Casa abierta al tiempo ( J N I V E R S I U A D AU.TONOhAA M E T R O P O L I T A N A
SEMINARIO DE IN VESTIGACION CBS
Departamento de Biotecnologia I I
ASESOR: M.C. Rafael Campos Montiel
ALUMNA: Jimener GonrBler Angelica
225754
TI TUL O
OBJETI VO
Determinar la estabi Iidad de un reactor UASB a Iimentado
con un medio de carboximetilcelulosa e inoculado con
I iquido rumina I, para ser uti Iizado como bioensayo para
probi 6 t i cos.
INTRODUCCION
Un bioreactor se define como un "sistema", en el
cúal se pone en contacto una fase biótica y una abiotica,
cualqui&ra que sea el tipo de microorganismo, el
bioreactor debe permitir ufil contacto tan bueno como sea
posible entre las dos fases, manteniendo la población en
condiciones controladas de temperatura, pH, concentración
de nutrientes etc.
El uso de reactores continuos se llevó acabo a
principios de este siglo, los cultivos continuos
favorecen los estudios fisiológicos, esto se debe a que
pueden guardar condiciones constantes, en contraste con
los cui tivos intermitentes donde el microorganismo estA
sujeto a cambios constantemente. (Aiba y ~01,1972; Bailey
y ~01,1977).
El reactor UASB, es u17 reactor anAerobio de flujo
ascendente con lecho de Iodos, la caracterización del
reactor, permite tener un sistema controlado, en el cual
se pueda reproducir el ambiente caracteristico del rumen,
y p o r lo tanto de la fermentación ruminal, todo esto con
la finalidad de poder determinar el efecto que tienen los
cultivos fúngicos, ta les como A s p e r p i I I us oryzae
(AMAFERM I , S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e YEA-SACC 1 y
Asuerpil Ius niaer en la flora microbiana del rumen
(Windschit y ~01,1992)
En diferentes experimentos realizados "in vivo"
(Czerkawski, Christie, Breckenridge y Hunter, 19751 se
mostraba inhibicicin en la producción de metano provocando
cambios en el metabolismo t9eI rumen, causando dificultad
en la interpretación de resultados.
Por lo tanto f u e necesario obtener una tBcnica que
mantuviera las condiciones del rumen a largo plazo, en un
principio se realizó un procedimiento simple de cultivo
continuo, pero fue eliminado, porque no simulaba las
condiciones del rumen. (Isaacson Hinds y Bryant 1975)
En 1977 J.W. Czerkswski y Grace Breckenridge
realizaron el diseño y desarrollo de una tgcnica de
simulación de rumen (Rusi tee).
Muchos tipos de aparatos artificiales del rumen
fueron descritos por Czerkawski (19761, estos fueron
diseñados especificamente para periodos cortos de
trabajo, cuando se requtsrfa rea lizar estudios del
mecanismo de producción de metano y su inhibicidn,
diversos estudios "In v i v o w mostraron que estos cambios
vienen gradualmente alrededor de semanas, por lo tanto se
vieron en la necesidad para tener tgcnicas a largo plazo
del rumen artificial.
La unidad completa consiste en 4 reactores, con una
capacidad de un litro cada uno, la temperatura fue
mantenida a 39°C.
El & x i to del reactor UASB depende de la alta formación de
flóculos. (Crawford y coI,l980).
Pdgina 2
L o s lodos ó agregados: se compactan y se obtienen
grAnulos, la formación de grdnulos permite mantener
act i va la biomasa bacteriana en el reactor
independientemente del cambio de f l u j o , manteniendo un
buen ni v e I de con versi ón, eficiente a cambios
relativamente altos de flujo.
A s i los grAnulos es una reunión dinAmica, capaz de *
responder a cambios del medio ambiente
La habilidad de floculación de los lodos depende en parte
de los catiónes divalentes por ejemplo magnesio, que a
una concentración de 100 m M los microorganismos crecen
como paquetes agregados de cglulas únicas /grAnulosl, no
hay crecimiento bacteriano a una concentración alrededor
de 400 mM, otros factores que intervienen en la
floculación es el pH, ademds del tipo de microorganismo.
FAgina 3
ME TODLIL OG I A
1 .- P r e p a r a r m e d i o d e c u l t i v o como se m u e s t r a e n l a t a b l a
I .
