Objetivo: Adquirir habilidad para el manejo de colorantes, microscopio, condiciones de asepsia y métodos de aislamiento
1) Métodos de coloración y observación de microorganismos
2) Manejo en condiciones de asepsia
3) Obtención de cultivos puros
4) Conservación de cultivos puros
PRÁCTICO N° 3
Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos
Síntesis del práctico 1
Laboratorio
Esterilización• Autoclave - horno
• Radiación
• Filtración
• Productos químicos
Medio de cultivo Observación Aislamiento
Práctico 2
Composición química• Fuente de energía/carbono • Base mineral• Agua
Preparación de medios
Líquidos• Pesar drogas• Disolver con agua destilada • Regular pH• Fraccionar
Sólidos
• Pesar drogas• Disolver con agua destilada• Regular pH• Agarizar• Fundir• Fraccionar
Esterilización en autoclave
Siembra de suelo
Incubación
Práctico 1
Métodos de coloración y observación de microorganismos
Características del microscopio óptico
Aumento: objetivo x ocular
Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión)
Tipos de microscopios
Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia
Métodos de coloración
Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo
Tipos de coloración:
• Simples (un solo colorante)• Dobles (dos colorantes, coloraciones diferenciales)
Colorantes más utilizados:
• Safranina• Azul de metileno• Fucsina• Cristal violeta• Azul de algodón
Manejo en condiciones de asepsia
Atmósfera: cámara de flujo, lámpara UV
Superficie de la mesa de trabajo: alcohol, hipoclorito
Obtención del material: ansa estéril
Flameado de recipiente
Preparación y fijación de un extendido por calor
Coloración
Observación
Secuencia de una coloración
Secuencia de una coloración simple
Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa
Extender Fijar al calorExtraer una alícuota
Secuencia de una coloración simple (cont.)
Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar
Secar
Observar
Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido)
Portaobjeto enterrado
Colorear con fucsina Fijación con ácido acéticoEsperar 5 minutos
Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el
portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).
Coloración simple (Rossy-Cholodny)
Hongo tabicado
Hongos
Bacterias
Actinomycetes
Partícula de arena
Coloración doble (Gram)
1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto) Todas las bacterias se tiñen de violeta
2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto)
3) Decolorar con alcohol Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran
4) Teñir con fucsina (30 segundos) Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas
Coloración doble (Gram)
Bacterias G-
Bacterias G+
Actividad: observar al microscopio bacterias Gram + y Gram –
Métodos de aislamiento
Aislamiento en medio sólido:
Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio solidificado.
Aislamiento biológico:
Consiste en inocular animales o vegetales y aislarlas de la sangre,
tejidos, etc.
Cultivo puro: cultivo de microorganismos genéticamente iguales.
Aislamiento: Método para obtener un cultivo puro.
Obtención de cultivos puros
Aislamiento en medio sólido por estriado
Obtención de cultivos puros
Fundir el agar
Esterilizar el ansa
Colocar en caja de Petri
Trazar estrías sobre el agar
Dejar solidificar
Incubar
Obtención de cultivos puros
Cultivos puros en caja de PetriCrecimiento confluente
Colonias aisladas
Actividad 1: realizar estrías en superficie.
Actividad 2: observar estrías en caja de Petri y cultivos puros en pico de flauta
Conservación de cultivos puros
Formas de conservación de cultivos puros
• Liofilización: desecación mas congelación
• Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C)
• Congelación: -90° C recubierto con glicerol
Síntesis del práctico N° 3
Técnicas microbiológicas
Normas de manejo en microbiología
Asepsia
Atmósfera
Sup. de trabajo
Manejo de material y recipiente
Observación
Microscopio ÓpticoTipos:
• Campo Claro• Contraste de Fase • Campo Oscuro• Florescencia
Coloración tipos •Simples
•Dobles
Conservación
Liofilización
Congelación
Subcultivos seriados
Aislamiento
• Medio sólido (estrías)
• Biológico (vegetales o animales)