DIAGNOSTICO DE DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LAS LABORATORIO DE LAS
INFECCIONES POR INFECCIONES POR PLASMODIUMPLASMODIUM
13-2-09Óscar
IntroducciónIntroducción
Plasmodiosis = Malaria = Paludismo:
Parasitosis caracterizada por episodios febriles típicos, precedidos por escalofrío intenso que terminan con diaforesis, hepatoesplenomegalia y anemia que varia de leve a grave.
Enfermedad causada por parasitos del genero PlasmodiumPhyllum: Apicomplexa (una sola célula)Clase: Sporozoea (carece de organelos de locomocion)Subclase: CoccidiaFamilia: PlasmodiidaeGénero y especies que pueden parasitar al hombre:
Plasmodium vivaxP.malariaeP. falciparumP. ovale.
EpidemiologíaEpidemiología
Entre 500-900 millones de individuos sufrirán ataques clínicos de paludismo el próximo año
Las infecciones más frecuentes son las debidas a P.vivax y P.falciparum.
El P.falciparum predomina en África Tropical, sudeste de Asia, Oceanía, la ribera amazonica y la Republica Dominicana.
P.Vivax es más común en América Central y en la India.
El paludismo es una enfermedad endémica en unos 100 países.
Enfermedad reemergente tanto en países endémicos como en países no endémicos.
Este aumento obedece a:
-Aumento de la resistencia de los parásitos
-Aumento de la resistencia del vector
-Aumento de los viajes a zonas endémicas
• Transmisores del paludismo: hembras de los mosquitos del genero Anopheles.
Especies de Anopheles mas importantes: A.quadrimaculatus
A.pseudopunctipennisA.albimanus.
• Predomina en las regiones tropicales y subtropicales.
DISTRIBUCIDISTRIBUCIÓÓN DEL PALUDISMON DEL PALUDISMO
Epidemiología : Otras formas de Epidemiología : Otras formas de transmisióntransmisión
• Personas que anteceden de transfusión sanguínea procedente de donadores con paludismo, puede desarrollar la enfermedad.
• Paludismo congenito: Ha sido descrito con las 4 especies. Al parecer, para que exista este tipo de transmisión se necesita que la barrera placentaria haya sido dañada
Manifestaciones clínicas:Manifestaciones clínicas:Periodo de incubaciónPeriodo de incubación
Varia según la especie infectante y de acuerdo con la cepa.P. vivax y P. ovale tienen un periodo de incubación de 10 a 7 díasP. falciparum de 8 a 12 yP. malariae de 27 a 40 días.
Los últimos días del periodo de incubación pueden caracterizarse por signos y síntomas como dolores musculares, anorexia, naúseas e inclusive vómito.El paroxismo febril casi siempre es precedido por un escalofrío repentino, que estremece al enfermo, al principio dura 10 a 15 minutos y se alarga un poco a medida que el cuadro clínico se repite.La etapa febril sigue a la de escalofrío y se acompaña de cefalea y dolores de tronco y miembros.
Esta etapa dura de 2 a 6 horas y es seguida por una etapa de sudoración intensa, en la cual el paciente suele sentirse débil y agotado, quedando casi siempre dormido.En el paludismo causado por P. vivax y P. ovale el periodo de la crisis es de 48 horas.En P. falciparum es casi de 48 horas.Y en P. malariae de aproximadamente de 72 horas.
Los cuadros clínicos menos graves son causados por P. ovale y P. vivax Los moderadamente graves por P.malariae y los graves e incluso frecuentemente mortales por P. falciparum.
