XXII Curso Problemas Frecuentes en Medicina … Anti-nucleares (ANA) Fluorescencia granular fina,...

XXII Curso Problemas Frecuentes en Medicina Ambulatoria del Adulto 2012

Laboratorio inmunológico:

Uso e interpretación racional

Dra. Mirentxu Iruretagoyena

30 de julio 2012

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGIA CLINICA Y REUMATOLOGIA

•  Estos exámenes consisten principalmente en la detección de auto-anticuerpos séricos

•  El laboratorio es una ayuda indispensable en el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades autoinmunes

•  Es siempre un complemento de la historia

clínica y el examen físico

Laboratorio Inmunológico

•  Las técnicas más utilizadas para la detección de

autoanticuerpos son:

–  Inmunofluorescencia (IFI) –  ELISA –  Aglutinación (látex) –  Nefelometría –  Radio-inmunoprecipitación

Laboratorio Inmunológico

Inmunofluorescencia

Temas a tratar

•  Artritis Reumatoide (AR)

–  Factor Reumatoide –  Anticuerpos Anti-Péptido Citrulinado Cíclico (Anti-CCP)

•  Enfermedades del tejido conectivo –  Anticuerpos Antinucleares (ANA) –  Anticuerpos anti-DNA –  Anticuerpos nucleares extractables (ENAs)

•  Vasculitis ANCA positivas –  Anticuerpos anti citoplasma de neutrófilos (ANCA) –  Anticuerpos Anti-MPO y Anti-PR3

•  Síndrome Anti-Fosfolípidos (SAF) –  Anti-cardiolipinas –  Anticuerpos Anti-β2 Glicoproteína-I (Anti- β2 GP I)

Factor Reumatoide (FR) : Son autoanticuerpos dirigidos contra el fragmento Fc de

la IgG

Anticuerpos en Artritis Reumatoide

•  Diagnóstico de Artritis Reumatoide (AR) - 75 a 80% de los pacientes con AR son (+) en algún momento de su evolución

•  Poco específico - 5 a 7% de la población general sana son (+) (% aumenta con la edad) - Presente en otras enfermedades - Valor predictivo positivo bajo en la población general

•  Marcador pronóstico en AR (enfermedad erosiva y

extraarticular) •  Títulos no se modifican con el tratamiento •  No sirve para el seguimiento

Anticuerpos en Artritis Reumatoide Factor Reumatoide (FR)

Anticuerpos en Artritis Reumatoide Otras enfermedades con FR positivo

•  Sd. Sjögren •  Crioglobulinemia •  LES •  EMTC •  Miositis •  Esclerodermia •  Sarcoidosis

Infecciones •  Hepatitis B, C •  Endocarditis •  TBC •  VIH

Fibrosis pulmonar idiopática

Neoplasias

•  Autoanticuerpo más específico conocido para AR: dirigidos contra residuos de citrulina (derivado de arginina)

•  Citrulinación es un cambio postraduccional generado por la deaminació�n de la arginina

•  Muchos antígenos citrulinados en la sinovial inflamada •  Citrulinación aumenta con el tabaquismo

Anticuerpos Anti-Péptido Citrulinado Cíclico (Anti-CCP)

Anticuerpos Anti-Pé�ptido Citrulinado Cíclico (Anti-CCP)

  Anticuerpos de aparición temprana (años)

  Marcador pronóstico y de agresividad en AR

  Puede ser (+) en AR seronegativa   40% de los pacientes FR seronagativos son anti-CCP positivos

  Artritis indiferenciada con CCP (+)

  90% de los pacientes desarrolla AR a 1 año   Valor PP 93%   Valor PN 75%

Arthritis Rheum 2000;43:1831-5; Ann Rheum Dis 2004; 63:1079-84

Examen Anti-CCP FR IgM

Sensibilidad 67% 69%

Especificidad 95% 85%

LR positivo 12,46 4,86

LR negativo 0,36 0,38


LR = likelihood ratio LR positivo = cuánto aumenta la probabilidad de tener la enfermedad cuando la prueba es positiva LR negativo = cuánto disminuye la probabilidad de tener la enfermedad cuando la prueba es negativa Ann Intern Med 2007; 146(11):797-808

•  Factor Reumatoide (FR) –  Positividad en 80% de las AR –  Factor de mal pronóstico –  Sensible pero poco específico

•  Anticuerpos anti-péptido citrulinado cíclico (anti-CCP) –  alta especificidad (>90%) –  Factor pronóstico –  Utilidad en AR sero (-) precoz


Anticuerpos anti-nucleares (ANA)

•  Autoanticuerpos que reaccionan con Ag nucleares: –  Complejos con DNA –  Complejos RNA con proteínas –  Estructuras de membranas –  Antígenos solubles

•  IFI es la técnica de elección –  células HEp-2 (carcinoma laringe) núcleo

grande

Anticuerpos Anti-nucleares (ANA)

