Post on 13-May-2020
Aproximación al Estudio
Diagnóstico Genético
PARTE 2
Dr. Esteban A. San Martín L.
Residente Genética Clínica
Universidad de Chile
CERPO
Centro de Referencia Perinatal Oriente
Facultad de Medicina, Universidad de Chile
Temario
• INTRODUCCIÓN
• FISH
• MLPA
• ARRAY CGH
• SECUENCIACIÓN DE SANGER
• SECUENCIACIÓN DE SIGUIENTE
GENERACIÓN
S. Down - citogenética
• Trisomía 21 libre 95%
47,XX,+ 21
• Trisomía por traslocación 3%
46,XX,der(14;21)(q10;q10),+21
65% de novo
46,XY, der(21;21)(q10;q10),+21
85% de novo
• Mosaico de trisomía 2%
47,XY,+21(10)/46XY(20)
46,XY, der(21;21)(q10;q10),+21 45,XY,der(21;21)(q10;q10)
Down S. De por translocación Padre portador balanceado de la translocación RIESGO DE TENER HIJOS DOWN =100%
Anomalías cromosómicas:
riesgo de recurrencia
Translocaciones robertsonianas:
Translocación Origen
materno paterno
t(14;21) 10-15% 2-5%
t(21;22) 10% 2%
t(21;21) 100% 100%
INTRODUCCIÓN
• Se ha visto que alteraciones
cromosómicas son responsables de
trastornos del desarrollo y
malformaciones
• Aunque el cariotipo ha sido el gold
standard:
– La resolución es limitada (5-10 Mb)
– Consume tiempo (producción y análisis)
– Requiere de gente muy entrenada Vermeesch et al. Hum Mutat 33: 906-15. 2012
Miller DT et al. Am J Hum Genet. 2010; 86:749-64
Caso Clínico • RN: E.A.C.B.
• F. Nac. : 20 – 04 – 2016
• Sexo: Femenino
• Edad Madre: 29
• Edad Padre: 29
• Embarazo controlado
• Exámenes control prenatal normales. VDRL y VIH (-)
• Eco 12 semanas:
– LCF (+)
– TN: 9.9 mm.
– Hueso nasal presente.
– Higroma quístico.
Caso Clínico
• Eco CERPO: – Gestación única, RCIU, OHA
– Tetralogía de Fallot
– Hipoplasia del hueso nasal
– Imagen de doble burbuja
– Quiste renal izquierdo
– Doppler fetal alterado
• Ecocardiografía prenatal informa: – Tetralogía de Fallot con Obs. DSVD tipo Fallot
– Cayado aórtico Derecho amplio
• Se ofrece Cariograma en L.A. y FISH para del
22q11.2
CONCEPTO
La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio físico en el que se encuentra, permitiendo analizar su distribución en cromosomas, células y tejidos.
FUNDAMENTO
Se basa en la complementariedad de las bases que componen los ácidos nucleicos: G con C (ADN y ARN) y A con T (ADN), o U (ARN).
Se diseña una sonda marcada que hibride con la secuencia a detectar.
FISH
Este sistema permite estudiar la distribución in situ de una
determinada secuencia de interés:
Las que revelan la presencia de algún patógeno
Asociadas a enfermedades de origen genético
Las que se han asociado a desarrollo de ciertos tumores o las que se emplean como indicadores de alteraciones numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo
FISH en núcleo interfásico
• Detección de mosaicos
• Detección de: trisomía,
traslocación críptica
• Detección de
microdeleciones
• Detección de
traslocaciones en
leucemias y tumores
• Diagnóstico Prenatal
FISH
Indicaciones de FISH
• Tejidos extraídos, células en cultivo, tejidos
fijados, células embebidas en parafina
• Indicaciones:
• Ayuda en estudios citogenéticos
• Fenotipo sugerente de una microdeleción
• Descartar mosaicismo si el fenotipo es
característico de un síndrome conocido
• Identificación de una aberración
cromosómica críptica
Indicaciones de FISH
Indicaciones:
• Descartar anomalías cromosómicas numéricas
en estudios prenatales cuando el ultrasonido
revela alteraciones específicas o tamizaje en
embarazos de alto riesgo para no disyunción
cromosómica
• Oncología: linfocitos periféricos, médula ósea,
ganglios, tumores sólidos, efusiones pleural,
ascitis,..
Indicaciones: diagnóstico y seguimiento de la
enfermedad
Diagnóstico: S.Turner
Cariotipo: mos 45,X/ 46,X,+mar
Síndrome Prader Willi/ Angelman
Síndrome Miller-Dieker
15p11.2 Green 15q11-q13 Orange
15q22 Orange
17p13.3 Orange
17q21.1 Green
Normal Deletado
Síndrome Di George/VCF
Blefarofimosis, hipoplasia discos ópticos,
coloboma, cataratas, cardiopatia
22q11.2 TUPLE 1
Orange
22q13 ARSA
Green
Normal Deletado
¿Y SI EL ESTUDIO HUBIESE
RESULTADO NEGATIVO?
Array CGH
• El uso del aCGH supera limitaciones
del cariograma:
– Sólo requiere ADN
– Análisis hasta en menos de 5 días
– Mayor resolución (hasta 0.5Kb o 500 pb)
– Mayor grado de automatización
– Actualmente es primer examen a pedir
para estudio de RDSM, DI y TEAs
Vermeesch et al. Hum Mutat 33: 906-15.