T A B L A I
m g / L * NaffCO3 4000
* NaZ PO4 . 7ff2.30 600
* K C L 580
* Na C L 480
* MgS04 . 7ffZO 1 O 0
* Ca CL2 64
* ( NH4 ) ,32504 480
* P e p t o n a d e C a s e i n a 1 O00
* E x t r a c t o d e LevaduJ-a 490
* C a r b o x i - m e t i l - c e I u I o : ~ a 6000
uta: se debe esterilizar el rpediu
2. - Montar el r e a c t o r U A S B , c o m o se m u e s t r a e n l a
f i g u r a I . E s un r e a c t o r c i I i n d r i c o d e un volumen de 2 .5 ,
1 i t r o s , c o n a l t u r a d e 4 3 . 5 c m . y d i d m e t r o d e 9 . 4 cm. E l
r e a c t o r f u e i n o c u l a d o ( c u l t i v o m i x t o d e b a c t e r i a s
c e l u l o l i t i c a s ) c o n a p r o x i m a d a m e n t e O . 5 l i t r o s d e
f l u i d o r u m i n a I , e x t r a i d o d e una vaca h o l s t e i n
f i s t u i a d a , d e un p e s o d e a p r o x i m a d o d e 4 5 0 K g , el r e a c t o r
se a l imentaba con un f l u j a d e 0.25 m l / h , e n o p e r a c i d n
c o n t i n u a . 3 . - A d q u i r i r p r a c t i c a e n l a s t e c n i c a s
4 . - R e c o l e c t a r m u e s t r a s ( t r e s ) d i a r i a m e n t e .
5. - Tomar 5 m l . d e c a d a m u e s t r a , C e n t r i f u g a r 20
m i n u t o s a 10,000 rpm, al s o b r e n a d a n t e se l e d e t e r m i n ó
(AGV y c e l u l a s a s ) , y a l o q u e p r e c i p i t a b a se l e
Pdgina 4
". O 5 . x
8
O G 4
P A , g i n a 5
determinaba L o w r y .
6. - Determinar la estabilidad del reactor UASB, cada
semana se cuantifico lo siguiente:
- Biomasa por el metodo de Lowry.
- Biomasa por densidad óptica.
- Acidos grascls voldtiles por
cromd togra f ia de gases
- pH con potenciómetro
- Enzimas celulolíticas por el metodo
celulasas.
METUDO DE LOWRY
Existen diferentes m.Btodos para la determinación de
proteína, uno de estos es el metodo de Lowry, el
fundamento es el siguiente?:
Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-
Cionalteu, para dar un complejo de color azul, debido a
la reacción de cobre alcalino con la proteina, la
intensidad del color depelnde del niimero de aminodcidos
aromrlticos presentes y enlaces peptidicos, la solución
azul muestra una absorbancia mAxima de 750 nm.
La variación de este m&todo se debe al cambio de pH,
tiempo de reacción, concentraci6n de los reactivos.
En este metodo las razones que se tiene para el uso
del reactivo de Folin son las siguientes: referencia)
al,- Se puede medir el contenido de proteinas en
fracciones enzimAticas
P&gina 6
bl.- Se p u e d e n h a c e r m e d i c i o n e s en m e z c l a s d e t e j i d o c o n
p r o t e i n a s
c 1 . - Se p u e d e n h a c e r m e d i c i o n e s d e so luc iones d i l u i d a s .
L a s v a r i a c i o n e s d e este m e t o d o p u e d e n deberse a l pH,
t i e m p o d e r e a c c i b n , c o n c e n t r a c i ó n d e l o s r e a c t i v o s ,
i n t e r f e r e n c i a d e s u s t a n c i a s como a z d c a r e s . E l r a n g o d e
l i n e a l i d a d es d e O a 300 m g / L .
MATERIAL:
t u b o s d e e n s a y e
g r a d i l l a
p r o p i p e t a
m a t r a z a f o r a d o 100 ml.
p i p e t a d e 1 m l .
p i p e t a d e 5 ml . p i c e t a
p r o b e t a s
e s p e c t r o f o t o m e t r o (SHINADZU 84001.
ce l d a s d e c u a r z o
vasos d e p r e c i p i t a d 0
A g i t a d o r d e tubos ( v o r t e x 1
R E : A C T I VOS:
Solución A : d i l u i r 20 g . de b i c a r b o n a t o d e s o d i o en 1
l i t r o d e u n a s o l u c i ó n 0 . 1 normal d e h i d r ó x i d o d e s o d i o
SuJuciBn 8: d i l u i r 1 g . d e a ; u l f a t o d e cobre en 100 m l . d e
agua des t i l a d a .
