Post on 06-Jun-2018
Dr. Rafael Castillo Bocanegra
Facultad de Química UNAM
Desarrollo de un fasciolicida
experimental soluble en agua
1
3 de mayo de 2017
Las enfermedades parasitarias continúan siendo un problema de salud en el mundo
Humanos Animales
Introducción
2
• Amoebiosis (Entamoeba histolytica)
• Giardiosis (Giardia intestinalis)
• Tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi)
• Trichinellosis (Trichinella spiralis)
• Taeniosis (Taenia spp)
• Fasciolosis (Fasciola hepatica)
Parasitosis
Protozoosis
Helmintiosis
Algunas parasitosis en humanos y animales
3 http://www.who.int/zoonoses/institutions/Parasitic/en/ (marzo 2014) Parasite Immunol. 2006, 28, 515-523.
MicrobiosPatógenos
Animales Humanos
Medio acuoso
Enfermedades transmitidas por el agua
El agua como medio de transmisión de parasitosis
4 WHO Headquarters, Geneva, Switzerland, October 2006. pp 39.
Fasciolosis
Infección parasitaria causada por el trematodo Fasciola hepatica, ataca al ganado ovino, bovino, caprino y ocasionalmente al hombre. Es endémica de los lugares con climas tropicales y subtropicales.
Kassai et al. Vet. Parasitol. 1988, 29, 299-326.
Relevancia de la fasciolosis
Baja tasa de crecimiento.
Disminución en parámetros productivos y reproductivos.
Decomiso de hígados en rastros.
Boray, J. C. In Food and Agricultural Organization of the United Nations: Rome; 1994
Fasciolosis (F. hepatica): 17 millones de personas infectadas. Parasitosis importante en el ámbito agropecuario (~18 millones de bovinos infectados y en aumento).
Prevalencia fasciolosis
7 Int. J. Parasitol. 2005, 35, 1255-1278. Vet. Parasitol. 2000, 93, 191-200. Infect. Genet. Evol. 2009, 9, 1023-1032. Expert Opin. Pharmacother. 2007, 8, 1885-1902.
Prevalencia de la fasciolosis animal en México
8
Distribución de la fasciolosis
Bulletin of the World Health Organization. 1999, 77, 340-346. Temas selectos de parasitología; FMVZ-UNAM. 2000, 130-131.
Ciclo de vida de F. hepatica
9 Tomado y modificado de J. Clin. Imaging Sci. 2012, 2, 1-7.
3 cm
1.5 cm
Zoonosis
Bovino infectado
Bovino sano
Distintos animales
Hombre
Transmisión • Alimentos contaminados • Fecal-oral • Agua contaminada
Transmisión • Agua contaminada • Pastura
Transmisión • Agua contaminada • Vegetales contaminados
Transmisión • Agua contaminada • Suelos contaminados
10
http://www.who.int/zoonoses/en/ (marzo 2014) Emerg. Infect Dis. 2003, 9, 403-404. PLOS one. 2014, 9(2): e89055.
Espectro de eficacia de los fármacos empleados para el tratamiento de la fasciolosis
Fairweather I., Boray J. C. Vet. J. 1999, 158, 81-112.
Edad de la F. hepatica en semanas y % de reducción
Fármaco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bitinol, Hexaclorofeno 50-70 80-99
Oxiclosanide, Niclofolán 50-70 80-99
Albendazol 50-70 80-99
Clorsulón +Ivermectina 50-70 80-99
Clorsulón 90-99
Nitroxinil, Closantel 50-90 91-99
Rafoxanida 50-90 91-99
Triclabendazol 99-100
Diamfenetida 100-91 80-50
Administración de triclabendazol
Por vía oral
Sólo el 5 % de la dosis administrada es absorbida.
Difícil control de dosificación para uso veterinario.
Gallay, J.J. et al. Pat US 4197307 (1978, 1980 Ciba Geigy); Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.
N
N
H
O
Cl
S
CH3
Cl
Cl
Administración de triclabendazol
El Triclabendazol es utilizado en una dosis de 12 mg/Kg en bovinos
12 mg-------------1 Kg
X--------------- 450 Kg X=5400 mg (5.4 g)
Ahora bien si tenemos 100 cabezas de ganado
540,000 mg 540 g
Compuesto absorbido 27 g
Peso 450-600 Kg
Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.
