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COLORANTES
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De forma genrica, todos los tejidos de
origen animal son incoloros salvo quecontengan algn tipo de pigmento, en
cuyo caso adoptan el color que aqul les
proporciona. As ocurre, por ejemplo, en la
piel, donde la melanina pigmenta de color
ms o menos pardo la epidermis y anejos
cutneos, o en la sangre y en todos los
tejidos vascularizados, a los que lahemoglobina confiere su caracterstica
coloracin roja o rosada.
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La primera utilizacin conocida de un agentecolorante para teir un tejido animal se debe a
Van Leeuwenhoek (1714), que emple unasolucin de azafrn en vino para facilitar laobservacin de las fibras musculares estriadasen sus preparaciones histolgicas. Ms tarde se
introdujeron como colorantes el carmn (Gopperty Cohn, 1849) y la hematoxilina (Waldeyer,1863). A partir de 1856 comienza la granexpansin mundial de la industria textil motivadapor la fabricacin de los primeros colorantesartificiales, los colorantes de anilina, querpidamente se extienden a los mtodos decoloracin para cortes histolgicos provocandoun vertiginoso desarrollo de la histotecnologa.
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El fundamento de cualquier mtodo detincin radica en la propiedad que poseen
todos los tejidos para incorporar y fijar demodo variable diversas sustanciascoloreadas llamadas colorantes.
La percepcin de los colores por la retinahumana est ligada a la capacidad queposeen sus fotorreceptores para captar laradiacin luminosa comprendida entre 400
y 800 nanmetros de longitud de onda ycuya mezcla homognea se denominaconvencionalmente luz blanca o espectrovisible de la radiacin solar.
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Cuando un cuerpo iluminado por la luz refleja ensu superficie toda la radiacin que recibe, laretina lo percibe de color blanco; si por elcontrario absorbe toda la radiacin emitida, sepercibe de color negro.
En el caso de que se produzca una absorcinparcial de la radiacin lumnica, los
fotorreceptores retinianos captan el espectrocomplementario de la radiacin absorbida,producindose la percepcin de los colores.
En otras palabras, puede decirse que el colorvisible es el complementario del color espectralabsorbido. Por ello y en sentido amplio, uncolorante puede definirse como una sustanciaque, puesta en contacto con un soporteadecuado, se une a l de forma perdurable
transmitindole su color.
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TIPOS DE COLORANTES
En funcin de su origen, se
distinguen dos tipos
fundamentales de colorantes:naturales y
artificiales
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Los colorantes naturales son
relativamente escasos y se obtienenen forma de extractos a partir de
ciertas plantas o insectos. En la
histotecnologa de rutina sonampliamente utilizados, siendo los
ms conocidos como colorantes
nucleares la hematoxilina y el carmn,y como colorantes citoplasmticos, la
safranina y la orcena.
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Los colorantes artificiales, en su mayor
parte derivados de la anilina (de rabe an-nil, azul oscuro) comenzaron a
introducirse en la segunda mitad de siglo
XIX, y hoy da en nmero de varios
centenares, constituyen la base denumerosas coloraciones histolgicas.
Aunque inicialmente se obtienen a partir
del alquitrn de carbn, en la actualidadse sintetizan en el laboratorio, por lo que
su gama crece continuamente.
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NATURALEZA QUMICA DE LOS COLORANTES:CROMOFOROS, CROMOGENOS Y
AUXOCROMOS
El soporte qumico fundamental de la mayorparte de los colorantes naturales y de latotalidad de los artificiales son anillos
aromticos derivados del benceno. El hechode que los dobles enlaces entre los tomos decarbono de estos anillos no sean fijos y, por
tanto, puedan ser reordenados, es la causa de
la gran diversidad posible de los derivados delbenceno y, en consecuencia, de los colorantes
de anilina.
