2002 FIS
HospitalUniversitarioNuestra Señorade Candelari
NefrologíaLínea: polimorfismo de los genes de respuestainflamatoria en la susceptibilidad genética a padecernefropatía en la diabetes mellitus
— —
Hospital deGran CanariaDr. Negrín
Servicio deInmunologia
Estudio genético de susceptibilidad a neumonía adquiridaen la comunidad de Canarias, Valencia y Madrid 2002 FIS
Hospital deGirona Endocrinología
Identificación de genes de susceptibilidad a la diabetesde tipo 2 mediante la aplicación de transcriptómica,genómica funcional y análisis masivo de SNPs.Fenotipado de genes de susceptibilidad a la diabetesmellitus de tipo 2
2002-2004 PN
Hospital Virgendel Rocío,Sevilla
Inmunología
Influencia del polimorfismo HLA y de otros genes candidatosen la susceptibilidad y curso clínico de enfermedadesautoinmunes sistémicas (artritis reumatoide, LupusEritematoso Sistémico y enfermedad de Behçet)
2000 FIS
Genéticahumana
Línea: identificación y caracterización molecular denuevos loci de susceptibilidad en enfermedadescomplejas, cáncer e infección.
— —
Genéticamédica
Identificación y caracterización molecular de nuevos locide susceptibilidad para la enfermedad de Hirschsprung yel cáncer medular de tiroides
2001 FIS
Hospital CarlosHaya
Unidad de BiologíaMolecular delServicio deHematología
Línea: monitorización de transplantes de médula enpacientes con leucemia (polimorfismos) — —
Genética médica
Evaluación y susceptibilidad a infección de individuosexpuestos al VIH, la progresión a SIDA en individuosseropositivos. Identificación de SNPs en genes quecodifican para las quimioquinas, receptores y otros genescandidatos; como factores víricos e inmunológicos
2000 FIS
Anatomíapatológica
Línea: alteraciones genéticas en el cáncer de hígado.Relación con infección viral y susceptibilidad individual — —
Endocrinología ynutrición Interacción genotipo-dieta-insulinresitencia 2003-2005 FIS
(Continúa en página siguiente)
78
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
Hospital ReinaSofía deCórdoba
Departamento
Unidad deBiologíaMolecular delServicio deHematología
Hospitales
Título del proyecto
Línea: monitorización de transplantes de médula enpacientes con leucemia (polimorfismos)
Duración
—
Financiación
(Continúa en página siguiente)
Hospital InfantilUniversitarioNiño Jesús(HNJ)
—Genes del sistema parkina-alfasinucleína: análisisfuncional de las variantes alélicas y su papel en laenfermedad de parkinson
2003 FIS
Unidad deGenética
Aterosclerosis y genes reguladores del ciclo celular:variación genómica y análisis funcional de las variantesalélicas y su asociación a la enfermedad coronaria
2004 FIS
Hospital de Cruces — Análisis de loci polimórficos que flanquean la región
HLA-DR/DQ en familias de etnia vasca con diabetes tipo 1 2000-2002 GobiernoVasco
Hospital Ramóny Cajal
GenéticaMolecular
Análisis de variantes alélicas en genes relacionados conresistencia insulínica en pacientes de síndrome de ovariopoliquístico
2002-2003 CAM
Hipoacusias prelocutivas no sindrómicas: identificación denuevos genes, epidemiología genética y estudio de lascorrelaciones genotipo-fenotipo.
2002 FIS
Psiquiatría Progesterona y genotipo del receptor GABA-a:implicaciones para la conducta suicida 2000 FIS
Instituto deToxicología Biología Línea: estudios poblacionales de polimorfismos de ADN
de interés forense — —
Hospital SantaCreu i Sant Pau
Genética
Farmacogenética en el tratamiento de las enfermedadesmentales graves FIS
Farmacogenómica de la respuesta tumoral y toxicidadinducida por antitumorales en neoplasias humanas. — PN
Estudio de la heterogeneidad genética de las distrofias decinturas dominantes (análisis de ligamento, identificaciónde nuevos LOCI, identificación de nuevos genes)
— FIS
Psiquiatría Farmacogenòmica del tractament de les malaltiesmentals greus — Fundació la
Marató TV3
Hematología
Genetic variation in Factor IX and thrombosis risk 2002-2005 NIH
Arquitectura alélica del gen del factor XII: identificaciónde sus polimorfismos funcionales como nuevos factoresgenéticos de riesgo tromboembólico
2003-2005 CICYT
Genetic Analysis of Idiopathic Thrombofilia 2002-2006 NIH/ NHLBI
Genetic Regulation of the End-Stage Clotting ProcessThat Leads to Thrombotic Stroke 2005-2007 EU
Nuevos factores genéticos de riesgo cardiovascular:identificación de los polimorfismos funcionales del gen delfactor VII
2003-2005 FIS
Nuevos factores genéticos de riesgo cardiovasculares:identificación de los polimorfismos funcionales del gen delfactor VII.
— FIS
BioquímicaIdentificación de variabilidad nucleotídica en genes de laregión cromosómica 1Q23, y su relación con alteraciones delmetabolismo de triglicéridos y resistencia a la insulina.
— FIS
Hospital MiguelServet Farmacología Línea: convocatoria I+D 2003: Farmacogenética 2003 PROFIT
biotecnología
Hospitalde TarragonaJoan XXIII
Facultad deMedicina
Fenotipado y genotipado de locus en la diabetes tipo 2.Análisis poblacional mediante SNPs informativos 2002 PN
79
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Proyectos de Investigación españoles relacionados con farmacogenómica y técnicas de genotipado (continuación)
Centro oempresa
Hospital de laSanta Cruz ySan Pablo
Departamento
Farmacología
Otros Centros de Investigación
Empresas
Título del proyecto
Cuantificación del papel de los enantiómeros delmetabolito activo (+m1/-m1) del tramadol en el efectoantinociceptivo: estudio en voluntarios sanospreviamente genotipados y aplicando técnicas de análisisfarmacocinético/farmacodinámico poblacional
Duración
2002
Financiación
FIS
HospitalGregorioMarañón
Bioquímica
Estimación de la prevalencia de las mutaciones iie172asnY Val281Leu causantes de las formas virilizantes y noclásicas de hiperplasia suprarrenal congénita (HSR)mediante genotipaje de muestras del screening neonatalen población española
2001 FIS
Hospital Docede Octubre
Centro deInvestigación
Análisis molecular y correlación genotipo-fenotipo enpacientes con déficit de miofosforilasa (enfermedad deMc Ardle)
2001 PNBiomedicina
Clínica Ntra.Sra. de laConcepción
Medicina interna Estudio de intervención farmacológica en función delgenotipo del receptor LDL y del transportador ABOG5 2001 PN
Biomedicina
Hospitalde la Fe
Centro deInvestigación
Contribución de la concentración, fracciones y genotiposdel fibrinógeno sobre la agregación eritrocitaria, enpacientes con infarto coronario, infarto cerebral ytrombosis venosa profunda
2000 FIS
Hospital Clínicoy Provincial deBarcelona
Dermatología
Estudio genético de susceptibilidad a melanoma.Correlación genotipo-fenotipo y aplicación al diagnósticoprecoz en familias con melanoma y en pacientes afectosde melanoma múltiple
2001 FIS
ToxicologíaSusceptibilidad genética a los efectos tóxicos del plomo.Influencia del genotipo del enzima delta-aminolevulínicoácido dehidratasa en la toxicocinética del plomo.