2012
Miller DT et al. Am J Hum Genet. 2010;
86:749-64
aCGH
• La hibridación genómica comparativa permite un análisis
exhaustivo de múltiples ganancias y pérdidas de ADN en
genomas enteros dentro de un solo experimento
• El ADN genómico del tejido a investigar, y el ADN normal de
referencia están marcados diferencialmente y, simultáneamente,
se hibridan.
• Mediante la comparación de las intensidades de fluorescencia de
ADN de prueba y control, los cambios en la intensidad de la señal
causadas por desequilibrios se pueden identificar.
• Los métodos anteriores son altamente limitados y apuntan a un
gen específico o una región cromosómica a la vez y dejan a la
mayoría del genoma sin examinar. La ventaja del aCGH la da su
inespecificidad.
Array CGH
Microarreglos (Microarray, Array)
• Experimento que se basa en la síntesis o fijación de moléculas (o sondas) sobre un sustrato sólido de manera ordenada, y que se expone a moléculas diana que se quieren estudiar
• Tamaño de sondas de ADN pueden variar de 25pb a cientos Kb
Theisen A. Nature Education 2008; 1(1)
Agilent Technologies
Utilidad Clínica
• Usos:
– Neoplasias, especialmente
hematológicas
– Diagnóstico Genético Preimplantacional
– Diagnóstico prenatal de Malformaciones
Congénitas
Methods Mol Biol. 2013;973:1-13
Clin Lab Med 31 (2011) 581–594
1.- Pre-tratamiento (en caso de ser necesario)
Neutralización
Tratamiento con solventes orgánicos
2.- Lisis celular
Disrupción mecánica
Agentes químicos
3.- Purificación de ADN Precipitación
Matrices (kits comerciales)
Método de extracción de ADN
¿Y SI EL ESTUDIO HUBIESE
SEGUIDO RESULTADO
NEGATIVO?
PCR
• La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por
sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica
de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.1 Su
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento
de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir
de una única copia de ese fragmento original, o molde.
• Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad
es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con
una muy alta probabilidad, virus o bacteriasntes de
una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o ADN
amplificado.
¿Qué Necesitamos?
1. Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo
ADN.
2. Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada
uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de
entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que
permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha
distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los
nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
3. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente
como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede
emplear manganeso (Mn2+). Actúan como cofactores de la polimerasa.
4. Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento
de la ADN polimerasa.
5. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima
alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
6. ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
7. Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las
etapas que conforman un ciclo.
MLPA • Es una variación de la reacción en
cadena de la polimerasa múltiple que permite la amplificación de blancos múltiples con un solo par de cebadores.
• Cada sonda consta de dos oligonucleótidos que reconocen sitios diana adyacentes en el ADN. Un oligonucleótido sonda contiene la secuencia reconocida por el cebador directo, el otro contiene la secuencia reconocida por el cebador inverso. Sólo cuando ambos oligonucleótidos de sonda se hibridan a sus respectivos objetivos, pueden ser ligados en una sonda completa.
MLPA
La ventaja de la división de la sonda en dos partes es que sólo los oligonucleótidos ligados, pero no los oligonucleótidos sonda no unida, se amplifican. El producto de amplificación dependerá del número de sitios diana presente en la muestra DNA.
Cada sonda completa tiene una longitud única, de modo que sus amplicones resultantes se pueden separar y se identificaron por electroforesis (capilar.
Debido a que el cebador directo usado para la amplificación sonda está marcada con fluorescencia, cada uno de amplificación genera un pico de fluorescencia que puede ser detectada por un secuenciador capilar.
Comparando el patrón de pico obtenido en una muestra dada con el obtenido en varias muestras de referencia, la cantidad relativa de cada amplicón se puede determinar. Esta relación es una medida de la proporción en la que la secuencia diana está presente en la muestra de ADN.
MLPA Actualmente se encuentra disponible el estudio con MLPA para el Sd. De
DiGeorge
Tiene un costo similar
Tiene mayor sensibilidad con respecto al FISH
Entrega información sobre el segmento deletado
Casos Clínicos
• Eco CERPO 1: – Gestación única, RCIU, OHA
– Estenosis pulmonar
– Hipoplasia del hueso nasal
– Quiste renal izquierdo
– Doppler fetal alterado
• Eco CERPO 2: – Gestación única, RCIU
– Encefalocele occipital
– Polidactilia en 4 extremidades
– Riñones displasicos
NGS • El desarrollo en los últimos años de las
denominadas tecnologías de secuenciación
masiva permite actualmente obtener millones
de secuencias de ADN a una velocidad sin
precedentes y a un coste cada vez más
reducido.
• Estas tecnologías están permitiendo la
consecución de logros científicos
trascendentales, con la identificación de nuevos
genes y la resolución de las bases genéticas de
enfermedades mendelianas a la cabeza.
• Su potencial ha permitido el desarrollo de
nuevas aplicaciones y pruebas biológicas que
van a revolucionar, en un futuro próximo, el
diagnóstico postnatal y prenatal de
enfermedades genéticas.
CONCLUSIONES
En los últimos años se han producido grandes avances tecnológicos que permiten el uso de nuevas herramientas de estudio molecular para múltiples enfermedades genéticas.
Cada vez existen más compañías que ofrecen servicios de estudio genético con costos más accesibles.
Todas estas tecnologías pueden ser aplicadas en el periodo prenatal.
En Chile existen iniciativas que están buscando la implementación de estas técnicas a nivel nacional.
Su complejidad radica en la interpretación de la información obtenida, y las implicancias que esta pueda tener para el paciente y su familia, siendo necesaria la formación de equipos multidisciplinarios.
Reunión CERPO
Gracias