RENDIMIENTO DE BIOMASA Y CONTENIDO DE LÍPIDOS DE Tetraselmis suecica
UTILIZANDO DIFERENTES CONCENTRACIONES DE EFLUENTES DE
BODEGAS DE EMBARCACIONES ANCHOVETERAS INDUSTRIALES EN
CONDICIONES DE LABORATORIO
BACH. JOSÉ ARTURO GONZÁLEZ FERRERBACH. LINCOL ROLLER POLO BORDONABE
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTAFACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL BIOLOGIA EN ACUICULTURA
Contienen proteínas, vitaminas y ácidos
grasos poliinsaturados (Quevedo et al., 2008).
Puede utilizar diferentes fuentes nitrogenadas inorgánicas (urea, fosfato diamónico, nitratos, nitritos, etc.)En cultivos heterotróficos utilizando residuos orgánicos, puede metabolizar diversos aminoácidos y vitaminas produciendo cambios importantes en su crecimiento y composición bioquímica (Merino et al., 2003).
microalga marina unicelular 4 flagelos isodinámicos 10 um de diámetro (Ulloa, 2011).
Alimentación humana y animal
investigaciones genéticas,
morfológicas, fisiológicas,
nutricionales y bioquímicas (Blanco, 1991; Alveal et al.,
1995; Bertoldo et al., 2006).
Indicadores biológicos de contaminación respecto a la calidad de las aguas (Gómez & Ramírez, 2004).
Microalgas
Tratamiento de las aguas residuales (Romero et al.,
2009)
Tetraselmis suecica
INTRODUCCIÓN
Industria Pesquera
Desechos sólidos y líquidos
ambiente marino
0,05 a 2 TM de sanguaza por TM de pescado crudo (Cabrera, 2002; TASA, 2013).
Líquidos orgánicos (sangre, escamas, vísceras y agua marina de faena, que al verterse en el mar ocasionarán problemas de contaminación.
Chimbote
Chlorella sp. con residuos industriales líquidos orgánicos pesqueros DBO 85 % Romero (2011)
Méndez et al. (2010)Biorremediación utilizando la clorofita Scenedesmus quadricauda en efluentes cloacales diluidos al 25, 50 y 75 % 94, 40, 94 y 94 % amoníaco (63,7 mg L-1), nitrato (2,5 mg L-1), fosfato (16,725 mg L-1), fósforo total (5,464 mg L-1)sulfuros disminuyeron un 99% respecto al valor inicial (1,645 mg L-1)
Silva et al. (2011) concentraciones de sanguaza entre el 2 y 9 % como medio de cultivo para T. suecica, encontrando que un 3,5 % y 4,56 % presentan los crecimientos máximos.
Zhang (2012)Demostró la efectividad de Chlorella para eliminar completamente el amonio y fostatos presentes en los efluentes domésticos secundarios.
Lípidos en microalgas
síntesis y acumulación de triglicéridos,
Composición Nitrógeno
(Alsull & Wan, 2012)
Contenido lipídico
1 - 90 % peso secoAdición o restricción
alteraciones en la composición de los lípidos y ácidos grasos.
Biomasa microalgal
Biocombustible
Lípidos
(Donohue & Codgell, 2006; Meng et al., 2009; Rodolfi et al., 2009).
ESTRÉS
Crece exitosamente en diferentes medios de cultivo y metabolizar diversas fuentes nitrogenadas orgánicas e inorgánicas (Fernández & Paredes, 2006; Ipanaqué & Paredes, 2010).
T. suecica
Ensayos realizados con residuos pesqueros (Fernández & Paredes, 2007)
Efluentes bodegas de embarcaciones
Biomasa microalg
al y lípidos
Biotransformación
Contaminación marina
¿Cuál es el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales en condiciones de laboratorio?