2002 FIS
GenéticaCaracterización del espectro mutacional del gen atp7b enla enfermedad de Wilson en la población española ycorrelaciones fenotipo-genotipo.
2002 FIS
Hospital Centralde Asturias
GenéticaMolecular
Variación Genómica de los factores angiogénicos:elaboración de un protocolo para los estudios deasociación a enfermedades y farmacogenética.
2001-2004 Plan I+D+Ide Asturias
Bioquímica yBiologíaMolecular
Mecanismos de susceptibilidad y de resistencia a laapoptosis inducida por receptores de la familia TNFr y porfármacos antitumorales
2002 PN
Hospital Ntra.Sra. de Aranzazu Neurología Susceptibilidad genética y metabolismo mitocondrial en la
esclerosis múltiple 2001 PN
Neocodex, S.L.
—Generación y organización de un banco de ADN depacientes oncológicos válido para la realización deestudios genómicos a gran escala
2003 PROFITbiotecnología
— Desarrollo de chips de SNPs y biochips aplicables aldiagnóstico molecular de la esterilidad humana 2003 PROFIT
biotecnología
Genómica, S.A. —Desarrollo de una plataforma tecnológica para lageneración de un catálogo de variantes de exones endistintos tipos de cáncer
2003 PROFITbiotecnología
Tabla 8. Proyectos españoles en genotipado de SNPs y farmacogenómica.Fuente: Elaboración propia.
Acrónimos
PN, Plan Nacional; FIS, Fondo de Investigaciones Sanitarias; MCyT, Ministerio de Ciencia y Tecnología; CAM, Comunidad deMadrid; DGESI, MEyC, Ministerio de Educación y Cultura; FRA, fundación Ramón Areces; CICYT, Comisión Interministerial deCiencia y Tecnología; UAB, Universidad Autónoma de Barcelona; U.E., Unión europea; PGI y DT, Plan Gallego de Investigación yDesarrollo Tecnológico; DGES, Dirección General de Enseñanza Superior; FCRG, Fundación Centro de Regulación Genómic; NIH,National Institutes of Health, USA; NIH/ NHLBI, National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).
80
Marco regulador en farmacogenómica
Organización
European Agency for the Evaluation ofMedicinal Products(http://www.emea.eu.int)
Documento de referencia
Report to the CPMP on the EMEA seminar on the use ofpharmacogenetics in the drug development process, EMEA,London, 2000 (EMEA/CPMP/1483/00)
Position paper on terminology in pharmacogenetics, EMEA, London,2002 (EMEA/CPMP/3070/01)
ANEXO II. Marco regulador en farmacogenómica
Concept paper on pharmacogenetics, EMEA, London, 2003(CPMP/4445/03)
The Pharmacogenetics Working Group(www.pharmacogeneticsworkinggroup.org)
Terminology for sample collection in clinical genetic studies,Pharmacogenomics J, 1, 2001: 101-103
Anderson DC et al. (2002). Elements of informed consent forpharmacogenetic research; perspective of the pharmacogeneticsworking group, Pharmacogenomics J, 2,284-292.
World Health Organization(http://www.who.int/es)
Report on Community approaches to the control of hereditarydiseases, Geneva, WHO, 1985
Food and Drug Administration, FDA(http://www.fda.gov)
Draft Guidance for Industry: Pharmacogenomic Data Submissions(http://www.fda.gov/cder/guidance/5900dft.pdf)
Marco regulador internacional
Declaration on the Promotion of Patients’ Rights in Europe, Geneva,WHO, 1994
Control of Hereditary Diseases, Technical Report Series Nº 865,Geneva, WHO, 1996
Proposed International Guidelines on Ethical Issues in Medical Geneticsand the Provision of Genetic Services, Geneva: WHO, 1997(http://wwwlive.who.ch/ncd/hgn/hgnethic.htm)
Collaboration in Medical Genetics, Report of a WHO meeting,Toronto, April 2002(http://www.who.int/ncd/hgn/publications.htm)
World Medical Association(http://www.wma.net)
Declaration of the Human Genome Project, 1992
Statement on Genetic Counseling and Genetic Engineering, 1987
Declaration of the Rights of the Patient, 1995(http://www.wma.net/e/policy/17-h e.html)
Declaration of Helsinki, Ethical Principles for Medical ResearchInvolving Human Subjects, 2000(http://www.wma.net/e/policy/17-c e.html)
—
—
— — —
United Nations Educational, Scientificand Cultural Organization(http://www.unesco.org)
The Universal Declaration on the Human Genome and HumanRights, 1997(http://www.unesco.org/ibc/uk/genome/project/index.html)
The International Declaration on Human Genetic Data, 2003(http://www.unesco.org/confgen/2003/genetic)
Organization for Economic Co-operationand Development(http://www.oecd.org/home)
Genetic Testing Policy Issues for the New Millennium, Paris, OECD,2000
Council for International Organizationsof Medical Sciences(http://www.cioms.ch)
Revision of the International Ethical Guidelines for BiomedicalResearch Involving Human Subjects, Geneva, 2002(http://www.cioms.ch/frame guidelines nov 2002.htm)
(Continúa en página siguiente)
81
TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Marco regulador en farmacogenómica (continuación)
Organización
Council of Europe(http://www.coe.int/DefaultEN.asp)
Documento de referencia
Recommendation N° R (92) 3 on genetic testing and screening forhealth-care purposes,1992 (http://www.coe.fr/cm/ta/rec/1992/92r3.htm)
Recommendation N° R (94) 11 on Screening as a Tool ofPreventive Medicine, 1994(http://www.coe.fr/cm/ta/rec/1994/94r11.htm)
Recommendation N° R (97) 5 on the Protection of Medical Data,1997 (http://www.coe.fr/dataprotection/rec/r(97)5eexp.htm)
Recommendation 1512: Protection of the Human Genome, 2001(http://star.coe.fr/ta/TA01/EREC1512.htm)
European Parliament(http://www.europarl.eu.int)
Temporary Committee on Human Genetics and Other NewTechnologies in Modern Medicine, Report on the ethical, legal,economic and social implications of human genetics, 2001(http://www.europarl.eu.int/comparl/tempcom/genetics/rapfin/rapfin en.doc)
European Commission Joint Research Centre, Institute forProspective Technological Studies(http://www.jrc.es/home/index.html)
Towards quality assurance and harmonisation of genetic testingservices in the EU, 2003 (EUR 20977 EN)(http://www.jrc.es/home/publications/publication.cfm?pub=1124)
European Commission(http://europa.eu.int)
Ethical, legal and social aspects of genetic testing:research,development, and clinical applications, Brussels, 2004(http://europa.eu.int/comm/research/conferences/2004/genetic/report en.htm)
25 Recommendations on the ethical, legal and social implications ofgenetic testing, Brussels, 2004(http://europa.eu.int/comm/research/conferences/2004/genetic/recommendations en.htm)
Data Protection Working Party, Article 29, Working document ongenetic data, 12178/03/EN. WP91, Brussels, 2004(http://europa.eu.int/comm/internal market/privacy/docs/wpdocs/2004/wp91 en.pdf)
Directivas europeas Directiva 95/46/EC: Directiva Europea de Protección de DatosDirectiva 98/79/EC: Productos para el diagnóstico in-vitroDirectiva 2001/20/EC: Ensayos clínicos
Marco regulador español132
Ley 14/1986, de 25 de abril General de Sanidad
Ley 35/1988, de 22 de noviembre Técnicas de Reproducción Asistida
Ley Orgánica 15/99 del 13 de diciembre Protección de Datos de Carácter Personal
Marco regulador europeo
—
—
—
—
132 No existen guías de actuación aprobadas para los análisis genéticos en España, siendo aplicada la Ley General deSanidad, 14/1986, de 25 de abril(http://www.juntadeandalucia.es/servicioandaluzdeempleo/sae/fpo/materialdidactico manipulacion alimentos/PDF/LEY 141986 25 abril.pdf).
