Universidad Nacional

Autónoma de México

Curso Genética y Biología Molecular

(1630)

Licenciatura

Químico Farmacéutico Biológico

Facultad de Química

Dra. Herminia Loza Tavera

Profesora Titular de Carrera

Departamento de Bioquímica

Lab 105, Edif E

5622-5280

hlozat@unam.mx

IX. PRINCIPIOS DE INGENIERÍA

GENÉTICA

• Objetivo general

– El alumno conocerá los principios de la

tecnología del DNA recombinante y su potencial

para generar organismos genéticamente

modificados.

Objetivos particularesEl alumno... Conoci-

miento

Compren-

sión

Aplica-

ción

1. Aislamiento,

análisis y

manipulación de

ácidos nucleicos

1.1. Examinará los principios y las bases de algunas técnicas

utilizadas en biotecnología (PCR, construcción y escrutinio de

bibliotecas, Northern y Southern-blot, microarreglos).

X

1.2. Distinguirá las diferencias entre biblioteca genómica y de

cDNA.

X

1.3. Comprenderá el principio de la técnica de la amplificación

de ácidos nucleicos por PCR.

1.4. Conocerá los métodos de análisis para evaluar la

expresión genética a nivel de RNA y proteínas.

X

2. Generación de

moléculas de DNA

recombinante

2.1. Conocerá las características, funcionamiento e importancia

de las enzimas de restricción.

X

2.2. Conocerá las características principales de los plásmidos

como vectores de clonación.

X

2.3. Conocerá la existencia de vectores de clonación diferentes

a los plásmidos (fagos, cósmidos, BACS y YACS).

X

2.4. Describirá las técnicas y pasos para la clonación y

expresión de moléculas recombinantes de DNA en organismos

heterólogos.

X

3. Ingeniería

Genética

3.1. Conocerá los métodos utilizados en la expresión de

proteínas recombinantes en organismos heterólogos.

X

3.2. Conocerá la aplicación de los organismos transgénicos en

la agricultura, farmacia y medicina.

X

3.3. Conocerá la aplicación de producción fármacos y vacunas

en animales y plantas transgénicos.

X

4. Clonación y

células troncales.

4.1. Conocerá las estrategias generales de clonación de

células de mamíferos.

X

4.2. Conocerá las características generales de las células

troncales y las aplicaciones potenciales de éstas en la terapia.

X

INGENIERÍA GENÉTICA

Clonación molecular

Clonar significa hacer copias idénticas

Este término originalmente fue aplicado al procedimiento de aislar

una célula y permitirle reproducirse creando una población de

células idénticas

Actualmente, la clonación molecular involucra la separación de un

fragmento de DNA específico, unirlo a una pequeña molécula de

DNA acarreador y luego replicar este DNA modificado miles o

millones de veces mediante el incremento en el número de células

así como por al aumento en el número de copias del DNA clonado

en cada célula

El resultado es una amplificación selectiva de un gen o segmento

de DNA en particular

1

5

4

3

2

in a selective medium

1. Aislamiento del DNA a

clonar y purificación del

vector molecular

2. Corte del DNA usando

enzimas de restricción

3. Unión del DNA exógeno

en el vector molecular

4. Introducción del DNA

recombinante en un

organismo para su

amplificación

5. Selección de las células

que contienen el DNA

recombinante

La clonación

molecular involucra

los siguientes

pasos

AISLAMIENTO DE DNA

Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes

(detergentes, proteasas, cambios de presión)

Separación del DNA del resto de los componentes celulares

(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenol-

cloroformo)

Repetir la extracción. Eliminación del fenol

Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol

Disolver el DNA (se concentra)

Análisis del DNA

Análisis de ácidos nucléicos por espectrofotometría

Espectro de absorción de

DNA

Estimación de la concentración

de A.N. por espectrofotometría

A260 = 1

50 g/ml DNA dc

33 g/ml DNA cs

40 g/ml RNA

Determinar la relación A260/ A280

para saber que tan contaminado

está con proteínas

A260/ A280 => 1.8-2.0 buena

preparación.