14
Planteamiento del problema
o Prevalencia en animales y humanos
o Pocas opciones de tratamiento o Desarrollo de cepas resistentes o Fármacos usados desde décadas
Nuevas alternativas de tratamiento
Moléculas con mayor potencia Menores efectos adversos Mejorar propiedades
fisicoquímicas Cuidado del medio ambiente
Investigación
15
Desarrollar un compuesto antiparasitario útil para el tratamiento de la fasciolosis animal empleando para ello conceptos de Química Farmacéutica como son el reemplazo bioisostérico y el uso de profármacos.
Objetivo de la Investigación
16
N
N
H
SCH3
O
Cl
Cl
ClN
N
H
SCH3
O
ClReemplazo bioisostéricoNo-clásico
Triclabendazol Compuesto Alfa
Diseño isostérico del compuesto Alfa
Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.
17
NCH3
OH CH3
NCH3
OH CH3
OH
OH
NCH3
OH CH3
Cl
Cl
O
OH
N
H
CH3
CH3
DicloroisoproterenolIsoproterenol
PronetalolPropranolol
Reemplazo bioisostérico
clásico
Reemplazo bioisostéricoNo-clásico
Burguer: bioisósteros son compuestos que poseen grupos funcionales con formas y volúmenes casi iguales, aproximadamente la misma distribución electrónica y que exhiben similares propiedades físicas y biológicas.
Bioisosterismo
Prog. Drug Res. 1991, 37, 287-371. Curr. Med. Chem. 2005, 12, 23-49.
N
N
H
SCH3
O
Cl
Compuesto Alfa
N
N
H
SCH3
O
Cl
Compuesto Beta
Evaluación fasciolicida del compuesto Alfa in vitro
100% de eficacia a una concentración de 9.09 mg/mL. El compuesto
Alfa además de matar las metacercarias también las desintegró.
18 Vet. Méx. 1997, 28, 291-296. Vera-Montenegro, E. Tesis de licenciatura QFB. Facultad de Química UNAM. 1991.
19
(a) K2CO3, DMF, 115 °C; (b) H2 / Ni-Raney o SnCl2 .2H2O; (c) 1) CS2, KOH-EtOH, 2) AcOH;
(d) CH3I, KOH/acetona; (e) KOH/MeOH.
+
1 2a: R = H
2b: R = COCH3
3a: R = H
3b: R = COCH3
4
5Compuesto Alfa
a 3a
c
d
e, b
3b
b
OHCl
Cl
NHR
NO2
O
Cl
NHR
NO2
O
Cl
NH2
NH2
O
Cl
N
N
H
SHO
Cl
N
N
H
SCH3
Metodología de síntesis
Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.
Rendimiento global ~41-51%
20
Pf: 181-182 °C sólido amorfo; 192-195 °C cristales
IR, pastilla (KBr) cm-1: 3402, 2720, 1453, 1316, 1157.
RMN 1H, (TMS, DMSO-d6, 300 MHz) d ppm: 2.84 (s, 3H, -SCH3); 6.48 (sa,1H, NH, intercambia
con D2O); 6.77 (d, 1H, J= 7.8 Hz, H-2); 7.29 (s, 1H, H-4); 7.40 (dd, 1H, J1= 7.8 Hz, J2= 8.1 Hz, H-
3); 7.53‒7.66 (m, 2H, H-6, H-7); 7.70 (d, 1H, J= 8.1 Hz, H-4); 7.89 (s, 1H, H-7); 7.94‒8.20
(m, 1H, H-5); 8.12‒8.22 (m, 1H, H-8).
RMN 13C, (TMS, DMSO-d6, 75 MHz) d ppm: 13.46 (S-CH3), 102.95 (C-7), 110.2 (C-2´), 113.116
(C-4), 119.7 (C-8´), 120.83 (C-5), 122.04 (C-4´), 123.8 (C-8´a), 124.12 (C-3´), 124.66 (C-6´),
125.25 (C-7´), 126.21 (C-5´), 128.72 (4´a), 131.34 (C-3a), 133.08 (C-7a), 148.05 ( C-1´), 150.75
(C-2), 152.03 (C-6).