PAgina 7
S o l u c i ó n C: d i l u i r 2 g . d e t a r t r a t o d e s o d i o y p o t a s i o en
100 ml. d e a g u a d e s t i l a d a .
S o l u c i t i n e s t a n d a r d e albúmina: d i s o l v e r 15 m i l i g r a m o s en
50 m1 d e agua des t i I ada .
P r o c e d i m i e n t o :
1 .- Preparar . l a c u r v a e s t d n d a r c o n l a s o l u c i ó n e s t d n d a r
d e a l b f i m i n a r e a l i z a r l a s i k f u i e n t e c u r v a d e c a l i b r a c i 6 n
T a b l a 1 1
tubo O 1 2 3 4 5
s l n . e s t A n d a r ( m 1 I O o. 2 O . 4 0 . 6 0 .8 1 . 0
H20 d e s t i l a d a ( m 1 . ) 1 0.8 O . 6 0.4 0.2 O
conc. (mg/l I O t i 0 120 180 240 300
' a b l a 11. P r e p a r a c i ó n d e l a c u r v a e s t d n d a r L o w r y .
2.- Tomar 1 ml. d e l a s o l u c i ó n que se va a a n a l i z a r
3.- A d i c i o n a r 1 m1 .) d e hsidrrixido de sod io 1 N a todos
los t u b o s , c a l e n t a r a b a ñ o m a r i a a t e m p e r a t u r a d e
e b u l l i c i ó n d u r a n t e 5 m i n .
4 . - P r e p a r a r u n a s o l u c i t i n d e l a s i g u i e n t e m a n e r a . 50
ml. s o l u c i ó n A , 1 ml. d e l a solucirin 3 y 1 ml. d e
l a s o l u c i ó n C
5.- A g i t a r en v o r t e x y r e p o s a r en l a o s c u r i d a d 30 m i n .
6.- A d i c i o n a r 1 ml. d e Ja s o l u c i ó n d e f o l i n
( d i l u i d a 1 : 1 ) , a g i t a r y r e p o s a r en l a o s c u r i d a d 30
m i n
PAgina 8
7. - Leer en un espectrofótometro (Shimatzu), a 750
nm.
CALCULOS PARA LA DETERM1NAC:IUN DE B I O M A S A ( L o w r y )
La curva patrón para la determinación de protefna
utilizando el mgtodo de Lowry, se muestra en la Tabla I I I
y GrAfica No.1.
CONC. ABSORB . (mg/L I
O 0
60 0. 056
120 0. 136
180 0.263
240 0. 376
300 O . 506
- Tabla I I I . Curva Estanda r.
Realizando una regresión lineal se encuentra la ecuación
de la recta siguiente.
absorbancia = m {concentración) + b
donde :
m= pendiente
b= ordenada al origen
abs. = 1 . 722 x lo-== {conc. - 0.03552
coef. de correlacidn = r = O . 991 054
Reordenando la ecuación ds? la recta en terminos de la
concentracijn
Concentración = {Absorbancia + 0.035521/1. 72.2 x 1 O-= Sustituyendo las absorbancias leidas de las muestras se
Curva Pat r6n metodo de lowry
absor bancia
O 5 o
grafica 1
1 O0 150 200 250 300 350 conc mg/L
encuentra la concentración de proteina.
DENSIDAD OPTICA:
La densidad dptica es una tkcnica rApida y se basa
en el hecho de que la turbidez en una suspensión de
cklulas es proporcional a la biomasa t cklulas en
suspensión l.
La densidad óptica se realizó en un espectrofótometro
t Shimadzu 8400 I a una longi tud de 600 nm.
METODO DE CEL UL A S A S
El reactivo DNS tdcido dinitrosalici licol, fue
descubierto por Summer, se emplea para la determinación
de azúcares reductores, .este mktodo proporciona una
estimación rdpida y simple, el principio de esta
determinacidn es: El reactivo y el azúcar forman una
"especie" ópticamente medible. La reacción es de oxido-
reducción, el dcido 3,5-dinitrosalicílico es reducido a
Bcido 3-amino-5-nitrosaiciJico, mientras que los grupos
aldebídos son oxidados a grupos carboxilo.