Tabla 9. Marco regulador en farmacogenómica.Fuente: Polymorphic sequence variants in medicine: Technical, social, legal and ethical issues Pharmacogenetics as anexample. ESHG/IPTS Background document. DRAFT Version as per June 10, 2004. European Commission. Directorate-General JRC. Joint Research Centre. Institute for Prospective Technological Studies (Seville) Life Sciences.
_ _ _ _ _
82
Affymetrix, Inc.
Dirección Affymetrix Inc. 3380 Central ExwySanta Clara, CA 95051, USAWeb: www.affymetrix.com
Objetivo Biochips, Arrays, GeneChip®, identificación de SNP, análisis de la expresión génicamediante tecnología de semiconductores, software científico
Fundación Fundada por Alejandro Yaffaroni. Separada de Affymax en 1991, se independizó de estaempresa en 1993. Affymetrix formó Perlegen Sciences para analizar y catalogar variaciones genéticasGlaxoSmithKline posee aproximadamente el 17% de la compañía.
Cooperaciónacadémica
John Hopkins School of Medicine National Cancer Institute Whitehead Institute Center for Genome Research Boston University Medical Center NIAID y TIGR
Cooperaciónindustrial
Perlergen Sciences (50% de los SNPs presentes en el GeneChip® Mapping 100K Arrayde Affymetrix pertenecen a esta compañía) Roche (desarrollo del AmpliChip CYP450 de Roche)ParAllele Bioscience (suministro de GeneChip Tag Arrays a Parallele)Orchid Biosciences (acuerdo de colaboración para el desarrollo de SNP-IT™)
Otros: Genomic Solutions, deCODE genetics, Merck, Procter and Gamble, AMDeC SignAcademicAccess, NEN, Sankyo, Joint venture, Millenium Pharmaceuticals, LionBioscience, Incyte, Qiagen, Organon, Monsanto, Biotique Systems, Ardais Corp., Roche,Axon, Ingenuity, Arcturus Bioscience Inc., NuGen, Caliper Life Sciences.
Patentes US5744305, US5556752, US5861242, US5981956, US5858659, US5945334,US5919523, US6025601, US5889165, US5922591, US6022963, US6027880,EP0853679A1, EP923050A2, EP764214A1, EP812922A2, US6136269, US5974164,US5800992, US5795716, US5744305, US5445934, US6386749, US6379895,US6368799, US6365400, US6346413, US6344316, US6342355, US6329143,US6329140, US6326211, US6309831, US6309823, US6309822, US6306643,US6303301, US6300063, US6294327, US6291183, US6287850, US6287778,US6284525, US6284460, US6271957, US6270644, US6262216, US6261776,US6261431, US6252236, US6242180, US6239273, US6238862, US6229911,US6228593, US6228575, US6225625, US6223127, US6207960, US6203989,US6203983, US6197595, US6197508, US6197506, US6188783, US6185561,US6171793, US6168948, US6156501, US6153743, US6150147, US6147205,US6141096, US6140044, US6083697, US6130046, US6124102, US6114122,USD430024, US6066454, US6045996, US6040138, US6596856, US6584410,US6604902, US6610482, US6630308, US6632611, US6638770
Plataformas degenotipado
GeneChip® Mapping 10K ArrayGeneChip® Mapping 100K ArrayGenFlex Tag Array
Capitalización 3,1 Billiones de $
ANEXO III. Fichas de empresas relacionadas con el genotipado de SNPs133
133 BiochipNet (http://www.biochipnet.de/EntranceFrameset.htm)
Otros productosrelacionados
GeneChip® (Predominante en el mercado de microarrays) NetAffx (Información genómica online) Affymetrix Software SolutionsGeneArray™ Scanner, Workstation, Fluidics Station 400, Hybridization Oven 640, 417™Arrayer, 418™ Array Scanner, 428™ Array Scanner, GeneChip® Scanner 3000
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Agilent Technologies, Inc.
Dirección 395 Page Mill Rd.P.O. Box: 10395, Palo Alto, CA 94306, USA Web: www.agilent.com
Objetivo Microarray, biochips
Fundación Creada en diciembre de 1999 como spin-off de Hewlett-Packard
Cooperaciónacadémica
Harvard Center for Genomics Research North Carolina State University Battelle Memorial Institute
Cooperaciónindustrial
Qiagen Genomics (acuerdo de colaboración para combinar la tecnología Masscode DNAtagging de Qiagen con el espectrómetro 1100 Series LC/MSD de Agilent)Caliper (acuerdo de colaboración para el desarrollo de LabChip®)
Otros: Paradigm Genetics, Applied Biosystems, Analytical Applic. Reading, RosettaBiosoftware, Analytical Applications Brielle, Antek Instruments, Inc., Applied Photophysics,ASPEN Research, BioAnalytische Instrumente, Chiralizer Services, Cohesive Technologies,Labsphere, LC Packings, LINC Quantum Analytics, MIDI, Packard Instrument, PickeringLaboratories, Scientific Instrument Services, Wyatt Technology, CDS Analytical, Zymark,Caliper, Incyte, Ambion, Callida Genomics, Abgenix, IBM, Callida Genomics, Hitachi,DiagnoSwiss, Spotfire, Accelrys, Rosetta Biosoftware, Pierce Biotechnology, Dharmacon
Patentes US6194900, US6184347, US6163031, US6158712, US6132997, US6115019, US6111356,US6110682, US6107038, US6103474, US6093371, US6093362, US6077674, US6074831,US6038922, US6033628, US6558908, US6591196, US6589739, US6587579, US6602472,US6656740, US6689319, US6682702, US6713262
Productos degenotipado
Detector de masas HP 1100 Series LC/MSD Trap (detección)
Otros productos relacionados
DNA Microarray, Agilent G4130A, Human 1B Oligo Microarray Kit, Agilent Rice OligoMicroarray Kit, Whole Human-Genome MicroarrayDNA 500 LabChip® Kit, DNA 7500 LabChip® Kit, DNA 12000 LabChip® Kit, DNAMicroarray Scanner, RNA 6000 PicoLabChip® Kit, Protein 50 LabChip®, Agilent 2100Bioanalyzer, cDNA Microarray Kits
Capitalización 19,1 Billones de $
Dirección Amersham Biosciences Corp800 Centennial AvenueP.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855-1327, USA Web: http://www.amershambiosciences.com o http://www.apbiotech.com
Objetivo Genómica, proteómica, descubrimiento y desarrollo de fármacos, fabricación defármacos, sistemas high-throughput, separaciones industriales, radioquímicos.