Manifestaciones clínicas:Manifestaciones clínicas:SíntomasSíntomas
Escalofríos intensoFiebre 40-41 º CSudoración.CefaleaNauseasTaquicardia
TratamientoTratamiento
Para destruir las formas eritrocitarias (tratamiento supresivo) se puede emplear principalmente:
AmodiaquinaCloroquina
• Debido al aumento de las resistencia a estos fármacos se están diseñando nuevos fármacos
• Estos tienen el inconveniente de ser unas 10 veces más caros
Ciclo biológicoCiclo biológico
1. Inoculación de esporozoito
2. Exporozoitos pasan del torrente sanguíneo al hepatocito
3. Esquizoogenesis
4. Esquizonte hepático
5. Merozoito
6. Merozoito penetra a los hematíes7. Trofozoito
8. Esquizonte hematico
9. Gametocitos
10. Gametocitos chupados por el mosquito
11. Fusión de los gametocitos y formación de los huevos
Diagnostico de laboratorio:Diagnostico de laboratorio:Examen de muestras de sangre Examen de muestras de sangre
perifericaperifericaMétodo de referenciaPreparación de las muestras:
Gota gruesa (sobre todo cuando hay menor presencia de parásitos)
Frotis (extensión en capa fina)
Tinciones– Giemsa (tinción de
referencia)– Field (tinción rapida y
sencilla)– Otras:
LeishmanNaranja de
Acridina
Plasmodium vivaxPlasmodium vivax
Los hematíes parasitados suelen tener tamaño aumentado y contienen gránulos de Schuffner (microtúbulos degradados de color rosado)
Las formas en anillo son de contorno fino y de tamaño considerable
Los Gametocitos tienen forma redonda u ovaladaLos Esquizontes contienen numerosos
merozoitos
Plasmodium falciparumPlasmodium falciparum
Multiples formas en anillo en el interior de un hematie
Gametocitos en forma de bananaNo suelen verse esquizontesInclusiones de color parduzco en el
interior de los neutrofilos y monocitos (pigmento de Maurer = hemozoina)
Plasmodium ovalePlasmodium ovale
Hematies aumentadosAnillos de forma ovalada mas compactos
que en el P.vivax y el P.falciparumGametocitos redondeados
Plasmodium malariaeHematies ligeramente menores que los
normalesAnillos compactosGametocitos redondeados
TROFOZOITOSTROFOZOITOS
Plasmodium falciparum: Los trofozoitos dentro del eritrocito
siempre están en forma de “anillo”, además de que sólo en P. falciparum se presentan múltiples trofozoitos en
una célula.
Plasmodium vivax: Los eritrocitos infectados por P. vivax son a veces
más grandes que los eritrocitos normales. Aproximadamente cabría
1.5 eritrocitos normales en uno infectado..
Plasmodium malariae: La característica de los trofozoitos de P.
malariae muestran la forma de “anillo” y una ligera tendencia de que
los eritrocitos normales sean de tamaño normal o más pequeños.
Plasmodium falciparum: El gametocito tiene forma de Platano.
Plasmodium ovale: El gametocito es más grande que los eritrocitos normales.Tienen una apariencia granular parecidos a los puntos de Schuffner.Plasmodium malariae: Los gametocitos de P. malariae tienen una apariencia redonda cercana a la de los eritrocitos. Tienen a demás una apariencia granular.
GAMETOCITOS
GAMETOCITOSGAMETOCITOS
Plasmodium malariae: Un esquizonte tiene de 6 a 12 merozoitos, dándole una apariencia granular.
Plasmodium vivax: Un esquizonte muestra numerosos merozoitos (de 16 a 24), y un mayor tamaño en comparación con los eritrocitos normales
ESQUIZONTES
Características morfológicas de los parásitos Características morfológicas de los parásitos palúdicos en extensiones sanguíneas finas palúdicos en extensiones sanguíneas finas
(según OMS).(según OMS).P.Vivax P.Ovale P.Malariae P.falciparum
Hematie infectado AumentadoPuntos de Schuffner
Aumentado, ovalPuntos de Schuffner
Normal o menor NormalHendiduras de Maurer
Anillo GrandeUno o dos puntos de cromatinaPuede haber 2 anillos
CompactoRaro 2 anillos
CompactoRaro 2 anillos
Pequeño DelicadoA menudo dos puntos de cromatina y 2 o más anillos
Trofozoito GrandeAmeboidePigmento en bastones fino
PequeñoNo ameboidePigmento granuloso
PequeñoCompacto, a menudo en forma de bandaPigmento granuloso
Tamaño moderadoCompactoPigmento en gránulos
Esquizonte GrandeMerozoitos grande (12-24)Pigmento coalescente
Mas pequeño que P.vivax6-12 merozoitosPigmento más oscuro que P.vivax
Pequeño6-12 merozoitos grandesAspecto tipico de “Margarita”Pigmento granulosos
RaroMerozoitos pequeños (8-26)Masa única de pigmento
Gametozito EsfericosCompactosNucleo únicoPigmento difuso y granuloso
Parecido a P.vivax pero más pequeños
Parecidos a P.vivax pero más pequeñosMenos mumerososSin puntos de Schufner
Forma semilunarNucleo único
Otras pruebas diagnosticas:Otras pruebas diagnosticas:Microscopia de fluorescenciaMicroscopia de fluorescencia
Colorantes fluorescentes con afinidad por los ácidos nucleicos de los parasitos:
Naranja de acridina (NA)Benzotiocarboxipurina (BCP)
Aumentan la sensibilidad.Pueden ser útiles en caso de parasitemias muy
bajaNo permiten la diferenciación de las diferentes
especies de Plasmodium
Otras pruebas diagnosticas:Otras pruebas diagnosticas:Sistema QBCSistema QBC
Quantitative Buffy Coat SystemSe basa en la concentración por gradiente de
densidad de los eritrocitos parasitados mediante la centrifugación de un capilar impregnado de heparina y NA, al que se añade un flotador.
