• CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA

Dra. Emma del Rosario Guerrero HurtadoDra. Emma del Rosario Guerrero Hurtado

CINETICA QUIMICACINETICA QUIMICA

Cinética Química es aquella parte de la Química que se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción Química y los factores que permiten su control. Se limita a :

a) Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICASQUIMICAS

Según el número de moléculas:Según el número de moléculas:A A P P

A + B A + B p p

A + B + C A + B + C P P

SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓNSEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓNR. Primer Orden: A PR. Primer Orden: A P

V= V= -d A-d A= K (A)= K (A)dTdT

R. Segundo Orden: A+ BR. Segundo Orden: A+ B P PV= V= -dA-dA = - = -dB dB ó + ó + dPdP dT dTdT dT dTdT

V= K (A) (B)V= K (A) (B)

R. Orden ceroR. Orden ceroV= K (A)V= K (A)o..................o..................V=KV=K

Orden con respecto a “A”

ceroV

[A]

1ºV

[A]

20ºV

[A]

Orden Cero 1er Orden

2do Orden

Orden cero con respecto a “A” Vx = k (n = o)

.Reacción de Orden Cero

CINETICA DE MICHAELIS-MENTENEn 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teória para explicar la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima, en función a la concentración del sustrato.

La concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como función de [S].La expresión de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :

Sacarosa Sacarosa Glucosa + Fructosa Glucosa + Fructosa

Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentalesexperimentales

a)(E) variable y (S) constantea)(E) variable y (S) constante

b)(E) constante y (S) variableb)(E) constante y (S) variable

invertasa

agua

(E)

A) Efecto de la (E) sobre la velocidad A) Efecto de la (E) sobre la velocidad EnzimáticaEnzimática

Vo

Vo & (E)

-------------------------------------------------------

Vo 1/2 Vmax

Sustrato KM

B) Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción

(S)

KM = Constante de Michaelis -Menten

Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción

Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

Se supone:

E + S ES ES E + P

Como se relacionan Vmax, Km y Vo?Como se relacionan Vmax, Km y Vo?

Observemos : Observemos : * *

K1K1 K3 K3

E + S ES E + P E + S ES E + P K2 K2 K4 K4

Que hay un solo sustrato Que hay un solo sustrato

Que la velocidad K4 se despreciaQue la velocidad K4 se desprecia

* Que la concentración del E es muy pequeña* Que la concentración del E es muy pequeña

* Que la E puede estar como: E libre y ES* Que la E puede estar como: E libre y ES

* Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que K3, por lo que éste es limitanteK3, por lo que éste es limitante

POR LO QUE...POR LO QUE...

LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA: VO = K 3(ES)

LA ECUACION RESULTANTE SERA:• VVO O = =Vmax.Vmax.(S)(S)

Ecuac. MichaelisMenten

(S) + Km

La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue:

.-1) Cuando [S] es igual que Km:

vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = VmaxVmax Km + [S] [S]+ [S] 2[S] 22

2)2) Km= Km= K2 + K3/K2 + K3/ K1K1

Si K2>> K3 Km =K2/K1Si K2>> K3 Km =K2/K1

Kes = Kes = (E) (S)(E) (S) KM = KM = (E) (S)(E) (S) (ES) (ES)(ES) (ES)

SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMASIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA

Vmax= K3 (ET)Vmax= K3 (ET)

# de recambio# de recambio

K3= número de moléculas de Sustrato K3= número de moléculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturadacuando la enzima esta saturada

NÚMERO DE RECAMBIONÚMERO DE RECAMBIO

CarboxipeptidasaCarboxipeptidasa 101022

TripsinaTripsina 101022 a 10 a 1033

CinasasCinasas 101033

DeshidrogenasasDeshidrogenasas 101033

TransaminasasTransaminasas 101033

Anhidrasa carbonicaAnhidrasa carbonica 101066

Superoxido dismutasaSuperoxido dismutasa 101066

catalasacatalasa 101077

DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL

Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S]

Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax

La ecuación de la recta es: y = a * x + b

La ecuación de la recta es: y = a * x + b

donde: y = 1 y x = 1 Vo [S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.

Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1v

KV s V

m

m x m x -1/Km

1/Vmax

ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMAVELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA

APLICAMOS LA ECUACION DE APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIBICIONINHIBICION ENZIMATICAENZIMATICA

INHIIBIDORES

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

E ES

EI

I

SE + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

COO-

CH2

CH2

COO-

FAD FADH2 COO-

CH

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDH

Succinato deshidrogenasa COO-

CH2

COO-

Malonato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidorescompetitivos

COO-

CH2

CH2

COO-

Succinato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidores competitivoscomo ánalogos estructurales

del substrato

E ES

EI

I

SE + P

I

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVAINHIBICION NO COMPETITIVA

E + I EIE + I EI

I + ES ESII + ES ESI

Algunas enzimas (no todas) que poseen un grupo Algunas enzimas (no todas) que poseen un grupo -SH esencial, son inhibidas no competitivamente -SH esencial, son inhibidas no competitivamente por iones de metales pesados (la enzima por iones de metales pesados (la enzima requiere esos grupos -SH intactos para su requiere esos grupos -SH intactos para su actividad normal).actividad normal).