Determinar la relación A260/ A230

para saber que tan contaminado

está con polisacáridos

Análisis electroforético de ácidos nucléicos

Separación en geles de agarosa (1–4%)

Electroforesis horizontal.

Migran al ánodo

Tinción con bromuro de etidio o Sybr safe

Intercala entre las bases del DNA

Forman complejos fluorescentes

Separación

electroforética de

moléculas de DNA

(A) Geles de secuenciación (separación

de bandas con 1 nt de diferencia)

(B) Electroforesis para RFLP (separación

entre 100 a 10,000 nt)

(C) Electroforesis de campo pulsante

(separación de DNA cromosomal)

+

––

–

+

+

Las enzimas de restricción

reconocen secuencias

específicas de DNA y cortan en

esos sitios

•Son purificadas de bacterias o

producidas de manera recombinante

•Las enzimas de restricción son

endonucleasas

•Rompen en sitios específicos del DNA

•Reconocen secuencias palindrómicas

específicas de 4, 6, u 8 pb.

•Algunas generan extremos romos y

otras generan extremos cohesivos,

éstos pueden ser:

- 5’ protruyentes

- 3’ protruyentes

El corte del DNA con enzimas de restricción

Análisis

genera extremos

romos

5’ protruyentes

5’ protruyentes

3’ protruyentes

Las enzimas de restricción fueron aisladas de

bacterias, su función natural es proteger contra

DNA extraño

DNA de un plásmido

digerido con EcoRI

DNA genómico digerido

con EcoRI

Extremos son compatibles

Las bases de los extremos cohesivos se aparean, aunque quedan

sin unir covalentemente

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos

cohesivos (sticky) que pueden asociarse con otros

semejantes

Vectores de clonación

Plásmidos

Se pueden clonar

fragmentos entre 1,000 y

10,000 nucleótidos

DNA doble cadena,

circular, origen propio

de replicación

Marcadores de resistencia a

antibióticosPermiten la selección de bacterias

transformadas con el plásmido o

con el DNA recombinante

Origen de replicaciónPermite que la molécula

se replique en un cierto

tipo de célula

Características

de los

plásmidos

Características de los

plásmidos

Sitio múltiple de

clonación:Sitios reconocidos por

diferentes enzimas de

restricción que solo cortan

una vez en el plásmido

Off

Operon Lac : regulación de la expresión de lacZ

On

Inductor MonodJacob

IPTG:

Inductor

gratuito

-gal

color azul

Cuando se cultivan colonias silvestres (wild type) en presencia de X-gal y se

induce la expresión de -galactosidasa con un inductor gratuito, el X-gal es

cortado produciendo un pigmento azul y por lo tanto las colonias son azules.

LB-agar IPTG + X-gal

Resultado de hidrolizar el X-gal

El gen lacZ tiene dos

mutantes: DM15 y

péptido a que no son

capaces de producir

-galactosidasa activa

Fenotipos de los mutantes lacZ en X-galSin embargo, cuando estos

dos genes mutados se

encuentran en una misma

célula, el a péptido se

combina con la proteína -gal

mutante generando una

enzima -gal activa la cual

rompe al X-gal, produciendo

colonias azules.

a-Complementación

Aplicación de la a-complementación para

la selección de moléculas recombinantes

El MCS del vector está insertado entre el promotor y el

péptido a, en el extremo 5’ del gen lacZ de E. coli

Cuando el vector contiene un fragmento de

DNA insertado en el MCS, la -galactosidasa

no es activa y por lo tanto el X-gal no es roto

y no se producen colonias azules, las

colonias son blancas.