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El benceno, al igual que todos los
hidrocarburos aromticos, es
originariamente una sustancia incoloraaunque susceptible de absorber radiacin
dentro del espectro de la luz ultravioleta.
Si en un momento determinado seproduce la fijacin de los dobles enlaces
dentro del anillo por ocurrir alguna
reaccin qumica sobre ste, el derivadobencnico que se obtiene puede absorber
radiacin luminosa dentro del espectro
visible y mostrar color.
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Los radicales qumicos responsables de
la modificacin molecular a la que se
debe la aparicin del color reciben elnombre genrico de gruposcromforos, reservndose ladenominacin de cromgeno para elconjunto formado por el grupo
cromforo ms anillo aromtico.
CROMGENO = grupocromforo +anillo
aromtico
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Debe tenerse en cuenta, sin embargo,
que cromgeno no es sinnimo de
colorante, ya que el primero no siempre
posee apetencia especfica por los
tejidos o, lo que es ms habitual, no se
liga fuertemente a ellos.
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En determinadas condiciones, un
colorante puede perder temporalmente
su capacidad para absorber radiacinlumnica dentro del espectro visible.
Ello ocurre por lo general a travs de un
proceso de reduccin del grupo
cromforo que lo transforma en un
leucoderivado. En estos casos, el color
suele reaparecer tras realizar unaoxidacin que restaura el grupo
cromforo.
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Los principales grupos
cromforos conocidos son
los radicales etileno (>C = CC=0),
tiazlico (>C=S),
imino (>C=N),
azoico (-N = N-),
nitroso (-N = 0),
nitro (-N02)
y en general cualquier anillo
derivado de las quinonas
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La conversin de un cromgeno en colorante
est vinculada a la adicin sobre la molcula
aromtica, de otros grupos atmicos que leconfieren la propiedad de disociarse
electrolticamente o de formar sales con los
tejidos. Estos radicales reciben la denominacin
genrica de grupos auxocromos opotenciadores de color, y por lo comn estndotados de carga elctrica, o lo que es igual,
poseen carcter cido o bsico, siendo los
responsables de que el colorante tenga mayor o
menor afinidad por la estructura que se va a
teir.
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Los grupos auxocromos de msimportancia son
los radicales hidroxilo (-OH),
carboxilo (-COOH), amino (-NH2),
sulfhidrilo (-SH) y
determinados iones metlicos derivados delhierro, cromo, aluminio, molibdeno, etc.
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CLASIFICACIN DE LOSCOLORANTES SEGN SUS
GRUPOS CROMOFOROS
En funcin del grupo cromgeno que
contienen, se distinguen 8 grandesgrupos de colorantes:
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a. Colorantes nitrados y nitrosados. Sonnitro (-NO2) o nitrosoderivados (-N = 0)del benceno o naftaleno con algunos
grupos hidroxilo, amino, etc. El ms
sencillo es el 2,4,6-trinitrofenol o cidopcrico, obtenido por nitracin del fenol.
La presencia de los tres grupos nitro
incrementa notablemente el carctercidodel grupo fenlico.
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b. Colorantes azoicos, que contienen el
cromforo -N = N- vinculando anillosadyacentes derivados del benceno o
antraceno. En general, se trata de
colorantes cidos, pero tambin los hay
neutros o bsicos. Pueden ser a su vez,
monoazoicos (orange G, cromotropo 2R,
ponceau de xilidina), o diazoicos (sudan
rojo y negro, rojo Congo, escarlata deBiebrich, azul tripn).
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c. Colorantes derivados de laantraquinona, obtenidos a partir de laoxidacin del antraceno para constituir
anillos quinnicos (rojo de alizarina S).
d. Colorantes derivados de la acridina yque contienen el cromforo >C = N-
(naranja de acridina).