Fundación En 1997, Amersham Biosciences (antes APBiotech) se formó de la unión entreAmersham Life Sciences y Pharmacia Biotech.
Cooperaciónacadémica
University of Washington, Sloan-Kettering Institute
Cooperaciónindustrial
BioDiscovery Inc (empleo de su software en el CodeLink de Amersham Biosciences)Orchid BioSciences Inc. (Amersham Biosciences posee una licencia no exclusiva deOrchid BioSciences para usar su tecnología SNP-IT)Intergen Co. (Amersham Biosciences posee una licencia no exclusiva de Intergen parausar su tecnología Amplifuor de deteccción)
Otros: UpFront Chromatography, Affibody AB, Thermo Electron, SurModics, AclaraBioSciences, Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A.
Patentes US6627446, US6664061, US6686161
Plataformas degenotipado
CodeLink P450 Bioarray (análisis toxicogenético)MegaBACE™ 4000 (alto rendimiento: 4.600 genotipos/día)GenomiPhi™ DNA Amplification Kit (medio rendimiento)
Otros productos relacionados
CyScribe Direct mRNA Labelling Kit, Templiphi DNA Sequencing Template Amplification,MegaBACE 4000, Lucidea Array Platform, Biotrak Visible Plate Reader, Biotrak PlateWasher, MegaBACE SNuPe Genotyping Kit, CodeLink™ Activated Slides, CyScribe™
Amersham Biosciences
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Applied Biosystems
Dirección Applied Biosystems GroupGroup Headquarters850 Lincoln Centre DriveFoster City, CA 94404, USA Web: http://www.appliedbiosystems.com
Fundación Pertenece al grupo Applera Corp., junto con Celera Corp.
Cooperaciónacadémica
Institute for Systems Biology, University of California
Cooperaciónindustrial
Decode, Epoc Biosciences, Genomica Corp., Oxagen
Otros: AnVil, Millipore, Ambion
Patentes US5153319, US5132418, US4973679, US4500707, US4458066
Plataformas degenotipado
SNPlex™ Genotyping System (alto rendimiento)ABI PRISM® SNAPshot™ (medio rendimiento)
Otros productos relacionados
7900 Micro Fluidic Card, MALDIspot™ kit, 8500 Affinity Chip Analyzer
Celera Diagnostics
Dirección 45 W. Gude Dr.Rockville, MD 20850, USA Web: http://www.celera.com
Objetivo Genómica, descubrimiento de fármacos, bioinformática
Fundación El grupo Celera Genomics se estableció en 1998 por PE Corporation y Craig Venter.Celera Diagnostics es una “joint venture” entre el grupo Celera Genomics y AppliedBiosystems.
Cooperaciónacadémica
Vanderbilt University, Harvard University, University of Texas, Sotuhwestern MedicalCenter, University of Cincinnati/Children's Hospital of Cincinnat, Ohio State University,Government of Australia, Howard Hughes Medical Institute, The Institute for GenomicResearch, Weizmann Institute of Science, Hospital for Sick Children, Toronto CaliforniaInstitute of Technology Max-Planck Society, Karolinska Institutet, Center of ExcellenceProgram at the University of Toronto, University of California at Berkeley
Cooperaciónindustrial
Bristol-Myers Squibb Co. (muestras y datos proporcionados a Celera diagnostics Inc.para el estudio de variaciones genéticas asociadas a la diabetes y enfermedadescardiovasculares)Oxagen (suscripción a las bases de datos de Celera)Genomica Corp (combinación de software para desarrollar la base de datos de Celera)Abbot, Applied Biosystems, Epoc Bioscience, Genomics Collaborative, Luminex, Merck,Variagenics
Otros: Merck, Aventis Pharma, Maxim Pharmaceuticals, Motorola
Productosrelacionados congenotipado
Celera Discovery System™ (identificación de SNPs y estudios de asociación enconjunción con Applied Biosystems)
Capitalización 1,076 Billones de $
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
CuraGen Corp.
Dirección 555 Long Wharf Dr., 11th Fl.New Haven, CT 06511, USA Web: http://www.curagen.com; http://curatools.curagen.com
Objetivo Genómica, minería de datos, herramientas de bioinformática
Cooperaciónindustrial
Sequenom, Pfizer
Patentes
Otros: Abgenix, Bayer AG, Biogen, COR Therapeutics, DuPont/Pioneer Hi-BredInternational, Gemini Genomics, Genentech, GlaxoSmithKline, Hoffmann-La Roche,Monsanto, Ono Pharmaceuticals y Roche Vitamins.
US6193866, US6190868, US6150179, US6141657, US6083693, US6057101,US6027941, US6017434, US6013630, US5993634, US5986055, US5977311,US5972693, US5938904, US5871697
Productosrelacionados congenotipado
SNPCalling™ (software de identificación y caracterización de SNPs basados en latecnología GeneCalling® y SeqCalling™)
Otros: CuraTools®, GeneCalling™, PathCalling®, OGI™, CuraChip™, PredictiveToxicogenomic Screen (PTS™)
Capitalización 986,5 Millones de $
Genaissance Pharmaceuticals, Inc.
Dirección Five Science ParkNew Haven, CT 06511, USAWeb: http://www.genaissance.com
Objetivo Descubrimiento y uso de variaciones genéticas para el desarrollo de medicamentospersonalizados y diagnóstico genético.
Fundación Genaissance fue fundada en el año 2003 y en ese mismo año compró la mayoría de DNASciences, incluyendo sus instalaciones de genotipado.
Cooperaciónacadémica
Janssen Research Foundation, Wayne State University
Cooperaciónindustrial
Sequenom (uso de Sequenom MassARRAY™ en la plataforma HAP™ Typing deGenaissance)AstraZeneca (acceso a marcadores HAP de Genaissance)Pharmacia (acuerdo de farmacogenómica con Pharmacia Corporation para emplear latecnología HAP™ de Genaissance con muestras de Pharmacia)Bayer (colaboración con la división diagnóstica de Bayer HealthCare LLC para identificarmarcadores farmacogenómicos)Millenium (acuerdo de licencia a Millenium para el uso de la tecnología HAP™)J&J, Novo Nordisk, Pharmacia, Sciona, Prometheus Laboratories Inc.
Otros: Gene Logic, Visible Genetics, TELIK, Becton Dickinson, Prometheus Laboratories
Patentes US6521747, US6232076, US5972614
Plataformas degenotipado
HAP™ Typing (basada en la tecnología MassARRAY™ de Sequenom)
Otros productosrelacionados congenotipado
DecoGen™ (sistema informático que permite la correlación entre pacientes y respuestasa fármacos mediante algoritmos )
Isogenomics™ Database (base de datos que contiene los marcadores HAP™, sufrecuencia y distribución)
HAP™ Database (base de datos que contiene todos los marcadores HAP™ identificadospor la empresa)
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Illumina, Inc
Dirección 9390 Town Centre DriveSan Diego, CA 92121, USA Web: http://www.illumina.com
Objetivo Desarrollo de herramientas de nueva generación que permiten el análisis a gran escalade variación y función génica.
