CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC
Definición: Técnica que realiza la separación de
una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Definición:Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina)
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase estacionaria:
• Silica gel (polar)
• Carbonato de calcio
• Almidón
• Alúmina (polar)
Diámetro: 5 - 50 mm
Longitud:5 cm – 1 m
Tamaño40 - 63 μm.63 – 200 μm.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAFase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente.
Serie eluotrópica
PentanoÉter de petróleoHexanoCiclohexanoTetracloruro de carbonoToluenoXilenoBencenoCloroformoAcetonaAcetato de etiloAcetonitriloIso-propanolMetanolAgua Rubinson & Rubison Química Analítica Contemporánea
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Mecanismo de separación:
K = CS/CM
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNATipos de cromatografía en columna:
Intercambio Iónico
Exclusión Molecular
Afinidad
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Cromatografía en columnaDesventajas de la cromatografía
en columna
Diámetro: 5 - 50 mmLongitud: 5 cm – 1 mTamaño de partícula: 40 – 200 μmGrandes volúmenes de fase móvilTiempos de análisis largosGran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado
Antecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el
desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a
biopolímeros polímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos . Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la
instrumentación se mejora 1970-1980 Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la
eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna.
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Instrumentación: Reservorio de fase móvil
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Reservorios de fase móvil
Recipiente de vidrio
Filtro
Fase Móvil:Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 12μmLibre de aire
Tubo de Teflón 1/8’’
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Instrumentación: Sistema de bombea
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Sistema de bombeo de fase móvil
Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna
Características:Resistente a los solventesAmplio intervalo de flujosFacilidad de cambiar un solvente por otroDe fácil manejo y mantenimiento
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Sistema de bombeo de fase móvil
Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática
Sistema de bombeo a flujo constante
Bomba tipo jeringa
Bomba reciproca
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Bomba neumática
10 bar
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Bomba tipo jeringa
Volumen de la cámara: 200 – 500 cm3
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Bomba reciproca
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Bomba reciproca
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Instrumentación: Puerto de inyección
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Instrumentación: Puerto de inyección
Válvula Rheodyne
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Características de la muestra
Libre de partículasFiltrar en membranas de 0.45 μm
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Instrumentación: Puerto de inyección
Diagrama de flujo válvula Rheodyne
Loop de 10 -50 μl
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Instrumentación: Puerto de inyección
Diagrama de flujo válvula Rheodyne
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Instrumentación: Columna
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Instrumentación: Columna
Acero ( Cr-Ni-Mo)Relativamente inerte a la corrosión químicaLongitud: 10, 12.5 o 15 cmDiámetro: 4.6, 6.2 o 9 mmSoporte: 10, 5, 4 o 3 μm
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Instrumentación: Soporte
Silica microporosa
Permeable a solventes (fase estacionaria)Diámetros : 3 - 10 μmÁrea superficial: 500 m2/g
Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica
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Instrumentación: Fase estacionaria
Fase polar Fase no polar
R= (CH2)3NH2 Amino R= (CH2)17CH3 Octadecilo
R= (CH2)3C=N Ciano R= (CH2)7CH3 Octilo
R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH
Diol R= (CH2)3C6H5 Fenilo
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Modo de separación
Fase Normal Fase Reversa
Polaridad fase estacionaria
Alta Baja
Polaridad fase móvil
Baja- media Media- alta
Típica fase móvil Heptano/CHCl3 CH3OH/H2O
Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar
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Fase reversa
• Separación de mezclas con polaridades diversas
• Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil
• Fácil, rápido y reproducible
• Picos menos coleados • Se estabiliza
rápidamente a cambios de fase móvil
• Reproducible
Fase normalVentajas
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Fase móvil
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Modalidades de separación
Isocrático Gradiente por etapas
Curvas de gradiente
+ +
+
--
-
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Modalidades de separación
Isocrático
Gradiente
Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad
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Efecto de la temperatura
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Efecto del tipo de fase estacionaria
Efecto del flujo de fase móvil
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Efecto del pH
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Efecto del fase móvil
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Detectores
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Tipo Respuesta
Rango lineal Detecta
UV/VisArreglo de diodos
Selectivo 10-4 -10-5Enlaces C-O, aromáticos, alquenos
Florescencia Selectivo 10-3 – 10-4 Hidrocarburos policíclicos
Conductividad
Selectivo 10-3 – 10-4 NO3-, NO2
-, SO42-, Cl-
Índice de refracción Universal 10-3 – 10-4
Ácidos orgánicos, azúcares
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Celda
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Aniones
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