EM, (IE) m/z: 342 (M+2, 39%); 340 (M+•,100%); 305(M‒35, 49%); 304 (M‒36); 290 (304‒15,
40%); 271 (304‒33, 20%); 258 (290‒32, 15%); 127 (340‒213, 20%).
EMAR, (IE) (M+•) m/z. Calculado para C18H13ClN2OS: 340.0437. Encontrado: 340.0437.
Análisis Elemental calculado para C18H13ClN2OS: C, 63.43; H, 3.84; N, 8.22; S, 9.41.
Encontrado: C, 62.82; H, 3.69; N, 7.97; S, 9.86.
4
7Cl
O
2'
3'
4'
8'
7'
5'
6'
N
N
H
SCH3
Compuesto Alfa
5-Cloro-2-(metiltio)-6-(1-naftiloxi)-
1H-bencimidazol
Constantes físicas del compuesto Alfa
Chem. Pharm. Bull. 2002, 50, 649-652.
22
Cl
O N
N
H
SCH3
Cl
O N
N
H
S
CH3
O
Cl
O N
N
H
S
CH3
OO
4-6 4-7 4-8
a b
(a) Ac. mCPB, CHCl3 -CH
3CN, 0-5 °C o NaIO
4, calor; (b) Ac. mCPB, CH
3CN, t.a.
Síntesis de metabolitos del Alfa
J. Mex. Chem. Soc. 2005, 49, 349-354.
Grupo (n=5)
Edad de la fasciola % de Reducción (15 mg/Kg)
a,b
1 3 días 100
3 2 semanas 100
5 4 semanas 100
7 6 semanas 100
9 8 semanas 100
11 10 semanas 100
Eficacia del compuesto alfa en ovinos a diferentes edades de la F. hepatica
Ibarra et al. Vet. Méx., 1997, 28, 297-301.
aPreviamente formulado por David Tamayo Esquivel bLos grupos control 2,4,6,8,10 y 12 tuvieron 0% de reducción
N
N
H
O
Cl
SCH3
Resultados ensayos in vitro e in vivo 100% eficacia in vitro
a 29.34 mM 86.9% de eficacia a dosis de 15 mg/kg contra fasciolas adultas de 10 semanas en borregos, en cápsulas de gelatina
100% de eficacia a 15 mg/kg formulado en suspensión contra fasciolas de 3 días a 12 semanas en borregos infectados experimentalmente
Dosis efectiva en bovinos 12 mg/Kg. Edad de las fasciolas 4-10 semanas.
96.4–100% de efectividad a 12 mg/kg en ganado bovino de 3 días a 12 semanas de desarrollo de las fasciolas
100% y 99.1% de reducción de huevos en animales experimental y naturalmente infectados a 12 mg /kg de peso en ganado bovino
100% de reducción de huevos en animales experimentalmente infectados a 15 mg /kg de peso en ganado ovino irlandés y mexicano
62.5% de reducción de fasciolas en animales experimentalmente infectados a 15 mg /kg en ganado ovino Irlandés
No es teratogénico
Dosis máxima tolerada en bovinos mexicanos 180 mg/kg de peso (IS = 15 veces la dosis efectiva)
Vet. Méx. 1997, 28, 297-301. Vet. Méx. 2000, 31, 47-51. Parasitol. Res. 2004, 92, 211-214. J. Vet. Med. B. 2006, 53, 145-149.
25
Resultados a nivel de ultraestructura
Pérdida de espinas, daño en tegumento, exposición de la lámina basal, daño en fibras musculares
Daño estructural en microtúbulos y/o actina, de células de tegumento y musculares
Activo en fasciolas resistentes in vitro
Efecto en las estructuras del sistema reproductor de fasciolas susceptibles a TCBZ (Espermatogénesis y Ovogénesis)
Daño estructural tiempo dependiente (6-72 hrs)
Parasitol. Res. 2004, 93, 283-286. Parasitol. Res. 2007, 100, 365-377. Vet. Parasitol. 2008, 153, 52-64. Parasitol. Res. 2010, 106, 311-323. Vet. Parasitol. 2012, 187, 183-195.
