BIOSÍNTESIS COMBINATORIA PARA LA OBTENCIÓN DE NUEVOS FÁRMACOS ANTITUMORALES DE TIPO INDOLOCARBAZOL
César Sánchez, Alfredo F. Braña, Aaroa P. Salas, Carmen Méndez y José A. Salas.Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (I.U.O.P.A.) - Obra Social Cajastur,
y Departamento de Biología Funcional, Universidad de Oviedo.
Los indolocarbazoles son una familia de productos naturales aislados de diferentes organismos (bacterias, hongos, invertebrados marinos) y que poseen interesantes actividades farmacológicas. En particular, la rebecamicina y la estaurosporina son dos indolocarbazoles producidos por varias cepas bacterianas del grupo de los actinomicetos. Actualmente existen varios derivados de ambos compuestos que se encuentran en ensayos clínicos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson) y ciertas patologías asociadas a la diabetes. Las actividades terapéuticas de estos compuestos se basan en su acción inhibitoria sobre ADN topoisomerasas (los derivados de rebecamicina) o sobre diversas proteína quinasas (los derivados de estaurosporina).
La biosíntesis combinatoria es una nueva estrategia, dentro de la ingeniería metabólica, que tiene como objetivo la producción de compuestos químicos de interés que sean inaccesibles o difíciles de obtener por métodos de síntesis química convencional. Para ello, se parte de un conjunto de genes (procedentes de diferentes organismos), cada uno de los cuales es responsable de una determinada reacción metabólica. La biosíntesis combinatoria consiste en la co-expresión de diferentes combinaciones de dichos genes en un organismo huésped, para crear nuevas rutas metabólicas que darán lugar a los compuestos de interés.
INTRODUCCIÓN RESUMEN
En primer lugar, necesitábamos identificar los genes responsables de la biosíntesis de los dos compuestos que queríamos modificar: rebecamicina y estaurosporina. Esto fue realizado mediante el empleo de sondas heterólogas y mediante la expresión (en cada caso) del conjunto completo de genes en la bacteria huésped S. albus, con la consiguiente obtención de nuevas cepas productoras de rebecamicina y de estaurosporina (Refs. 2, 3). Los genes de biosíntesis de pirroindomicina en S. rugosporus y de tienodolina en S. albogriseolus fueron suministrados por otro laboratorio (Prof. Karl-Heinz van Pée, TU Dresden, Alemania).
Genes responsables de la biosíntesis de rebecamicina (reb)y de estaurosporina (sta). El código de colores es el mismo que en la Figura 1.
1. Sánchez C, Zhu L, Braña AF, Salas AP, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Combinatorial biosynthesis of antitumor indolocarbazole compounds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 461-466.
2. Sánchez C, Butovich IA, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2002. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem. Biol. 9, 519-531.
3. Salas AP, Zhu L, Sánchez C, Braña AF, Rohr J, Méndez C, Salas JA. 2005. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti-tumourindolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase. Mol. Microbiol. 58, 17-27.
Algunas de las combinaciones de genes que fueron expresadas en S. albus, y productos obtenidos.
Gracias a Obra Social Cajastur por el apoyo financiero a C.S. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (BIO2000-0274, BMC2003-00478) y por el Plan Regional de Investigación del Principado de Asturias (GE-MED01-05). Agradecemos también el apoyo de la Red Temática de Investigación Cooperativa de Centros de Cáncer (Ministerio de Sanidad y Consumo). El estudio de compuestos mediante NMR fue realizado por el laboratorio del Prof. Jürgen Rohr en la Universidad de Kentucky (EE.UU.).
AGRADECIMIENTOS REFERENCIAS
Biosíntesis de Moléculas Antitumorales
Universidadde
Oviedo
En este póster, presentamos algunos resultados de nuestro trabajo en el campo de la biosíntesis combinatoria de indolocarbazoles antitumorales (recientemente publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA) (Ref. 1). Para ello, expresamos en un microorganismo huésped (Streptomyces albus) diferentes conjuntos de genes implicados en la biosíntesis de rebecamicina, estaurosporina, pirroindomicina y tienodolina (todos estos compuestos son metabolitos derivados de triptófano, producidos por Lechevalieriaaerocolonigenes, Streptomyces longisporoflavus, S. rugosporus y S.albogriseolus, respectivamente). La colección de cepas generadas fue analizada en busca de derivados o precursores de tipo indolocarbazol. El resultado fue la obtención de más de 30 compuestos diferentes, cuya actividad antitumoral está siendo ensayada actualmente. El número de compuestos derivados podrá ser ampliado mediante métodos biológicos (manipulaciones genéticas adicionales) o químicos (modificaciones químicas de los compuestos obtenidos), con el objetivo de generar compuestos con actividades antitumorales mejoradas.