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e. Colorantes derivados de iminasquinnicas, que poseen dos gruposcromforos y en funcin de ellos se
clasifican en:
a. derivados oxacnicos (galocianina, azul deNilo, violeta de cresilo);
b. derivados tiacnicos (tionina, azul demetileno, azur A, B y C, azul de toluidina,
tioflavina T), yc. derivados acnicos (rojo neutro, safranina
E, azocarmn
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f. Colorantes derivados del difenilmetano(auramina) y del trifenilmetano (fucsinas,
verde ligero), cuyo cromforo es el grupo>C=NH. Los colorantes de este grupo puedenser cidos o bsicos dependiendo de losauxocromos vinculados a la molcula.
g. Colorantes derivados del xanteno, concromforos variables entre los que seencuentra la pironina, rodamina y sulfaftalena)
h. Colorantes derivados de las ftalocianinas,
como el azul o amarillo alcin, que contienende dos a cuatro grupos de isotiouronioalrededor de un tomo de cobre para formaruna molcula que recuerda vagamente al anillohem- de la hemoglobina.
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Por lo comn, junto al nombre de los
colorantes y su designacin de grupo,figuran algunas siglas y ciertos cdigos
alfanumricos. Las primeras corresponden
a abreviaturas de caractersticas comunesa diversos colorantes, por ejemplo: B -azulado; G = verdoso; L = insensible ala luz; M = mezcla; R = rojizo; S =soluble; W = soluble en agua; Y =amarillento, etc.
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CLASIFICACION DE LOS COLORANTESSEGN SUS GRUPOS auxocromos Y
APETENCIA TISULAR
Se distinguen cinco grupos
fundamentales: colorantes bsicos,cidos, neutros, indiferentes y
metacromticos.
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COLORANTES BSICOS
Estn formados por la asociacin de uncromgeno de baja intensidad y carcter
dbilmente cido, con grupos auxocromos
catinicos fuertemente bsicos que son los
responsables de la carga global del colorante. Por este motivo se utilizan para colorear
estructuras acidas, principalmente contenidas
en el interior de los ncleos celulares en forma
de cidos nucleicos (lacas de hematoxilina,fucsina bsica, galocianina, etc.).
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COLORANTES CIDOS
Son productos de la unin de un
cromgeno de baja intensidad
dbilmente bsico con grupos
auxocromos cidos que confieren dicho
carcter al colorante. En general, tien
estructuras bsicas contenidas en los
citoplasmas celulares (eosinas, fucsina
acida, pironina, etc.)
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COLORANTES NEUTROS Se producen por la unin de carcter salino
entre colorantes cidos y bsicos para formarun precipitado, comnmente insoluble en agua ymuy estable en disolucin alcohlica. De estaforma, siendo su carga global neutra conservan
en parte la propiedad de colorear conjunta oseparadamente diversas estructuras.
Ello depende de que sean o no capaces deatrapar alguno de los iones generados cuando
la sal se disocia tras ser inestabilizada alcolocarla en disolucin acuosa (tincin deGiemsa). Las estructuras as coloreadasadquieren una tonalidad polcroma.
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COLORANTES INDIFERENTES
Son aquellos que no poseen un carctercido, bsico o salino definido, por lo que
habitualmente colorean los tejidos a travs
de un mecanismo por impregnacin fsica.
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COLORANTES METACROMATICOS En condiciones normales, la mayor parte de los tejidos
tienden a teirse con una tonalidad semejante a la del
colorante utilizado para su demostracin. Esta propiedadrecibe la denominacin de ortocromasia. Sin embargo,cuando se utilizan ciertos colorantes bsicos derivadosde la anilina, algunas estructuras tisulares se tien contonos de color totalmente distinto al que cabra esperar
por el colorante empleado (por ejemplo, grnulos de losmastocitos de coloracin roja con el azul de metileno ode toluidina). Este efecto se conoce con el nombre demetacromasia y las estructuras as teidas,cromtropas. Los colorantes metacromticos sonsustancias qumicamente puras y no de carcter salino.Por ello la explicacin ms comnmente aceptada paraeste fenmeno es la de que se produce unapolimerizacin entre las molculas de coloranteadyacentes a la estructura que se va a teir.
