Post on 19-Feb-2019
Objetivo:
• OBJETIVO: Identificación y enumeración de la subpoblación de
linfocitos T (CD3+), células NK (CD3- CD16+ CD56+) y linfocitos B
(CD19+) de una muestra de sangre periférica, utilizando un reactivo
de inmunofluorescencia directa de tres colores y posterior análisis
por citometría de flujo.
Citometría de Flujo: principios y aplicaciones
La citometría de flujo se basa en el hecho que partículas simples son conducidas por una corriente líquida de manera que puedan ser alineadas y que, en un breve período de tiempo, una a una pasen a través de una celda o cámara en la cual son analizadas.
En dicha celda las partículas son impactadas por una fuente luminosa, como consecuencia de dicha interacción se generan señales ópticas, bandas espectrales en el espectro visible los que pueden ser detectados, integrados y obtener datos correspondientes a sus características físicas (tamaño, granularidad) o bioquímicas.
Ventajas
• La CF permite analizar individualmente un gran número de partículas en tiempos brevísimos (10.000 cél/seg) generando información entre 10-20 parámetros diferentes de cada partícula.
• Usando análisis estadístico es posible separar electrónicamente diferentes poblaciones e identificarlas usando técnicas de análisis multivariado.
• Finalmente, la técnica de sorting permite separar físicamente las células para su posterior análisis.
• Sistema de fluídica
• Sistema de iluminación
• Sistema de detección
• Sistema de análisis
Componentes básicos de un citómetro:
CF permite realizar la medición de una variedad de características celulares:
Tamaño celular relativoGranularidad y complejidad
celular internaNiveles de autofluorescenciaPresencia o ausencia de una
marca fluorescente exógena
Determinación de parámetros celulares:
Fluorocromos
Los fluorocromos son
sustancias que al ser
estimulados por fotones con
una determinada longitud de
onda, comprendida entre
distintos rangos de excitación,
emiten fotones de mayor
longitud de onda (emisión).
Cada compuesto posee une
espectro de excitación y otro
de emisión.
• Clínica médica, hematología, inmunología,
oncología
• Medicina reproductiva
• Biología celular
• Microbiología
• Veterinaria
• Industria farmacéutica
Áreas de competencia:
Principales usos:
• Inmunofenotipificación nos permite analizar:
• Linajes celulares
• Estado de activación celular
• Capacidad de Homing
• Ensayos de funcionalidad celular:
• Producción de citoquinas
• Eflujo de Ca++
• Fosforilación de proteínas
• ROI
• Proliferación celular
• Fagocitosis
• Despolarización mitocondrial
Inmunofenotipificación
El inmunofenotipo es la identificación y cuantificación de distintas poblaciones celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de membrana
MATERIALES
-Reactivo CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD19-PECy5 (Cytognos)
-Citómetro de Flujo equipado con láser de 488 nm y software asociado.
-Tubos eppendorf.
-Sangre obtenida por punción venosa, anticoagulada con EDTA.
-Buffer de lisis de glóbulos rojos
-Buffer salino (PBS)
Especificidad:
El antígeno CD3 se encuentra en la superficie celular de timocitos maduros y linfocitos T
en sangre periférica.
CD3 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como un
mediador de la transducción de la señal, a través de la asociación con el receptor de los
linfocitos T (TCR).
CD3 es una proteína multimérica compuesta de cuatro cadenas polipeptídicas distintas (ε,
γ, δ ζ,), que consta de dos heterodímeros (εγ, εδ) y un homodímero (ζζ). CD3 se expresa
por un alto porcentaje de células T periféricas circulantes y se considera un marcador de
linfocitos T.
Los anticuerpos anti-CD3 se utilizan para la identificación y cuantificación del % de
linfocitos T en muestras de sangre o preparaciones celulares. Se utilizan frecuentemente
para la clasificación clínica de muestras hematológicas en pacientes con leucemias,
linfomas o inmunodeficiencias.
El antígeno CD19 se encuentra en la superficie celular de los linfocitos B normales y
neoplásicos, está ausente en las LT, monocitos y granulocitos.
CD19 es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que actúa como una
molécula de transducción de señales crítica y reguladora del desarrollo, diferenciación y
activación de linfocitos B.
CD19 se expresa en las células dendríticas foliculares y linfocitos B, desde los primeros
estadíos reconocibles de linaje B, su expresión se pierde en la maduración a plasmocitos.
CD19 es un marcador linfocitos B comúnmente utilizado.
El antígeno CD56 se encuentra en las células NK y en subpoblaciones de LT CD3+CD4+ y
CD3+CD8+. Los LB normales, monocitos y granulocitos no expresan el antígeno CD56 en
su superficie.
La combinación CD16 / CD56 facilita la identificación de células NK, como subpoblaciones
que expresan CD16 + / CD56 +, CD16 + / CD56- o CD16 / CD56 +, pero carecen de CD3 y
receptor de células T (TCR).
PROCEDIMIENTO
1- Mezclar 100μl de sangre periférica con 26μl del reactivo: CD3-FITC/CD16+CD56-
PE/CD19-PECy5.
2- Para evaluar la unión inespecífica del anticuerpo puede prepararse un tubo control de
isotipo.
3- Incubar 20 minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
4- Añadir 1 ml de buffer de lisis de glóbulos rojos e incubar la muestra durante 10 minutos
a temperatura ambiente en oscuridad.
5- Lavado: pasar la muestra a un tubo falcon de 15 ml conteniendo 10 ml de PBS frío.
Centrifugar a 400xg durante 5 min.
6- Descartar el sobrenadante por volcado y resuspender el pellet de células en 1 ml de
PBS. Mantener en hielo y al resgurado de la luz.
7- Analizar por citometría de flujo.
Análisis: Antes de adquirir las muestras, ajustar las condiciones de
adquisición para minimizar el debris y asegurarse de que la población celular
de interés se distingue apropiadamente. Verificar que el citómetro está
alineado correctamente y estandarizado para dispersión de la luz (FSC/SSC
en escala lineal) e intensidad de fluorescencia (FL1, FL2 y FL3 en escala
logarítmica).
Crear regiones:
R2: linfocitos: pequeños y de granularidad baja
R1: monocitos
R3: granulocitos
Stats:
Region X-Mean Y-Mean Events %Total %Gated
R0 2169.6 1648.4 21470 100.00 100.00
R2 1631.3 407.3 7234 33.69 33.69
R1 2260.5 1023.8 2548 11.87 11.87
R3 2558.6 2624.0 9280 43.22 43.22
FL1
FL1
controles de isotipo con marca
0,03%
0,07% 0,00%
99,9% 55,8%
13,1% 0,28%
30,8%
0,00%
0,00% 0,03%
99,9% 50,7%
22,8% 5,32%
21,1%
FL3
FL2
Los resultados se deberán informar como porcentaje de linfocitos T, células NK y
linfocitos B respecto al total de linfocitos o leucocitos presentes en la muestra que a
su vez puede determinarse por CF en base a su característico patrón de FSC/SSC
(tamaño/granularidad o complejidad interna).
Valores de referencia (adultos)
Linfocitos T: 61-85%
Células NK: 6-29%
Linfocitos B: 7-23%
(% obtenido por CF respecto del total de linfocitos presente en la muestra)