Cinetica Inmovilizacion de Enzimas

8/13/2019 Cinetica Inmovilizacion de Enzimas

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INSTITUTO TECNOLGICO DEMRIDA

ING. BIOQUMICA

CINTICA QUMICA Y BIOLGICA

Q.F.B. GERARDO RIVERA MUOZ3.7 SISTEMAS CON ENZIMAS

INMOVILIZADAS

INTEGRANTES:AZUETA MATA CIELOKU PUC LIDIA

SNCHEZ CUPUL LENNY19/01/2014


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CONTENIDO

3.7.1 Mtodos de inmovilizacin.

3.7.2 Velocidad de reaccin en sistemas con enzimasinmovilizadas.

3.7.2.1 Efecto de la inmovilizacin sobre la actividadcataltica.

3.7.2.2 Limitaciones difusionales en sistemas conenzimas inmovilizadas.

3.7.2.3 Efecto alostrico y electrosttico en sistemas conenzimas inmovilizadas.

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INTRODUCCIN

La inmovilizacin de las enzimaspermite una mejora significativa de suestabilidad, lo que hace posible su

empleo en la produccin industrial deproductos qumicos, farmacuticos yde alimentos; en el tratamiento de

residuos; en el diagnstico ytratamiento de enfermedades, y otrasmuchas aplicaciones.

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3.7 SISTEMAS CON ENZIMASINMOVILIZADAS

Los biocatalizadores inmovilizados sonenzimas, clulas u organelos (o

combinacin de ellos) confinados olocalizados en cierta regin definida delespacio, con retencin de su actividadcataltica y, si es necesario, de su

viabilidad, y que pueden ser usados demodo repetido y continuo.

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VENTAJAS DEL EMPLEO DEENZIMAS INMOVILIZADAS

1.- Se produce un gran aumento de laestabilidad de la enzima o clulainmovilizada.

2.- Se aumenta de gran manera laproductividad enzimtica por la capacidad dereutilizacin.

3.- Se aumenta la facilidad de recuperacin ypurificacin de los productos.

4.- Se puede elegir entre una gran variedadde diseos ingenieriles

5.- Se aumenta la facilidad de operacin y

control del proceso, al trabajar encondiciones ms suaves19/01/2014


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DESVENTAJAS DEL EMPLEODE ENZIMAS INMOVILIZADAS 1.- Generalmente,

se disminuye laactividad enzimtica.

2.- Se aumentan losproblemasdifusionales.

3.- El biocatalizador

es mas caro que laenzima nativa.

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3.7.1 MTODOS DEINMOVILIZACIN

En general, los mtodos deinmovilizacin se suelen clasificar endos grandes categoras:

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AtrapamientoRetencin

Fsica Inclusin en Microencapsulacion

membranas Reactores demembrana

Mtodos

De

Inmovilizacin Unin Absorcin Inica

a

Unin Soporte Unin covalente

Qumica

Reticulado

o Entre- Co-reticulado

cruzamiento19/01/2014


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M TODO DE INMOVILIZACI NDE ENZIMAS POR RETENCIN

FSICAAtrapamiento.Consiste en la retencin fsica de la enzimaen las cavidades interiores de una matrizslida porosa constituida generalmentepor prepolmeros fotoentrucruza-bles opolmeros del tipo poliacrilamida,

colgeno, alginato, carraginato o resinasde poliuretano.

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CONTINUACINATRAPAMIENTO El atrapamiento puede ser en geles o

en fibras, que suelen ser msresistentes que los geles.

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Es de gran sencillez desde el puntode vista experimental

Como ventaja adicional, la enzima nosufre ninguna alteracin en suestructura.

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RETENCIN FSICA MEDIANTE ELUSO DE MEMBRANAS

Se divide en dos tipos

Microencapsulacin

Reactores de membranas

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INCLUSIN EN MEMBRANAS

MicroencapsulacinEn esta tcnica, las enzimas estn

rodeadas de membranas

semipermeables que permiten el pasode molculas de sustrato y producto,pero no de enzima.

Las microcpsulas obtenidas son deforma esfrica, con tamaoscomprendidos entre 1 y 100 mm de

dimetro. 19/01/2014


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Reactores de membranasLos reactores emplean membranas

permeables al producto final,permeables o no al sustrato inicial yobviamente impermeables a laenzima. Mediante una bomba se

establece un flujo lquido de sustratoque atraviesa el reactor.