Objetivos
Objetivo general
Evaluar el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales en condiciones de laboratorio.Objetivos específicos
- Determinar el rendimiento de biomasa y velocidad de crecimiento de T. suecica utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales (EEA) en condiciones de laboratorio;
- Determinar el contenido de lípidos de T. suecica utilizando diferentes concentraciones de EEA en condiciones de laboratorio.
Hipótesis de investigación
Si utilizamos concentraciones de 1, 2 y 5 % de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales (EEA) se obtendrá mayor rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis suecica con la concentración de 2 % de EEA.
- Variable independiente (Vi) Concentraciones de EEA (1, 2 y 5 % ).
- Variable condicional (Vc) Condiciones de Laboratorio (luz, temperatura, aireación).
- Variables dependientes (Vd) Producción de biomasa. Concentración de lípidos totales.
Materiales y métodosMaterial biológico
Guillard f/2
20 mL Luz 40 w
Tratamiento del agua de cultivo
suspensión
Agitación constanteT. suecica
Laboratorio Cultivos
agua de mar
“El Dorado”
Transporte
2 recipientes 100 L c/u
Sedimentado
48 h
Filtrado
10 µm - malla de Nytal
Hipoclorito de sodio (5,25 %) 1 ml x L de agua de mar x 24 h
Neutralizado
Tiosulfato de sodio (15 % ) 1 mL x L de agua de mar
abundante aireación (5 L min-1) x 1 h
Preparación de los inóculos de T. suecica
Inóculos microalgal
es
100 mL cultivo
agua de mar esterilizada
iluminación constante x 5 días (2000 lux)
250 mL
Volumen efectivo 600 mL
iluminación (2000 lux)
aireación constante (50 mL min-1)
agitación manual 2 veces x día.
Inóculos
1
2
Preparación de los medios de cultivo
Medio Guillard f/2
COMPUESTOCONCENTRACIÓN
(mg L-1)
Nutrientes MayoresNaNO3
NaH2PO4H2O
75,05,0
MicronutrientesNa2EDTA
FeCl3.6H2O
CuSO4.5H2O
ZnSO4.7H2O
CoCl2.6H2O
MnCl2.4H2O
Na2MnO4.2H2O
4,363,150,01
0,0220,010,18
0,006
VitaminasTiaminaBiotinaCianocobalamina
0,10,50,5
Obtención de EEA
Homogenizar (licuadora) y
filtrar a 20 um malla de nytal
Autoclave 121 °C x 15', licuar y filtrar -papel Whatman 41
Realizar las diluciones
Neutralizar a pH 7, con NaOH o
HCl
Almacenar a 5 °C en las botellas
hasta el inicio del experimento
Flujo de la preparación de los efluentes para el cultivo de T. suecica.
Acondicionamiento de las Unidades Experimentales
Tratamientos Especificaciones
T0Cultivo de T. suecica con medio de cultivo Giullard f/2 (Control).
T1Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 1 % de EEA.
T2Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 2 % de EEA.
T3Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales con una concentración de 5 % de EEA.
Tratamientos utilizados en los cultivos de T. suecica.
PARÁMETROS CONCENTRACIÓN
Humedad (%) 91,26
Proteínas (%) 3,71
Lípidos (%) 0,14
Cenizas (%) 3,38
Sólidos Totales (g L-1) 87,44
Nitratos (mg L-1) 1,52
Nitritos (mg L-1) 0,02
Fosfatos (mg L-1) 1,17
Amonio (mg L-1) 8,23
Valores de las concentraciones de los principales parámetros de los efluentes de las embarcaciones anchoveteras industriales (EEA).
Analizado en el Laboratorio de Biología y Ecología de la Universidad Nacional del Santa.
Determinación del crecimiento poblacional de T. suecica
conteos diarios
suspensión
microalgal
Cámara Neubauer alícuotas
microscopio
binocular Olympus
velocidad de crecimiento
poblacional por día (µ)
tiempo de duplicación diaria (TD) al quinto día de cultivo
N0 y Nf corresponden al número de células por mL al inicio y al quinto día (T0 y Tf), respectivamente.
