Que son los cultivos celulares?...
Conjunto de técnicasMantenimiento o
crecimientoCell, tejidos u
órganos (animal o vegetal)
Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial
in vitro
Fisiológicas, bioquímicas,
genéticas
propiedades
APLICACIÓN...
AislamientoAmplificació
n
Descubrimiento
Vacunas Rta inmunitaria
Hospedero
Biología molecular
Bioquímica
HISTORIA...
1866• Von Recklinghansen.• Logro mantener vivos por mas de un mes hematies de anfibios
1885• Roux.• Demostró la factibilidad de mantener cell vivas en medios artificiales
1907• Harrison. • Estudio sistemático de los cultivos en cell in vitro
1913
• Steinhadt.• Virus de la viruela sobrevivía varias semanas en cultivos de tejidos de • cornea de conejos y caballos
1932• Topacio y Hyde • Los virus al multiplicarse producen cambios en los cultivos cell ECP
1948
• Earle y col.• Demostraron que para que una cell se divida necesita ser alimentada• con los nutrientes correctos
1949
• Enders y col.• El virus de la poliomielitis puede propagarse en cultivos cell de origen• diferente al tejido nerviosos
1952
• Gry y col.• Establecen la primera línea cell continua (HeLa).• Medios con plasma de pollo, extracto SFB
1955• Se investiga los requerimientos nutritivos de las cell en cultivo.• Suero, a.a, azucares.
1961
• Hayflick y Moorhead• Usaron por primera vez a/b para prevenir la contaminación de los • cultivos de fibroblastos. Pudieron realizar 12 pases de los cultivos.
1969• Austi Tocco y Sato.• Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares diferenciadas
1979
• Sato y col• demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas • distintas de hormonas y factores de crecimiento.
Hoy • Se realiza la vacuna para la Influenza A H1N1 en Cultivos Cell
Consiste en transferir células de un cultivo crecido a un nuevo recipiente, para que se genere otro cultivo. (PASE)
Extraer el órgano o tejido del organismo
de origen
Tienen diferentesclases de cultivo, que se caracteriza
Capacidad de replicacion
Capacidad de ser sub-cultivado
CLASES DE CULTIVOS CELULARES...
CULTIVOS EN MONOCAPA...
Células adherentes ocultivos fijos
Requieren unirse SUPERFICIE
Dependientes de anclaje
MULTIPLICARSE2 TIPOS
AGITACIÓNESTACIONARIO
CULTIVOS EN SUSPENSIÓN ...
Células se multiplican Suspendidas
Medio liquido
Subcultivo por dilución No adhesión
Cultivo inicial adquirió máximo
de saturación
CULTIVO PRIMARIO...
• MÁXIMO 10 SUBCULTIVOS.
Células provenientes del tejido original
Trasplantados a Condiciones artificiales
Porción celular variada
POBLACIÓN CELULAR PASES SUCESIVOSPROLIFERAR
LENTAMENTERÁPIDAMENTE
DESAPARECEPREDOMINA
LINEAS CELULARES...
Derivadas deun cultivo
primario, se puedencultivar in vitro repetidamente
y se dividen en :
DIPLOIDE HETEROPLOIDES
+ 75%
• Mismo cariotipo de las células • Se originan normales y siguen normales
- 75%
• Mismo cariotipo de las células • Se originan tejido normal o anormal • Cell sufren transformaciones
LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO
CELULAR
HEp-2 Carcinoma epidermoide de laringe humana
Herpes simplex, Enterovirus, Poliovirus, Adenovirus.
MDBK Riñón bovino Herpes y Adenovirus bovino, estomatitis vesicular.
MDCK Riñón canino Influenza, Adenovirus
MRC-5 Pulmón embrionario humano Citomegalovirus
Vero Riñón de mono Herpes y Poliovirus
BHK-21 Riñón de hamster Estomatitis vesicular y feibre aftosa
HeLa Carcinoma de cervix humano
Poliovis, Adenovurus
RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex
PK 15 riñón porcino Estomatitis vesicular, Parvovirus porcino.
A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.
MEDIOS DE CULTIVO...
MEMMedio de
crecimientoMedio de
mantenimientoMedios
selectivosMedios de
congelación
Requerimiento Mínimo
MEM MEMTipo de células
MEM
SSB, a.a. vitaminas
10-15% 2% SFBPropósito del
cultivo50% SFB
Base para losdemás medios
SFBIntervalo desubcultivos
Crecimientoutilización
8% dimetilsulfoxido
Factores basicos para la supervivencia celular...
Presión osmótica
pH
CO2Oxigeno
Agua
SSBVitaminas
A.A. Suero
Aminoácidos Vitaminas Sales Otros compuestos* Proteínas
requeridas en los
medios definidos
libres de suero
Arginina Cisteína Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina
Biotina Colina Folato Nicotinamid
a Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina
NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2
Glucosa
Penicilina
Estreptomicina
Anfotericina
Rojo fenol
Suero fetal
bovino
Insulina Transferrina Factores de
crecimiento
específicos
Tabla 1. Requerimientos moleculares de un medio de cultivo para virus.
Contenedores para cultivo celular
A: Fraso T. B: Frasco triple. C: Botellas rodantes. D: Biorreactor. E: Frasco con pipetas. F: Frascos con agitación.
Contaminación de los cultivos cell...
La contaminación puede tener varios origenes:Tejidos originalesProductos biológicos (suero –mycoplasma R a
penicilina)El personal del laboratorio con su propia floraDel medio ambiente (laboratorio- material)
Cuando esta presente en cultivos celulares, no
siempre resulta en alteraciones
microscópicas de las células o del medio;
muchas infecciones crecen lentamente y pueden tener
los siguientes efectos:
Niveles y normas de seguridad
Nivel 1. No presentan peligros reconocidos.
Nivel 2. Se emplean materiales de origen primario que no se conoce el riesgo de infección o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patógenos.
Nivel 3. Su manejo presenta un riesgo potencial.
Nivel 4. Extremadamente peligrosos.
Contaje celular...
Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra).
Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104
Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).
• CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIAS POST INOCULACIÓN SE OBSERVAN CÉLULAS GIGANTES Y MULTINUCLEADAS (40X)
• CÉLULAS VERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDO EL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOS NUCLEOLOS.
• CÉLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO ( CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO POR VIRUS DE Herpes zoster.