LB-Amp+ IPTG+X-Gal

a) Corte del DNA con enzimas de restricción

b) Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector

Inserción de DNA exógeno en un vector

molecular

Construcción

de una

molécula de

DNA

recombinanteDNA A

DNA B

DNA AB

ligasa

Une covalentemente formando un

enlace fosfodiéster

Reacción de ligación

Introducción de moléculas de DNA

recombinante a bacterias hospederas

Múltiples copias de DNA

recombinante

La transformación implica la introducción de DNA extraño a una

célula hospedante

Plásmido de bajo número de copias

Plásmido de alto número de copias

Los fagos como vectores de clonación

Cromosomas artificiales de bacteria (BAC´s)

Se pueden clonar hasta

350,000 nt

Gen de -galactosidasa

Medio con sustrato de -gal

Colonias azules: plasmido

nativo

Colonias blancas: plasmido

recombinante

Cromosomas artificiales de levadura (YAC´s)

Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos

Bibliotecas genómicas

DNA genómico

Digestión con enzima de restricción

Bibliotecas de cDNA

Cebador de oligo dT

Reverso transcripción

Síntesis de DNA

doble cadena

RNA mensajero

Bibliotecas genómicas vs Bibliotecas de cDNA

BUSCANDO UN GEN EN UNA

BIBLIOTECA GENÓMICA

Hibridación y reconocimiento

de secuencias con alta homología

ó a 65oC ó a 50oC

Marcaje de un fragmento de DNA

(obtención de una sonda)

dCTP[a32P]

a

BUSCANDO UN GEN EN UNA

BIBLIOTECA GENÓMICA

SECUENCIACIÓN DE DNA

Secuenciación de DNA por el método de Sanger

No acepta elongación de la

cadena de nucleotidos por

la DNA polimerasa

• dsDNA molde (¿secuencia?)

• 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)

• cebador de DNA

• DNA polimerasa

SECUENCIACIÓN DE DNA

La lectura de la secuencia se

hace de abajo hacia arriba

Secuenciación automatizada de DNA

• En una sola reacción

se incluyen los cuatro

dideoxys marcados

con un fluoróforo

distinto cada uno.

• No es necesario

detener la reacción.

• Es posible

secuencias

fragmentos 800 pb

• Se lee con un láser y

se almacena la

secuencia en una

computadora.

DETECCIÓN DE UN GEN ESPECÍFICO

Pasos para la detección de genes

específicos

A nivel de genoma (DNA)

Southern Blot

A nivel de transcriptoma (RNA)

Northern Blot

1. Aislamiento de DNA

2. Cortar con enzimas de restricción

3. Separar fragmentos por electroforesis

4. Desnaturalizar el DNA

5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon

6. Hibridar con sonda específica

7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager

1. Aislamiento de RNA

2. Desnaturalizar el RNA

3. Separar por electroforesis desnaturalizante

4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon

5. Hibridar con sonda específica

6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager

Bromuro

de etidio

Sonda 32P

28S

18S

Southern BlotNorthern Blot

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La amplificación es exponencial

En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento

particular de interés

1

2

4 8

El uso de una DNA pol termoresistente ha permitido el desarrollo de la PCR

Great Fountain Geyser,

Yellowstone. Manantial

Temperatura 55-80°C

Thermus aquaticus

TaqDNA Polimerasa

Después del PCR los fragmentos se pueden clonar

Los cebadores son

diseñados con extremos

reconocidos por

enzimas de restricción

El PCR se puede utilizar como alternativa al

Southern y Northern blot

DNA: PCRAmplificación directa

RNA: RT-PCR1. Transcripción

reversa

(obtención de

cDNA)

2. Amplificación

por PCRExones +

intrones

Solo

exones

Pruebas de identidad

La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones

• Detección de alelos mutantes caracterizados.

• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.

• Identificación de microorganismos patógenos.

– Caracterización de cepas del virus de la influenza

• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cDNA (Clonación de genes)

• Secuenciación de DNA

• Generación de mutantes puntuales.

• Estudiar la expresión génica.