Fundación Fundada en 1998 por John Stuelpnagel y Mark Chee
Cooperaciónacadémica
John Hopkins Medical University, Boston University Medical Center, University ofCalifornia, San Diego, University of North Carolina, University of Cambridge, Cold SpringHarbor Laboratory, National Center for BioChip Technology (NCBT) in Shanghai
Cooperación industrial
GlaxoSmithKline (licencia de uso de la plataforma BeadArray™)Placer (licencia de uso de la plataforma BeadArray™)
Otros: PE Biosystems, Third Wave Technologies, GeneLogic, Oxagen, Genomas Inc.
Patentes US6620584
Plataformasde genotipado
BeadArray™ (sistema de fibra óptica)
Otros productos Oligator™, fSet™ Oligos for the Human Genome, Sentrix gene expression arrays
Capitalización 256 Millones de $
Invitrogen Corp.
Dirección 1600 Faraday AveCarlsbad, CA 92008, USA Web: http://www.invitrogen.com
Objetivo Descubrimiento y producción de fármacos
Fundación Fundada en 1987, en el año 2002 adquirió InforMax. En el año 2003 adquirió Molecular Probes, Inc., líder en tecnologías de fluorescenciapara el marcado de biomoléculas.
Cooperaciónindustrial
Orchid (Invitrogen tiene la licencia esclusiva desde el año 2001 para desarrollar ycomercializar productos de genotipado empleando la tecnología SNP-scoring primerextensión de Orchid)Luminex (licencia de uso a Invitrogen de su tecnología LabMap)
Patentes US6017754, US5827657, US5487993, US6638722, WO9940434, EP1060395,CA2318175
Productosrelacionados congenotipado
Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase
Otros productos SuperScript™ Indirect cDNA Labeling System, MyArray™ DANN, VastArray™ TissueArrays, Vector Xpression 3.0 Microarray Data Analysis Software
Salida a bolsa Nasdaq: IVGN
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Luminex Corporation
Dirección 12212 Technology BlvdAustin, TX 78727, USA Web: http://www.luminexcorp.com
Fundación Fundada en 1995 como spin off de Luminex' RBM (Rules-Based-Medicine)
Cooperaciónindustrial
Orchid Biosciences Inc. (desarrollo conjunto de la plataforma de genotipado SNPstream)Tm BioScience (licencia de la tecnología xMAP de Luminex)Abbot (licencia de la tecnología xMAP de Luminex)Bayer (licencia de la tecnología xMAP de Luminex)Applied Biosystems y Celera Genomics (licencia de la tecnología xMAP de Luminex)
Otros: Bio-Rad, BioSource International, LINCO Research, Inc., MiraiBio, Inc., LifecodesCorporation, One Lambda, Inc., Zeus Scientific, Inc., R&D Systems, Multimetrix GmbH,Bender MedSystems, INOVA Diagnostics, Rules-Based Medicine, Upstate Biotechnology,Applied Cytometry Systems, Marligen Biosciences, Inc, Radix BioSolutions, BMD, FutureDiagnostics, Genaco, ImmuneTech, Qiagen
Patentes US6411904, EP1208382, EP1204869, US6366354, WO 0224959, CA 2331897, CA 2331896,CA 2328408, CA 2306501, CA 2318779, AU 4989501, AU 4325801, WO 0178087, WO 0163284, US6268222, AU6788100, AU 6788100, AU 6779700, AU 6779300, AU 6779200, US6658357, US6649414, US6632526, US6592822, US6528165, US6524793,US6514295, US6449562, US6139800, US6057107, US6046807, US5981180, US5736330,EP1257821, EP1250675, EP1248853, EP1079967, EP1049807, EP1023464, EP0852004
Productos Luminex 100™, Luminex XYP™, Luminex SD™, Luminex HTS™, Universal ArrayMicrospheres, Luminex® 100 IS
Otros productos LabMAP microspheres, Luminex 100™, Luminex XYP™, Luminex SD™, Luminex HTS™,xMAP™ Multi-Analyte COOH Microspheres, FlexMAP™ Microspheres, xMAP Multi-AnalyteLumAvidin Microspheres
Lynx Therapeutics, Inc.
Dirección Lynx Therapeutics, Inc. 25861 Industrial Blvd.Hayward, CA 94545, USA Web: http://www.lynxgen.com
Objetivo Descubrimiento de genes, expression génica, genómica
Fundación Fundada en 1992 para la clonación de ADN y tecnologías de análisis de ADN
Cooperaciónacadémica
Institute of Molecular and Cell Biology, IMCB
Cooperaciónindustrial
Genomics Collaborative Inc. (acuerdo para realizar el cribado de marcadores SNPasociados a la diabetes tipo 2) AstraZeneca (acuerdo de licencia para el empleo de la tecnología Megatype en eldescubrimiento de SNPs relacionados con el asma)
BASF, DuPont, Molecular Engines Laboratories, S.A., Takara Shuzo Co. Ltd, Phytera, CeleraGenomics, Urogène, AstraZeneca, Hybrigenics, Wilex AG, Aventis CropScience, Aventis,Hybrigenics, Anigenics, Manteia, Solexa, IBM, Millenium Pharmaceuticals, Oxagen
Patents US 5552278, US 5599675, US 6103445, US 5714330, US 5571677, US 6150516, US 6140489, US 6138077, US 6048974, US 6013445, US 6013165, US 5969119, US 5965720, US 5962228, US 5888737, US 5863722, US 5859233, US 5856093, US 5846719, US 5837835, US 5831065, US 5830658, US 5824793, US 5817795, US 5780231, US 5763175, US 5750341, US 5747255, US 5741643, US 5726297, US 5695934, US 5684143, US 5631135, US 5599922, US 5591607, US 5571903, US 5473060, US 5395928, US 5292875, US 5998604, WO 98/53300, WO 00/20639, WO 00/26411, US 5654413, US 5635400, US 5604097
Plataformas degenotipado
Tecnología Megaclone™, basadas en técnicas MPSS (Massively Parallel SignatureSequencing), que permite el análisis de millones de moléculas de ADN en paralelo
Otros productos Megatype™ (aplicaciones al descubrimiento de SNPs, en fase de desarrollo)
MPSS™, Megaclone™, Megasort™ Profiler™
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Nanogen
Dirección 10398 Pacific Center CourtSan Diego, CA 92121, USAWeb: http://www.nanogen.com
Objetivo Desarrollo de tecnologías que integran la microelectrónica con la biología molecular enmicrochips semiconductores.