El agente quelante EDTA se une reversiblemente El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de modo no competitivo a algunas enzimas que de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad. precisan esos iones para su actividad.

DROGADROGA USO USO TERAPEUTICOTERAPEUTICO

ENZIMA ENZIMA AFECTADAAFECTADA

TIPO DE TIPO DE INHIBICIONINHIBICION

LovastinaLovastina HipercolesteroHipercolesterolemialemia

HMGCoA HMGCoA reductasareductasa

CompetitivaCompetitiva

5fluoroacil5fluoroacil cancercancer Dihidrofolato Dihidrofolato reductasareductasa

competitivacompetitiva

alopurinolalopurinol gotagota Xantino Xantino oxidasaoxidasa

irreversibleirreversible

cumadincumadin anticoagulanteanticoagulante GlutamilcarGlutamilcarboxilasaboxilasa

competitivacompetitiva

captoprilcaptopril hipertensiónhipertensión ECAECA competitivacompetitiva

CONCEPTO DE ANÁLOGO DE ESTADO DE TRANSICIÓN (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Substrato

Estado detransición

Análogo deestado de transición

Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH,

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3CCH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

DFP:diisopropilfluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad

Substratos Suicidas(Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS,

- Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas, sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos.Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibióticos b-lactámicos.

R CO NH S

NO

CH3

CH3

COO-

R CO NH S

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

b-Lactamasa

Penicilina (activa)

Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la -lactamasa, el ácido clavulánico

O

NO

COO-

CCH2OH

H-Lactamasa O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

O-

O

HN

COO-

CCH2OH

H

CO

OCH2CHSer

Esta moléculareacciona con la

serina activa de la-lactamasa,

produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL

Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

HO

HO

CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

NH3 + H2O2

HO

HO

CHOH CHO

Noradrenalina

Dihidroxifenilglicol

Monoaminooxidasa

La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamentalpara la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

HC C CH N+CH3

CH3

N

NNH

N

H3C

H2C

O

OSER

N

NNH

NH

H3C

H2C

O

OSER

CH

CHCHN+H3C

H3C

Flavina

Flavina modificada

N,N’ dimetilpropargilamina

(pargilina)

Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARESCINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES

1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple

Azahar:Azahar:

A +E AEA +E AE

A E + B AEBA E + B AEB

B+ E BEB+ E BE

BE + A BEABE + A BEA

2) ORDENADA2) ORDENADA

MALATO + NAD MALATO + NAD

OXALACETATO + NADHOXALACETATO + NADH..

E-NAD-MALATOE-NAD-MALATO 1 21 2

M.D

2) 2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTOREACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO

ASPARTATO + OXOGLUTARATO ASPARTATO + OXOGLUTARATO

OXALACETATO + GLUTAMATOOXALACETATO + GLUTAMATO

1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + 1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + OxalacetatoOxalacetato

2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + 2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + GlutamatoGlutamato

S EF

S

EF

ENZIMA

CA C.ALOST.

ENZIMAS ALOSTERICAS

ENZIMAS ALOSTERICASENZIMAS ALOSTERICAS

PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE

UNION DE LIGANDOS:UNION DE LIGANDOS:

1.- Centro Activo, donde se une el sustrato.1.- Centro Activo, donde se une el sustrato.

2.- Centro Alostérico, donde se unen las 2.- Centro Alostérico, donde se unen las

moléculas denominada efectores o moléculas denominada efectores o

moduladores.moduladores.

MODULADORES O EFECTORES ALOSTERICOS MODULADORES O EFECTORES ALOSTERICOS

Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-)

de la velocidad catalítica.de la velocidad catalítica.

No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.

Pueden ser el mismo sustrato denominado Homotrópico o es Pueden ser el mismo sustrato denominado Homotrópico o es

otra sustancia al que se le conoce como Heterotrópico.otra sustancia al que se le conoce como Heterotrópico.

CINETICA SIGMOIDEACINETICA SIGMOIDEA

La unión cooperativa de la La unión cooperativa de la primera molécula de S o ligando a primera molécula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad la Enzima incrementa la velocidad de unión de subsecuentes de unión de subsecuentes moléculas de sustrato a los otros moléculas de sustrato a los otros sitios de unión: sitios de unión: cooperatividad cooperatividad positivapositiva

ENZIMAS ALOSTERICASENZIMAS ALOSTERICAS

Enzimas susceptibles de ser modificadas por Enzimas susceptibles de ser modificadas por moléculas pequeñas. moléculas pequeñas.

Efector +

Efector -

Vo

Vmax/2

Km Km Km

T

ESTADO CONFORMACIONALESTADO CONFORMACIONAL

R

Baja afinidad por el sustrato

Alta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICASMODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS

MODELO CONCERTADOMODELO CONCERTADO::

+ S

RR

RR

TT

MODELO SECUENCIALMODELO SECUENCIAL : :

+ S

+ S

RT

RR

TT