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Esta adsorcin se puede realizar de dosformas:

1.Mediante el paso de una solucintamponada de enzima a travs de lamembrana;

2. Por contacto continuo de una solucinde enzima con la membrana.

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METODO VENTAJAS DESVENTAJAS

MEMBRANAS Simplicidad. Problemas difusionales debidosa la membrana.

Posibilidad de uso simultneo devarios enzimas.

Posible inactivacin de enzimas,sometidos a fuerzas de

cizalla elevadas.

Uso de membranas selectivas:control de sustratos/productos

en mezclas.

Mal funcionamiento a bajasconcentraciones de sustrato

(adsorcin de ste en lamembrana)

Proteccin del enzima anteinhibicin, envenenamiento

Estricto control del tiempo deresidencia para sustratos de

bajo peso molecular.

No hay prdidas.

Adecuado para sustratos de altopeso molecular, buen contacto

enzima-sustrato: altasconversiones.

M TODO DE INMOVILIZACI N


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M TODO DE INMOVILIZACI NDE ENZIMAS POR UNIN

QUMICAUnin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin

ms utilizados y de los que se disponede una mayor informacin.

Se debe procurar que lainmovilizacin incremente la afinidadpor el sustrato, disminuya lainhibicin, ample el intervalo de pHptimo y reduzca las posibles

contaminaciones microbianas.19/01/2014


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La eleccin del soporte y del tipo de enlaceresultan determinantes en el comportamientoposterior del biocatalizador.

Los soportes pueden clasificarse en dos

grandes grupos: 1. Soportes inorgnicos. Dentro de este

grupo tenemos una gran variedad desoportes, que pueden ser naturaleso

materialesmanufacturados 2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar

en: Po lmeros natu rales: a su vez divididosen:polisacridos y en protenas fibrosas

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UNIN A SOPORTE

Las enzimas se pueden unir a estossoportes mediante :

Adsorcin Inica

Unin covalente

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UNIN A SOPORTE PORADSORCIN

En la adsorcin, la enzima se une a unsoporte sin funcionalizar medianteinteracciones inicas,

fuerzas de Van der Waals y por puentesde hidrgeno. Los principales factoresque influyen en la adsorcin, son:

El pH medio

La fuerza inicaEl dimetro de poroLa presencia de iones

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UNIN A SOPORTE: UNINCOVALENTE

Formacin deenlaces covalentesentre enzima ysoporte, mucho msfuertes que en laadsorcin.

La unin covalente

debe afectar agrupos funcionalesdel enzima que nointervengan en elproceso cataltico.

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Mtodos Ventajas Inconvenientes

ADSORCIN Los centros activospermaneceninalterados.

Posible desorcin deenzimas

por cambios en pH,

temperaturaNo se requieren

reactivos y las etapasde activacin son

sencillas

Mtodos no especficospara

cada reaccin/enzima

Mtodo sencillo yeconmico.UNINCOVALENTE

Estabilidad del enzima. Nose desliga.

Mtodo caro y complicado.

Mtodo muy flexible,segn se elija el agenteportador y mtodo de

enlace.

La actividad puede

reducirse si losreactivos usados sontxicos para el enzima.

Los centros activos puedenmodificarse/daarse

durante el proceso.19/01/2014


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UNIN QUMICA :RETICULADO

Tambindenominadoentrecruzamiento o

cross-linking. El mtodo consiste

en uso de reactivosbifuncionales que

originan unionesintermolecularesentre las molculasde enzima

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El resultado del reticulado sonenzimas con enlaces intermolecularesirreversibles capaces de resistir

condiciones extremas de pH ytemperatura.

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mtodo ventajas inconveniente

ENTRECRUZAMIENTOEnzima muy estable,

fuertementeenlazado.

Puede daar los centrosactivos.

Puede usarse encombinacin

con la adsorcin paraprevenir prdida de

catalizador.

Puede haber problemasdifusionales que limiten

el rendimiento.

Prdida de enzimadurante preparacin.

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UNIN QUMICA: CO-RETICULADO

Consiste eninmovilizar la enzimapor adsorcin sobre

una resina deintercambio inico oun soporte polimrico(con lo que se

consigue unaelevada cargaenzimtica) yposteriormente

aadir el reactivo19/01/2014


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3.7.2 VELOCIDAD DE

REACCIN EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADAS

3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACION SOBRE LA

ACTIVIDAD CATALITICA

3 7 2 1 EFECTO DE LA


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3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACION SOBRE LA

ACTIVIDAD CATALITICA Altera significativamente el comportamiento de las

enzimas.