Determinación de la biomasa de T. suecica
Pesado papel filtro Whatman N° 42
Embudo Büchner
matraz Kitasato
Bomba de vacío Filtrado50 mL de suspensión microalgal x c/ unidad experimental
Secado
estufa a 60° C por 8 h105° C por 10 min
Enfriado
Pesado
secador de campana por 1 h
Biomasa (mg L-1)
((P2 – P1) / 50) x 1000
P1: Peso inicial (papel) mgP2: Peso final (papel + muestra) mg.
Agregar 2 mL de H2SO4
concentrado
Muestra centrifugada (10 mL)
Agregar 3 mL de metanol:cloroformo (2:1)
Centrifugar 10000 rpm por 10 min.
Agregar 3 mL de agua y extraer la capa superior
Evaporación de gases y secado con calor
Calentar a 200 ºC x 60´
Enfriar a temperatura ambiente
Lectura espectrofotométrica a 375 nm (longitud de onda)
Dejar reposar por 24 horas a 5 ºC
Flujograma para determinar los lípidos totales de T. suecica en todos los tratamientos. Metodología de Blight & Dyer (1959) y Marsh & Weinsteinn (1966).
y = 1,7635xR² = 0,9982
y = 1,6876xR² = 0,9934
0,0
0,1
0,3
0,4
0,5
0,6
0,8
0,9
1,0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Abso
rban
cia
Lípidos (mg mL-1)
A
B
Lineal (A)
Lineal (B)
Curvas de calibración para la determinación de lípidos en T. suecica.
(Blight & Dyer, 1959; Marsh & Weinsteinn, 1966)
Donde:V: Volumen final de muestra analizada (ml).M: Peso equivalente al peso seco (mg) en 10 mL de cultivo.
Contenido de lípidos (LT) en biomasa
Donde:L: Porcentaje de lípidos (%).B: Biomasa seca total por litro (mg).
Análisis estadístico de los datos
Análisis de varianza (ANOVA) Diferencias ÷ promedios
Prueba de Tukey HSD para establecer el mejor promedio
Nivel de significancia de 0,05Microsoft Office Excel 2010 y SPSS 20.0 para Microsoft Windows 7
Resultados
Parámetros del cultivo de T. suecica
Variación de la temperatura promedio (°C) en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).
22,1 - 24,3 °C
Δ 2,2 ºC
Variación del pH promedio en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).
Δ 7,81 al inicio del experimento, y 9,26 en el cuarto y quinto día de cultivo.
Crecimiento poblacional de T. suecica
DÍA DECULTIVO
EEA (%)
CONTROL 1 2 5
0 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a 0,18 ±0,00a
1 0,26 ±0,01a 0,21 ±0,01b 0,20 ±0,01b 0,20 ±0,01b
2 0,42 ±0,02a 0,34 ±0,03b 0,31 ±0,02b 0,32 ±0,02b
3 0,94 ±0,04a 0,82 ±0,02b 0,77 ±0,02b 0,80 ±0,02b
4 1,75 ±0,10ab 1,64 ±0,09b 1,88 ±0,10a 1,93 ±0,05a
5 2,33 ±0,13b 2,13 ±0,11b 2,65 ±0,08a 2,78 ±0,09a
6 2,70 ±0,07b 2,16 ±0,09c 2,91 ±0,09ab 3,05 ±0,09a
7 2,72 ±0,12b 2,04 ±0,09c 3,24 ±0,16a 3,44 ±0,15a
8 2,59 ±0,12c 1,90 ±0,13d 3,22 ±0,15b 3,61 ±0,08a
9 2,40 ±0,09b 1,75 ±0,09c 3,15 ±0,10a 3,34 ±0,11a
10 2,36 ±0,10b 1,40 ±0,11c 3,18 ±0,16a 3,42 ±0,10a
11 1,89 ±0,12c 1,13 ±0,07d 3,07 ±0,14b 3,38 ±0,12a
Densidad poblacional promedio (x106 cél. mL-1) de T. suecica cultivados con medio EEA y Guillard f/2 (control).