Fundación Fundada en 1993
Cooperaciónacadémica
US Centers for Disease Control, NASA
Cooperaciónindustrial
Gentris (acuerdo de colaboración para el estudio de marcadores de enzimas ytransportadores de fármacos)
Becton, Dickinson and Co. (BD), Aventis Research and Technologies. GmbH & Co. KG,Hitachi Ltd., Bio-Rad, Bionomics Ltd., DNA Print
Patentes US6067246, US5835404, US5787032, US5632957, US6162603, US6129828,US6099803, US6071394, US6068818, US6051380, US6048690, US5965452,US6013166, US5929208, US5849489, US5849486, US5605662, US5565322,US5965452, US6067246, US5835404, US6017696, US5532129, US6017696,US6488832, US6468742, US6375899, US6423271, US6416953, US6385080,US6379897, US6315953, US6309833, US6569382, US6540961, US6531302,US6524517, US6518022, US6589742, US6652808, US6682936
Plataformas degenotipado
NanoChip®; Molecular BiologyWorkstation
Otros productosrelacionados congenotipado
NanoChip™ cartridge, Chip Loader
Capitalización 188,4 millones $
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Orchid BioSciences
Dirección Orchid BioSciences, Inc.303 College Road EastPrinceton, NJ 08540, USA Web: http://www.moleculartool.com o http://www.orchid.com
Objetivo Identificación de SNPs, microfluídica, robótica, desarrollo y comercialización detecnologías genómicas, productos y servicios
Fundación Fundada en 1995 como spin-off de Sarnoff Corporation
Cooperaciónacadémica
The SNP Consortium, University of Cincinnati, University of Pennsylvania, University ofHackensack Medical Center
Cooperaciónindustrial
Beckman Coulter (licencia de uso de los instrumentos, reactivos y software degenotipado de Orchid. Licencia exclusiva del uso de la tecnología de análisis SNP-IT deOrchid en investigación, y licencia no exclusiva en el campo del diagnóstico) Tepnel Life Sciences (venta del sistema SNPstream de Tepnel)GlaxoSmithKline (colaboración en un proyecto de genotipado a gran escala)Invitrogen (licencia exclusiva para el desarrollo y la venta de productos de genotipadoempleando la tecnología de extensión de primer de Orchid) Asper Biotech (acuerdo de licencia que permite a Asper emplear la tecnología SNP-IT ensus arrays)Thermo BioStar (acuerdo para el desarrollo y venta de tests de genotipado de SNPs)LGC (licencia de LGC a Orchid para usar sus polimorfismos P450 2D6 en su plataformade genotipado) Perkin Elmer (licencia de venta de productos basados en tecnologías SNP-IT parainvestigación)Merck (estudio farmacogenómica en asma por parte de Merk, y licencia de uso de susoftware a Orchid para su uso en medicina personalizada)Invitrogen (licencia de venta de productos basados en tecnologías SNP-IT parainvestigación)
Otros: Affymetrix, Amersham Pharmacia Biotech, Applied Biosystems (PE Biosystems),Dynal, Genomica, Institute for Systems Biology, Luminex, NEN, Sarnoff, GeneticTechnologies, Genetic solutions, GSK,
Patentes US6030782, US6013431, US6004744, US5958344, US5952174, US5939291,US5939261, US5919626, US5912124, US5916776, US5908755, US5882903,US5879632, US5872623, US5858195, US5863708, US5958804, US5858193,US5854684, US5846396, US5840256, US5842106, US5837860, US5770370,US5762876, US5755942, US5747169, US5681484, US5679524, US5643738,US5632876, US5610287, US5603351, US5593838, US5585069, US5518900,WO0076662, US6585939
Productosrelacionados congenotipado
SNPstream™ 25K (en desarrollo la versión 50K, que permite el doble de ensayos degenotipado al día)
Otros: SNPware™, SNP-IT™ (tecnología de extensión de primer)
Capitalización 464,3 Millones de $
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ParAllele BioScience Inc.
Dirección 384 Oyster Point Blvd., Suite 8South San Francisco, CA 94080, USA Web: http://www.p-gene.com
Objetivo Análisis a gran escala de alelos en paralelo, genotipado de SNPs, estudio de la variacióndel genoma, análisis de expresión empleando microarrays
Fundación Fundada en noviembre del año 2000 como ParAllele Genomics.
Cooperaciónacadémica
Baylor College of Medicine Cambridge UniversityNational Cancer Institute
Cooperaciónindustrial
Merck (acuerdo de colaboración empleando la tecnología de descubrimiento de SNPs deParAllele y los genes identificados por Merck)Roche (acuerdo de colaboración empleando la tecnología de descubrimiento de SNPs deParAllele para descubrir variaciones genéticas asociadas a la diabetes tipo II en muestrasde pacientes de Roche)Affymetrix (acuerdo de colaboración en un proyecto de genotipado a gran escala endiabetes tipo I)
Plataformas degenotipado
MegAllele™
Proyectos HapMap
Qiagen N.V.
Dirección Spoorstrat 505911 KJ Venlo, The Netherlands Web: http://www.qiagen.com
Objetivo Clonaje, inmunización, transfección, aislamiento de ADN, expresión de proteínas,instrumentación, productos para la separación y purificación de ácidos nucleicos
Fundación Qiagen Genomics pertenece al grupo Qiagen, que incluye además Qiagen Operon,Qiagen Sciences, PreAnalytiX (joint venture entre Qiagen y Becton Dickson),pAlliance, Sawady y Qiagen instruments.
Cooperaciónacadémica
Montefiore Medical CenterInstitute of Genomic ResearchUniversity of Washington
Cooperaciónindustrial
Agilent (acuerdo de colaboración para el desarrollo conjunto de una plataforma degenotipado mediante la tecnología Masscode™ de Qiagen y la espectrometría de masasde Agilent)Daiichi Pure Chemicals (licencia no exclusiva de la tecnología Masscode™)Shimadzu (licencia no exclusiva de la tecnología Masscode™)Otros: Aventis, Kreatech Biotechnology, Affymetrix, Luminex
Gene Alliance: alianza estratégica entre otras cuatro empresas alemanas biotecnológicaspara hacer frente a proyectos a gran escala de análisis del genoma (Agowa GmbH,Biomax Informatics GmbH, GATC GmbH y MediGenomix)
Productosrelacionados congenotipado
Otros productos
Masscode™ System
ZeptoGene Workstation Microarray, SensiChip Human Kinase DNA Array Bar, Zebrafisharray, BioRobot™ 9600, Microarray Products, LiquiChip workstation, HybridizationChamber, LabelStar Array Kit, HiLight and SensiChip Systems
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
Sequenom, Inc.
Dirección 11555 Sorrento Valley Rd. San Diego, CA 92121-1331, USA Web: http://www.sequenom.com
Objetivo Genómica, identificación de SNPs, tecnología de microarrays
Fundación Fundada en 1994 por Hubert Köster. Posee dos unidades de negocio, SequenomGenomics (centrado en el genotipado mediente la tecnología MassArray) y SequenomBiotherapeutics (descubrimiento de nuevas dianas terapeúticas)En el año 2002 adquirió la compañía Axiom Biotechnologies, ampliando sus objetvoshacia el descubrimiento de nuevos fármacos.