Se informa : –  Título: positivo es ≥ 1:40 (se informa la última dilución positiva)

–  Patrón: sugieren antígenos determinados – Homogéneo (DNA) – Moteado (RNP-Ro-La) – Mixto (mezcla moteado y homogéneo) – Nucleolar – Centrómero – Periférico


Arthritis Rheum 2002; 47:434-444

Enfermedad Autoinmune Sensibilidad (%)

LES 93

Esclerodermia 85

EMTC 93

Poli/dermatomiosi9s 61

AR 41

Tiroidi9s Hashimoto 46

Enf Graves 50

Hepa99s Autoinmune 63-‐91

Cirrosis Biliar Primaria 10-‐40


Fluorescencia homogénea en todo el núcleo Antígenos: dsDNA, histonas Asociaciones: LES, lupus por drogas

Patrón Homogéneo

Fluorescencia granular, nucléolos negativos, mitosis positiva (homogéneo-moteado): Asociación: Inespecífico

Patrón Mixto

Fluorescencia granular, nucléolos negativos, mitosis negativa Antígenos: Ro, La, Sm, RNP Asociación: LES, EMTC, SS, PM, SSc y sobreposiciones

Patrón Moteado


Fluorescencia granular fina, mitosis positiva (en meta y anafase se ve barra, en profase “nube”) Antígeno: CENP-B Asociaciones: Esclerodermia limitada (CREST), Raynaud

Patrón Centrómero

Fluorescencia en anillo alrededor del núcleo Antígenos: dsDNA, histonas, anti-membrana nuclear Asociaciones: LES

Patrón Periférico

Fluorescencia granular gruesa (nucléolos) Antígenos: Scl-70 (topoisomerasa-I), PM/Scl, RNA polimerasa-I Asociación: Esclerodermia difusa

Patrón Nucleolar


•  Alta frecuencia en pacientes con enfermedades del tejido conectivo (LES, AR, SSc, Sjögren)

•  Presente en población sana

•  En personas sanas se describen valores de hasta: •  - >1/40: 20 a 30% •  - >1/80: 10 a 12% •  - >1/160: 5% •  - >1/320: 3,3%

Arthritis Rheum 1997; 40: 1601-1611


•  Estudio 918 personas sanas y 153 pacientes ETC •  ANA •  Población sana ANA + se reevaluó 5 años después •  118 (12,9%) población sana ANA +


Anticuerpos anti-antígenos nucleares extractables (ENA)

•  Anticuerpos dirigidos contra proteínas nucleares no histonas Anti-Ro (SSA) Anti-La (SSB) Anti-Sm Anti-RNP (anti-Sm/RNP)

Anti Scl-70 (anti-topoisomerasa I) Anti Jo-1 (anti-sintetasa)

Asociadas a RNA (complejo proteína-RNA)

Anti-ENA Enfermedad o Manifestación Clínica Ro 60 o 52 kD

Síndrome de Sjögren (70-97%)

LES: Fotosensibilidad, lupus cutáneo subagudo Lupus neonatal Bloqueo AV completo (BAVC) neonatal (2-5%

de madres Ro +)

La Síndrome de Sjögren BAVC neonatal

Sm LES (25%) RNP EMTC

Raynaud Scl-70 Esclerodermia difusa

Fibrosis pulmonar Jo-1 Dermato/Polimiositis


•  Se determinan mediante ELISA

•  Los valores no se utilizan para seguimiento (positivo o negativo)

•  En pacientes con LES, Anti-Ro, La, Sm y RNP permanecen estables independiente del tratamiento.


Lupus 2011; 20:250-255

• Uso: diagnóstico de LES

• Específico (97% para LES)

•  Detección mediante IFI, ELISA y técnica de Farr (radioinmunoprecipitación)

–  IFI: uso diagnóstico (informe positivo o negativo título 1/20)

–  Farr: cuantitativo, seguimiento, asociaciones clínicas (nefritis)

Anticuerpos Anti-DNA

Arthritis Rheum 2002

Anticuerpos Anti-DNA

•  Se usa para el seguimiento

•  Indices de actividad: SLEDAI y SLEDAI-2K (SLE Disease Activity Index, 1992 y 2002)

•  Se ha asociado con nefritis lúpica

•  Inconvenientes: – Uso de radioactividad – Caro – Tiempo de TM

Anticuerpos Anti-DNA Farr

•  ANCA están dirigidos contra distintos componentes de los gránulos de los neutrófilos: proteinasa-3 (PR3) y mieloperoxidasa (MPO) citoplasmáticos o de membrana

•  P-ANCA: distribución perinuclear en neutrófilos (etanol), asociado principalmente a MPO

•  C-ANCA: citoplasmático, asociado a PR-3 •  Atípicos: antígenos desconocidos

Anticuerpos Anti-Citoplasma de Neutrófilos (ANCA)

