Clonación en Fagos

Escrutinio de la biblioteca con sonda

Bibliotecas genómicas

DNA genomico

Digestion con enzima de restriccion

Bibliotecas de cDNA

Cebador de oligo dT Reverso transcripcion

Sintesis de DNA doble cadena

RNA mensajero

Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cDNA

Clonación en Cósmidos

Cromosomas artificiales

Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos

La tecnología de DNA recombinante genera herramientas para estudiar los genes y sus productos

Insertar en vector de expresión

Transformar E. coli u otro hospedero

Deducir secuencia de aminoácidos

Preparar péptidos sintéticos

Preparar anticuerpos específicos para una proteína

Secuencia de aminoácidos

Anticuerpo específico

Sintetizar sonda específica

Escrutinio de una biblioteca de DNA por Southern blot

Escrutinio de una biblioteca de expresión por Western blot

Análisis global de los genomas

TRANSCRIPTOMA

PROTEOMA

INTERACTOMA

METABOLOMA

SNPs

RNAs pequeños

Polimorfismos de un solo nucleótido: Este tipo de análisis permite detectar mutaciones, variaciones genéticas entre individuos, y base hereditaria en un organismo

Análisis global de la expresión genética: Permite obtener información rápida, detallada y comparativa del estado en la expresión de genes en diferentes tipos celulares, tejidos u órganos, estados de desarrollo, condiciones o mutantes específicas

Análisis global de la función de proteínas: Información de redes metabólicas y de interacción sistemática entre proteínas en un organismo

Arreglos (Arrays, Chips) de DNA

Macroarreglos: el tamaño del spot es de ~ 300 micras

Colección ordenada de secuencias de ácido nucleico que proporciona un medio para aparearlas con una muestra problema facilitando la determinación de los niveles de dichas secuencias en la muestra y la identificacón de genes desconocidos.

Microarreglos: el tamaño del spot es de ~ 2-5 micras

Análisis de microarreglos con dos marcas

problema control

Transformacion en celulas eucariontes

Transformación directa

Biobalística

Microinyección

Virus

Métodos de transfección Permeabilización química de las membranas Electroporación Liposomas

Vectores

Vectores derivados de virus animales SV40 Retrovirus Vacuna Vectores mixtos

Métodos de selección

Detección de actividades enzimáticas Resistencia a inhibidores Resistencia a antibióticos

Integración dirigida

Clonación en células animales

Vectores de expresión para células animales

Promotor inducible para animales

Creando ratones Knockout

El resto de características de los vectores de expresión son similares

Promotor del gen X Gen reportero

5’UTR X 3’UTR X

Construcción de Reporteros

Proteínas reporteras

Proteína verde fluorescente (GFP)

Beta-glucoronidasa (GUS)

Luciferasa de luciérnaga (LUC)

Las regiones reguladoras del promotor se pueden clonar individualmente ó en combinación

Transformación de células vegetales

Agrobacterium tumefaciens

Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens

Transformación por biobalística

¡ Muchas gracias por ser un grupo tan bueno y con ganas de saber !

El Fin ¿ O solo el principio ?