2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus

CICLO DE CORI

↑Demanda de ATP↓O2

Piruvato

NADH

Lactato deshidrogenasa (LDH)

L-Lactato NAD+

Hígado

Sangre

Músculo

Glucosa Glucosa Glucógeno

L-Lactato L-Lactato

ATP + GTP

ADP + GDP + Pi ADP + Pi

ATP

Glucogenolisis y Glucólisis

Gluconeogénesis

2. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO

DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO

DE BOVINO

PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

¿PARA QUÉ PURIFICAR UNA PROTEÍNA?

Lipasa Hexosa oxidasa Vacuna Hepatitis B Insulina Gelatina Proteínas recombinantes

varias Pectinoesterasas

•Suero fetal bovino•Colorante de carne•Proteína liofilizada

¿POR QUÉ QUEREMOS PURIFICAR UNA PROTEÍNA?

Precisar secuencias de aminoácidos.

Establecer relaciones evolutivas.

Investigar la función bioquímica.

Establecer relaciones estructura-función.

Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

FASES DE LA PURIFICACIÓN

1. Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína.

2. Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus.

3. Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible.

DEFINIR LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA DE INTERÉS

SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA

La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como:

a)la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína,

b)la cantidad de la proteína de interés en el tejido y c)cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida,

que ayudará en su estabilización y su aislamiento.

RUPTURA DE LA CÉLULA¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas

elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas.

•Suaves:Lisis celular (choque osmótico)Digestión enzimática (lisozima)Lisis química (detergentes)Homogenización manualMolienda

Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.

MÉTODOS

RUPTURA DE LA CÉLULA¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD

•Moderados:Homogenización con cuchillasMolienda abrasivaCongelamiento 

•Vigorosos:UltrasonicaciónHomogenizador Manton-GaulinPrensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

MÉTODOS

SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA

SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA

Aditivos

FRACCIONAMIENTO CELULAR: CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

Eliminar contaminantes o clarificar la muestra

Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente.

Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.

Diagrama para la obtención de diferentes fracciones celulares

Homogenización del tejido

Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’)

Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación

media(20 000 g, 20’)

Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación

alta(80 000 g, 1 h)

Sobrenadante sujeto

a velocidad de centrifugación

muy alta(150 000 g, 3 h)

Sobrenadante

contiene proteínas solubles

Tejido homogena

do

Pellet, contiene células

completas, núcleos, membran

as plasmátic

as

Pellet, contiene

mitocondrias,

lisosomas, peroxisom

as Pellet, contiene

microsomas (fragmentos

de RE), vesículas pequeñas Pellet, contiene

ribosomas, macromoléculas

grandes

Otros compuestos utilizados para formar el gradiente: detergentes no iónicos, Ficoll, Percoll, Nycodenz y Optiprep.

 

Centrifugación

Muestra

Gradiente de

Sacarosa

Componentes menos

densosComponen

tes más densos

Fraccionamiento

REMOVER CONTAMINANTES Y/O CONCENTRAR LA MUESTRA Después de romper las células y estabilizar las

proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos:

Ultrafiltración

Liofilización

PrecipitaciónPrecipitación

Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

La solubilidad de una proteína es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica.

Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína.

El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4.

¡Y es el que vamos a hacer en la práctica!

Sin embargo, también hay otros métodos…Pp con solventes orgánicos.Pp isoeléctrica.Pp térmica.

Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

Fuerza Iónica

Log

(S

/S’)

Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

Solubilidad

Capa de Hidrataci

ónSalting

inSalting

out

Concentración de sal

Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

EXISTEN TABLAS QUE NOS INDICAN CUANTO AÑADIR DE SULFATO DE AMONIO

Y TAMBIÉN EN INTERNET

http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl Conocer:1. Sulfato de amonio sólido2. Conocer el volumen de la solución3. Y la concentración final de la sal

¿CÓMO VAMOS A PURIFICAR A LA LDH DE Gallus gallus?

PROPIEDADES DE LDH DE Gallus gallus

LDH A LDH B

Numero de aminoácidos 332 333

Peso molecular (Da) 36514.4 36318.0

Punto isoeléctrico 7.75 7.07

Promedio general de hidropaticidad (GRAVY)

-0.004 0.087

Localización celular Citoplasma Citoplasma

Forma activa Homotetrámero

Homotetrámero

Superfamilia LDH/MDH LDH/MDH

Tipo de enzima Oxidoreductasa Oxidoreductasa

Cofactor NAD+ NAD+