La sal de Rochelle es introducida previamente al reactivo
para disolver el oxígeno, el fenol aumenta la cantidad de
color producido, y el bi'sulfito estabiliza el color
obtenido en la presencia del fenol, el alcali es
requerido para reducir la acción de la glucosa sobre el
DNS . MATERIAL;
tubos de ensaye
pipetas de 2 ml.
225'754
PAgina 11
propipeta
probeta
gradi I la
matraz aforado de 1 O 0 m i .
bafio marfa
termómetro
piceta
espectrofótometro / S H I I Y A T Z U I .
celdas de cuarzo
vórtex
REACT1 V O S :
1.- - Solución de carboximetilcelulosa (1%)
- Solucidn estdndar de Dextrosa anhidra, de una
conc. de O.Zg/L.
- Solucidn de DNS, que esta compuesto de:
dcido dinitrosalicflico
s a l de Roche1 le
feno I
bisul fi to de sociio
hidrdxido de sociio
2.- Con la solución estdndar de dextrosa, realizar la
siguiente curva de calibracidn, ver Tabla IV.
tubo 1 2 3 4 5
s i n . estAndar(ml. 1 O 0.5 1 .o 1.5 2
N20 desti lada (m1 (. 1 2 1.5 1 . o 0 . 5 o Cnnc. fmg/l) O 62.5 125 187.5 250
-3
PAgina 1 2
3. - Tomar 2 m l . d e l a s o l u c i ó n a a n a l i z a r .
4 . - A d i c i o n a r 1 m l . d e l a s o l u c i ó n d e
c a r b o x i m e t i l c e l u l o s a a t o d o s los t u b o s , i n c l u y e n d o
c u r v a e s t a n d a r .
5.- C o l o c a r l o s e n un baño maria a una temp. d e 50-55" C
d u r a n t e 1 /2 h o r a .
6.- A d i c i o n a r 3 ml. del r e a c t i v o d e DNS.
7 . - C a l e n t a r d u r a n t e 5 min. a t e m p . d e e b u l l i c i ó n .
8 . - D e j a r e n f r i a r y a g i t a r e n v ó r t e x .
9 . - L e e r e n el e s p e c t r o f c j t o m e t r o t s h i m a t z u ) a 5 7 5 n m .
CALCULOS PARA LA DETERJYINACION DE CELULASAS.
La c u r v a p a t r ó n p a r a d e t e r m i n a c i ó n d e c e l u l a s a s se
m u e s t r a e n l a T a b l a V y l a G r d f i c a No. 2.
ABS.
0
0 . 1 1 0
0 . 1 96
0.31 9
0.420
0. 5 3 1
Tabla V . Curva Estandar
Rea 1 i z a n d o una r e g r e s i ó n l i n e a l se e n c u e n t r a l a e c u a c i ó n
de l a r e c t a s i g u i e n t e .
a b s o r b a n c i a = m ( c o n c e n t r a c i ó n 1 + b
PAsgina 13
donde :
m= pendiente
b= ordenada al origen
abs. = 1 . 6 6 5 x 10-= (conc.) + 7.096 x 10
coeficiente de correlación = r = 0.994958
Reordenando la ecuación de la recta en termino de la
concentracidn:
Concentración = /Absorbancia - 7.096 x 1 0 -=/l. 665 x lo-=
Sustituyendo las absorbancias leídas de las muestras se
encuentra la concentración de Azúcares.
En Celulasas para determinar la unidad definida como
la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol
de glucosa por minuto a las condiciones del bioensayo
( U I I , se tiene:
Ul= [ {azúc. reductores- azúc. reductores ,? /Pfl(p~UCP.. I -7 /30 x fOO0 aicromol
iniciales fina 1 mol.
DETERMINACION DEL. pH
MATERIAL
potenciómetro
agua desti lada
solución buffer
vaso de precipitado
El pH se determinó mediante un potenciómetro usando
una solución buffer de fosfatos a pH=7. Para la
PAgina 14
. ..