Cooperaciónacadémica
Human BioMolecular Research Institute University of California
Cooperaciónindustrial
LGC (acuerdo de colaboración para el desarrollo de un panel de marcadores genéticos enensayos de SNPs, con fines forenses y análisis de paternidad)Bristol-Myers Squibb (licencia de uso de la tecnología MassArray de Sequenom)Phenomix (identificación de genes asociados con determinadas patologías medianteanálisis de SNPs)Gentra Systems (utilización del kit de purificación de ADN de Puragene en los productosMassARRAY)CuraGen (colaboración para realizar estudios genéticos de población y técnicasproteómicas)Samsung (licencia de uso de la tecnología MassArray de Sequenom)
Otros: Protogene, Novartis Research Foundation, Procter & Gamble Pharmaceuticals,GSK, ingenium,
Patentes
Plataformas degenotipado
Otros productosrelacionados congenotipado
Capitalización
US6146854, US6140053, US6133436, US6111251, US6074823, US6043031,US6024925, US6022688, US5928906, US5900481, US5872003, US5777324,US5691141, US5622824, US5605798, US5547835, US5851765, EP0815261B1
MassARRAYsystem
SpectroTYPER, Homogenous MassEXTEND™ Assay, SpectroChip, SpectroReader
342,1 Millones de $
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Third Wave Molecular Diagnostics, Inc.
Dirección 502 South Rosa Rd.Madison WI 53719-1256, USA Web: http://www.twt.com
Objetivo Análisis de variaciones genéticas, SNPs, sistemas de ensayo para su uso en plataformasde microarrays
Cooperaciónacadémica
Stanford University Institute of Physical and Chemical Research (Japan)The National Cancer Center (Japan)
Cooperaciónindustrial
Innogenetics (principal distribuidor de los productos de diagnóstico que emplean latecnología Invader® de Third Wave Technologies)BML (comercialización de productos de diagnóstico que emplean la tecnología Invader®de Third Wave Technologies)Daiichi Pure Chemical Co. (acuerdo de colaboración en el desarrollo de testsfarmacogenómicos para el fármaco Irinotecan)Aclara BioSciences (acuerdo de colaboración para el desarrollo de productos dediagnóstico combinando tecnologías propias) Otsuka (distribución en Japón de productos con la tecnología Invader®)Novartis (acuerdo de colaboración para el desarrollo de un panel de alta densidad deSNPs)
Applied Biosystems, Beckman Coulter, GSK
Patentes
Productosrelacionados congenotipado
US5719028, US6214545, US6210880, US6194149, US6090606, US6090543,US6001567, US5994069, US5985557, US5888780, US5846717, US5843669,US5843654, US5837450, US5795763, US5614402, US5541311, US5691142,US6692917, US6709815, US6709819, WO0244994, EP1364334, WO02090572,WO03072831, AU3945502
Invader® Paneles de SNPs
Tm Bioscience Corp.
Dirección 439 University Avenue,Suite 1710, Toronto, OntarioCanada M5G 1Y8 Web: http://www.tmbioscience.com
Objetivo Herramientas genómicas, biochips de ADN, identificación de SNPs, análisis de laexpresión génica
Cooperaciónacadémica
Ottawa Health Research Institute (Canadá)
Cooperaciónindustrial
Luminex Corp. (acuerdo de colaboración para el desarrollo de productos de genotipado yanálisis de ADN mediante microsferas Universal Array de Luminex y la tecnología xMAP™de Luminex)
Procrea Bioscience
Productosrelacionados congenotipado
MetriGenix (licencia de la tecnología Universal Array)
Tm 100 Universal Array, Tag-It™ p450
Patentes US6221589, US5770365, US5902724, US6060248, US6027884, US5593834
Fuente: The informational website on BioChip Technologies (http://www.biochipnet.de); Yahoo Finance(http://finance.yahoo.com)
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
• Ambrose, H. J. (2002). SNPs andPharmacogenomics. Pharmacogenomics 3(5),583-586.
• Anderson, D. C. et al. (2002). Elements ofinformed consent for pharmacogenetic research;perspective of the pharmacogenetics workinggroup, Pharmacogenomics J, 2,284-292.
• Cardon, L. R. et al. (2003). Using hapotypeblocks to map human complex trait loci. Trendsin Genetics. Vol. 19(3) 135140.
• Collins, F. S. (2003). A vision for the future ofgenomics research. Nature Vol 422, 24 April.
• Dennis C. (2003). The rough guide to thegenome. Nature. Apr 1;428(6982):467.
• Destenaves, B.; Thomas, F. (2000). Newadvances in pharmacogenomics, Curr. Op. inChem. Biol. 4, 440-444.
• Draft Guidance for Industry: PharmacogenomicData Submissions(http://www.fda.gov/cder/guidance/5900dft.pdf)
• Elahi, E.; et al. (2004). Global genetic analysis.Journal of Biochemistry and Molecular Biology.Vol 37(1), 11-27.
• Evans, W. E.; et al. (2003). Pharmacogenomics.Drug disposition, drug targets, and side effects.The New england Journal of Medicine 348(6).539-549.
• Freimuth, R. R.; et al. (2004). High-throughputgenotyping methods for pharmacogenomicsstudies. Curr. Pharmacogenomics, 2, 21-33.
• García Alonso, Fernando. Siglo XXI: desafíoscientíficos y sociales. Capítulo 3: Farmacología YGenética. Pag. 37-43.
• Garte, S.; et al. (2001). Metabolic genepolymorphism frequencies in controlpopulations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.Dec. 10 (12), 1239-48.
• Ginsburg, G. S.; McCarthy, J. J. (2001).Personalized medicine: revolutionizing drugdiscovery and patient care. TRENDS inBiotechnology Vol.19 No.12 December, 491-496
• Goldstein, D. B. (2003). Pharmacogenetics goesgenomic. Nature Reviews. Vol. 4, 937-947.
• Hosford, D. A. (2004). Pharmacogenetics topredict drug-related adverse events. Toxicologicpathology, 32 (suppl. 1): 9-12.
• International Biopharm, October 2004, vol. 17,N 10, 20-22.
• Jain, K. K. (2002). From molecular diagnosticsto personalized medicine. Expert Rev. Mol.Diagn. 2(4) 299-301.
• Jain, K. K. (2004). Aplications of biochips: Fromdiagnosis to personalized medicine. Curr. Op. inDrug Discovery & Development. Vol. 7(3): 285-289.
• Jenkins, S.; Gibson, N. (2002). High-throughputSNP genotyping. Comp Funct Genom. 3: 57–66.
• Johnson, J. A.; Evans, W. E. (2002). Moleculardiagnostics as a predictive tool: genetics of drugefficacy and toxicity. TRENDS in MolecularMedicine Vol.8 No.6 June, 300-305.
• Johnson, J. A. (2003). Pharmacogenetics:potencial for individualized drug therapy throughgenetics. TRENDS in Genetics Vol.19 No.11November, 660-666.
• Kirkwood, S. C.; Hockett, R. D. Jr. (2002).Pharmacogenomic biomarkers. DisMarkers.18(2):63-71.