Se producen cambios en su estabilidad.

La enzima inmovilizada es un sistema heterogneoen el cual todos los componentes que intervienen enel proceso cataltico se encuentran en interfase: en el

medio de reaccin y en la fase constituida por elsoporte con la enzima.

Como consecuencia, la actividad enzimtica se veafectada por efectos de tipo difusional, estrico y del

microentorno. 19/01/2014

3 7 2 1 EFECTO DE LA


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3.7.2.1 EFECTO DE LAINMOVILIZACIN SOBRE LA

ACTIVIDAD CATALTICA.La actividad enzimtica puede disminuir eincluso perderse. Si se pierde totalmentepuede ser debido:

1. La unin al soporte se produce de tal formaque el paso del sustrato al centro activo estimpedido.

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionancon algn aminocido que forme parte delcentro activo o que sea esencial para laactividad cataltica de la enzima.

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3. Cuando se pueda originar un cambioconformacional que da lugar a una formainactiva.

4. Las condiciones experimentales causan ladesnaturalizacin o desactivacin de laenzima.

Si la prdida de actividad no es total loscambios se debern principalmente efectos :

difusionales, electrostticos, estricos y/o del19/01/2014

3 7 2 2 LIMITACIONES


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3.7.2.2 LIMITACIONESDIFUSIONALES EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADAS. La difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima

puede estar impedida por resistencias de tipo :externo einterno.

a) resistenc ias difu sion ales externas:

Si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustratodeber atravesar la pelcula lquida estacionaria que rodea elsoporte.

En las proximidades de un soporte no cargado, laconcentracin de sustrato es menor que en el resto de ladisolucin.

Los valores de km para las enzimas inmovilizadas sonsiempre aparentes (km).

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3 7 2 2 LIMITACIONES


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3.7.2.2 LIMITACIONESDIFUSIONALES EN SISTEMAS CONENZIMAS INMOVILIZADASb) res is tenc ias d i fus ionales in ternas:

Debida a que los sustratos tienen que atravesar elinterior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte

donde se encuentra la enzima inmovilizada.

Diversas maneras de minimizar estos efectosdifusionales como:

disminuir el tamao del biocatalizador, aumentar la

concentracin de sustrato, incrementar la agitacin o elflujo en el reactor, etc.

Se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, ycomo consecuencia, el valor de km disminuye.

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3 7 2 3 EFECTO ALOST RICO Y


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3.7.2.3 EFECTO ALOST RICO YELECTROSTTICO EN SISTEMAS

CON ENZIMAS INMOVILIZADAS. Efectos electrostticosentre el sustrato y elsoporte Si tienen la misma carga existe una repulsin

mutua, mientras que si las cargas son opuestashay atraccin.

Cuando tienen cargas opuestas, el valor de kmaparente puede verse reducido hasta variasveces por debajo del obtenido en disolucin.

Hornby y cols. desarrollaron una expresinmatemtica que permite calcular la actividad de

las enzimas inmovilizadas.19/01/2014

3 7 2 3 EFECTO ALOSTRICO Y


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3.7.2.3 EFECTO ALOSTRICO YELECTROSTTICO EN SISTEMAS

CON ENZIMAS INMOVILIZADAS. La expresin de Michaelis-Menten en estecaso es:

donde x=espesor de la capa de Nernst;D=coeficiente de difusin;

T=temperatura (K); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday; R=constante universal de los gases V=gradiente de potencial en el soporte.19/01/2014


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APLICACIONES DE LA ENZIMASINMOVILIZADAS

Las aplicaciones ms importantes delas enzimas inmovilizadas se puedenclasificar en:

1. Aplicaciones analticas:biosensores

2. Aplicaciones mdicas: tratamientos

con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la

industria qumica, farmacutica,

alimentaria y de tratamiento de19/01/2014


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BIOSENSORES

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OBTENCIN DEANTIINFLAMATORIOS

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TRATAMIENTO DERESIDUOS

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BIBLIOGRAFA

- Inmovilizacin de enzimas, Prof.J.M.Snchez-Montero, Grupo deBiotransformaciones, Departamento deQumica Orgnica y Farmacutica. Fac.

Farmacia- Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos,

mtodos y aplicaciones, DR. MIGUELARROYO, Departamento de Bioqumica yBiologa Molecular I Facultad de CienciasBiolgicas, Universidad Complutense deMadrid 28040 Madrid

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