26
Fasciola hepatica (tres semanas)a las 6 h (1), 12 h (2) y 24 h (3) tras exposición al compuesto Alfa. La microscopía electrónica de barrido muestra daño al tegumento de la superficie ventral (flechas negras). Es notoria la pérdida del tegumento después de 24 h, así como el disco succionador (O) y el tegumento de la parte posterior (flechas blancas).
Estudios sobre el efecto del compuesto Alfa en la estructura y ultraestructura de la F. hepatica
Parasitol. Res. 2005, 95, 379-382.
27
Tegumento de Fasciola hepatica resistentes a TCBZ después de 24 h de la exposición al metabolito AlfaSO. (A) Se observa daño evidente en la superficie del tegumento (flechas), el disco y el succionador ventral (OS y VS) y en las espinas (SS). (B) Imagen de la superficie dorsal de F. hepatica. (C y D) Amplificación de la zona dorsal. Es evidente la pérdida de las espinas, importantes para la adhesión y permanencia del parásito en el huésped.
Estudios sobre el efecto in vitro del compuesto Alfa en la estructura y ultraestructura de la F. hepatica
Parasitology. 2006, 133, 195-208.
29
Compuesto CI50 mM
G intestinalis
CI50 mM
E. histolytica
CI50 mM
T. vaginalis
ALFA 0.3095 0.0264 0.4518
ABZ 0.0370 56.600 1.5920
NTZ 0.0130 0.0550 0.1100
MTZ 1.2280 0.3500 0.2160
Actividad inhibitoria del compuesto Alfa sobre la enzima Triosafosfato isomerasa (TIM) 100 mM E. histolytica: 66% de inhibición T. cruzi: 13% de inhibición
Otras actividades biológicas
Susceptibilidad in vitro en protozoarios
Ensayos en TIM
J. Mol. Graphics Modell. 2011, 30, 90-99.
30
N
H
N
O
Cl
SCH3
Resultados de farmacocinética
Alfa no se detectó en sangre pero sí sus
metabolitos SO y SO2
pka 2.87
logP 1.44
Unión a proteínas plasmáticas 82-86 %
t1/2 Alfa SO en ovinos 19.86 ±1.18 h
t1/2 Alfa SO2 en ovinos 19.43 ±3.33 h
t1/2 Alfa SO en bovinos 29.87 ±8.84 h
t1/2 Alfa SO2 en bovinos 46.32 ± 15.23 h
Solubilidad a pH 7.4, > 0.02 mg/mL
4% de la dosis se absorbe
Alfa 5-Cloro-2-metiltio-6-(1-
naftiloxi)-1H-bencimidazol
J. Vet. Pharmacol. Therap. 2008, 32, 154-159.
Solubilidad acuosa de los bencimidazoles
Mckellar, Q. A.; Scott, E. W. J. Vet. Pharmacol. Ther. 1990, 13, 223–247.
Pobre
solubilidad
acuosa
Administración de triclabendazol
Por vía oral
Difícil control de dosificación para uso veterinario.
Gallay, J.J. et al. Pat US 4197307 (1978, 1980 Ciba Geigy); Wolff et al, Vet. Parasitol., 1983, 13, 145.
N
N
H
O
Cl
S
CH3
Cl
Cl
33
Compuesto poco soluble en agua
Modificación química
Modificación física
Alteración de la composición del
solvente
Sistemas acarreadores
Profármacos Formación de sales
Molienda Micronizado Nanocristales Co-cristales Estructuras porosas
Ajuste de pH Co-solventes Surfactantes
Ciclodextrinas Micelas Microemulsiones Liposomas Polímeros anfifilicos
Modificación de la solubilidad
34
Profármacos
Mejorar solubilidad
Aumentar biodisponibilidad
Mejorar estabilidad
Mejor selectividad
Biotransformación
Modificador
Derivado biorreversible
Bioprecursor
Oxidoreducción Hidrólisis
Fosfonooximetil derivados de 1H-bencimidazol-2-carbamato de metilo
Chassaing, C. et al. J. Med. Chem. 2008, 51, 1111–4. Christophe, P. A.; Chassaing, S. Pat US 20090131369A1 2009.