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).
Variación de la densidad poblacional (x106 cél. mL-1) en los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).
PARÁMETRO
EEA (%)
CONTROL 1 2 5
µ (día-1) 0,51 ±0,01b 0,49 ±0,01b 0,54 ±0,01a 0,55 ±0,01a
TD (día) 1,35 ±0,03b 1,40 ±0,03b 1,29 ±0,01a 1,27 ±0,02a
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).
Promedios de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación diaria (TD) poblacional de T. suecica en los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
Al quinto día de cultivo
Inicio del experimento
Contenido de lípidos en T. suecica
a
b bc
Contenido de lípidos en porcentaje de T. suecica en los tratamientos con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control). Letras diferentes indican diferencia significativa (α=0,05).
Rendimiento de biomasa total y lípidos en T. suecica
PARÁMETROSEEA (%)
1 2 5
Biomasa Total (BT)(mg L-1)
434,66 ±22,85b 569,49 ±22,63a 607,13 ±18,18a
Biomasa Lípidos (BL)(mg L-1)
116,09 ±4,12b 133,09 ±2,17a 140,63 ±2,61a
Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica, en los tratamientos cultivados con 2 y 3 % de EEA.
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).
Rendimiento de biomasa total y lípidos de T. suecica en los tratamientos dosificados con EEA.
Letras diferentes entre tratamientos indica diferencia significativa (α=0,05).
434,66
569,49
607,13
116,09133,09 140,63
0
100
200
300
400
500
600
700
10 20 50
mg
L-1
EEA (mL L-1)
BIOMASA TOTAL BIOMASA LÍPIDOS
(2 %) (5 %)(1 %)
b
b
a
a
a
a
PARÁMETROSEEA (%)
2 5
Rendimiento BT(g / L de EEA)
28,47 ±1,13a 12,14 ±0,36b
Rendimiento BL(g / L de EEA)
6,65 ±0,11a 2,81 ±0,05b
Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica, en relación a la dosificación de EEA, en los tratamientos cultivados con 2 y 5 % de EEA.
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).
R² = 0,9954
R² = 0,9989
0
10
20
30
40
0 10 20 30 40 50 60
Ren
dim
ient
o (g
/ L
de E
EA
)
EEA (mL L-1)
R BIOMASA TOTAL R BIOMASA LÍPIDOS
(2 %) (5 %)
Rendimiento de biomasa total y de lípidos en relación a la dosificación de EEA para T. suecica en los tratamientos con medio de cultivo EEA.
DISCUSIÓN
cultivos microalgales características ambientales
composición química
luminosidad
nutrientes
pH
(Laing & Helm, 1981; Richmond & Becker, 1986; Millán-Núñez et al., 2010)
Rango T°
especiemicroalgas
cultivadas
Rango T°
Hasta 25 °C
36 °C
Abalde et al. (1995)
T. suecica
18 y 22 °C
productividad no es afectada
Laing & Helm (1981)
significativamente iguales en cada día de cultivo, por lo que no serían condicionantes para la obtención de los resultados.
Δ T° 22,1 - 24,3 °C,
pH
Rango óptimo
7 - 8
(Richmond & Becker, 1986)
cultivan T. suecica 7,3 y 8,5
Millán-Núñez et al. (2010)
Silva et al. (2011)
cultivan T. suecica 7,13 y 8,69
pH entre 7,81 y 9,26, no determinante en los resultados.
crecimiento
poblacional
asimilación nutrientes,
T. suecica
Nitrógeno
limitación de
nutrientes
crecimiento
Densidades microalgales
acumulación de lípidos
el doble (Thompson 1996)Tiempo de duplicación diaria (TD)
1,50 día Sheehan et al. (1998)
Alsull & Wan (2012) Loera-Quezada & Olguín (2010)
Fábregas et al. (1996)
Inhibición x
saturación N
CONCLUSIONES
Las mayores densidades poblacionales de T. suecica al quinto día de cultivo se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % EEA, con 2,65 y 2,78 x106 cél. mL-1, respectivamente; mientras que el menor se encontró con el dosificado con 1 % de EEA con 2,13 x106 cél. mL-1.
