DOCENTE:DOCENTE:Villanueva Aguilar CarlosVillanueva Aguilar Carlos

ALUMNO:ALUMNO:Milian Perez RonaldMilian Perez Ronald

"UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO”FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Lambayeque, junio del 2010

CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS DISOLVENTOGENAS

Gen. Clostridium: Tiene 3 caracteristicas:

Formación de endosporos Metabolismo anaerobio de producción de energía Incapacidad de reducir los sulfatos

Propiedades complementarias para caracterización de especies: 

Aerotolerancia por crecimiento sobre medio sólido en aerobiosis.

Presencia de actividad enzimática: Asimilación de azucares y producción de ácidos Naturaleza de productos formados (ácidos,

disolventes) en medio “peptona-extracto de levadura-glucosa” (PYG)

CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS DISOLVENTOGENAS

C. acetobutylicum y C. beijerinckii: Son las especies mejor estudiadas y las mejores productoras de disolventes. C. acetobutylicum:

es la especie principal típica forma bastoncillos de 2.5 – 5 um, móviles por medio de cilios perítricos Gram (+) en cultivo joven esporas subterminal anaerobio estricto temperatura optima de crecimiento de 35 – 37 °C 

C. sporogenes y C. pasteurianus: Son otras especies capaces de producir una cierta cantidad de butanol en condiciones apropiadas.

2. CARACTERISTICA NUTRICIONALES

FUENTES DE CARBONO  Fermentan almidón y sacarosa

ELEMENTOS MINERALES Y FACTORES DE CRECIMIENTO

Utiliza un medio que en su composición incluye biotina y ácido p-amino-benzoico y elementos minerales.

2. CARACTERISTICA NUTRICIONALES

HABITAT Bacterias mesófilas Crecimiento activo: 30 – 40 °C Fácil aislamiento de suelos o vegetales diversos: patata, dalias, granos de maíz, etc. Preponderantemente de suelos calientes donde descomposición de materia orgánica es rápida.

CINETICA Y BALANCE DE LA FERMENTACION DISCONTINUASe desarrolla siguiendo 2 fases

EN UNA PRIMERA FASE (ACIDOGÉNESIS): Cae el pH Excreción de ácido acético y butírico alcanzando un maximo a

12-18 horas. Se produce un desprendimiento gaseoso de H2 y CO2. EN UNA SEGUNDA FASE (DISOLVENTOGÉNESIS): El metabolismo de los azucares surge una reorientación y se

producen directamente acetona, butanol y etanol. La acidez decrece.

El desprendimiento gaseoso aumenta de nuevo se enriquece en CO2 y empobrece en H2.

Crecimiento lento y después estacionario.

AL FINAL DE LA FERMENTACIÓN:

La concentración final de disolventes es próxima a 20 gl-1

La producción especifica de 6-8 g disolventes por g (peso seco) de células.

Contenido de butanol 60-80 % de los disolventes (p/p), de acetona 20-35 % (p/p).

El control de pH puede asegurarse según 2 técnicas:Por regulación a un valor constante, variable según las cepas o siguiendo un perfil determinado gracias a la adición de un agente alcalino (NH4OH, KOH,NaOH).

Por adición de un tampón al medio.

FERMENTACION CONTINUA EN REACTOR HOMOGENEO

La fermentación continua es una practica atractiva para la mejora de la producción sobre todo en una fermentación limitada por la inhibición por los productos.

CON INMOVILIZACION O RECICLADO DE LA BIOMASALa inmovilización (en geles de alginato) y el confinamiento de la biomasa constituyen en general dos métodos de elección para mejorar las productividades volúmicas.

La producción de ABE constituye un ejemplo típico de una fermentación limitada.

Es el butanol con su acumulación en el medio que disminuye y detiene la fermentación.

La acetona a la concentración presente no ejerce inhibición notable.

Técnicas de mejora de la resistencia de cepas al butanol: Adaptación de las cepas a través de cultivos en

medios progresivamente enriquecidos en butanol.

Acción de agentes mutagénicos asociada a la selección de mutantes por su resistencia al butanol.

Fisiológicamente el Oxigeno provoca:Enlentecimiento. Detenimiento el crecimiento y síntesis de

ADN, ARN y proteínas.Detenimiento de la producción de ácido

butírico. No de ácido acético.C. acetobutylicum induce una NADH

oxidasa.

RELACION ENTRE ESPORULACION Y DISOLVENTOGENESIS

Al comienzo de la acidogénesis: las células vegetativas son móviles por cilios perítricos. Forma de bastones alargados y netamente positivas al Gram.

Al final de la acidogenesis: 1-2 horas antes del punto de ruptura del pH , las células se cargan de granulosa, polímero de reserva parecido a la amilopectina que colorea de azul violeta al yodo.