Curva Estandar (celulasas)
Absor bancia 0#6
005
004
003
0#2
0*1
O O 5 o 1 O0 150 200 250 300 350
Conc' (mg/L)
Graf lca 2
P&g.ina 1 5
p o r lo t a n t o s i el volumen d e l a s o l u c i ó n b u f f e r es d e 1
I t se t i e n e q u e :
WHP044-a = T H P 0 4 - 2 ~ . p ~ H P 0 4 - 2 - I t s o l u c = O . 5 M ~ l 4 l g / m o l ~ l l t =
7 0 . l g
PAgina 16
DETERHINACION DE ACIDOS GRASOS VOLATILES:
La determinación de los A G V producidos durante la
prueba, se realizo mediante un cromatogr-dfo de gases
V A R I A N 3400, con un integrador tambien V A R I A N 4400. El
procedimiento fue el siguiente:
al Se preparo una solución estandar, con una mezcla de
0.2ml de Acid0 acgtico, 0 , l m l de dcido propidnico y O.lml
de Acid0 butírico, por 100 m1 de agua destilada.
bl 5 m1 de esta sol ucidn estandar se l levo a un volumen
final de 20 m1 (dilución) con agua destilada.
cl Se aplicaron inyecciones de 5 A I de la solución
estandar di I uida al cromatogr-dfo de gases V A R I A N 3400,
desde un niimero de 5 a 1 0 aplicaciones, esto con la
finalidad de calibrar el comatrogr-dfo.
Las condiciones del cromatogr-dfo eran:
- I N Y E C T O R : 2 70" C
- DETECTOR: 260°C
- COLUMNA : 1 70" C-235" C
- T I E M P O T O T A L DE C O R R I D A : 4.62 min
dl Desputjs de calibrado el cromatogr-dfo, por duplicado se
aplicaron las muestras con volumenes constantes de 5 A I .
En cada uno de los cromatogrBmas obtenidos en cada
corrida (como el que se muestra en la Fig 2 1 , mediante un
in tegrador V A R I A N 4400, previamente programado, se
estimaron los tiempos de retencidn y el &rea bajo la
curva, en la solución patrón y en las muestras para
determinacibn en Amol/ml y % molar de A G V .
P-dgina 2 7
CALCULOS PARA L A DETERNINACZON DE ACIDOS GRASOS
VOLATZLES. AGV l
L o s tiempos de retención caracteristicos, en la columna
empleada para los picos de los AGV fueron: .. l e m p o s d e r e t e n c i ó n d e AGV
tr t m i n l d c i d o a c a t i c o 1 . 8
d c i d o p r o p i h n i c o 2.9
dcido b u t í r i c o 4 . 1
La determinación de H m c l l / l de AGV se estimo a partir
de la ecuación:
pmol/l AGV = A t m X C t s p A t s p
donde :
A t m : Suma de las Areas de los picos obtenidos para &c.
acgtico, propiónco y butirico en la muestra (el subfndice
m significa que fue determinado a partir de la muestra)
Atm = Aacm + Apropm + Abutm
A t s p : Suma de las areas de los picos obtenidos para dc.
acgtico, propiónico y butfrico en la solución patrón (el
subfndice sp significa que fue determinado a partir de la
solución patrón).
Atsp = Aacsp + Apropsp + Abutsp
Ctsp: Suma de las concentraciónes de los Ac. acetico,
propiónico y butirico de la: solución patrón.
Ctsp = Cacsp + Cpropsp + Cbutsp
Para determinar el % molar de cada uno de los AGV,
Pdg.ina 1 8
se emplearon l a s siguientes relaciones:
%molar &c. acBtico = IAacm/Aacspl X Cacsp X 100 N m o l / I A G V
%molar Ac. propicjnico = / A p r o p m / A p r o p s p l X CproDsp X 100 f i m o I /I A G V
Pdgina 1 9
Determinacidn de AGV
SOLUCION ESTANllARD DE AQV
MUESTRAS
2 2 5 7 5 4
Pdlgina 20
RESUL TADOS Y ANAL I S I S Proteína
140
120
1 O0
80
60
Concentraci6n (mg/L)
conc.
88.3 62.2 68.2
c ::I , , , O I I
O 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (mes)
Grhflca 3. Determinacidn de Proteins (promedio mensual durante 6 meses)
L o s resultados sobre prote€na se muestran en la
Grdfica No. 3, el cua l es un promedio mensual. Como se
observa existe una variabilidad del sistema pero sin
haber diferencias significativas l P > U . U 5 1 entre los
da tos mues treados.