• Kwok, Pui-Yan (2001). Methods for genotypingsingle nucleotide polymorphisms. Annu. Rev.Genomics Hum. Genet. 2:235-58
• Kwok, Pui-Yan (2003). Detection of singlenucleotide polymorphisms. Curr. Issues Mol.Biol. Vol. 5: 43-60
• Lesko, L. J.; Woodcock, J. (2002).Pharmacogenomic-guided drug development:regulatory perspective. EEL (Ethical, Economic,Legal & Social) Article. The PharmacogenomicJournal 2, 20-24.
• Lindpaintner, K. (2002). The impact ofpharmacogenetics and pharmacogenomics ondrug discovery. Nature Reviews. Drug Discovery.Vol. 1, June. 463-46.
Referencias
• Meloni, R.; et al. (2004). DNA Microarrays andpharmacogenomics. Pharmacological research.49, 303-308.
• Meyer, J. M.; Ginsburg, G. S. (2002). The pathto personalized medicine. Current Opinion inChemical Biology, 6:434–438.
• Nebert, D. W.; Bingham, E. (2001).Pharmacogenomics: out of lab and into thecommunity. Trends in Biotechnology. Vol 19(12),519-523.
• Norton, R. M. (2001). Clinical pharmacogenomic:applications in pharmaceutical R&D. DDT Vol. 6,No. 4 February, 180-185.
• Peet, N.; Bey, P. (2001). Pharmacogenomics:challenges and opportunities. DDT. Vol. 6(10),495-498.
• Pfost. D. R.; et al. (2000). A SNPshot:pharmacogenetics and the future of drugtherapy. TIBTECH Vol. 18, 334-338.
• Pharmacogenomics: A strategic Market Outlookand Business Analysis. (2003) Sample pages.Frontline Strategic Consulting, Inc. StrategicMarket Reports.
• Phillips, K. A. (2003). The economics ofpharmacogenomics. Current Pharmacogenomics,1, 277-284.
• Phillips, K. A.; et al. (2004). Genetic testing andpharmacogenomics: Issues for determining theimpact to healthcare delivery and costs. TheAm. J. of Managed Care. Val. 10(7): 425-432.
• Position paper on terminology inpharmacogenetics. Committee for proprietarymedicinal products (CPMP).EMEA/CPMP/3070/01, November 2002.
• Ring, H. Z; Kroetz, D. L. (2002). Candidategene approach for pharmacogenetic studies.Pharmacogenomics. Vol. 3(1), 47-56.
• Roses A. D. (2001). How will pharmacogeneticsimpact the future of research anddevelopment?. Drug Discov Today. Jan1;6(2):59-60.
• Roses, A. D. (2002). Genome-basedpharmacogenetics and the pharmaceuticalindustry. Nature Reviews. Drug discovery, vol 1,July, 541-549.
• Ross, J. S.; Ginsburg, G.S. (2002). Integratingdiagnostics and therapeutics: revolutionizingdrug discovery and patient care. DDT Vol. 7, No.16 August. 859-864.
• Schmitz, G.; et al. (2001). Pharmacogenomics:implications for laboratory medicine. ClinicaChimica Acta 308, 43–53
• Severino, G.; Del Zompo. M. (2004). Adversedrug reactions: role of pharmacogenomics.Pharmacological research 49, 363-373.
• Shah, J. (2003). Economic and regulatoryconsiderations in pharmacogenomics for druglicensing and healthcare. Nature Biotechnology,vol. 21 (7), 747-753.
• Shi, M. M. (2002). Technologies for individualgenotyping. A. J. Pharmacogenomics vol. 2(3):197-205.
• Syvanen, A. C. (2001). Accessing geneticvariation: genotyping single nucleotidepolymorphisms. Nat Rev Genet. 2(12):930-42.
• Taylor A. L.; et al. (2004). Combination ofIsosorbide Dinitrate and Hydralazine in Blackswith Heart Failure. N Engl J Med 351:2049-2057, Nov 11.
• Tetlow, S. (2003). Successful Pharmacogenomicsbusiness models. Life Sciences Reports.Cambridge Healthtech Institute.
• Thomas, F. (2002). Business models forpharmacogenomic companies. TARGETS Vol. 1,No. 6 December 2002. 177-181.
• Tollman, P.; et al. (2001). A revolution in R&D.How genomics and genetics are transformingthe biopharmaceutical industry. The BostonConsulting Group, Inc.
• Tsuchihashi, Z.; Dracopoli, N. C. (2002).Progress in high throughput SNP genotypingmethods. Pharmacogenomics J.;2(2):103-10.
• Twyman, R. M.; Primrose, S. B. (2003).Techniques patents for SNP genotyping.Pharmacogenomics. Jan;4(1):67-79).
• Wallace, R. W. (1999). Pharmacogenomics: thenext logical step. DDT Vol. 4, No. 3 March.
• Wieczorek, S. J.; et al. (2001).Pharmacogenomics: will it change the field ofmedicine?. Clinica Chimica Acta 308, 1-8.
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TÉCNICAS DE GENOTIPADO EN LA SALUD HUMANA
• Ácido nucleico: término genérico para el ADN oARN. Los ácidos nucleicos se componen deunidades repetidas que forman las largascadenas observadas en el doble filamentohelicoidal del ADN o en la estructura del ARN.
• Ácido ribonucleico (ARN): cadena única deácido nucleico que contiene como azúcar laribosa. El ARN es responsable de transferir lainformación genética desde el ADN del núcleo alos ribosomas en el citoplasma, donde se utilizacomo guía para la fabricación de proteínas.
• Alelos: cualquiera de un conjunto de dos o másgenes diferentes que ocupan la misma posición(locus) en un cromosoma.
• Expresión génica: proceso por el cual todos losorganismos transforman la informacióncodificada en los ácidos nucleicos en lasproteínas necesarias para su desarrollo yfuncionamiento.
• Fenotipo: rasgos o características visibles de unorganismo.
• Gen: material hereditario, formado por ADN,que codifica una molécula de proteína.
• Genoma: conjunto total de genes de unapersona o célula.
• Haplotipos: variantes genéticas que seobservan en una región cercana, ligada a un geno alelo concreto del mismo cromosoma.Conjunto de alelos de un grupo de genes
íntimamente asociados que normalmente seheredan juntos.
• Mapa genético: situación lineal de los genes enuna región específica del cromosoma.
• Marcadores genéticos: fragmentos de ADN detamaño variable y posición conocida, quepueden utilizarse como puntos de referencia enestudios de genómica. Los marcadores mássimples son los SNPs.
• PCR o reacción en cadena de la polimerasa:técnica que se emplea para conseguir unnúmero ilimitado de copias de cualquierfragmento de ADN, incluso a partir de muestrasmuy reducidas.
• Polimorfismo genético: múltiples variantes deun gen (por tanto de la proteína que codifica)que debe existir al menos en el 1% de lapoblación. En el ADN humano aproximadamente1 de cada 20-500 nucleótidos es polimorfo, esdecir varía de un individuo a otro.
• Proteína: molécula de gran tamaño compuestapor unidades estructurales de aminoácidosunidas en una cadena y plegada de formacompleja.
• Sonda: fragmento de material biológico que seemplea en ciertas técnicas de laboratorio paradetectar genes o proteínas y estudiar susfunciones. En este caso se compone de unfragmento de ADN de secuencia conocida, ydiseñado específicamente para que se una alADN de la muestra.
Glosario
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