Sistema caro: necesita de centrifuga, capilares especiales, un acoplador de microscopio con un sistema de epifluorescencia, lentes especiales,…
No aporta mucho al frotis y a la gota gruesa, ni permite diferenciar diferentes especies
• Utilizan principios de inmunocromatografía incorporados a formatos de cintas reactivas o de tarjetas de prueba
• Pretenden tipificar a la especie de Plasmodium conforme a la detección de antígenos específicos producidos por el parásito.
•Las PRDM pretenden ser :sencillas (manejo a temperatura ambiente sin
instrumentos) rápidas (diagnóstico en sólo 10 a 15 minutos)
PRUEBAS RAPIDAS PARA EL DIAGNOSTICO DEL PALUDISMO (PRDM)
PRDMDetección de HRP-2
• Proteína 2 rica en histidina especifica de P. falciparum (PfHRP-2)
• Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía
• Tienen falsos negativos y no son cuantitativas• Tienen falsos positivos: especialmente con el FR• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en
diagnostico microscopico
• Los kit comerciales utilizan anticuerpos contra HPR-2 especifica de P.falciparum, y anticuerpos contra antigenos panmalaricos, o sea, presentes en las cuatro especies de Plasmodium (Lactato Deshidrogenasa parasitaria y Aldolasa de Plasmodium).
• Detección mediante la captura antigénica con anticuerpos especificos y técnicas de inmunocromatografía
• Metodo barato• No ofrece mejor sensibilidad que la microscopia, tienen falsos
negativos ,no son cuantitativas y no permite distinguir entre especies diferentes a P.falciparum.
• Tienen falsos positivos• Faciles de utilizar en laboratorios sin experiencia en diagnostico
microscopico
PRDMKit comerciales de detección conjunta de
HPR-2 y pLDH o Aldolasa de plasmodium
OPTIMAL: Diagnóstico de malariacon anticuerpos monoclonales contrala enzima pLDH
Técnicas molecularesTécnicas molecularesPCR a tiempo real PCR a tiempo real
• Se amplifica el gen de la subunidad 18S del RNA ribosomalEste gen presenta secuencias de bases comunes y
especificas de cada especie.• Se utilizan varios pares de primers en un unico tubo (PCR
multiplex) que permite la amplificación simultanea de varios fragmentos de DNA.
• El producto amplificado se detecta por fluorescencia• La detección de las intensidades de fluorescencia mientras se
produce la PCR, hace posible la detección y cuantificación del producto amplificado.
• Permite la detección incluso de 0.7-4 parásitos/uL• Al ser cuantitativa: sirve para controlar tratamientos• Altisima sensibilidad y especificidad
• MUY CARA. Solo posible en países desarrollados
- - Diagnostico molecular de malaria en sangre de pacientesDiagnostico molecular de malaria en sangre de pacientes
ssDNA Plasmodium
ssrDNA Humano
P. vivax (499 pb)
P. falciparum (395 pb)
P. malariae (269 pb)
Serología Serología
• Derección de anticuerpos anti P.falciparum en el suero
• Baja sensibilidad.• Solo se utiliza en determinados casos en donde
la microscopia es negativo debido a la medicación
• Existe una técnica de inmunofluorescencia (Falciparum-spot IF. Bio-Merieux).
• Mas recientementew se ha introducido un enzimoinmunoensayo (Malaria IgG Celisa. BMD).
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
LA OBSERVACIÓN MICROSCOPICA ES EL METODO DE REFERENCIA
cuantitativo ,diferencia especies y barato
LAS TECNICAS INMUNOCROMATOGRAFICAS SON FACILES Y BARATAS PERO PEORES
menos sensibilidad y con falsos positivos y falsos negativos
LA PCR ES LA MAS SENSIBLE PERO LA MAS CARAdetecta parasitemias bajas. Util para control de
ttos.
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