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Expresión de receptores en oocitos de Expresión de receptores en oocitos de Xenopus laevisXenopus laevis
Fisiología del Sistema Nervioso 2006
Dra. Eleonora KatzDra. Paola Plazas
Se realiza el viernes 7 de abril de 9.30 a 13 hs y de 14 a 17.30 hs en el INGEBI: Vuelta de Obligado 2490.
1. Preparación
2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M
3. Inyección de cRNA
4. Registro de corrientes iónicas con TVC
ProcedimientoProcedimiento
9
Amplificación del plásmidoAmplificación del plásmido
LB + ampicilina
1. Preparación de cRNA1. Preparación de cRNA
Lavado EtOH+ DNA se redisuelve
1. Tris+EDTA (pH 8)+ Rnase A
Purificación del Plásmido (lisis alcalina)Purificación del Plásmido (lisis alcalina)
2. NaOH + SDS
3. Kac (frío)
Plásmido
ssDNARestos célulasKDS
Buffer de lavado
sobrenadante
Linealización y preparación del templadoLinealización y preparación del templado
SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTRinserto
XX
Tratamiento con Proteinasa K +
Extracción con Fenol-cloroformo
Templado para transcripción in vitro
Transcripción Transcripción in vitroin vitro
SP6 ori amp T7 5’UTR 3’UTRinserto
T7 RNApolrATP;rCTP;rUTP:rGTPCAPBuffer
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
T7RNA pol
Geles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNAGeles de Agarosa con diferentes estadios de la preparación del cRNA
Purificación del plásmidoPurificación del plásmidoPurificación del plásmidoPurificación del plásmido Digestión con Nhe IDigestión con Nhe I Síntesis de cRNASíntesis de cRNA
1. Preparación
2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M
3. Inyección de cRNA
4. Registro de corrientes iónicas con TVC
ProcedimientoProcedimiento
9
2. Aislamiento de los oocitos2. Aislamiento de los oocitos
Anestesiadas con ácido 3-aminobenzoico etil éster
Remoción quirúrgica de los
oocitos
Lóbulos ováricosLóbulos ováricos
Los lóbulos estan formados por oocitos rodeados de tejido conectivo altamente
irrigado (gran cantidad de vasos sanguíneos).
Lóbulos abiertosLóbulos abiertos
Pueden observarse los oocitos en distintos estadios de desarrollo
Polo animal
Polo vegetal
Se eliminan las células folicularesSe eliminan las células foliculares
Diámetro del oocito: 1-1.2mm
1. Preparación
2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M
3. Inyección de cRNA
4. Registro de corrientes iónicas con TVC
ProcedimientoProcedimiento
9
3. Inyección del cRNA a los oocitos 3. Inyección del cRNA a los oocitos
5’UTRAAAAAAAAAAAA
3’UTR
Biosíntesis de la proteína de interés a partir del cRNA por el oocito
… luego de 3 días
Expresión de receptores nAChR 910 en la membrana del oocito
1. Preparación
2. Aislamiento de los oocitos ACh 100 M
3. Inyección de cRNA
4. Registro de corrientes iónicas con TVC
ProcedimientoProcedimiento
9
4. Registro de corrientes iónicas con TVC4. Registro de corrientes iónicas con TVC
Ca2+Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Cl -
Canales endógenos del oocitoCanales endógenos del oocito
BAPTA
•ICl activada por Ca2+ (expresión elevada)
• Canales activados por estiramiento (expresión elevada)• receptores mACh (muscarínicos)• Canales de K+ activados por Ca2+ (expresión baja)
El receptor nicotínico El receptor nicotínico 991010
1960s -1990s AChR ?
1010
9
9
10
99
9
9
9
Elgoyhen et al. 1994 Elgoyhen et al. 2001
El receptor colinérgico nicotínico El receptor colinérgico nicotínico 9910 es una canal iónico10 es una canal iónico
Na +Na + Na +
Na +Na +
Ca2+
Ca2+Ca2+
Ca2+Ca2+
Ca2+
K+ K+
K+
K+
0 5 10 15 20 25 30
-135
-120
-105
-90
-75
-60
ACh
Vsostén = -70mV
Trabajo en el laboratorioTrabajo en el laboratorio10
10
9
9
101. Inyeccción del cRNA de interés a los oocitos (mostración)
2. Fijación de voltaje con dos microelectrodos en oocitos control e inyectados con cRNA de las subunidades nAChR 9 y 10
3. Registro de corrientes evocadas por ACh
4. Efecto de la nicotina
5. Evaluación de la permeabilidad al Ca2+ del nAChR 910 por la activación secundaria de la corriente de cloro activada por Ca2+ en soluciones extracelulares con y sin Ca2+.