36
O
S
Cl
O N
N
O
P O-
O-
CH3
Na+
Na+
O
S
Cl
O
Cl
Cl
N
N
O
P O-
O-
CH3
Na+
Na+
Profármacos hidrosolubles: Fosfonooximetil derivados
S
Cl
O N
NH
CH3
CH3
S
Cl
O N
NH
Cl
Cl
Compuesto Alfa
Triclabendazol
37
O
O
PO O-
Na+
O
O
PO H
2322
O
O
PO OH
24
a b
Cl
O S
O
O
Cl
27
OHS
O
O
Cl + CH2BrCl
25 26
c
O
O
PO O
Cld
28
Ruta sintética
Reactivos y condiciones: (a) KMnO4, NaHCO3, H2O, 0-5 °C; (b) HCl, 0-5 °C; (c) reflujo 70°C; (d) NaHCO3, n-Bu4NHSO4, CH2Cl2–H2O, 0 °C–temperatura ambiente
38
NH
NSCH3
Cl
O
R1
O
O
PO O
Cl
+
13, 14 28
29a, 30a
e
OO
O
SCH3
Cl
O N
N
O
P
R1
O
OO
O
P
SCH3
Cl
O N
N
R1
+
29b, 30b
f
g
OHOH
O
SCH3
Cl
O N
N
O
P
R1
Na+
Na+
O-OO
-
SCH3
Cl
O N
N
O
P
R1 OH
OHO
O
P
SCH3
Cl
O N
N
R1
Na+
Na+
O-
O-O
O
P
SCH3
Cl
O N
N
R1 ++
31a, 32a 31b, 32bMFR-33a, MFR-34a MFR-33b, MFR-34b
13: Alfa, R1= naftiloxi
14:Triclabendazol, R1= diclorofeniloxi
Ruta sintética
Reactivos y condiciones: (e) NaH, DMF, temperatura ambiente; (f) HCl 4 M en dioxano, temperatura ambiente; (g) NaOH, MeOH/H2O, temperatura ambiente.
Mezcla de regioisómeros obtenidos
O
SCH3Cl
O N
N
OP O
-
O-
SCH3Cl
O N
N
OP O
O- O
-
O
SCH3Cl
O
Cl
Cl
N
N
OP O
-
O-
SCH3Cl
O
Cl
Cl
N
N
OP O
O- O
-
Na+
Na+
Na+ Na
+
Na+
Na+
Na+Na
+
MFR-33a MFR-34a MFR-33b MFR-34b
41
Mezcla de regioisómeros
O
S
Cl
O N
N
O
P O-
O-
S
Cl
O N
N
O
P O
O-
O-
+
Na+
Na+
Na+ Na
+
Molecular Formula = C19
H14
ClN2Na
2O
5PS + Na+
Formula Weight = 494.79616 + Na+ = 516.97
Monoisotopic Mass = 493.984495 Da
Estrategia de profármaco utilizada
Derivatización
13-14
(Soluble en agua)
+H H
O
MFR-33
MFR-34
13-14 III
(Pobre solubilidad acuosa)
K1Hidrólisis
enzimática
Cl
SCH3
O
R1
N
NH
Na+
Na+
O
SCH3
Cl
O
R1
N
N
O
P O
O
+
II I
O
O
OH OP Na+
Na+
SCH3
Cl
O
R1
N
N
OHCl
SCH3
O
R1
N
NH
K2
Descomposición
espontánea
13, MFR-33, II= 1-naftilo
14, MFR-34, II= 2,3-diclorofenilo
Solubilidad, estabilidad acuosa e hidrólisis con fosfatasa alcalina
aDeterminado a 25 °C, b>95% por UV-HPLC determinado a temperatura ambiente, cdeterminado a pH 7.4 y 37°C.