ESTAUROSPORINAREBECAMICINA
Derivados en ensayos clínicos contra el cáncer: Becatecarin (DEAE-
rebeccamycin), Edotecarin (J-107088)
Derivados en ensayos clínicos contra el cáncer: Midostaurin (PKC412),
CEP-701, UCN-01
BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: ESTRATEGIA
BIOSÍNTESIS COMBINATORIA: RESULTADOS
rebO rebD 1rebO rebD rebP 2 3 4, ,
rebO rebD rebC rebP 2rebO rebD rebC rebP rebG 5rebO rebD rebC rebP rebG rebM 6, 5rebO rebD rebH 7, 8, 1 26 27 30/ , ,
rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebH 11 31 /
rebO rebD rebC rebP rebT rebG rebHrebM 12 32 /
rebO rebD staP 2 3 4, ,
rebO rebD rebC staP 2rebO rebD staC staP 3rebO rebD staC rebP 3rebO rebD staC rebP rebG 13rebO rebD staC rebP rebG rebM 14, 13rebO rebD staC rebP rebH 15 16, 8,
rebO rebD staC rebP rebG rebH 17 18, 8,
rebO rebD staC rebP rebG rebHrebM 19 20, 8,
rebO rebD pyrH 21 22, 1,
rebO rebD rebC rebP pyrH 23, 2rebO rebD staC rebP pyrH 24, 3rebO rebD thal 25, 1
9 28, / , 10, 2 29rebO rebD rebC rebP rebH
Combinaciones de genes Productos
N N
HN O
OHH3C
ONH
CH3
CH3
NH
N
HN OO
O
OOH
OH
HO
Cl Cl
H3C
1 kbG O D C P M R F U H Treb
sta G O D CP MAR EJ K I MBNAB
Formación del indolocarbazol
Unión del azúcar
Cloración
Formación del azúcar
Resistencia / Secreción
Regulación
IDENTIFICACIÓN DE GENES
L. aerocolonigenes rebecamicina
G O D C P M R F U H T
O
D
CP
staC
thal
BANCO DE GENES
GH
MpyrH
1. Extracción y purificación de compuestos (HPLC).
2. Caracterización estructural (MS, NMR).
3. Ensayos de actividad antitumoral.
Combinaciones de genes(diseñadas racionalmente)
S. rugosporuspirroindomicina
pyrH
S. albogriseolus tienodolina
thalestaurosporinaS. longisporoflavus
staC
Colección de cepas recombinantes
Actividad antitumoral de algunos de los compuestos obtenidos en este trabajo.
GI50 a (μM)
Tumor cell lines Sta b 12 6 2 3 9 1 7 Prostate DU-145 0.004 0.444 0.339 3.07 2.39 8.09 18.5 18.5 LN-caP 0.011 0.438 0.291 >30.7 13.0 12.6 >25.9 >25.9 Ovarian IGROV 0.008 0.426 0.168 8.76 7.10 12.4 14.4 14.4 IGROV-ET 0.006 0.777 0.461 16.1 6.20 7.25 15.1 15.1 Breast SK-BR3 0.013 0.845 0.279 0.162 1.90 1.48 7.08 7.08 Melanoma SK-MEL-28 0.025 0.906 0.201 >30.7 10.1 14.1 17.1 17.1 NSCL c A549 0.008 0.761 0.512 >30.7 10.6 6.98 14.3 14.3 Leukemia K-562 0.641 0.470 0.383 >30.7 29.0 14.0 12.2 12.2 Pancreas PANC1 0.008 1.23 0.668 13.6 8.25 8.76 10.8 10.8 Colon HT29 0.076 1.55 1.11 >30.7 15.6 2.54 >25.9 >25.9 LOVO 0.014 0.144 0.479 1.57 1.32 3.20 7.99 7.99 LOVO-DOX 0.058 6.08 6.08 >30.7 11.3 15.2 >25.9 >25.9 Cervix HELA 0.007 0.314 0.758 0.959 0.652 2.49 7.71 7.71 HELA-APL 0.022 0.996 0.630 6.15 4.53 15.1 25.5 25.5
a GI50, 50% growth inhibition. b For comparison, values for staurosporine (Sta) are also shown. c NSCL, non-small cell lung.
NH
NH
HN COOHHOOC
1
HOOC
NH
NH
HN OO
2NH
NH
HN O
3
NH
NH
HN OHO
4
5
NH
N
HN OO
O
OHOH
OH
HO 6
NH
N
HN OO
O
OCH3OH
OH
HO 78
262730
R1=R2=Cl
R1=R2=BrR1=Cl, R2=Br
R1=Cl, R2=H
R1=Br, R2=H
NH
NH
HN COOHHOOCHOOC
R1 R2
NH
NH
HN OO
R1 R2
9102829
R1=Cl, R2=HR1=R2=ClR1=Br, R2=HR1=R2=Br
11
NH
N
HN OO
O
OHOH
OH
HO
R1 R2
R1=R2=Cl31 R1=R2=Br
NH
N
HN OO
O
OCH3OH
OH
HO
R1 R2
12 R1=R2=Cl32 R1=R2=Br 13
NH
N
HN O
O
OHOH
OH
HO
14
NH
N
HN O
O
OCH3OH
OH
HO
R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl
1516
NH
NH
HN O
R1 R2
R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl
1718
NH
N
HN O
O
OHOH
OH
HO
R1 R2
R1=Cl, R2=HR1=R2=Cl
1920
NH
N
HN O
O
OCH3OH
OH
HO
R1 R2
2122 R1=R2=Cl
R1=Cl, R2=H
NH
NH
HN COOHHOOCHOOC
R1 R2
NH
NH
HN OO
Cl
23
NH
NH
HN O
Cl
24
25
NH
NH
HN COOHHOOCHOOC
Cl
S. albus