ANCA ANCA

IFI ELISA

Asociación clínica

C-ANCA citoplasmático Anti-PR-3 (proteinasa 3)

G. Wegener

P-ANCA perinuclear Anti-MPO (anti-

mieloperoxidasa)

Micropoliangeítis

Asociados a vasculitis de vaso pequeño: –  G. Wegener (90% ANCA + > PR3) –  Churg-Strauss (50% ANCA + MPO-PR3) –  Micropoliangeítis (70% ANCA + > MPO)

•  Detección mediante IFI y ELISA: complementarios

Anticuerpos Anti-Citoplasma de Neutrófilos (ANCA)

ANCA

•  Se considera necesario al obtener un resultado positivo mediante IFI y confirmarlo mediante ELISA siempre (Colegio Americano de Patólogos, 2006).

•  ANCA por IFI y ELISA aumenta su valor predictivo positivo:

•  – VPP IFI: 45%, – VPP ELISA: 83%, – VPP IFI má�s ELISA: 88%

ANCA

Arthritis Care Res 2000; 13: 424

SAF Síndrome antifosfolípidos

•  Síndrome Anti-Fosfolípidos (SAF):

–  Clínica (trombosis, complicaciones obstétricas) –  Laboratorio (2 determinaciones separadas por

12 sem):

Anti-cardiolipinas (aCL) (ELISA) Anticoagulante lúpico (LAC) (prolonga TTPA,

Laboratorio Hemostasia, ) Anti- β2 glicoproteína-I (anti- β2GP-I)

(ELISA)

•  Anticuerpos anti-cardiolipinas están dirigidos contra fosfolípidos: –  Participan en la cascada de la coagulación –  Están presentes sobre la membrana de plaquetas y de células

endoteliales –  Contra proteínas plasmáticas que unen fosfolípidos como

β2GP-I y anexina

•  Determinación por ELISA de IgM e IgG

Sindrome antifosfolipidos Anticuerpos anti-cardiolipinas

•  Pueden estar presentes a pesar de la ausencia de aCL o LAC

•  Ante sospecha clínica importante se deben solicitar

•  Determinación por ELISA de IgM e IgG

Anticuerpos Anti-β2 Glicoproteína-I (Anti- β2 GP I)

SAF Síndrome antifosfolípidos

•  En pacientes con serología positiva, las determinaciones deben repetirse después de 12 semanas.

•  Niveles elevados de anticardiolipinas, ACL y

β2GP-I pueden observarse en individuos sanos durante infecciones bacterianas o virales.

Conclusiones

•  el estudio de auto-anticuerpos es útil en el diagnóstico, clasificación y seguimiento de enfermedades autoinmunes

•  No existen exámenes 100 % seguros para el diagnóstico

•  Presentes en población normal •  no son útiles como método de screening de

población general.

Conclusiones

•  An9cuerpos An9-‐Pép9do Citrulinado Cíclico (An9-‐CCP)

•  – Especificidad de > 95% – Elevado valor predic3vo posi3vo en artri3s indiferenciada temprana y sujetos sanos – Capacidad pronós3ca

•  • An9cuerpos An9-‐MPO y An9-‐PR3 •  – Son un complemento indispensable en la evaluación diagnós3ca y seguimiento de las vasculi3s ANCA posi3vas

•  An9cuerpos An9-‐β2 Glicoproteína-‐I (An9-‐ β2 GP I)

•  – Pueden estar posi3vos en ausencia de aCL y LAC •  • An9cuerpos an9-‐DNA por Farr •  – U3lidad en el seguimiento de pacientes con LES

•  – Ventajas sobre el ELISA: asociación con ac3vidad (evaluado mediante escalas) y nefri3s

•  Comparación entre la eficacia de las 2 técnicas (Farr RIA y ELISA) para detectar an9cuerpos an9-‐DNA y su capacidad de medir ac9vidad de la enfermedad

•  • Determinación de Farr y ELISA, evaluación clínica y de laboratorio, SLEDAI-‐2K

•  550 pacientes, 2940 visitas del 2000 al 2002 •  Correlación Farr y ELISA 0,46 (95% CI 0,39-‐0,52, p<0,0001)

independiente •  del valor (1a visita) •  • Farr anormal se asocia significa9vamente a mayor

SLEDAI-‐2K y a compromiso renal (121 pacientes) •  • No se ve asociación con ELISA

•  – Sensibilidades distintas según la técnica de ELISA usado

•  • Uso de ELISA (Rheumatology 2004;43:174–180)

•  • Positividad PR3-ANCA fluctúa de 53 to 80% con ELISA directo y de 72 to 76% con ELISA por “captura”

•  – Seguimiento de la actividad de la enfermedad (principalmente ELISA por “captura o sandwich” in house)

•  – Diagnóstico mediante mediante ELISA directo comercial

Anticuerpos Anti-MPO y Anti-PR3

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