Celulasas
250 -
200 -
160 -
mea 300T UI/I
1001 1 I I I I I
O 1 2 3 4 5 6 7 Tierrlpo(mes)
Qr6flca 4. Determinacl6n de Celulasas (Promedio mensual durante 6 meses)
En l a p r o d u c c i ó n d e Selulasas como se m u e s t r a e n l a
G r b f i c a No. 4 t a m p o c o e x i s t e d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a (
p>0.05 I e n t r e los t r a t a m i e n t o s e n c o n t r a n d o s e un p r o m e d i o
d e 185.6 U / / L .
Pbg'ina 22
Acidos Grasos Volatiles Concentracl6n (pmol/L)
50
40
30
20
10
O
----2+----"-""/
38. 1 sa. 3 7.5 se. 4 11.2 38.6 8.2
O 1 2 3 4 5 6 7 Tiempo (mes)
- Ac. Ac6tlco -" Ac. Propl6nlco
GrBfica 6. Determinacl6n de AGV (promedio mensusi durante 6 meses)
En la producción de A G V solo se detectaron la
producci6n de Acido acBtico y propiónico. A l realizar
anBiisis estadistico se encontro que no habia diferencias
significativas ( P>O.O5 1 en el semestre, la produccicin
total fue aproximadamente de 46.65 Amol/L, siendo en un
80% la producción de Acido ac&tico (GrBfica No 5)
Densidad Optica
0.3 -
0.2 -
0.1 -
meu Abuorb. O. 187 O. 170 o. 180 O. 188 O. 160 o. íes
O a 4 T
Absor bancla
OL"--I I I 1 I I
O 1 2 3 4 5 6 7 Tlempo (mes)
Qr6fica 6. Determinacl6n de Densidad Optica(promed1o mensual durante 6 meses)
En l a d e n s i d a d ó p t i c a se o b s e r v o una c i e r t a
v a r i a b i l i d a d p e r o al r e a l i z a r a n z i l i s i s e s t a d i s t i c o se
e n c o n t r o q u e n o h a b í a d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a s ( P,bO.O5
I e n este p e r í o d o e n c o n t r a n d o s e un p r o m e d i o d e 0 . 1 7 2 d e
a b s o r b a n c i a ( G r A f i c a No.6)
PBgina 24
14
12
10
8
6
4
2
O O 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (mes)
Grdfica 7 . Determinacidn de pH (promedio mensual durante 6 meses)
L o s ~esultados sobre €21 ,@ se m u e s t r a n e n l a G r d f i c a
N o . 7 , y se o b s e r v a n q u e n o e x i s t e n d i f e r e n c i a s
s i g n i f i c a t i v a s e n t r e los meses p o r lo q u e s u g e r i m o s q u e
p o r l o s d a t o s m o s t r a d o s el r e a c t o r se e n c u e n t r a e n e s t a d o
e s t a c i o n a r i o .
CONCL us1 ON
En este servicio se determino la estabilidad de un
reactor continuo tipo U A S B , alimentado con un medio
sintetico de carboximetilcelulosa, puesto en operación
con microorganismos del rumen de una vaca Holstein
fistulada para ser utilizado como un bioensayo para
probióticos. Se utilizo el reactor U A S B de 2.5 litros con
un f I u30 de 0.25 ml /min operando por 3 meses.
Determinando su estabilidad por seis meses por la
cuantificación de A G V , densidad optica, celulasas y
biomasa.
Los resul tados obtenidos demuestran estabi I idad en
el reactor t P>O,O5 1 con una producción de 60.03 mg/l de
biomasa, 185.6 U I / L de celulasas y 46.65 Hmol/l de A G V .
Por lo que puede ser utilizado como fuente de
microorganismos anaerobios celulolfticos para bioensayos
con aditivos que estimulen el crecimiento microbian0 dei
rumen.
Este trabajo sirvió como base para realizar un bioensayo
de compuestos fungicos, estimulantes del crecimiento de
bacterias celuloliticas anaerobias. (R. G. Campos Montiel
y G. Viniegra Gonz&lezl, publicada por la revista
Biotechnology Techniques, Volumen 9 No. 1, p. 65 a 68.
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REFERENCIA
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