Los mayores valores de µ para T. suecica al quinto de cultivo se presentaron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de EEA, con 0,54 y 0,55 día-1, respectivamente; y el menor valor se presentó en el tratamiento dosificado con 1 % de EEA, con 0,49 día-1.
El mayor valor de TD para T. suecica en el quinto día de cultivo, se obtuvo en el tratamiento con 1 % de EEA, con 1,40 día; mientras que los menores valores se presentaron en los tratamientos con 2 y 5 % de EEA, con 1,29 y 1,27 día, respectivamente.
El mayor contenido en porcentaje de lípidos para T. suecica al quinto día de cultivo, se obtuvo en el tratamiento dosificado con 1 % de EEA con 26,73 %; y con dosificaciones de 2 y 5 % de EEA se obtuvieron menores porcentajes con el 23,39 y 23,18 %, respectivamente.
Los mayores rendimientos en biomasa de lípidos para T. suecica al quinto día de cultivo, se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de EEA, con 133,1 y 140,6 mg L-1, respectivamente; y con el 1 % de EEA se obtuvo una menor biomasa de lípidos con 116,1 mg L-1.
Al comparar el rendimiento de biomasa total (BT) y lípidos (BL) de los tratamientos con 2 y 5 % de EEA, se obtuvo que el dosificado con 2 % de EEA presentó un mayor rendimiento para BT y BL con 28,47 y 6,65 g / L de EEA, respectivamente; mientras que con 5 % de EEA, se obtuvieron 12,14 y 2,81 g / L de EEA, para BT y BL, respectivamente.
RECOMENDACIONES
Evaluar el contenido de carbohidratos y proteínas de los cultivos de T. suecica con diferentes concentraciones de EEA.
Evaluar el efecto del número de dosificaciones en el crecimiento y contenido de lípidos, carbohidratos y proteínas de T. suecica cultivado con diferentes concentraciones de EEA.
Determinar el efecto de diferentes concentraciones de EEA en el crecimiento poblacional y contenido de lípidos en cultivos masivos de T. suecica cultivados en tanques de 100 L. Evaluar con diferentes concentraciones de EEA, los costos de producción de biomasa y lípidos a escala piloto de T. suecica.
Gracias
PARÁMETRO
EEA (%)
CONTROL 1 2 5
R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3
N0 (x106 cél. mL-1) 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18 0,18
Nf (x106 cél. mL-1) 2,46 2,33 2,21 2,03 2,11 2,24 2,56 2,66 2,72 2,68 2,79 2,86
Día 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
µ (día-1) 0,52 0,51 0,50 0,48 0,49 0,50 0,53 0,54 0,54 0,54 0,55 0,55
TD (día) 1,33 1,35 1,38 1,43 1,41 1,37 1,31 1,29 1,28 1,28 1,26 1,25
Valores de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación diaria (TD) poblacional de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
PARÁMETROS
EEA (%)
CONTROL 1 2 5
Biomasa (mg L-1)507,
5480,
2460,
6
412,7
433,0
458,3
545,
5572,
4590,
5
587,7
609,9
623,8
Absorbancia (λ)0,35
50,36
00,33
8
0,391
0,394
0,417
0,45
20,45
90,46
7
0,494
0,476
0,486
Lípidos (%)20,2
721,7
221,2
6
27,45
26,37
26,36
24,0
123,2
322,9
1
24,35
22,61
22,58
Lípidos (mg L-1)102,
9104,
397,9
113,3
114,2
120,8
131,
0133,
0135,
3
143,1
137,9
140,8
Valores de la Biomasa, Absorbancia, Porcentaje de lípidos y Biomasa de lípidos de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
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