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MECANISMOS GENERALES DE LACOLORACIN
Segn la naturaleza de la vinculacinmolecular entre los colorantes y lostejidos, existen tres mecanismos
generales: de carcter fsico, fisicoqumicoo histoqumico.
Estos mecanismos combinados entre sen distinta medida explican lasparticularidades de las principalestcnicas de tincin en anatomapatolgica.
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Los mecanismos de carcterpuramente fsico estn ligados a laspropiedades de disolucin eimpregnacin del colorante sobre eltejido.
En el primer caso, el colorante es mssoluble en el tejido que en eldisolvente que acta como medio de
transporte, de forma que tiende apasar desde ste a aqul. Un ejemplocaracterstico de este tipo loconstituyen las tinciones para grasas.
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En el caso de la impregnacin, el
colorante, por su gran volumen molecularo por una precipitacin selectiva en forma
de agregados insolubles, queda atrapado
entre la malla de clulas y fibras queconstituyen los tejidos. Ejemplos tpicos
de impregnacin son algunas tinciones
argnticas para clulas nerviosas, as
como las coloraciones diferenciales para
fibras colgenas del tejido conjuntivo.
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Las tinciones ligadas a un mecanismo
principalmente qumico estnbasadas en el desarrollo de una
reaccin qumica entre el colorante
(comnmente un leucoderivado) y laestructura objeto de tincin de forma
que al interaccionar ambos se produce
un nuevo cromgeno responsable delcolor obtenido.
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Los mecanismos fisicoqumicos de
coloracin tisular estn vinculados a laformacin de uniones intermoleculares por
atraccin electrosttica o por fuerzas de
tensin superficial. Los primeros se basanen la propiedad de ligarse entre s que
poseen las molculas de carga elctrica
contraria, de manera que los colorantes
de carcter cido tien las estructuras
bsicas, y viceversa, por electroadsorcin.
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Los fenmenos de tensin superficial,
responsables de la interaccin molecularen los lquidos, son debidos a las fuerzas
de gravitacin generadas al disponerse
las molculas muy prximas entre s.
Este tipo de mecanismo tintorial est
implicado fundamentalmente en
coloraciones que utilizan molculas en
dispersin coloidal para interaccionar conagregados moleculares dispuestos en la
superficie de la estructura a colorear.
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COLORACIONES NUCLEARES
La mayor parte de las coloraciones que se utilizanhabitualmente en histopatologa contienen algncolorante que tie de manera especfica el ncleocelular, definiendo su contorno y realzando sucontenido cromatnico.
Con esta finalidad se utilizan generalmentecolorantes de carcter bsico con apetencia por losgrupos fosfricos cidos del ADN. Entre ellos seencuentran algunos colorantes artificiales como lagalocianina, el verde de metilo, el azul de alizarina
S, la fucsina bsica, el violeta de cresilo o el rojonuclear extra, si bien los de mayor importancia sonde origen natural como el carmn, la safranina ysobre todo la hematoxilina, que es el colorantenuclear por excelencia.
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Hematoxilinas
La hematoxilina es un colorante natural que se extraedel rbol hematoxylon campechianum, palo decampeche o palo azul de Centroamrica. Inicialmentefue utilizado para teir seda y lona, y en 1862 empez aemplearse en la coloracin de tejidos animales.
En el comercio se encuentra en forma de cristalesrosados o amarillentos solubles en agua y alcohol.
Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilinaen su forma natural no es un colorante, pero losrecientes progresos de la qumica de los colorantes han
permitido establecer que pese a expenderse en formade leucocompuesto, la molcula de hematoxilina se uneespecficamente mediante puentes de hidrgeno adiversos sustratos entre los que se encuentran mltiplesderivados de la celulosa, si bien esta unin no generacolor.
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