Compuesto
Solubilidad Acuosa (mg/mL)a
Aumento de la solubilidad
Estabilidad Acuosa (h)b
Hidrólisis en solución con fosfatasa alcalinac
pH 7 pH 1 y 7.4 t1/2 (segundos) Promedio ± DE
Alfa 2.6 X10-4 >26
Triclabendazol 2.4 X10-4 >26
MFR-33 20.67 79,500 >26 7.9±2
MFR-34 21.12 88,000 >26 13.6±4
SCH3
Cl
O N
NH
SCH3
Cl
O N
NH
Cl
Cl
Compuesto Alfa Triclabendazol
O
SCH3
Cl
O N
N
O
P O-
O-
Na+
Na+
MFR-33
O
SCH3
Cl
O
Cl
Cl
N
N
O
P O-
O-
Na+
Na+
MFR-34
Eficacia in vivo de MFR-33 en ovinos contra fasciolas adultas
Compuesto y ruta de
administración (n=6)
Dosis
(mg/Kg)
Promedio ± EEa Eficacia (%)
Fasciolas
recuperadas
Huevos
recuperados
Reducción
de fasciolas
Reducción
de huevos
MFR-33 (oral) 12 12.3±7.3 3.6±1.7 83.3 95.2
MFR-33 (intramuscular) 4 9.0±2.8 37.5±14.8 87.8 50.8
MFR-33 (subcutánea) 4 28.5±7.4 23.0±11.4 61.4 69.8
Grupo control Sin
tratamiento
74.0±4.7 76.3±26.8
0 0
aEE. Error estándar.
Compuesto alfa en suspensión es utilizado en ovinos a una concentración de 15
mg/kg obteniendo una reducción de fasciolas de 86.9%.
Flores-Ramos, M.; et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 5814-5817
MFR-33bMFR-33a
+SCH3
Cl
O N
N
O
P OO
- O-Na
+ Na+
O
SCH3
Cl
O N
N
O
P O-
O-
Na+
Na+
Eficacia in vivo de MFR-34 en ovinos contra fasciolas adultas
Compuesto y vía de
administración (n=6)
Dosis
(mg/Kg)
Promedio ± EEa Eficacia (%)
Fasciolas
recuperadas
Huevos
recuperados
Reducción de
fasciolas
Reducción
de huevos
MFR-34 (intramuscular) 4 3.5±1.4 0±0 96.8 100
MFR-34 (intramuscular) 6 1.7±1.1 0±0 98.3 100
MFR-34 (intramuscular) 8 0.8±0.6 0±0 99.2 100
Triclabendazol (14, oral) 12 0.1±0.1 0±0 99.9 100
Grupo control Sin
tratamiento
102.6±12.3 31.5±4.7
0 0
aEE. Error estándar.
Flores-Ramos, M.; et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, en proceso.
MFR-34bMFR-34a
+SCH3
Cl
O
Cl
Cl
N
N
O
P OO
- O-Na
+ Na+
O
SCH3
Cl
O
Cl
Cl
N
N
O
P O-
O-
Na+
Na+
Parte química
Rendimiento global 43 %.
Parte biológica
El compuesto Alfa en suspensión fue efectivo al 100% in vivo contra fasciolas desde 3
días hasta 12 semanas de edad.
Se demostró ampliamente que el compuesto Alfa es un bioisóstero del TCBZ y que
se puede emplear como fármaco alternativo para el tratamiento de la fasciolosis en
ganado ovino y bovino.
Se propone que la tubulina y actina sean los posibles blancos.
El compuesto Alfa se detecta en plasma como sulfóxido y sulfona, los cuales podrían
ser las especies activas.
Mostró ser un potente amebicida, CI50= 26.4 nM.
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Conclusiones
Se lograron sintetizar dos nuevos profármacos del compuesto Alfa (MFR-33) y del triclabendazol (MFR-34) como sal de fosfato disódico. Rendimiento global 84%.
La solubilidad acuosa.
Se incrementó 79,500 y 88,000 veces en comparación a sus compuestos precursores.
Estabilidad acuosa. >95% después de 26 horas a pH 7.4, ideal para la formulación desde un
punto de vista fisiológico. Los resultados confirman que el compuesto administrado al ganado se
trata del profármaco y no de los compuestos precursores. Con esta estabilidad, se puede garantizar la administración de los
profármacos a una población considerable de animales sin que los compuestos en solución sufran degradación.
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Conclusiones en relación a los profármacos