RELACION ENTRE ESPORULACION Y DISOLVENTOGENESISAl inicio de la disolventogénesis: la célula

inicia la fase estacionaria. Pierde movilidad y toma la morfología clostridiana (forma de cigarros puros inflados, refringentes rodeados de cápsulas de polisacáridos). Son formas bacterianas donde el mecanismo de esporulación entra en acción hasta los estadios I y II. Prosigue la formación del endosporo (estadio III) y la síntesis de cortex (estadio IV).

AUTOLISIS

Este fenómeno parece observarse desde el final de la fase exponencial de crecimiento.

Se caracteriza por una liberación masiva de autolisina al medio que provoca, paralelamente a la disminución de la biomasa en el reactor, un descenso marcado de la productividad volúmica de disolvente.

2.7. DEGENERACIONConsiste en una evolución considerada

irreversible de la forma clostridiana hacia una forma “degenerada”, anesporulada, acidógena y no disolventógena.

VIAS METABOLICASLos clostridios disolventógenos utilizan una

gran variedad de azúcares.

El metabolismo de la glucosa por C. acetobutylicum sigue la vía glucolítica ( Vía de Embden-Meyerhof-Parnas), usada por los clostridios sacarolíticos.

Los azúcares con 5 C: vía Pentosa Fosfato.

El piruvato entra en una secuencia de reacciones que conduce a la formación de ácidos y disolventes.

VÍA DE ACIDOGÉNESIS Y DE DISOLVENTÓGENAS EN CLOSTRIDIUM

VÍA DE ACIDOGÉNESIS Y DE DISOLVENTÓGENAS EN CLOSTRIDIUM

Balances de las reacciones a los que conducen estas vías a partir de la glucosa

REGULACION DE LAS VIAS METABOLICAS: TRANSICION DE LA ACIDOGENESIS A LA DISOLVENTOGENESIS

La regulación de las vías metabólicas, es crucial para la comprensión y control de la fermentación acetonobutílica.

El punto central objeto de intensos estudios, es la transición de las fases acidogénesis / disolventogénesis

Fisiología de la transiciónParece que el fenómeno conocido como

<efecto desacoplante de los ácidos > sea el origen de la transición hacia la disolventogénesis

La disolventogénesis:Aunque produce menos ATP que la acidogénesis

(Tabla 5) es más favorable energéticamenteProduce menos protonesPermite el reconsumo de ácidosElimina el gasto energético que provoca la

presencia de ácidos ejerciendo un papel de detoxificación.

Mecanismo de la transición La transición acidogénesis/disolventogénesis se manifiesta por una baja de las actividades enzimáticas características de la acidogénesis y por un importante, aunque variable de las actividades especifica de la producción de acetona y butanol.

La conversión en disolventes del acetato y del butirato producidos (o añadidos al medio de fermentación) se efectúa en realidad por la intermediación del acetoacetil CoA.

OBTENCION DE MUTANTES Mutagénesis en C. acetobutylicum: 

Se pueden obtener mutantes resistentes a los antibióticos y al butanol.

Los mutágenos que actúan por acción directa (EMS, N-metil-N´nitro-N nitrosoguanidina) son eficaces, mientras que los que implican la intervención de los mecanismos celulares falibles de reparación del DNA (rayos UV) son malos mutágenos.

Una técnica particularmente útil es el empleo de sustratos-suicida (derivados halogenados del acetato y del butirato)

SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENETICA Se puede realizar transferencias genéticas. Transferencia a C. acetobutylicum de genes de

resistencia a antibióticos portados por plásmidos de estreptococos conocidos por su amplio espectro de hospedadores.

Se ha observado una buena expresión en E. coli de los genes de C. acetobutylicum.

La transformación plasmídica de protoplastos o fusión de protoplastos es una técnica atrayente pues ofrece una amplia posibilidad de manipulación genética de las cepas.

FAGOSLos fagos constituyen otro tipo de vector susceptible

de ser utilizado para las transferencias genéticas.Numerosos estudios, dedicados a los fagos de estos

clostridios han sido motivados por la considerable importancia, de prevenirse frente a la contaminación por los fagos.

Fagos de C. saccharoperbutylacetonicum:Obtención de mutantes resistentes .Estudio de propiedades y clasificación de fagos

obtenidos.Espectro reducido de hospedadores

5.1. AISLAMIENTO Se aprovecha la propiedad de resistencia al

calor de los esporos Muestras de tierra o materia orgánica en

descomposición se somete a shok térmico violento (1 o 2 minutos a 100 °C ) o pasteurización (5-10 minutos a 70-80 °C)

La germinación y crecimiento bacteriano tiene lugar en anaerobiosis estricta en tubos de medio líquido.

Los tubos con cubierta de espuma o que desprenden un olor de alcohol butílico se extienden sobre placas petri en anaerobiosis.

Resembrar las colonias aisladas en medio líquido y someter a prueba de producción de disolventes.

CONSERVACION DE LAS CEPASEn estado esporulado mezcladas con

tierra o arena estéril por añosMétodos clásicos de la microbiología

de los anaerobiosCongelaciónLiofilización de las formas esporuladas

Conservación a 4 °C en medio liquido en anaerobiosis